CN101692023B

CN101692023B - 基于荧光共振能量转移对超痕量***物tnt分子识别的化学制备方法

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Publication number: CN101692023B
Application number: CN 200910144974
Authority: CN
Inventors: 高大明; 张凌云; 管航敏; 孙虹; 朱德春; 陈红
Original assignee: Hefei College
Current assignee: Hefei University; Hefei College
Priority date: 2009-09-16
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2029-09-16
Also published as: CN101692023A

Abstract

一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法，包括用二氧化硅球形纳米粒子作支撑体，在其表面修饰上氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，使其表面带特定的官能团。本发明的制备过程包括如下两个步骤：首先是让反应单体APTS与荧光素C1609在一定的反应条件下通过共价耦联，形成耦联体。然后，以氨水为催化剂水解和缩合TEOS得到二氧化硅粒子，最后将含有过量APTS的耦联体与制得的二氧化硅纳米粒子混合反应，从而制备对TNT有专识性识别作用的二氧化硅纳米粒子，其比表面积大，形成高密度识别位点、选择性好、敏感性好、形成带有分子识别性能纳米结构探针。

Description

基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法

技术领域本发明涉及材料科学领域，特别涉及具有基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法。

背景技术从社会安全的角度来看，硝基芳香化合物具有极高的***性和环境的危害性，因此，近年来，在对超痕量硝基芳香化合物的探测和相关的传感器阵列的探索已经引起了社会研究机构广泛的关注和富有成效的探索。特定硝基芳香族***物及其蒸汽信号的实验室探测已经通过气质联用仪、离子迁移谱和中子活性分析等的方法被广泛的开展。这些传统分析技术能够满足分析中的基本要求，如选择性，可靠性，准确性和可重复性，但是这些检测方法是昂贵的、耗时的和繁琐笨重的，因为检测中样品必须是脱离检测现场送往实验室去分析，不能够做到实时实地的检测。综上所述，有必要寻求一种能够快速和便捷的检测TNT的方法。在应用方面，荧光分子是构筑纳米尺度结构的理想敏感材料。而纳米二氧化硅高的表面积，表面易于功能化，是理想的纳米荧光传感器载体材料。为了解决***物检测问题，迫切地需要化学传感器能够对液相和汽相环境中的目标分析物提供一种高选择性、高响应、高敏感、快速、低成本和原位探测。

在各种信号传感器中，基于荧光“关”或荧光“开”机理的光学可寻址传感器已经被证明是研究者在许多挑战的环境中所期盼对各种小分子目标分析物检测的方法，由于该检测方法的高信号输出和可靠的检测结果。荧光“关”机理的化学传感器对硝基芳香化合物用荧光方法检测是极其有利的。拥有缺电子的芳香环的硝基芳香***物是一个电子的接受体，这样就显示出对富电子的荧光材料表面拥有很高的亲和力。这种光致发光是在电子受体和给体之间通过电子转移π复合物机理直接淬灭的，这种淬灭主要依赖于硝基芳香化物的接受电子能力。近来，美国Swager科研小组用拥有很高的荧光量子产率的半导体有机聚合物对超痕量的硝基芳香族化合物蒸汽探测已经显现了一系列的成功实例。在光纤的表面涂抹上导电聚合物，对芳香硝基***物检测信号放大了30倍。与此同时，其他的光致发光聚合物材料如聚四苯基硅烷，聚四苯基锗烷和物理吸附染料的多孔二氧化硅微球都已经被证明是对低标准的硝基芳香***物蒸汽探测的有效传感器。近来，美国swager研究小组报道荧光“开”化学传感器通过以活性酶为媒介的还原反应对非芳香硝基化合物黑索金(RDX)和季戊四醇四硝酸酯(PETN)进行直接探测方法。

