CN101698848B - 金鱼自主转座子基因gfTol2、该基因编码的转座酶及该基因的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金鱼自主转座子基因gfTol2，其具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明还公开了上述基因gfTol2编码的转座酶，其具有SEQ IDNo：2所示的氨基酸序列。本发明还公开了上述基因gfTol2作为金鱼的基因药物或基因试剂的用途：通过调节该基因转录产物的浓度来提高金鱼的正品率和诱发后代变异。

Description

金鱼自主转座子基因gfTol2、该基因编码的转座酶及该基因的用途

技术领域

本发明涉及一种金鱼自主转座子基因gfTol2、该基因编码的转座酶及该基因的用途，本发明涉及金鱼自主转座子基因的分离，以及转座酶编码cDNA的分离，同时还涉及利用该基因产物调节金鱼的正品率和诱发后代变异。属于鱼类基因工程领域。

背景技术

转座子主要分为两类：一类是具有类似反转录病毒结构的I型转座子，采用“复制粘贴”机制，首先将DNA转录为RNA，在反转录酶的作用下合成DNA，反转录的DNA插人染色体的其他部位，结果在染色体上的位置发生了移动。另一类是II型转座子，主要采用“剪切-粘帖”的转座机制，将DNA从染色体上切下来后直接***到别的部位，由两端较短的反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)和编码转座酶的基因组成，但是此类转座子的转座酶大多在漫长的进化中失活。II型转座子在矮牵牛、金鱼草、飞燕草、甜豌豆等植物以及一些低等无脊椎动物中存在，并广泛用于作物优良基因和基因调控元件的捕获、基因的功能和转基因研究。

长期以来II型转座子在脊椎动物中的发现和应用一直都是空白。直到1996年，日本学者在一种白化变异的青鳉鱼(Oryzias latipes)中发现一种hAT家族转座子，这个转座子家族以果蝇的hobo转座子、玉米Ac转座子以及金鱼草的Tam3转座子为代表，因此叫作hAT家族，并命名为Tol2转座子。青鳉Tol2转座子是迄今所发现的第一个天然具有活性的脊椎动物转座子。青鳉Tol2转座模式同其它低等生物DNA转座子一样也是通过“剪切-粘帖”方式转座的，主要有3个过程：①即转座元件带动目的功能基因和启动子从原来位点割离下来；②重新整合到被转移物种的基因组中，从而实现转基因并在后代中遗传；③上述2个过程须由青鳉Tol2自身编码的转座酶基因催化完成。

金鱼(Carassius auratus Linnaeus，Goldfish)的体形、体色、头型、鳞片、鳍、眼、鼻、鳃盖骨等部位的变异非常突出，经过几百年的人工培育，目前，我国有记录的金鱼品系约有500多种。可分为草金鱼(Common goldfish)、文种金鱼(Fantail goldfish)如琉金(Ryukin goldfish)和珍珠(Fantail pearlscale)、龙睛金鱼(Goldfish with moor)如蝶尾(Moor with butterfly tail)和蛋种金鱼(Egg-fish goldfish)4大类。金鱼繁殖和新品种的选育缺乏科学依据，非常盲目，导致后代遗传变异严重，成品率大大降低，正品率在10％以下。也就是说，每繁殖培育出1万尾小鱼，最终能够达到出口质量要求的，只有几百尾。这不仅浪费了大量的人力物力，而且成品数量不能满足国际市场的需求。出口厂家为了凑足数量，常常降低选择标准，严重影响了中国金鱼在国际市场上的美誉，破坏了中国金鱼的品牌。通过研究我们发现，金鱼的体色和体型变异与其基因组内存在的gfTol2转座子***诱变有关，金鱼gfTol2转座子具有天然活性，在我国一些金鱼品种中广泛存在，金鱼gfTol2转座子是迄今发现的第二例脊椎动物转座子。高活性的金鱼gfTol2转座子可引发***突变，是金鱼基因组变异的重要驱动力之一，与金鱼的体色和体型等性状的遗传稳定性密切相关，我们实践表明可通过控制金鱼胚胎体内转座酶活性来提高金鱼后代的正品率和诱发后代变异。

发明内容

本发明要解决的技术问题是筛选一种金鱼转座子基因gfTol2，以及该基因编码的转座酶cDNA，该基因产物与金鱼后代的遗传稳定性密切相关。本发明的目的是提供一种可以提高金鱼后代正品率和变异度的方法。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种金鱼自主转座子基因gfTol2，其特征在于，是编码SEQ ID No：2的氨基酸序列的转座酶的核苷酸序列。

所述基因gfTol2核苷酸序列如SEQ ID No：1。所述基因gfTol2编码的转座酶cDNA，所述cDNA是由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQID No：1的第2170～3229，3315～3630和4018～4498位碱基具有至少90％的同源性。

