CN101675167B - 在转基因单子叶植物中产生重组***-ⅰ（igf-ⅰ）和***结合蛋白-3（igfbp-3） - Google Patents

Abstract

已经在单子叶植物中生产出两种重要的人类蛋白，即胰岛素生长因子I(IGF-I)和胰岛素生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)。重组产生的蛋白质具有天然形式的已知活性。

Description

在转基因单子叶植物中产生重组***-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和***结合蛋白-3(IGFBP-3)

相关申请的交叉参考

本申请要求2007年2月20日提交的美国临时专利申请序列号(“USSN”)60/890,828的优先权。通过引用明确将上述申请全文纳入本文用于所有目的。

通过EFS-WEB提交的序列表的说明

本申请是通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交的，如MPEP§1730II.B.2(a)(A)的授权和说明，此电子申请包括电子提交的序列(SEQ ID)表。通过引用将该序列表的全部内容纳入本文用于所有目的。该序列表以如下所示的电子提交的.txt文件表示：

文件名	创建日期	大小(字节)
			549072000540Seqlist.txt	2008年2月19日	6,351字节

技术领域

本发明涉及在单子叶植物中产生哺乳动物，特别是人的蛋白质。通过在转基因稻中成功产生IGF-I和IGFBP-3加以说明。

背景技术

***-I(IGF-I)和***结合蛋白-3(IGFBP-3)是调节细胞和组织的存活、生长和分化的重要蛋白质。

人IGF-I是70个氨基酸残基的单链多肽，它由染色体12上的一个基因编码。它与胰岛素原和胰岛素具有48％氨基酸序列相同性。IGF-I含有三个链内二硫桥键，位于A20-B18、A6-A11和A7-B6，但没有糖基化位点。大部分循环IGF-I在肝脏中合成，并且受生长激素(GH)、胰岛素和营养摄取的调节。循环IGF-I水平相对稳定，主要由于其组成型的分泌模式和IGF-I与高亲和结合蛋白的结合。然而，IGF-I调节异常可能在胰岛素耐受和其它代谢异常的发生中起到一定作用。

IGF-I在糖代谢调节中的确切作用尚不清楚，但在调节代谢中非常重要。在健康志愿者中，重组的人IGF-I(rhIGF-I)可行使急性低血糖作用，但rhIGF-I比相同剂量的胰岛素的强度低10倍。相反，与胰岛素相比IGF-I对蛋白质代谢的作用更明显，与相同的葡萄糖剂量的胰岛素相比，它能降低整体净氨基酸流。而且，IGF-I是胰腺释放胰岛素的强效抑制剂。在1型糖尿病患者中，使用rhIGF-I导致循环IGF-I水平上升、GH分泌过多的逆转、胰岛素需求下降和血糖控制的改善。在2型糖尿病患者中，需要较高剂量的rhIGF-I来降低禁食后的血浆葡萄糖、胰岛素和C-肽水平。此外，rhIGF-I治疗与脂肪质量降低相关联，这可部分解释上述对胰岛素敏感性的有益影响。

已鉴定到六种人IGF-结合蛋白。在这六种结合蛋白中，IGFBP-3结合血浆中95％以上的IGF-I。它含有264个氨基酸残基，计算分子量约为29kD。有三个可能的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)，分别位于IGFBP-3中心区的Asn⁸⁹、Asn¹⁰⁹和Asn¹⁷²上，但糖单位似乎对IGF结合并不重要。IGF-I/IGFBP-3二聚体与“酸不稳定性亚基”形成三元络合物，这能延长IGF-I的半衰期并滴定IGF-I对其受体的供应。

IGFBP-3是许多组织中局部产生的40-45kDa的糖蛋白，在这些地方其用作调节细胞生长和凋亡的自分泌和旁分泌调节物。IGFBP-3通过结合IGF抑制细胞增殖和存活，防止它们激活靶细胞上的IGF-I受体。还发现，IGFBP-3能以IGF依赖方式负向调节细胞增殖并诱导凋亡。不存在IGF-I时，IGFBP-3能够与多种生长抑制性蛋白质和物质如p53、视黄酸、肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β相互作用。IGFBP-3的过度表达会抑制细胞增殖并减少肿瘤形成，但对正常器官的生长抑制作用很小。近年来的研究表明，IGFBP-3会抑制乳腺癌、***癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌，因此IGFBP-3能用作有效的抗癌剂。