目前这些方法中作为可替代的方法之一就是半导体量子点代替荧光素，由于其拥有很高荧光量子产率，荧光半导体量子点参杂二氧化硅纳米粒子近来显示了对于光学为基础的化学/生物传感器检测有巨大的潜力。发展在“纳米粒子上的实验室”技术将提供一种更具有灵活性的化学/生物传感器的新颖策略，这种灵活性的策略允许光学可调和特定配合物和接受体的组装，能够提供高比表面积为更好的接触目标分析物，同时拥有对各种传感器的组装能力。从原理上来说，基于纳米粒子的传感器可以通过共价耦联两个组分：一种是识别接受体结合目标分子和另一种传感器(发色基团)，即信号的接受体。最典型的就是美国Goldman等人近来报道了用在量子点一部分抗体和有机染料之间基于荧光共振能量转移化学/生物传感器。这种对麦芽糖和酶活性具有特定的检测功能的传感器已经被成功制备。

近年来，以二氧化硅纳米粒子为载体，修饰荧光基团作为探针吸引了大批研究者的兴趣。2006年Wiesner科研小组的发明专利(US2006183246)公开了“Fluorescent silica-based nanoparticles”制备方法。它采用了下述步骤：(1)染料TRITC为芯-壳型纳米粒子的芯；(2)以正硅酸乙酯为反应的前驱体，以氨水为催化剂制备出芯壳型的粒径为30nm荧光二氧化硅纳米粒子。2007年Aizawa Hideki科研小组的发明专利(WO2007074722)公开了“Fluorescentsilica nano-particle，fluorescent nano-material，biochip using the material，andassay method”制备方法。它采用了下述步骤：(1)以正硅酸乙酯为反应的前驱体，以氨水为催化剂制备粒径为30nm或小于30nm的荧光二氧化硅纳米表面修饰上Cy3和Cy5荧光染料，这种荧光二氧化硅粒子可以用来作为生物芯片来检测生物分子。

但是这些芯壳型的二氧化硅纳米粒子和表面修饰了荧光染料TRITC、Cy3和Cy5的荧光二氧化硅纳米粒子选择性相对较差，敏感性差，由于其表面没有携带专识性的基团。因此，合成高选择性和高敏感性的荧光二氧化硅纳米探针制备方法，实现对超痕量TNT分子识别有其必要性。

在本发明中，我们报道了在二氧化硅纳米粒子表面的一种荧光共振能量共振转移策略对在溶液和气相中超痕量TNT的探测。二氧化硅纳米粒子是尤其适合作为荧光化学传感器支撑体，因为二氧化硅纳米粒子光学透明和光子物理惰性以及其表面能够很容易通过与硅烷化试剂缩合反应而修饰上新组装功能的亚单元。二氧化硅纳米粒子表面的氨丙基能够与TNT目标分子通过形成电荷转移复合物，由于存在电子离域，这种电荷转移复合物在500-600nm波长范围类显示了一个很强的可见吸收峰。这一结果的发现，激发我们在二氧化硅纳米粒子表面通过共价交联3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(C1609)来探索基于荧光共振能量转移化学传感器对TNT目标分子的专识性的检测。当选择一个合适荧光染料分子其拥有的荧光发射光谱与APTS-TNT复合物的紫外-可见的吸收光谱相重合，它的荧光共振将会被APTS-TNT复合物所吸收，因此，二氧化硅纳米粒子的光致发光将会被有效的淬灭。由于在二氧化硅纳米粒子表面有许多的对TNT结合敏感性很强的氨丙基亚单元，这样将会导致选择性的对环境中TNT目标分子形成快速的响应。而目前关于二氧化硅纳米粒子表面修饰上氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯未见文献报道。这种表面修饰了APTS和C1609的二氧化硅纳米粒子通过荧光共振能量转移在溶液中选择性探测到纳摩尔浓度级TNT分子和在气相中数个ppb级。这种对TNT分子具有专识性作用的荧光二氧化硅纳米粒子，以荧光作为探针、氨丙基为识别位点显现出对TNT高选择性、高敏感和超痕量的探测。

发明内容发明目的：针对目前现有技术存在的不足之处，本发明首次利用纳米二氧化硅作为支撑体合成了带有氨丙基和荧光基团的一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法，并首次将纳米二氧化硅表面进行功能化修饰用于对超痕量***物TNT分子识别。所述方法为化学合成法，首先制备的单分散凝胶二氧化硅纳米粒子进行表面的氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯修饰，使其功能化。

