CN101701030A - 一种超声场协助酶解法提取苦楝素的方法 - Google Patents
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Abstract
超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是操作过程为:以粉碎的苦楝树树皮、籽、叶或根为被提物,将被提物加入在提取液中;向所述提取液中加入生物酶之后置于超声场中:在所述超声场中完成超声酶解后得酶解液,酶解液依次经过灭活、离心、过滤、萃取分离、蒸发、干燥,即得含有有效成分苦楝素的晶体。本发明方法原料廉价易得、工艺简单、无需使用有机试剂、提取成本低。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物开发与生物技术应用领域,特别是生物酶法提取天然产物苦楝素的方法及工艺。
背景技术
苦楝素(toosendanin)是从天然植物苦楝或川楝中提取的四环三萜类物质,具有一定的医药治疗作用,并有着良好的广谱杀虫抗菌性能,对人体无损,易于降解,可以用来防治农作物病虫害,是一种极具潜力的植物源农药。楝科植物有效成分提取方法包括溶剂浸提法、超临界流体萃取法和超声场协助提取法、微波协助提取法等等。
由于苦楝素极性中等,且苦楝树皮或树籽中杂质较多,用溶剂浸提的方法很难将其全部提出,且溶剂消耗过大,提取工艺繁琐复杂;超临界二氧化碳萃取法适于常温下提取热敏性成分,但提取成本高,设备复杂,对苦楝素等纯度要求不高、植株中活性成分含量较低的物质并不适合;超声场协助混合溶剂提取,可有效提高浸提物质的穿透能力,提高提取率,但消耗较多有机溶剂,提取工艺繁琐复杂;微波可对浸提物内外同时均匀、迅速地加热,可提高提取效率,但不适用于热敏性成分的提取,且难实现连续化生产。
酶解法的作用原理是利用生物酶所具有的高效性、专一性及超声场所具有的空化作用,将细胞壁的组成成分水解或降解,破坏细胞壁结构,使有效成分苦楝素更快地渗出细胞,并溶解、混悬或胶溶于溶剂中,从而达到快速高效提取细胞内有效成分目的一种新型提取方法。超声协助酶解法提取具有无需使用有机溶剂、反应条件温和、作用时间短、产品产量高等优点。迄今尚未见有关生物酶解法提取楝科植物的有效成分,尤其是酶解法提取苦楝素的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,是从苦楝树的皮、籽、叶或根中,以超声场协助酶解法提取有效成分苦楝素。利用生物酶的高效、专一性,破坏细胞壁结构,在超声场协助下使有效成分苦楝素更快的渗出细胞,并溶解、混悬或胶溶于溶液中。为苦楝素提取提供一种新的、绿色的方法及工艺,并拓展了生物技术的应用。
本发明超声场协助酶解法提取苦楝素的方法的特点是按如下过程进行操作:
以粉碎的苦楝树树皮、籽、叶或根为被提物,将所述被提物加入在提取液中;向所述提取液中加入生物酶之后置于超声场中;在所述超声场中完成超声酶解后得酶解液,所述酶解液依次经过灭活、离心、过滤、萃取分离、蒸发干燥,即得含有有效成分苦楝素的晶体。
本发明方法的特征也在于:
所述提取液为一种、或混合的多种溶液或缓冲溶液,调节所述提取液pH值的溶剂为盐酸、硫酸或醋酸溶液或缓冲液。
所述生物酶为一种、或混合的多种酶制剂或酶粉末;所述生物酶是对细胞壁具有降解作用的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、崩溃酶或离析酶。
所述生物酶的用量为0.1mg·ml-1~10mg·ml-1,所述超声酶解的温度为20~80℃,所述超声酶解是在恒定温度下1~12小时完成。
所述被提物按10~100目的粒度要求进行粉碎,所述被提物与提取液的质量体积比为1∶5~1∶100g·ml-1,所述提取液的pH为3~6.5。
所述萃取分离中的萃取剂为正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷中的一种或几种。
所述蒸发干燥的温度设置为30~120℃。
所述超声场为内置场或外置场,所述超声场的超声功率为10W~400W,超声频率为10KHz~100KHz。
与已有技术相比,本发明有益效果体现在:
1、本发明采用超声场协助酶解法,利用了生物酶的高效性、专一性,可有效的破解苦楝细胞壁,在超声作用下使有效成分的加速溶出,实现高效率、低成本提取。
2、相同提取条件下,本发明方法的提取率比传统溶剂浸提法提高了2倍甚至2倍以上,提取效果明显。
3、经本发明方法后苦楝素提取率为1.5%以上;经后期分离后,所得产品的纯度达85%以上。
附图说明
图1为本发明方法提取苦楝素粗品的高效液相色谱图。
图2为本发明方法提取苦楝素粗品的红外光谱图。
以下通过具体实施方式,并结合附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1:
将干燥后的苦楝树皮粉碎到60目,取5g置于250ml的具塞三角瓶中,加入100ml pH为5、温度为50℃的醋酸溶液,加入生化级纤维素酶0.02g,酶活≥20000u·g-1,在功率为40W、频率为28KHz超声提取器中,温度为45℃恒温酶解2小时;酶解结束后,在沸水中加热5分钟使酶失活;以4000rpm离心10分钟后抽虑;滤液用50ml正丁醇萃取24小时,重复两次,合并萃取液;减压蒸发干燥,得到淡黄色粉末产品。由于该成分不易挥发,减压蒸发是为了加快干燥速度,只要压力低于大气压力,温度低于该压力下正丁醇的沸点均可。
提取物经检测,苦楝素的提取率为1.74%。