因此，人IGF-I和人IGFBP-3均有药用价值。使用IGF-I和IGFBP-3的主要障碍是其生产成本。这些蛋白质主要由微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)重组产生；或者由肉瘤细胞系或红细胞样细胞提取和/或在转基因小鼠中产生。这些***不适合大规模生产，因为设备和生产成本很高并且可能被病原体污染。IGF-I和IGFBP-3也出现在其他哺乳动物中，起到类似功能。

可工程改造植物细胞以接受和表达来自各种生物体的遗传信息，包括来自原核和真核来源的基因。因为植物细胞是真核细胞，所以它们能够产生哺乳动物蛋白质，对于合适的蛋白质或酶功能而言常常需要适当的翻译后修饰(如糖基化、异戊烯化和形成二硫桥)。此外，许多植物的种子是可以食用的，并且可能在种子中富集重组蛋白质。在一些情况下，重组蛋白质可能不需要进一步加工和纯化就能口服递送，只要控制剂量水平和频率，因为每种蛋白质具有特征性的酸和蛋白酶抗性。可利用递送运载体如生物包囊和植物组织来防止蛋白质在胃和内脏中降解(Daniell，H.等，Trends Plant Sci.(2001)6：219-226)。已经开发基于种子的平台，用于药用蛋白质的生物组装和生产(Sardana，R.K.，等，Transgenic Res.(2002)11：521-531)。他们的结果提示，使用植物种子作运载体通过“种子药丸(seed as pill)”产生和递送生物药品是一种可行的选择。

已经在转基因烟草中产生重组人IGF-I和重组人IGFBP-3，第五届香港糖尿病和心血管风险因素东西方交流大会，2003年10月上的三个海报演讲中报道了这些结果(“在转基因烟草中表达人***I(IGF-I)和***结合蛋白3(IGFBP-3)”(Expression of Human Insulin-like Growth FactorI(IGF I)and Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3(IGFBP 3)in TransgenicTobacco))；第64届美国糖尿病协会科学会议，2004年6月(“植物作为表达人***I(IGF-I)和***结合蛋白-3(IGFBP-3)的生物反应器”(Plants as Bioreactors for Expressing Human Insulin-like Growth Factor I(IGF I)and Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3(IGFBP 3))；和2004年美国植物生物学家协会年会，2004年7月(“人***结合蛋白-3(IGFBP-3)在烟草中的转基因表达”(Transgenic Expression of Human Insulin-likeGrowth Factor Binding Protein 3(IGFBP 3)in Tobacco Seeds))。在烟草植物中产生这些蛋白质无法提供在诸如玉米、稻、小麦和大麦等可食用单子叶植物中产生的优点。单子叶植物也包括诸如甘蔗、菠萝、椰枣和香蕉等重要的食用作物。这些单子叶植物代表可食用物质的多产来源。

每天超过40％的世界人口消耗的稻是世界上农业生产实践中良好鉴定的，被认为是产生药用和市售的重要蛋白质和疫苗的模式生物反应器(Fischer，R.等，Transgenic Res.(2000)9：279-299)。它不含有害的化学物质，如烟草所含的烟碱和毒性生物碱，并且具有较低的变应原性。稻中重组蛋白质可以占到粒重的1％。使用特异性启动子和信号序列靶向重组蛋白质在稻胚乳区(至多占全部种粒的91％)中的生产和储存，蛋白质累积可以提高至粒重的2.7％(Liu，Q.Q.，Thesis Department of Biology(2002)中国扬州大学(Yangzhou University)和香港的香港中文大学(the Chinese University of Hong Kong)。一个稻植株可以具有高达100个分蘖，产生超过10,000个谷粒，能够快速生产大量种子和重组蛋白质。此外，快速生长(每年3-4轮)的稻日本亚种可用作生产的生物反应器植物。干燥种子的储存和销售很简单，在室温下储存5个月以上后，谷粒中的产率和重组蛋白质活性没有明显降低(Stoger，E.，等，Plant Mol.Biol.(2000)42：583-590)。在水分含量低的条件下，谷粒可储存3-5年而不损失活性(Huang，N.，BioProcessInternational(2002)1月：54-59)。