本发明的技术方案是：一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT 分子识别的化学制备方法，包括用二氧化硅球形纳米粒子作支撑体，在其表面修饰上氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，其特征在于；所述修饰的二氧化硅球形纳米粒子中富电子氨丙基同缺电子TNT目标分子之间通过电荷转移形成深红色复合物，此复合物在525nm处有最大可见吸收峰，而表面的6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯稳态荧光发射谱正好与其重叠，根据荧光共振能量转移原理，正好能够被这个波长的TNT的复合物所吸收，通过荧光强度的下降，从而实现对TNT分子识别，本发明的制备过程包括如下两个步骤：

1.1将3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APTS)中的氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(6-Carboxyfluorescein N-succinimideester，C1609)中的琥珀酰亚胺酯，通过亲核取代反应以共价键形式耦联到硅烷化试剂APTS上。典型的合成方法是在含有过量的0.5mL的APTS和2.4mg的染料C1609的分散到10mL的无水乙醇溶液中，用恒温摇摆床以250rpm相对缓慢的转速在室温下避光连续反应12h，得到亮黄绿色的反应产物；

1.2第二步反应是将89.1mL的无水乙醇置于500mL的单颈磨口烧瓶中，3.4mL的TEOS迅速的加到乙醇溶液中，在500rpm下搅拌3min，然后把10.9mL的氨水加入到上述反应溶液中，并迅速强烈的以750rpm搅拌三分钟后，搅拌转速降至500rpm，在室温下反应18h，得到粒径大约是200nm的氧化硅粒子溶液。将反应所得到荧光染料C1609耦联到APTS上的亮黄绿色的反应产物连同50μL TEOS一道加入到反应合成后粒径大约为200nm的上述反应溶液中去，在室温下以500rpm转速搅拌避光反应24h。

将上述所得的产物离心、超声分散用无水乙醇洗三次，再重新分散到乙醇中。最终得到了C1609、APTS封端的二氧化硅纳米粒子，具有对TNT高选择性、高敏感性和超痕量探测的荧光二氧化硅纳米粒子探针。

作为对现有技术的进一步改进，所说支撑体为纳米二氧化硅粒子，其粒径可控可以通过调节反应物的量之间的比例来加以控制；所说二氧化硅球形纳米粒子支撑体的表面经修饰使其表面富含氨丙基和荧光素基团；所说硅烷化试剂是：3-氨丙基三乙氧基硅烷。所说荧光素是6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。所说被识别分子为TNT。所说的二氧化硅纳米粒子表面的氨丙基能够专识性的结合TNT目标分子。

相对于现有技术的有益效果：

其一：相对于现有技术，2006年Wiesner科研小组的发明专利(US2006183246)公开了“Fluorescent silica-based nanoparticles”制备方法。它采用了下述步骤：(1)染料TRITC为芯-壳型纳米粒子的芯；(2)以正硅酸乙酯为反应的前驱体，以氨水为催化剂制备出芯壳型的粒径为30nm荧光二氧化硅纳米粒子。2007年Aizawa Hideki科研小组的发明专利(WO2007074722)公开了“Fluorescent silica nano-particle，fluorescentnano-material，biochip using the material，and assay method”制备方法。它采用了下述步骤：(1)以正硅酸乙酯为反应的前驱体，以氨水为催化剂制备粒径为30nm或小于30nm的荧光二氧化硅纳米表面修饰上Cy3和Cy5荧光染料，这种荧光二氧化硅粒子可以用来作为生物芯片来检测生物分子。这种荧光纳米粒子没有专识性的识别位点，选择性差，没有涉及到荧光共振能量转移机理，修饰的荧光基团不是通过共价键键合上，荧光分子容易洗脱，不稳定。

本发明采用了平均粒径为200nm的二氧化硅球形纳米粒子作模板为支撑体，在其表面通过键合修饰上氨丙基和荧光素C1609，修饰后的二氧化硅球形纳米粒子拥有专识性的富电子功能基团-氨丙基，本发明的制备过程包括两个步骤：首先，将0.5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和2.4mg的6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯分散在10mL的无水乙醇中，APTS中的氨丙基和C1609中的琥珀酰亚胺酯通过亲核取代反应以共价键形式耦联到硅烷化试剂APTS上。