作为本发明的第二方面，一种如上述的gfTol2基因编码的转座酶，其特征在于，该转座酶序列如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

所述转座酶的氨基酸序列中发生一或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。

作为本发明的第三方面，一种金鱼自主转座子基因gfTol2作为金鱼的基因药物或基因试剂的用途。该基因gfTol2作为一种基因药物，利用该基因gfTol2产物调节金鱼的正品率和诱发后代变异。

所述金鱼为琉金、蝶尾和珍珠品系的金鱼。

根据SEQ ID No：1所示的核苷酸序列设计gfTol2的吗啉寡聚核苷酸(Morpholino oligo)，所述吗啉寡聚核苷酸的序列如SEQ ID No：21所示，将吗啉寡聚核苷酸注射入金鱼1-2细胞期胚胎内，使金鱼内源转座酶表达下调，提高金鱼的正品率。

根据SEQ ID No：1所示的核苷酸序列设计的gfTol2mRNA，所述mRNA的序列如SEQ ID No：22所示，将gfTol2mRNA注射入金鱼1-2细胞期胚胎内，使金鱼转座酶浓度上调，诱发金鱼后代变异，用于获得新品系。

本发明通过分子生物学技术手段分离和分析与金鱼遗传变异密切相关的自主转座子基因，为提高繁育生产过程中的金鱼正品率和获得新变异品系奠定基础。

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，意外地发现在琉金、珍珠和蝶尾3品系金鱼中发现有Tol2转座子(命名为gfTol2)的存在。在此基础上完成了本发明。在一优选例中，本发明的金鱼自主转座子基因gfTol2及其用途可包括：设计合适引物在不同鱼类中广泛进行Tol2转座子的筛选；金鱼自主转座子基因gfTol2的分离；金鱼gfTol2转座酶全长cDNA的克隆；gfTol2基因与金鱼正品率和诱发后代变异的关系等方面，所涉及的技术详细描述如下：

(1)广泛进行鱼类Tol2筛选。

1996年，日本名古屋大学的Inagaki H和Koga A等对白化突变青鳉(Oryzias latipes)变种进行连锁分析时，发现其酪氨酸酶基因***了一个4.7kb左右的片段，能够在青鳉基因组中进行自主转座，后经研究将该转座元件命名为Tol2转座子归属于hAT家族。这是迄今在脊椎动物中发现的第一个天然有活性的转座子。发明人发现在玉米AC的第二个编码区和青鳉Tol2转座子的第二个编码区上，有两段相似度为100％的氨基酸序列，其中第一个氨基酸相似片段的大小为9个氨基酸(CACHILNLV)，第二个氨基酸相似片段为6个氨基酸(TRWNST)序列。根据这2个氨基酸保守区设计引物SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，在近20中养殖鱼类和6品系金鱼中进行筛选，最后在琉金(Gold plating goldfish)、珍珠(Genuine pearl goldfish)和蝶尾(Butterfly Tailgoldfish)3品系金鱼中发现有完整的Tol2转座子gfTol2基因的存在。

(2)金鱼自主转座子基因gfTol2的分离。

既然引物SEQ ID No：3和SEQ ID No：4在琉金金鱼中扩增的序列与青鳉序列具有很高的相似度。接下来，本发明人参考了GenBank中的青鳉的Tol2转座子(AB031079.1)分别设计了SEQ ID No：5和SEQ ID No：6、SEQ ID No：5和SEQ ID No：7、SEQ ID No：3和SEQ ID No：8、SEQ ID No：4和SEQ ID No：9、SEQ ID No：7和SEQ ID No：8、SEQ ID No：10和SEQ ID No：11多对引物组合，并进行PCR片段扩增、测序和交叉重叠片段拼接，最终获得了完整的金鱼gfTol2转座子DNA序列(SEQ ID No：1)。

(3)金鱼gfTol2转座酶全长cDNA的克隆。

对有gfTol2基因表达的胚胎时相cDNA进行3’-和5’-RACE扩增。用BioEdit 7.0软件中的CLUSTAL W程序比较5’-/3’-RACE序列重叠部分，去掉5’-/3’-RACE序列两端添加的引物部分，拼接得到金鱼gfTol2全长cDNA序列，并推测出金鱼gfTol2转座酶编码氨基酸序列(SEQ ID No：2)。

(4)通过吗啉寡聚核苷酸(Morpholino oligo)沉默技术提高金鱼正品率

体外合成的gfTol2转座酶基因的吗啉寡聚核苷酸，通过显微注射入1-2细胞期的金鱼胚胎，可干扰和减低gfTol2转座酶mRNA的表达量，提高与亲本性状相似后代的比例，提高金鱼正品率。

(5)通过增加gfTol2转座酶mRNA的浓度诱发金鱼后代变异

体外合成的gfTol2转座酶基因的mRNA，通过显微注射入1-2细胞期的金鱼胚胎，可增加gfTol2转座酶mRNA的表达量，提高金鱼内源性转座子的活性，引发转座***诱变，提高金鱼的变异频率。

