CN101676403A - 木糖醇生产菌株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种木糖醇生产菌株的筛选方法，涉及一种通过自然筛选得到的木糖醇高产菌株的方法。该筛选方法由(1)筛选培养基配方；(2)液体菌种的制备；(3)菌株筛选；(4)木糖的发酵；(5)发酵液的分离纯化工艺步骤组成，本发明采用该筛选方法获得的木糖醇高产菌属于热带假丝酵母，生长速度快，木糖醇转化率高，残糖低，是具有重要推广价值的菌种。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过自然筛选得到的木糖醇高产菌株的方法。
技术背景
微生物转化法生产木糖醇的研究始于20世纪70年代，一直是国内外专家研究的热点，目前，筛选木糖醇生产菌种的主要有浙江大学、四川大学等，他们利用经简单脱毒(如氨处理)的玉米芯水解液来发酵生产木糖醇，经驯化诱变虽然找到了能生产木糖醇的变异菌种，但是菌种的稳定性差，在实际应用中容易发生恢复性突变，不易适用于长期的木糖醇生产，因此筛选木糖醇高产菌种对发展木糖醇产业具有重要的经济意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种木糖醇生产菌株的筛选方法，以降低木糖醇的生产成本，更好的实现安全生产，促进木糖醇在人们日常生活中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案由以下工艺步骤组成：
(1)筛选培养基配方：在1L水中添加木糖1-20g、酵母粉0.1-1.0g、MgSO4·7H2O 0.1-0.5g、CaCl2·2H2O 0.05-0.3g、KH2PO41-5g、(NH4)2SO42-10g，组成筛选培养基；
(2)液体菌种的制备：在1L水中添加MgSO4·7H2O 0.1-1.0g、CaCl2·2H2O0.05-0.5g、KH2PO40.5-4.0g、(NH4)2SO41.0-8.0g，另外在每升溶液中添加木糖10-40g、葡萄糖10-50g、酵母膏5-20g，组成种子培养基；于无菌条件下，在250ml三角瓶中，加入50-100ml上述种子培养基，并接入一环菌种，在20-40℃，100-400r/min条件下振荡培养10-30h，得液体菌种；
(3)筛选步骤：分别取木糖母液、木糖中间品、土壤三个菌种来源的样品各1g，加入已编号的250ml三角瓶中，各三角瓶中再加入50ml纯水，于100-400r/min，20-40℃下摇瓶富集20-50h，然后分别对三种摇瓶富集液做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的梯度稀释，并涂布平板，于20-40℃的生化培养箱中培养30-60h后检测平板中的菌落分布和数量，发现稀释度为10-6的效果最好；在涂布的平板中挑取单菌落划平板，经若干次平板划线分离纯化后，挑取了30-45个菌株，并在2-6℃的麦芽汁培养基中保存；采用步骤(1)中的液体筛选培养基对挑选的菌株做发酵试验，每隔24h检测一次，直至培养基中木糖消耗殆尽，通过摇瓶试验筛得一株木糖醇高产菌，可以使发酵液中木糖醇的含量达到80-100％；
(4)木糖的发酵试验：在木糖中间品中按其干物含量的0.1-0.5％加入玉米浆作为木糖醇高产菌的生长因子，按木糖中间品总量的1-5％加入硫酸铵作为氮源，按木糖中间品总量的2-6％加入由步骤(2)培养得到的液体菌种，控制搅拌转速为100-400r/min，发酵温度28-31℃，前20h通气量为3.5-3.9L/min，以后通气量为1.1-1.4L/min，发酵总时间为68-72小时；
(5)发酵液的分离纯化：发酵液停止搅拌静止3小时，菌体全部絮凝沉降，将上清液放出，菌体回收继续发酵；将上清液加热到85-90℃，过滤除去蛋白质等沉淀物，经蒸发浓缩，使木糖醇浓度达70-85％，采用梯度降温的办法，得到高质量的结晶木糖醇产品。
本发明的积极效果是：采用该筛选方法获得的木糖醇高产菌属于热带假丝酵母，生长速度快，木糖醇转化率高，残糖低，是具有重要推广价值的菌种。发明人采用实验室自行筛选的一株以木糖为底物的木糖醇高产菌，通过发酵生产的木糖醇产品纯度高，几乎无色素，省去了木糖纯化和高温、高压的化学加氢步骤，降低了生产成本，实现了安全生产，应用价值很大。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
(1)制备筛选培养基：在1L水中添加15g木糖、0.5g酵母粉、0.3g MgSO4·7H2O、0.1g CaCl2·2H2O、2g KH2PO4、5g(NH4)2SO4，组成筛选培养基；
(2)制备液体菌种：在1L水中添加0.5g MgSO4·7H2O、0.1g CaCl2·2H2O、2.0g KH2PO4、5.0g(NH4)2SO4、20g木糖、30g葡萄糖、10g酵母膏，组成种子培养基，然后在无菌条件下，取80ml上述种子培养基倒入250ml三角瓶中，并接入一环菌种，在30℃，300r/min条件下振荡培养20h，得液体菌种；