然后，将上述反应溶液连同50μL的TEOS一道加入含有3.4mL的TEOS为前驱体，10.9mL的氨水为催化剂和89.1mL的无水乙醇为溶剂的反应后合成粒径大约为200nm二氧化硅纳米粒子的混合液中，在室温下以500rpm转速搅拌避光反应24h。

将上述所得的产物离心、超声分散用无水乙醇洗三次，再重新分散到乙醇中。得到了表面富含氨丙基和荧光素的二氧化硅纳米粒子，制备出对TNT目标分子具有高选择性、高敏感和超痕量探测的荧光二氧化硅纳米粒子探针。

综上所述，纳米分子荧光探针，尤其是在纳米二氧化硅表面带有分子识别基团的荧光探针，既增大纳米荧光探针的比表面积，有增加了分子识别位点，提高选择性、识别性和敏感性。

其二：表面修饰了氨丙基和荧光素C1609分子的二氧化硅纳米粒子，能够对TNT分子识别。例如，加入一定量的TNT目标分子可以同二氧化硅表面的氨丙基形成暗红色的复合物，此复合物吸收二氧化硅表面荧光素C1609的发射光，通过荧光强度下降，实现对TNT分子识别。合成表面富含氨丙基和荧光素的二氧化硅纳米粒子球，同时也可以选择性用来检测其他硝基***物分子，如2，4-二硝基甲苯(DNT)、硝基苯(NB)和黑索金(RDX)。并且本发明中的荧光素是6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。可见，本发明所提供的方法是通用的，实用范围比较广泛。

其三：与传统的荧光分子探针相比较，表面修饰二氧化硅纳米粒子分子探针具有较大的比表面积，较多的识别位点，高选择性，高敏感性，提高分子识别性能。图9是本发明中纳米粒子芯片淬灭百分数随着在目标分析物饱和蒸汽时间的变化函数关系图(A)和修饰了不同荧光染料的纳米粒子在TNT饱和蒸汽中淬灭百分数时间函数的比较(B)。其中图9(A)是修饰了C1609的二氧化硅纳米粒子对不同的目标分析物饱和蒸汽检测结果，其中在TNT浓度相同的条件下淬灭百分数为最大。图9(B)是修饰了C1609的二氧化硅粒子和修饰了6-Carboxy-X-rhodamine N-succinimidyl ester(ROX)的二氧化硅对TNT淬灭百分数的比较，可以看出表面修饰了C1609的二氧化硅粒子对TNT的敏感性要远远的优于ROX的敏感性。

其四：本发明所提供的方法中，粒径可控的二氧化硅纳米粒子可以通过调节反应物量之间的比例来加以控制。即带功能识别基团的二氧化硅荧光纳米粒子的粒径是可以控制的，因此，通过调节氨水和TEOS的量来控制二氧化硅纳米粒子的粒径。

其五：选择溶胶二氧化硅纳米颗粒作为球形模板目的因为其具有以下优点：(1)容易合成溶胶氧化硅纳米颗粒，其粒径范围可从5nm-2000nm，较大的表面积，相对较低成本；(2)在反应过程中具有化学和热的稳定性不与有机溶剂反应；(3)表面容易嫁接有机官能团；(4)对环境无害。

附图说明

图1是本发明所采用的表面修饰了APTS和C1609的二氧化硅纳米粒子合成示意图。

图2是本发明所采用的APTS与TNT目标分子在溶液中通过电荷转移相互作用形成的红色复合物(A)和APTS-TNT红色复合物的归一化紫外-可见光谱图及C1609的稳态荧光发射光谱图(B)。