本发明的有益效果：

在金鱼中发现存在有天然活性的自主gfTol2转座子基因和转座酶编码cDNA，金鱼转座子gfTol2与金鱼的遗传和变异密切相关。通过减少转座酶mRNA的表达量，降低gfTol2的***诱变，可使更多的金鱼后代保持亲本的遗传性状，提高金鱼的正品率，减少人力、物力消耗，提高金鱼养殖场的效益；另外，通过增加转座酶mRNA的表达量，增加gfTol2的***诱变，可使更多的金鱼后代产生有别于亲本的变异，从而创建育种材料，用于获得新品系。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1是由SEQ ID No：10和SEQ ID No：11、SEQ ID No：3和SEQ ID No：8引物组合在琉金、珍珠和蝶尾3个金鱼品系中扩增出gfTol2转座子的电泳图；

注：其中M为分子量标记，1-10：使用SEQ ID No：10和SEQ ID No：11引物组合扩增出的条带，大小约为1447bp，11-20：使用SEQ ID No：3和SEQ IDNo：8引物组合扩增出的条带，大小约为1882bp。

图2是由SEQ ID No：10和SEQ ID No：11引物组合在琉金金鱼胚胎发育的不同时期扩增出gfTol2的表达情况图，孵化水温为16-19℃。

图3是由SEQ ID No：10和SEQ ID No：11引物组合在琉金金鱼成鱼不同组织扩增出gfTol2的表达情况图。

图4是在琉金金鱼1-2细胞期胚胎显微注射吗啉寡聚核苷酸(Morpholinooligo)和gfTol2转座酶mRNA后的原肠期胚胎gfTol2转座酶基因的实时定量PCR表达图。***为差异极显著p＜0.001。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，未详细说明的技术为常规技术。

实施例1、金鱼自主转座子基因gfTol2的分离

通过比较玉米AC转座子(GenBank登录号：P08770)和青鳉Tol2转座子(GenBank登录号：AB031079.1)的氨基酸序列，我们发现在玉米AC的第二个编码区和青鳉Tol2转座子的第二个编码区上，有两段相似度为100％的氨基酸序列，其中第一个氨基酸相似片段的大小为9个氨基酸(CACHILNLV)，第二个氨基酸相似片段为6个氨基酸(TRWNST)序列。根据这两段氨基酸保守序列的核苷酸序列，分别设计引物SEQ ID No：3和SEQID No：4，利用这一对引物(SEQ ID No：3和SEQ ID No：4)进行hAT家族转座子小片段的扩增，PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延长5min。2008年，我们尝试利用该引物在材料与方法中所述的近20种常见的养殖鱼类(青、草、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊、罗非鱼、河鲈、花鲈、牙鲆等)中寻找转座子。然而，这些养殖鱼类基因组中都不能扩增出与该保守片段相似的片段。

在偶然的情况下，通过使用该对引物(SEQ ID No：3和SEQ ID No：4)对琉金品系金鱼(文种)的DNA中进行PCR扩增，我们惊喜的发现：该对引物在琉金品系金鱼的基因组中可扩增出小片段。从金鱼中扩增出的小片段与青鳉Tol2转座子的相应区域具有很高的遗传相似度(99％)。既然引物SEQ IDNo：3和SEQ ID No：4在琉金金鱼中扩增的序列与青鳉序列具有很高的相似度。接下来，我们参考了GenBank中的青鳉的Tol2转座子(AB031079.1)分别设计了SEQ ID No：5和SEQ ID No：6、SEQ ID No：5和SEQ ID No：7、SEQ ID No：3和SEQ ID No：8、SEQ ID No：4和SEQ ID No：9、SEQ ID No：7和SEQ ID No：8、SEQ ID No：10和SEQ ID No：11多对引物组合，并进行PCR片段扩增(PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延长5min)、测序和交叉重叠片段拼接，最终获得了完整的金鱼Tol2转座子DNA序列(SEQ ID No：1)。

在获得了琉金品系金鱼Tol2转座子的DNA序列后，我们进一步在6品系常见金鱼(草金鱼、红狮、蝶尾、琉金、珍珠、蓝寿)和其他近缘观赏鱼中(锦鲤、彩鲤)进行Tol2转座子的扩增分析，每个品系各10尾。通过使用引物SEQ ID No：10和SEQ ID No：11组合，以及SEQ ID No：3和SEQ ID No：8组合，进行个品系PCR扩增(PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延长5min)，这两对引物涵盖了几乎整个金鱼Tol2的转座酶的DNA序列。实验发现在琉金、珍珠、蝶尾中存在完整的Tol2转座子(图1)，另外检测的草金鱼、红狮、蓝寿、锦鲤、彩鲤等品系的金鱼没有扩增出相似或者完整的PCR条带。