如果蛋白质设计用于家畜，那么在其他谷物，如燕麦中生产可能更合适。

以前的研究证明，密码子使用偏见与基因表达水平强烈相关。高表达的基因优选使用一小组称为“优化”密码子的密码子(Moriyama，E.N.，等，J.Mol Evol(1997)45：514-523)。而且，这些优化密码子对应于最丰富的tRNA，导致翻译的准确率和效率提高(Marais，G.，等，J.Mol Evol(2001)52：275-280)。在以下实施例中，根据两种种子贮藏蛋白质所用的植物优选密码子修饰人IGF-I和IGFBP-3的DNA序列，以便提高这些蛋白质在稻中的产量。选择来自四菱豆的富含赖氨酸的蛋白质(LRP)和来自捉猴果坚果(Paradise nut)的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密码子用法作为修饰基础，因为在先前的研究中观察到它们在转基因拟南芥(Arabidopsis)中高表达和稳定累积(LRP和PN2S分别占可提取种子蛋白总量的3-10％和3-15％)。

另一种提高以下实施例所用的靶蛋白产率的方案是将重组蛋白质导向特定部位，以防止被细胞的蛋白质水解***降解。已报道，连接信号肽序列导致内质网(ER)分泌，通常需要作为外来基因的N-和C-末端的ER保留信号的四肽KDEL以便高水平地累积产物(Wandelt，C.I.等，Plant J.(1992)2：181-192；和Herman，E.M.等，Planta(1990)182：305-312)。KDEL四肽通过与高尔基复合物和ER之间循环的受体相互作用，进行蛋白质定位。KDEL信号对于可溶性蛋白质在植物ER中的累积而言是足够的(Wandelt，C.I.等，同上；Frigerio，L.等，Plant Cell(2001)13：1109-1126；和Napier，J.等，Planta(1997)203：488-494)。已发现，相对于不含KDEL的构建物，含有KDEL的构建物转化的细胞中scFv水平为6-14倍(Conrad，U.等，Plant Mol.Biol.(1998)38：101-109)。

发明内容

本发明提供了两种重要的哺乳动物蛋白质-IGF-I和IGFBP-3的经济实用的来源。优选产生人形式。通过在单子叶植物中产生这些蛋白质，本发明第一次提供能够产生足量的适合人类治疗应用或兽医应用的形式的有用来源。

因此，在一个方面，本发明涉及经修饰产生人IGF-I和/或人IGFBP-3的单子叶植物细胞。在另一方面，本发明涉及含有这类细胞的植物或植物部分。

附图简要说明

图1显示编码人IGF-I的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，如Jansen，M.等，Nature(1983)306：609-611所述。

图2显示编码人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，如Wood，W.I.等，Mol.Endocrinol.(1988)2：1176-1185所述。

图3显示根据植物中的密码子优选性修饰的编码人IGF-I的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

图4显示根据植物中的密码子优选性修饰的人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。

图5显示人IGF-I的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。

图6显示人IGFBP-3的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图7是显示稻中产生的人IGF-I在L6细胞中造成边缘波动的能力和这种作用对市售人IGFBP-3的易感性的实验结果。

图8显示稻中产生的人IGFBP-3抑制MCF-7细胞生长的有效性。

本发明实施方式

如下所述，第一次在单子叶植物中产生了两种重要的人蛋白质IGF-I和IGFBP-3。因为单子叶植物包括主要营养来源且不含有害化合物，所以非常适合产生用于人类治疗的蛋白质。它们也非常适合产生用于治疗食草性或杂食性哺乳动物的相应蛋白质。通过适当设计包含表达***的DNA构建物来提高这些蛋白质的产量，所述表达***具有操作性连接于合适控制序列以便表达的编码这些蛋白质的核苷酸序列。

对植物细胞进行遗传修饰和重建完整植株的技术已经为本领域熟知一段时间。参见例如，Gelvin等，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)，(1990))；Dashek，《植物生物化学和分子生物学中的方法》(Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology)(CRC出版社，1997)。本领域在这个方面的发展状态的有用小结可参见2004年1月14日公开的美国专利公开2004/0009476，将该文献中有关植物遗传操作的技术内容通过引用纳入本文。