图3是本发明所采用的表面富含氨丙基和C1609的二氧化硅纳米粒子对TNT目标分子检测原理示意图。

图4是本发明所采用的表面富含氨丙基和C1609的二氧化硅纳米粒子的扫描电镜图(A)和透视电镜图(B)。

图5是本发明所得到的表面修饰了氨丙基和C1609的二氧化硅纳米粒子的紫外-可见光谱图(a)及其稳态荧光光谱图(b)。

图6是本发明所得到的修饰不同的荧光染料的二氧化硅纳米粒子和其纯染料对不同的硝基化合物的荧光淬灭常数的比较图。

图7是本发明所得到的滴加10μL不同浓度的TNT溶液到C1609-APTS-silica纳米粒子组装的芯片上荧光点的亮度和尺寸变化的荧光共聚焦显微镜照片。

图8是本发明中荧光纳米粒子随TNT浓度的增加荧光强度的变化(A)和其对不同分析物浓度的淬灭百分数的变化(B)。

图9是本发明中纳米粒子芯片淬灭百分数随着在目标分析物饱和蒸汽时间的变化函数关系图(A)和修饰了不同荧光染料的纳米粒子在TNT饱和蒸汽中淬灭百分数时间函数的比较(B)。

根据附图进一步解释具体实施方式

图1是本发明所采用的表面修饰了APTS和C1609的二氧化硅纳米粒子合成示意图。在图1中首先APTS与C1609进行共价耦联，然后在二氧化硅凝胶纳米粒子表面修饰上氨丙基和荧光素C1609，得到了荧光二氧化硅纳米粒子。

二氧化硅纳米粒子表面必须进行修饰，使表面带上特定官能基团，以便二氧化硅纳米粒子表面具有识别位点。本发明采用的是在纯二氧化硅纳米粒子表面共价耦联氨丙基和荧光素C1609，使其表面覆盖着氨丙基和荧光素C1609，这样有利于缺电子的目标分析物同富电子氨丙基在二氧化硅纳米粒子表面形成复合物；

首先是使硅烷化试剂APTS与荧光素C1609在一定的反应条件下通过共价耦联，形成耦联体。然后，以氨水为催化剂水解和缩合TEOS得到二氧化硅粒子，最后将耦联体同制得的二氧化硅纳米粒子混和液反应，从而制备对TNT有专识性识别作用的荧光二氧化硅纳米粒子。

图2是本发明所采用的APTS与TNT目标分子在溶液中通过电荷转移相互作用形成的红色复合物(A)和APTS-TNT红色复合物的归一化紫外-可见光谱图及荧光素C1609的稳态荧光发射光谱图(B)。APTS-TNT红色复合物在525nm处有最大的可见吸收峰，其复合物的吸收正好同荧光素C1609的稳态荧光发射光谱图相重叠，根据荧光共振能量转移，荧光素C1609的稳态荧光发射光正好被APTS-TNT红色复合物所吸收，使得C1609荧光强度的下降，实现对TNT分子识别。

图3是本发明所采用的表面富含氨丙基和C1609的二氧化硅纳米粒子对目标分子检测原理示意图。在TNT目标分子存在的条件下，荧光二氧化硅粒子表面富电子的氨丙基与缺电子TNT目标分子之间通过电荷转移作用形成红色的复合物，根据荧光共振能量转移，荧光素C1609的稳态荧光发射光正好被APTS-TNT红色复合物所吸收，使得C1609荧光强度的改变，从而使荧光淬灭，实现对TNT分子识别。

图4是本发明所采用的表面富含氨丙基和荧光素的二氧化硅纳米粒子的扫描电镜图(A)和透射电镜图(B)。由于采用两步反应，首先，通过共价耦联氨丙基和荧光素，然后，制备纯二氧化硅纳米粒子，最后再将两者混合反应得到表面富含氨丙基和荧光素的二氧化硅纳米粒子的扫描电子显微镜和透射电子显微镜照片。

图5是本发明所得到的表面修饰了氨丙基和C1609的二氧化硅纳米粒子的紫外-可见光谱图(a)及其稳态荧光光谱图(b)。从紫外-可见吸收谱图可以清楚的看到修饰上的荧光素的二氧化硅纳米粒子在502nm处的吸收峰，同时从稳态荧光发射谱也清晰地看到其在518nm处的最大发射强度。