通过使用SEQ ID No：10和SEQ ID No：11引物组合在琉金金鱼胚胎发育的10小时、24小时、34小时、48小时和一周时间扩增出gfTol2的表达情况，孵化水温为16-19℃，结果如图2所示。结果表明：gfTol2在琉金金鱼胚胎发育的早期具有较高的表达量，随着发育进行，gfTol2的表达量呈下降趋势。

通过使用SEQ ID No：10和SEQ ID No：11引物组合在琉金金鱼成鱼卵巢、***、心、肝、脾、胃、肾、肠、眼、肌、鳃和鳍扩增出gfTol2的表达情况图，结果如图3所示。结果表明：gfTol2在琉金金鱼卵巢中表达量最高，其次为肝脏，而在***、心、脾、胃、肾、肠、眼、肌、鳃和鳍中表达量较低。

实施例2、金鱼gfTol2转座酶全长cDNA的克隆

对琉金金鱼来源于不同时期胚胎，分别取10个以TRIZOL(Invitrogen)试剂提取总RNA，用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的逆转录酶反转为3’端单链cDNA，设计1对正反引物(SEQ ID No：12和SEQ ID No：13)扩增金鱼gfTol2小片段，并进行克隆和测序分析(委托北京华大基因研究中心)，以判断是否存在gfTol2基因的表达。对有gfTol2基因表达的胚胎时相cDNA进行3’-和5’-RACE扩增。

3’-RACE：根据所测小片段序列设计3’-RACE引物(SEQ ID No：14)和3’-RACE巢式引物(SEQ ID No：15)，以3’端单链cDNA为模板，用3’-RACE试剂盒中的M13Primer M4(SEQ ID No：16)作为反向引物，3’-RACE引物(SEQID No：14)为正向引物进行PCR扩增；然后再以第一次的PCR产物为模板，用M13Primer M4和3’-RACE巢式引物(SEQ ID No：15)进行第二次PCR，扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，割胶回收目的片段，将回收产物连接至pMD-19T载体(TaKaRa)中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50μg/mL的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200ml菌液甘油保存，并送往北京华大基因研究中心进行双向测序。上述2轮PCR反应程序均为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延长5min。

5’-RACE：在3’-RACE测序结果基础上，按照SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit说明书要求，设计5’-RACE引物(SEQ ID No：17)和5’-RACE巢式引物(SEQ ID No：18)。用试剂盒反转得到5’端第一链cDNA，用试剂盒中10×Universal Primer A(UPM)和5’-RACE引物(SEQ ID No：17)进行PCR。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延长5min。接着以第一次PCR产物为模板，用Nested Universal PrimerA(NUP)和设计的5’-RACE巢式引物(SEQ ID No：18)做第二次PCR，PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃50s，35个循环；72℃延长5min。巢式PCR所得产物经1.2％琼脂糖凝胶，以TBE为缓冲液，在5V/cm的电压下电泳分离后，进行割胶回收目的片段，将回收产物连接至pMD-19T载体(TaKaRa)中，并转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，接种到氨苄青霉素含量为50μg/mL的液体LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取200ml菌液甘油保存，并送往北京华大基因研究中心进行双向测序。

用BioEdit 7.0软件中的CLUSTAL W程序比较5’-/3’-RACE序列重叠部分，去掉5’-/3’-RACE序列两端添加的引物部分，拼接得到金鱼gfTol2全长cDNA序列，所述cDNA是由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQ IDNo：1的第2170～3229，3315～3630和4018～4498位碱基具有至少90％的同源性。并推测出金鱼gfTol2转座酶编码氨基酸序列(SEQ ID No：2)。

实施例3、gfTol2基因过表达与金鱼变异的关系

对琉金金鱼来源于不同时期胚胎，分别取10个以TRIZOL(Invitrogen)试剂提取总RNA，用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中的逆转录酶反转为3’端单链cDNA，设计1对正反引物(SEQ ID No：19和SEQ ID No：20)扩增金鱼gfTol2全长cDNA，PCR反应程序均为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延长5min。PCR产物经BamHI和XbaI双酶切后，亚克隆到经BamHI和XbaI双酶切的pCS2+载体中。pCS2+重组质粒经NotI线性化后，采用Sp6 mMessage mMachine kit(Ambion)试剂盒进行gfTol2mRNA合成。获得的gfTol2 mRNA通过显微注射注入1-2细胞期的琉金金鱼胚胎，每个胚胎注射1nl gfTol2mRNA溶液，注射剂量约为200pg。结果显示，注射gfTol2mRNA的实验组的gfTol2转座酶mRNA的表达量达2.83，显著高于对照组(0.91)(图4)。

试验一：共注射琉金金鱼胚胎200个，经过6个月饲养，成活152尾，试验组后代与亲本具有相似性状(体型和体色)的比例为6个，比例为3.9％；而对照组200尾，后代与亲本具有相似性状比例为18个，比例为9.0％。