本实施例中,提取前的溶液,即提取液为弱酸性醋酸溶液,酶解需要在一定pH环境下才能进行,酶解后提取到有效成分后的液体为酶解液。
实施例2:
将干燥后的苦楝树籽粉碎到60目,取5g置于250ml具塞三角瓶中,加入100ml pH为4.5,温度为50℃的盐酸溶液,加入生化级半纤维素酶0.02g,酶活≥2000u·g-1,在功率为60W、频率为40KHz超声提取器中,温度为45℃恒温酶解2小时;酶解结束后,在沸水中加热5分钟使酶失活;以4000rpm离心10分钟后抽虑;滤液用50ml正丁醇萃取24h,重复两次,合并萃取液;减压蒸发干燥得到淡黄色粉末产品。
提取物经检测,苦楝素的提取率为1.855%。
实施例3:
将干燥后的苦楝树皮粉碎到40目,取3g置于250ml具塞三角瓶中,加入100ml pH为4.5,温度为50℃的盐酸溶液,加入生化级果胶酶0.02g,酶活≥30000u·g-1,在功率为80W、频率为45KHz超声提取器中,温度为50℃恒温酶解2.5h;酶解结束后,在沸水中加热5min使酶失活;以6000rpm离心10min后抽虑;滤液用50ml正丁醇萃取24小时,重复两次,合并萃取液;减压蒸发干燥得到淡黄色粉末产品。
提取物经检测,苦楝素的提取率为2.085%。
实施例4:
将干燥后的苦楝树皮粉碎到40目,取3g置于250ml具塞三角瓶中,加入100ml pH为4.5,温度为50℃的硫酸溶液,加入生化级果胶酶、半纤维素酶各0.01g,酶活均≥20000u·g-1,在功率为120W、频率为48KHz超声提取器中,温度为50℃恒温酶解2小时;酶解结束后,在沸水中加热5分钟使酶失活;以6000rpm离心10分钟后抽虑;滤液用50ml正丁醇萃取24h,重复两次,合并萃取液;减压蒸发干燥得到淡黄色粉末产品。
提取物经检测,苦楝素的提取率为2.140%。
实施例5:
将干燥后的苦楝树皮粉碎到40目,取4g置于250ml具塞三角瓶中,加入100ml pH为4.5,温度为50℃的醋酸一醋酸钠缓冲液,加入生化级纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶各0.01g,酶活均≥20000u·g-1,在功率为200W、频率为28KHz超声提取器中,温度为50℃恒温酶解2h;酶解结束后,在沸水中加热5min使酶失活;以6000rpm离心10分钟后抽虑;滤液用50ml正丁醇萃取24小时,重复两次,合并萃取液;减压蒸发干燥得到淡黄色粉末产品。
提取物经检测,苦楝素的提取率为2.213%。
实施例6:
将干燥后的苦楝树皮粉碎到80目,取4g置于250ml具塞三角瓶中,加入100ml pH为5,温度为50℃的磷酸盐缓冲液,加入生化级纤维素酶、崩溃酶各0.01g,酶活均为≥20000u·g-1,在功率为200W、频率为40KHz超声提取器中,温度为50℃恒温酶解2h;酶解结束后,在沸水中加热5min使酶失活;以6000rpm离心10分钟后抽虑;滤液用50ml正丁醇萃取24小时,重复两次,合并萃取液;减压蒸发干燥得到淡黄色粉末产品。
提取物经检测,苦楝素的提取率为2.313%。
图1所示为本发明方法提取苦楝素粗品的高效液相色谱图。
图2所示为本发明方法提取苦楝素粗品的红外光谱图。
Claims (8)
1.超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是按如下过程进行操作:
以粉碎的苦楝树树皮、籽、叶或根为被提物,将所述被提物加入在提取液中;向所述提取液中加入生物酶之后置于超声场中;在所述超声场中完成超声酶解后得酶解液,所述酶解液依次经过灭活、离心、过滤、萃取分离、蒸发、干燥,即得含有有效成分苦楝素的晶体。
2.根据权利要求1所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述提取液为一种、或混合的多种溶液或缓冲溶液,用于调节所述提取液pH值的溶剂为盐酸、硫酸或醋酸溶液或缓冲液。
3.根据权利要求1所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述生物酶为一种、或混合的多种酶制剂或酶粉末;所述生物酶是对细胞壁具有降解作用的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、崩溃酶或离析酶。
4.根据权利要求1或3所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述生物酶的用量为0.1mg·ml-1~10mg·ml-1,所述超声酶解的温度为20~80℃,所述超声酶解是在恒定温度下1~12小时完成。
5.根据权利要求1所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述被提物按10~100目的粒度要求进行粉碎,所述被提物与提取液的质量体积比为1∶5~1∶100g·ml-1,所述提取液的pH为3~6.5。
6.根据权利要求1所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述萃取分离中的萃取剂为正丁醇、乙酸乙酯和三氯甲烷中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述蒸发干燥的温度设置为30~120℃。
8.根据权利要求1所述的超声场协助酶解法提取苦楝素的方法,其特征是所述超声场为内置场或外置场,所述超声场的超声功率为10W~400W,超声频率为10KHz~100KHz。
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