图6是本发明所得到的不同荧光染料修饰的二氧化硅纳米粒子和纯染料对不同的硝基化合物的荧光淬灭常数的比较图。从图中可以看出修饰了氨丙基和C1609染料的二氧化硅纳米粒子对TNT的淬灭常数最大，选择性和敏感性显著。

图7是本发明所得到的滴加10μL不同浓度的TNT溶液到C1609-APTS-silica纳米粒子组装的芯片上荧光点的亮度和尺寸的变化的荧光共聚焦显微镜照片。从图中可以清晰地看出随着TNT浓度的增大荧光二氧化硅纳米粒子组成的芯片阵列在图中荧光的强度逐渐的降低。

图8是本发明中荧光纳米粒子随TNT浓度的增加荧光强度的变化(A)及其对不同分析物浓度的淬灭百分数的变化(B)。从图8A中可以看出这种修饰了荧光素的二氧化硅纳米粒子球对TNT的探测可以低至10^-9mol L^-1。从图8B中表面了这种纳米粒子对TNT的检测限为最低。

图9是本发明中纳米粒子芯片淬灭百分数随着在目标分析物饱和蒸汽时间的变化函数关系图(A)和修饰了不同荧光染料的纳米粒子在TNT饱和蒸汽中淬灭百分数时间函数的比较(B)。其中图9A是修饰了C1609的二氧化硅纳米粒子对不同的目标分析物饱和蒸汽检测结果，其中在TNT浓度相同的条件下淬灭百分数为最大。图9B是修饰了荧光素C1609的二氧化硅粒子和修饰了荧光素ROX的二氧化硅对TNT淬灭百分数的比较，可以看出表面修饰了C1609的二氧化硅粒子对TNT的敏感性要远远的优于ROX的敏感性。

具体实施方式：一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法，包括用二氧化硅球形纳米粒子作为支撑体，在其表面修饰上氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，其特征在于：所述的二氧化硅球形纳米粒子表面带有氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，其表面的氨丙基可进一步与TNT目标分子作用，使其表面富电子的氨丙基作为电子供体同缺电子的TNT受体之间通过电荷转移作用形成深红色的复合物，此深红色复合物，通过荧光共振能量转移可以吸收二氧化硅球形纳米粒子表面6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的荧光，利用荧光强度的改变，实现对超痕量***物TNT分子识别，本发明的制备过程包括如下两个步骤：

第一步，是将3-氨丙基三乙氧基硅烷中的氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯通过加成反应以共价键形式耦联到硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷上，典型的合成方法是在含有过量的0.5mL～1mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和2.0mg～10mg的6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的分散到10mL～20mL的无水乙醇溶液中，用恒温摇摆床以100rpm～300rpm相对缓慢的转速在室温下避光连续反应12h～24h；

第二步，反应是将50mL～90mL的无水乙醇置于500mL的单颈磨口烧瓶中，1mL～3.6mL的正硅酸乙酯(Tetraethyl orthosilicate，TEOS)迅速的加到乙醇溶液中，在500rpm下搅拌3min～10min，然后把1mL～15mL的氨水加入到上述反应溶液中，并迅速强烈的以500rpm～750rpm搅拌三分钟后，搅拌转速降至400rpm～600rpm，在室温下反应15h～24h，在含有过量的0.5mL～1mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和2.0mg～10mg的6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的10mL～20mL无水乙醇溶液中，反应所得到6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯耦联到3-氨丙基三乙氧基硅烷上的亮黄绿色的反应产物连同10μL～50μL TEOS一道加入到反应合成后得到二氧化硅纳米粒子的上述反应溶液中去，在室温下以400rpm～600rpm转速搅拌避光反应15h～24h。

将上述所得的拥有氨丙基和荧光素的二氧化硅纳米粒子离心、用无水乙醇超声分散洗三次再重新分散到乙醇中，最终得到了氨丙基和荧光素C1609封端的二氧化硅纳米粒子，具有对TNT高选择性、高度敏感和超痕量探测的荧光二氧化硅纳米粒子探针。

表面修饰的二氧化硅纳米粒子中加入目标分子，能够改变其识别性能。如加入TNT分子，二氧化硅纳米粒子表面的氨基与TNT形成复合物，吸收二氧化硅粒子表面的荧光素所发射的荧光，从而得到对TNT分子识别。