试验二：共注射琉金金鱼胚胎230个，经过6个月饲养，成活198尾，试验组后代与亲本具有相似性状的比例为10个，比例为5.0％；而对照组200尾，后代与亲本具有相似性状比例为21个，比例为10.5％。结果显示，gfTol2基因mRNA过量表达会显著增加金鱼的变异，可以用于优良新品系的选育过程。

实施例4、gfTol2基因沉默与金鱼正品率的关系

根据金鱼gfTol2 SEQ ID No：1所示的2160-2184、3305-3329区间的核苷酸序列设计吗啉寡聚核苷酸(Morpholino oligo)，注射入金鱼1-2细胞期胚胎内，每个胚胎注射1nl溶液，注射剂量约15ng。结果显示，注射吗啉寡聚核苷酸的实验组的gfTol2转座酶mRNA的表达量仅为0.08，显著低于对照组(0.98)(图4)。

试验一：共注射琉金金鱼胚胎200个，经过6个月饲养，成活168尾，试验组后代与亲本具有相似性状(体型和体色)的比例为44个，比例为26.2％；而对照组200尾，后代与亲本具有相似性状比例为18个，比例为9.0％。

试验二：共注射琉金金鱼胚胎223个，经过6个月饲养，成活155尾，试验组后代与亲本具有相似性状的比例为45个，比例为29.0％；而对照组200尾，后代与亲本具有相似性状比例为21个，比例为10.5％。结果显示，gfTol2基因沉默使内源转座酶表达下调，显著提高金鱼的正品率，可用于繁殖生产过程中增加金鱼正品率。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

附：本发明所涉及的DNA核苷酸序列如下

SEQUENCE LISTING

<110>上海海洋大学

<120>金鱼自主转座子基因gfTol2、该基因编码的转座酶及该基因的用途

<130>说明书序列表

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No：1

<211>4686

<212>DNA

<213>carassius auratus(linnaeus)