(3)菌种的筛选：分别取木糖母液、木糖中间品、土壤三个菌种来源的样品各1g，加入已编号的250ml三角瓶中，各三角瓶中再加入50ml纯水，于200r/min，30℃下摇瓶富集35h，然后分别对三种摇瓶富集液做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的梯度稀释，并涂布平板，于30℃的生化培养箱中培养50h后检测平板中的菌落分布和数量，发现稀释度为10-6的效果最好；在涂布的平板中挑取单菌落划平板，经6次平板划线分离纯化后，挑取了39个菌株，并在4℃的麦芽汁培养基中保存；采用(1)中的液体筛选培养基对挑选的39个菌株做发酵试验，每隔24h检测一次，直至培养基中木糖消耗殆尽，通过摇瓶试验筛得一株木糖醇高产菌，可以使发酵液中木糖醇的含量达到90％；
(4)木糖的发酵：取质量百分比浓度为17％的木糖中间品300g倒入500ml三角瓶中，加入0.16g玉米浆，1.5g硫酸铵，2g(2)中的液体菌种，控制搅拌转速为200r/min，发酵温度30℃，前20h通气量为3.6L/min，以后通气量为1.2L/min，发酵总时间为70小时；
(5)发酵液的分离纯化：发酵停止并静止3小时，菌体全部絮凝沉降，将上清液放出，菌体回收继续发酵；将上清液加热到88℃，过滤除去蛋白质等沉淀物，检测其木糖醇含量为91.2％，经蒸发浓缩，使其质量百分比浓度为81％，然后按1℃/h的速率降温至35℃，进行离心，得到结晶木糖醇产品30g，木糖醇含量为99.8％。
Claims (1)
1、一种木糖醇生产菌株的筛选方法，其特征是该筛选方法有以下工艺步骤组成：
(1)在在1L水中添加木糖1-20g、酵母粉0.1-1.0g、MgSO4·7H2O 0.1-0.5g、CaCl2·2H2O 0.05-0.3g、KH2PO41-5g、(NH4)2SO42-10g，组成筛选培养基；
(2)液体菌种的制备：在1L水中添加MgSO4·7H2O 0.1-1.0g、CaCl2·2H2O0.05-0.5g、KH2PO40.5-4.0g、(NH4)2SO41.0-8.0g、，另外在每升溶液中添加木糖10-40g、葡萄糖10-50g、酵母膏5-20g，组成种子培养基；于无菌条件下，在250ml三角瓶中，加入50-100ml上述种子培养基，并接入一环菌种，在20-40℃，100-400r/min条件下振荡培养10-30h，得液体菌种；
(3)菌株筛选：分别取木糖母液、木糖中间品、土壤三个菌种来源的样品各1g，加入已编号的250ml三角瓶中，各三角瓶中再加入50ml纯水，于100-400r/min，20-40℃下摇瓶富集20-50h，然后分别对三种摇瓶富集液做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的梯度稀释，并涂布平板，于20-40℃的生化培养箱中培30-60h后检测平板中的菌落分布和数量，发现稀释度为10-6的效果最好；在涂布的平板中挑取单菌落划平板，经若干次平板划线分离纯化后，挑取了30-45个菌株，并在2-6℃的麦芽汁培养基中保存；采用步骤(1)中的液体筛选培养基对挑选的菌株做发酵试验，每隔24h检测一次，直至培养基中木糖消耗殆尽，通过摇瓶试验筛得一株木糖醇高产菌，可以使发酵液中木糖醇的含量达到80-100％；
(4)木糖的发酵：在木糖中间品中按其干物含量的0.1-0.5％加入玉米浆作为木糖醇高产菌的生长因子，按木糖中间品总量的1-5％加入硫酸铵作为氮源，按木糖中间品总量的2-6％加入由步骤(2)培养得到的液体菌种，控制搅拌转速为100-400r/min，发酵温度28-31℃，前20h通气量为3.5-3.9L/min，以后通气量为1.1-1.4L/min，发酵总时间为68-72小时；
(5)发酵液的分离纯化：发酵液停止搅拌静止3小时，菌体全部絮凝沉降，将上清液放出，菌体回收继续发酵；将上清液加热到85-90℃，过滤除去蛋白质等沉淀物，经蒸发浓缩，使木糖醇浓度达70-85％，采用梯度降温的办法，得到高质量的结晶木糖醇产品。
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| CN108676819A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-10-19 | 山东绿爱糖果股份有限公司 | 一种酶解复合物理活化改性的木糖醇及其制造方法 |
| CN108676820A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-10-19 | 山东绿爱糖果股份有限公司 | 一种采用酶与微生物方法制造的活性木糖醇及其制造方法 |
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2008
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