实施例：根据共价耦联反应，利用纳米二氧化硅作为支撑体，采用两步反应可得到表面富含氨丙基和荧光素的二氧化硅纳米粒子。

1、APTS和荧光素C1609的耦联反应：在含有过量的0.5mL的APTS和2.4mg的染料C1609的分散到10mL的无水乙醇溶液中，用恒温摇摆床以250rpm相对缓慢的转速在室温下避光连续反应12h；

2、修饰了氨丙基和荧光素C1609的二氧化硅凝胶纳米粒子制备：将89.1 mL的无水乙醇置于500mL的单颈磨口烧瓶中，3.4mL的TEOS迅速的加到乙醇溶液中，在500rpm下搅拌3min，然后把10.9mL的氨水加入到上述反应溶液中，并迅速强烈的以750rpm搅拌三分钟后，搅拌转速降至500rpm，在室温下反应18h。在含有过量的0.5mL APTS和2.4mg C1609的10mL无水乙醇溶液中，反应所得到荧光染料C 1609耦联到APTS上的亮黄绿色的反应产物连同50μLTEOS一道加入到反应合成后粒径大约为200nm的上述反应溶液中去，在室温下以500rpm转速搅拌避光反应24h。对比染料ROX的修饰过程类似于染料C1609。

Claims

1.一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法，包括用二氧化硅球形纳米粒子作为支撑体，在其表面修饰上氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，其特征在于：所述的二氧化硅球形纳米粒子表面带有氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，其表面的氨丙基可进一步与TNT目标分子作用，使其表面富电子的氨丙基作为电子供体同缺电子的TNT受体之间通过电荷转移作用形成深红色的复合物，此深红色复合物通过荧光共振能量转移可以吸收二氧化硅球形纳米粒子表面6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的荧光，利用荧光强度的改变，实现对超痕量***物TNT分子识别，此制备过程包括如下两个步骤：

1.1第一步反应是将3-氨丙基三乙氧基硅烷中的氨丙基和6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯中的琥珀酰亚胺酯通过亲核取代反应，以共价键形式将6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯耦联到硅烷化试剂3-氨丙基三乙氧基硅烷上，其合成方法是在含有过量的0.5mL～1mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和2.0mg～10mg的6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的分散到10mL～20mL的无水乙醇溶液中，用恒温摇摆床以100rpm～300rpm相对缓慢的转速在室温下避光连续反应12h～24h，得到6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯耦联到3-氨丙基三乙氧基硅烷上的亮黄绿色的反应产物；

1.2第二步反应是将50mL～90mL的无水乙醇置于500mL的单颈磨口烧瓶中，1mL～3.6mL的正硅酸乙酯(Tetraethyl orthosilicate，TEOS)迅速的加到乙醇溶液中，在500rpm下搅拌3min～10min，然后把1mL～15mL的氨水加入到上述反应溶液中，并迅速强烈的以500rpm～750rpm搅拌三分钟后，搅拌转速降至400rpm～600rpm，在室温下反应15h～24h，得到二氧化硅球形纳米粒子，将第一步反应所得到6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯耦联到3-氨丙基三乙氧基硅烷上的亮黄绿色的反应产物，连同10μL～50μL正硅酸乙酯一道加入到第二步反应合成后得到二氧化硅球形纳米粒子的反应溶液中去，在室温下以400rpm～600rpm转速搅拌避光反应15h～24h；

将所得的拥有氨丙基和荧光素的二氧化硅球形纳米粒子离心、用无水乙醇超声分散洗三次再重新分散到乙醇中，最终得到了荧光素和氨丙基封端的二氧化硅球形纳米粒子，这种二氧化硅球形纳米粒子具有对TNT高选择性、高度敏感和超痕量探测。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法，其特征是：所说支撑体为二氧化硅球形纳米粒子，其粒径可控可以通过调节反应物的量之间的比例来加以控制。

3.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移对超痕量***物TNT分子识别的化学制备方法，其特征是：所说二氧化硅球形纳米粒子表面的氨丙基能够专识性的结合TNT分子。