<400>1

cagaggtgta aaagtacttg agtaatttta cttgattact gtacttaagt attatttttg 60

gggatttttt actttacttg agtacaatta aaaatcaata cttttacttt tacttaatta 120

catttttttt agaaaaaaag tactttttac tccttacaat tttatttaca gtcaaaaagt 180

acttattttt tggagatcac ttcattctat tttcccttgc tattaccaaa ccaattgaat 240

tgcgctgatg cccagtttaa tttaaatgtt atttattctg cctatgaaaa tcgttttcac 300

attatatgaa attggtcaga catgttcatt ggtcctttgg aagtgacgtc atgtcacatc 360

tattaccaca atgcacagca ccttgacctg gaaattagag aaattataac agtcaatcag 420

tggaagaaaa tggaggaagt atgtgattca tcagcagctg cgagcagcac agtccaaaat 480

cagccccagg atcaagagca cccgtggccg tatcttcgcg aattcttttc ttttagtggt 540

gtaaataaag attcattcaa gatgaaatgt gtcctctgtc tcccgcttaa taaagaaata 600

tcggccttca aaagttcgcc atcaaaccta aggaagcata ttgaggtaag tacattaagt 660

attttgtttt actgatagtt tttttttttt ttttgggtgt gcatgttttg acgttgatgg 720

ctcgcctttt atatgtgtag taggcctatt ttcactaatg catgcgattg acaatataag 780

gctcacgtaa taaaatgcta aaatgcattt gtaattgtct gtaaattatt tgctatggta 840

acgttaggtc cacgggaaat ttggcaccta ttgcagcttt gaataatcat tatcattccg 900

tgctctcatt gtgtttgaat tcatgcaaaa cataagaaaa tcaagcgaga aatttttatt 960

tttaataatt accaaacatg ttgtattgtc aaaacggtaa cactttacaa tgaggttgat 1020

tagttcatgt attaactaac attaaataac catgagcaat acatttgtta ctgtatctgt 1080

taatcttggt taacgttagt taatagaaat acagatgttc attgtttgtt catgttagtt 1140

cacagtgcat taactaatgt taacaagata taaagtatta gtaaatgttg aaattaacat 1200

gtatacgtgc agttcattat tagttcatgt taactaatgt agttaactaa cgaaccttat 1260

tgtaaaagtg ttaccatcaa aactaatgta atgaaatcaa ttcaccctgt catgtcagcc 1320

ttacagtcct gtgtttttgt caatataatc agaaataaaa ttaatgtttg attgtcacta 1380

aatgctactg tatttctaaa atcaagtatt taacattata aagtgtgcaa ttggctgcaa 1440

atgtcagttt tattaaaggg ttagttcacc caaaaatgaa aataatgtca ttaatgactc 1500

gccctcatgt cgttccaagc ccgtaagacc tccgttcatc ttcagaacac agtttaagat 1560

attttagatt tagtccgaga gctttctgtg cctccattga gaatgtatgt acggcatact 1620

gtccatgtcc agaaaggtaa ttaaaacatc atcaaagtag tccatgtgac atcagtgggt 1680

tagttagaat tttttgaacc atcgaataca ttttgacttt attcggcatt gtattctctt 1740

ccgggtctgt tgtcaatccg cgttcacgac ttcgcagtga cgctacaatg ctgaataaag 1800

tcgtaggttt tgttattttc ggaccaaaat gtattttcga tgcttcaaat aattctacct 1860

aacccactga tgtcacatgg actactttga tgatgttttt attacctttc tggacatgga 1920

cagtataccg tacatacatt ttcagtggag ggacagaaag ctctcggact aaatcctaaa 1980

atatcttaaa ctgtgttccg aagatgaacg gaggtgttac gggcttgtaa tgacatgagg 2040

gtgagtcatt aataacatct tttcattttt gggtgaacta accctttaat gctgtaatca 2100

gagagtgtat gtgtaattgt tacatttatt gcatacaata taaatattta tttgttgttt 2160

ttacagagaa tgcacccaaa ttacctcaaa aactactcta aattgacagc acagaagaga 2220

aagatcggga cctccaccca tgcttccagc agtaagcaac tgaaagttga ctcagttttc 2280

ccagtcaaac atgtgtctcc agtcactgtg aacaaagcta tattaaggta catcattcaa 2340

ggacttcatc ctttcagcac tgttgatctg ccatcattta aagagctgat tagtgcactg 2400

cagcctggca tttctgtcat tacaaggcct actttacgct ccaagatagc tgaagctgct 2460

ctgatcatga aacagaaagt gactgctgcc atgagtgaag ttgaatggat tgcaaccaca 2520

acggattgtt ggactgcacg tagaaagtca ttcattggtg taactgctca ctggatcaac 2580

cctggaagtc ttgaaagaca ttccgccttt gcacttgcct gcaaaagatt aatgggctct 2640

catacttttg aggtactggc cagtgccatg aatgatatcc actcagagta tgaaatacgt 2700

gacaaggttg tttgcacaac cacagacagt ggttccaact ttctgaaggc tttcagagtt 2760

tttggtgtgg aaaacaatga tatcgagact caggcaagaa ggtgtgaaag tgatgacact 2820

gattctgaag gctgtggtga gggaagtgat ggtgtggaat gccaagatgc ctcacgagtc 2880

ctggaccaag acgatggctt cgaattccag ctaccaaaac atcaaaagtg tgcctgtcac 2940

ttacttaacc tagtctcaag cgttgatgcc caaaaagctc tctcaaatga acactacaag 3000

aaactctaca gatctgtctt tggcaaatgc caagctttat ggaataaaag cagccgatcg 3060

gctctagcag ctgaagctgt tgaatcagaa agccggcttc agcttttaag gccaaaccaa 3120

acgcggtgga attcaacttt tatggctgtt gacagaattc ttcaaatttg caaagaagca 3180

ggagaaggcg cacttcggaa tatatgcacc tctcttgagg ttccaatgta agtgtttttc 3240

ccctctatcg atgtaaacaa atgtgggttg ttgttgttta atactctttg attatgctga 3300

tttctcctgt aggtttaatc cagcagaaat gctgttcttg acagagtggg ccaacacaat 3360

gcgtccagtt gcaaaagtac tcgacatctt gcaagcggaa acgaatacac agctggggtg 3420

gctgctgcct agtgtccatc agttaagctt gaaacttcag cgactccacc attctctcag 3480

gtactgtgac ccacttgtgg atgccctaca acaaggaatc caaacacgat tcaagcatat 3540

gtttgaagat cctgagatca tagcagctgc catccttctc cctaaatttc ggacctcttg 3600

gacaaatgat gaaaccatca taaaacgagg taaatgaatg caagcaacat acacttgacg 3660

aattctaatc tgggcaacct ttgagccata ccaaaattat tcttttattt atttattttt 3720

gcacttttta ggaatgttat atcccatctt tggctgtgat ctcaatatga atattgatgt 3780

aaagtattct tgcagcaggt tgtagttatc cctcagtgtt tcttgaaaca aaactcatat 3840

gtatcatatg tggtttggaa atgcagttag attttatgct aaaataaggg atttgcatga 3900

ttttagatgt agatgactgc acgtaaatgt agttaatgac aaaatccata aaatttgttc 3960

ccagtcagaa gcccctcaac caaacttttc tttgtgtctg ctcactgtgc ttgtaggcat 4020

ggactacatc agagtgcatc tggagccttt ggaccacaag aaggaattgg ccaacagttc 4080

atctgatgat gaagattttt tcgcttcttt gaaaccgaca acacatgaag ccggcaaaga 4140

gttggatgga tatctggcct gtgtttcaga caccagggag tctctgctca cgtttcctgc 4200

tatgtgcagc ctctctatca agactaatac acctcttccc gcatcggctg cctgtgagag 4260

gcttttcagc actgcaggat tgcttttcag ccccaaaaga gctaggcttg acactaacaa 4320

ttttgagaat cagcttctac tgaagttaaa tctgaggttt tacaactttg agtagcgtgt 4380

actggcatta gattgtctgt cttatagttt gataattaaa tacaaacagt tctaaagcag 4440

gataaaacct tgtatgcatt tcatttaatg ttttttgaga ttaaaagctt aaacaagagt 4500

ctctagtttt cattcttgtt tttattttta cttctttaat actcaagtac aaatttaatg 4560

tggcactttt ttacttttac tcaagtatga ttctggccag atacttttag ttttaattga 4620

gtaaaatttt tcctaaatac ttgtactttc actttagtaa atatttttag tacttttaca 4680

cctctg 4686

<210>SEQ ID No：2

<211>578

<212>PRT

<213>carassius auratus(linnaeus)

<400>2

Met His Pro Asn Tyr Leu Lys Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln

             5                   10                 15

Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr His Ala Ser Ser Ser Lys Gln

           20                   25                 30

Leu Lys Val Asp Ser Val Phe Pro Val Lys His Val Ser Pro Val