一旦获得含有重组构建物的转化的植物细胞，则可由其重新产生转基因植物，评价所需蛋白质的产量水平。

可利用几种技术优化非天然核苷酸序列在植物中的表达。如以下实施例的进一步描述，可按照植物细胞中表达的密码子优选性修饰编码的核苷酸序列。这种修饰基于描述植物密码子优选性的公开数据。其次，可延伸编码核苷酸序列以加入信号和保留序列，并将编码蛋白质导向内质网并实现保留。这也对产率产生有益的影响。通常，在所需蛋白质的N末端产生信号传导肽，在其C末端产生保留信号。

使用这些技术能显著提高所需的IGF-I和IGFBP-3的产率。

使用合适启动子实现表达也是有用的。例如，合适启动子包括35S CaMV、稻肌动蛋白启动子、泛素启动子或胭脂碱合酶(NOS)启动子。提高种子中的产量的组织特异性启动子包括种子特异性谷蛋白启动子(Gt-l_pro)，但也可采用其他种子特异性启动子。也可使用终止信号，例如胭脂碱合酶终止信号。

如下所述设计两组构建物，以驱动植物优化的编码序列并通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化引入稻中。一组构建物仅含有谷蛋白信号肽(SP)，而另一组含有SP以及靶向的四肽KDEL信号。合成这些构建物以提高蛋白质表达并使蛋白质靶向储存部位，以及提高蛋白质稳定性。利用种子特异性谷蛋白启动子(Gt-l_pro)驱动IGF-I和IGFBP-3在转基因稻中的表达，分析转基因的表达。由转基因稻谷粒产生的rhIGF-I和rhIGFBP-3有生物活性。

也可修饰该构建物以包含纯化辅助物，如组氨酸标签或FLAG序列，和/或包含标记物，如荧光蛋白质，以便随后进行纯化。也可在编码蛋白质和纯化标签和/或标记物之间工程设计切割位点。如果需要可采用标准的纯化技术，或者在某些情况下，可口服给予植物组织，以利用植物的营养价值和其低毒的优点。

在1型或2型糖尿病患者中，利用重组产生的IGF-I降低胰岛素需求和提高血糖控制水平。IGFBP-3能实施凋亡，并可用于治疗恶性肿瘤。因此，如果需要，可将重组产生的蛋白质配制到给予需要用这些蛋白质治疗的对象的组合物中。配制蛋白质和其他药物的通用方法可参见《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，最新版，马克出版公司(Mack PublishingCo.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，PA)，通过参考纳入本文。该蛋白通常通过注射或透皮或跨粘膜递送途径以胃肠道外的方式全身给药，或者在某些情况下可以口服给药。可使用根据特定给药方式设计的不同剂型，包括脂质体制剂和含有脂质或聚合物基纳米颗粒的制剂等。

提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。

实施例1

用IGF-I和IGFBP-3构建物转化土壤细菌

根据两种种子贮藏蛋白质所用的优选密码子修饰人IGF-I(图1)和IGFBP-3(图2)的DNA序列。选择来自四菱豆的富含赖氨酸的蛋白质(LRP)和来自捉猴果坚果的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密码子用法(表1)作为修饰基础，因为在先前的研究中观察到它们在转基因拟南芥(Arabidopsis)中高表达和稳定累积(LRP和PN2S分别占可提取种子蛋白总量的3-10％和3-15％)。

与初始对应物编码相同氨基酸序列(图5和6)的经修饰的IGF-I(图3)和IGFBP-3(图4)基因由MWG生物技术公司(MWG Biotechnology Company)获得。IGF-I和IGFBP-3的密码子改变分别为28.6％和14.8％。

表1：根据LRP和PN2S序列优先化的密码子优选性的小结

设计构建物，以提高rhIGF-I和rhIGFBP-3的稳定性和产率，并控制其糖基化。加入两种蛋白质靶向信号，以将靶蛋白导向稻谷粒的特定部位中，它们或者是谷蛋白信号肽(SP)用于在高尔基体中糖基化，或者是四肽KDEL用于在内质网中稳定累积(无糖基化)。由种子特异性谷蛋白启动子(Gt-l_pro)驱动该表达构建物。嵌合基因构建物的详情如下，