             35                 40                  45

Thr Val Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile Ile Gln Gly Leu His

            50                 55                   60

Pro Phe Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys Glu Leu Ile Ser

             65                 70                 75

Ala Leu Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro Thr Leu Arg

            80                  85                  90

Ser Lys Ile Ala Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys Val Thr

            95                 100                 105

Ala Ala Met Ser Glu Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp Cys

            110                 115                 120

Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp

            125                 130                 135

Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Phe Ala Leu Ala

            140                 145                 150

Cys Lys Arg Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu Val Leu Ala Ser

            155                 160                 165

Ala Met Asn Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val

            170                 175                 180

Val Cys Thr Thr Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Leu Lys Ala Phe

            185                 190                 195

Arg Val Phe Gly Val Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Gln Ala Arg

            200                 205                 210

Arg Cys Glu Ser Asp Asp Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly

            215                 220                 225

Ser Asp Gly Val Glu Cys Gln Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln

            230                 235                 240

Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu Pro Lys His Gln Lys Cys Ala

            245                 250                 255

Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser Val Asp Ala Gln Lys Ala

            260                 265                 270

Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr Arg Ser Val Phe Gly

            275                 280                 285

Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg Ser Ala Leu Ala

            290                 295                 300

Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu Leu Arg Pro

            305                 310                 315

Asn Gln Thr Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp Arg Ile

            320                 325                 330

Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn Ile

            335                 340                 345

Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu

            350                 355                 360

Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val

            365                 370                 375

Leu Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu

            380                 385                 390

Leu Pro Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His

            395                 400                 405

His Ser Leu Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln

            410                 415                 420

Gly Ile Gln Thr Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile

            425                 430                 435

Ile Ala Ala Ala Ile Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr

            440                 445                 450

Asn Asp Glu Thr Ile Ile Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val

            455                 460                 465

His Leu Glu Pro Leu Asp His Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser

            470                 475                 480

Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala Ser Leu Lys Pro Thr Thr His

            485                 490                 495

Glu Ala Gly Lys Glu Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Cys Val Ser Asp

            500                 505                 510

Thr Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala Met Cys Ser Leu Ser

            515                 520                 525

Ile Lys Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala Ala Cys Glu Arg

            530                 535                 540

Leu Phe Ser Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys Arg Ala Arg

            545                 550                 555

Leu Asp Thr Asn Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys Leu Asn

            560                 565                 570

Leu Arg Phe Tyr Asn Phe Glu

            575

<210>SEQ ID No：3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TGTGCCTGTCACTTACTTAACC    22

<210>SEQ ID No：4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

AGTTGAATTCCACCGCGT       18

<210>SEQ ID No：5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

CAGAGGTGTAAAAGTACT       18

<210>SEQ ID No：6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

GGCCGATATTTCTTTATTAAGC    22

<210>SEQ ID No：7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ATGGACTACATCAGAGTGCATC    22

<210>SEQ ID No：8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

CTACTCAAAGTTGTAAAACCTC    22

<210>SEQ ID No：9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC-          21

<210>SEQ ID No：10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

GCTTAATAAAGAAATATCGGCC        22

<210>SEQ ID No：11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

GATCAGAGCAGCTTCAGCTAT        21

<210>SEQ ID No：12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

CCCACTTGTGGATGCCCTAC       20

<210>SEQ ID No：13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

AACTCTTTGCTGGCTTCATG    20

<210>SEQ ID No：14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

-TTGTCCAAGAGGTCCGAAAT    20

<210>SEQ ID No：15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ATGGACTACATCAGAGTGCATC    22