IGF-I：

1)(Gt-l_pro)+SP+IGF-I^*+NOS_ter

2)(Gt-l_pro)+SP+IGF-I^*+KDEL+NOS_ter

IGFBF-3：

3)(Gt-l_pro)+SP+IGFBP-3^*+NOS_ter

4)(Gt-l_pro)+SP+IGFBP-3^*+KDEL+NOS_ter

其中*表示IGF-I或IGFBP-3的经修饰的cDNA，NOS_ter表示胭脂碱合酶终止子。

将该嵌合基因盒***超级二元载体pSB130中，并转化到土壤杆菌菌株EHA105中，该菌株非常适合感染稻愈伤组织。利用简单的冻融方法来转化土壤杆菌(如Chen，H.，等，BioTechniques(1994)16：664-668，670所述)。用抗生素潮霉素(50mg/L)选择转化的细菌，通过PCR进一步确认靶基因的DNA转化。

实施例2

稻的转化、选择和培育

切开日本稻(japonica)9983成熟种子的盾片，在愈伤组织诱导培养基(N₆基础培养基，2mg/l 2，4-D，0.5g/l酪蛋白水解，30g/l蔗糖，2.5g/l Phytagel

pH 5.8)上培养，以诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导培养基中培养4-7天后，衍生自未成熟胚胎的愈伤组织立即用于与含有靶基因的土壤杆菌EHA 105共同培养。

首先将土壤杆菌接种到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的3mlLB肉汤中，28℃过夜，然后在25ml AB培养基(3g/l K₂HPO₄、1g/l NaH₂PO₄、1g/l NH₄Cl、0.3g/l MgSO₄·7H₂O、0.15g/l KCl、10mg/l CaCl₂·2H₂O、2.5mg/lFeSO₄·7H₂O、5g/l葡萄糖、pH 7.2)中再次培养5小时，接着离心，并重悬于15-25ml AAM培养基(AA基础培养基，68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，0.5g/l酪蛋白水解物，pH 5.2，100μmol/l乙酰丁香酮)。

将稻愈伤组织浸入土壤杆菌培养物中，室温下静置10-20分钟，间歇地振荡。然后，将感染的愈伤组织转移到含有100μmol/l乙酰丁香酮的N₆D₂C培养基(N₆D₂，10g/l葡萄糖，pH 5.2)中，26-28℃避光静置3天。共同培养后，将愈伤组织放置在N₆D₂S培养基(N₆D₂，50mg/l潮霉素B，500mg/l头孢噻肟，pH 5.8)上，在26℃避光选择耐受性愈伤组织2周，接着在新N₆D₂S培养基中培养，直到出现新形成的耐受性愈伤组织。

然后，将耐受性愈伤组织放在HGPR培养基(Higrow

稻培养基(GIBCO-BRL)、50mg/l潮霉素B、200mg/l头孢噻肟)上，避光静置7天，并在光照和26℃的条件下静置7天。预先再生后，将耐受性愈伤组织转移到MSR培养基(MS基础培养基、30g/l蔗糖、0.5g/l酪蛋白水解物、2mg/l 6-BA、0.5mg/lNAA、0.5mg/l KT、pH 5.8、50mg/l潮霉素B、500mg/l头孢噻肟、2.5g/l Phytagel)中，在26℃和光照的条件下静置16小时/避光静置8小时以便再生。

出现再生的新芽后，将它们放在1/2MSH培养基(1/2MS大分子盐(macrosalt)、Fe-EDTA和小分子盐(micro salt)、MS维生素、30g/l蔗糖、0.5mg/l NAA、pH 5.8、50mg/l潮霉素B、500mg/l头孢噻肟、2.5g/l Phytagel

)上以便生根。最后，将转基因稻苗转移至土壤中，在温室中生长。

实施例3

转基因稻的分析

Southern印迹分析

分析转基因稻植株，以确认靶基因整合到稻基因组中。通过溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法提取叶基因组DNA(Doyle，J.D.等，Focus(1990)12：13-15)。用BamHI将15μg基因组DNA消化过夜，在0.8％琼脂糖凝胶上分离，并利用VacuGeneXL真空印迹***(法玛西亚生物科技公司(Pharmacia Biotech))转移到带正电的尼龙膜(罗氏公司(Roche))上。按照DIG核酸检测试剂盒(罗氏公司)所述的方法进行杂交和检测。利用DIG DNA标记试剂盒(罗氏公司)，通过PCR制备双链DIG-标记的DNA探针(IGF-I和IGFBP-3)。临用前99℃加热探针以变性。