<210>SEQ ID No：16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

GTTTTCCCAGTCACGAC    17

<210>SEQ ID No：17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

AGACTTCCAGGGTTGATCCAGTGAG    25

<210>SEQ ID No：18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

GCAGCAGTCACTTTCTGTTTCAT    23

<210>SEQ ID No：19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

GGATCCGTGATTTGAATCGCGGTGT    25

<210>SEQ ID No：20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

TCTAGATCTTGTTTAAGCTTTTAATCTC    28

<210>SEQ ID No：21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

CTCTCTTACGTGGGTTTAATGGAGT      25

<210>SEQ ID No：22

<211>1734

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

atgcacccaa attacctcaa aaactactct aaattgacag cacagaagag aaagatcggg  60

acctccaccc atgcttccag cagtaagcaa ctgaaagttg actcagtttt cccagtcaaa 120

catgtgtctc cagtcactgt gaacaaagct atattaaggt acatcattca aggacttcat 180

cctttcagca ctgttgatct gccatcattt aaagagctga ttagtgcact gcagcctggc 240

atttctgtca ttacaaggcc tactttacgc tccaagatag ctgaagctgc tctgatcatg 300

aaacagaaag tgactgctgc catgagtgaa gttgaatgga ttgcaaccac aacggattgt 360

tggactgcac gtagaaagtc attcattggt gtaactgctc actggatcaa ccctggaagt 420

cttgaaagac attccgcctt tgcacttgcc tgcaaaagat taatgggctc tcatactttt 480

gaggtactgg ccagtgccat gaatgatatc cactcagagt atgaaatacg tgacaaggtt 540

gtttgcacaa ccacagacag tggttccaac tttctgaagg ctttcagagt ttttggtgtg 600

gaaaacaatg atatcgagac tcaggcaaga aggtgtgaaa gtgatgacac tgattctgaa 660

ggctgtggtg agggaagtga tggtgtggaa tgccaagatg cctcacgagt cctggaccaa 720

gacgatggct tcgaattcca gctaccaaaa catcaaaagt gtgcctgtca cttacttaac 780

ctagtctcaa gcgttgatgc ccaaaaagct ctctcaaatg aacactacaa gaaactctac 840

agatctgtct ttggcaaatg ccaagcttta tggaataaaa gcagccgatc ggctctagca 900

gctgaagctg ttgaatcaga aagccggctt cagcttttaa ggccaaacca aacgcggtgg 960

aattcaactt ttatggctgt tgacagaatt cttcaaattt gcaaagaagc aggagaaggc 1020

gcacttcgga atatatgcac ctctcttgag gttccaatgt ttaatccagc agaaatgctg 1080

ttcttgacag agtgggccaa cacaatgcgt ccagttgcaa aagtactcga catcttgcaa 1140

gcggaaacga atacacagct ggggtggctg ctgcctagtg tccatcagtt aagcttgaaa 1200

cttcagcgac tccaccattc tctcaggtac tgtgacccac ttgtggatgc cctacaacaa 1260

ggaatccaaa cacgattcaa gcatatgttt gaagatcctg agatcatagc agctgccatc 1320

cttctcccta aatttcggac ctcttggaca aatgatgaaa ccatcataaa acgaggcatg 1380

gactacatca gagtgcatct ggagcctttg gaccacaaga aggaattggc caacagttca 1440

tctgatgatg aagatttttt cgcttctttg aaaccgacaa cacatgaagc cggcaaagag 1500

ttggatggat atctggcctg tgtttcagac accagggagt ctctgctcac gtttcctgct 1560

atgtgcagcc tctctatcaa gactaataca cctcttcccg catcggctgc ctgtgagagg 1620

cttttcagca ctgcaggatt gcttttcagc cccaaaagag ctaggcttga cactaacaat 1680

tttgagaatc agcttctact gaagttaaat ctgaggtttt acaactttga gtag       1734

Claims (7)

1.一种金鱼自主转座子基因gfTol2，其特征在于，是编码SEQ ID No：2的氨基酸序列的转座酶的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的金鱼自主转座子基因gfTol2，其特征在于，所述基因gfTol2核苷酸序列如SEQ ID No：1。

3.一种如权利要求1或2所述的gfTol2基因编码的转座酶，其特征在于，该转座酶序列如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

4.一种如权利要求1所述的金鱼自主转座子基因gfTol2在制备可调节金鱼的正品率和诱发后代变异药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述金鱼为琉金、蝶尾和珍珠品系的金鱼。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，根据SEQ ID No：1所示的核苷酸序列设计gfTol2的吗啉寡聚核苷酸，所述吗啉寡聚核苷酸的序列如SEQ ID No：21所示。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，根据SEQ ID No：1所示的核苷酸序列设计的gfTol2mRNA，所述mRNA的序列如SEQ ID No：22所示。

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