结果证实，稻基因组中存在该构建物。

Western印迹分析

通过将种子研磨成粉末并与蛋白质提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 6.8，0.1M NaCl和10％SDS)混合，由成熟的稻种子提取总种子蛋白质。离心后，将澄清的上清液转移到新的离心管中，储存为种子总蛋白提取物。然后，在17％Tricine SDS-PAGE上分析不同量的总蛋白，并印到PVDF膜上。利用抗-人IGF-I或IGFBP-3多克隆抗体进行Western印迹分析。最后，如Aurora^TM Western印迹化学发光检测***(ICN)手册所述，用化学发光Starlight^TM底物(ICN)对该印迹进行非放射性检测。

结果证实，种子提取物中存在IGF-I和IGFBP-3蛋白。

实施例4

稻中产生的rhIGF-I的生物学活性

类似于胰岛素，IGF-I能引起肌肉细胞的膜边缘波动和葡萄糖摄入。IGFBP-3可结合于IGF-I形成ALS复合物，该复合物会抑制IGF-I引起的膜边缘波动作用。稻中产生的重组hIGF-I与胰岛素平行检测，以比较其生物学活性。

在成肌细胞单层培养物中培养表达c-myc表位标记的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的大鼠L6骨骼肌细胞(L6myc细胞)，其培养是在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％(v/v)抗生素-抗真菌药溶液(100U/ml青霉素G、10mg/ml链霉素和25mg/ml两性霉素B)的α-极限必需培养基中、5％CO₂气氛下、37℃进行的。用0.25％胰蛋白酶消化亚铺满的培养物，以便亚培养细胞。为了分化成肌管，将成肌细胞接种到含有2％(v/v)FBS的培养基中，细胞密度约为4x10⁴个细胞/毫升，以便进行自发融合。每48小时更换一次培养基，接种后5-7天使用肌管。然后使大鼠L6肌肉细胞在置入六孔板的25-mm-直径的盖玻片上生长至肌管阶段。

使肌管失去血清3小时，用不同浓度和组合的提取自转基因稻的rhIGF-I和rhIGFBP-3于37℃处理10分钟。培育后，肌管用冰冷的3％(v/v)多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，然后用0.1M甘氨酸的PBS溶液洗涤10分钟，用0.1％(v/v)曲通X-100的PBS溶液通透3分钟，然后用PBS洗涤。肌管在0.1％BSA中封闭1小时，然后在鬼笔环肽(1∶500稀释于0.1％(w/v)BSA)中培育。培育后，用PBS洗涤细胞，加入ProLong不变色溶液中滴在载玻片上。用蔡司(Zeiss)Axioplan 2成像显微镜和蔡司LSM 510 META激光扫描共聚焦显微镜(德国耶拿的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss，Jena，Germany))检测样品。

转基因IGF-I稻的粗蛋白引起L6细胞的膜边缘波动，该边缘波动作用可被市售的hIGFBP-3显著降低。这些结果见图7。如图7所示，1.25mg和5mg的IGF-1以剂量依赖方式在稻中产生边缘波动作用。这种活性被12nM浓度的市售IGFBP-3所抑制。

实施例5

稻中产生的rhIGFBP-3蛋白的抗癌活性

人IGFBP-3能抑制***-依赖性和-非依赖性乳腺癌细胞的增殖。为了检测稻中产生的rhIGFBP-3是否具有抗癌功能，使用MCF-7人乳腺癌细胞。

MCF-7人乳腺癌细胞通常在添加有1％青霉素和链霉素、0.1％两性霉素B和5％胎牛血清(FBS)的Eagle极限必需培养基中培养，培养条件是37℃和5％CO₂湿气氛。对于rhIGFBP-3处理，将MCF-7细胞接种到含有含血清培养基的96孔板中。1天后将不同浓度的由含有rhIGFBP-3的稻转化体提取的粗蛋白加入细胞中。每3天用新鲜的蛋白质提取物替代粗蛋白提取物，共替换两次。

处理7天后，收集细胞进行MTT测定。简要说，将20μl MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)溶液(5mg/ml MTT的HPBS溶液，pH 7.4)加入各孔中，再于37℃培育2小时。将100μl酸化异丙醇加入各孔中，以分解细胞并溶解结晶紫。用微孔板分光光度计测定OD₅₇₀，以确定各孔中的紫色强度。

如图8所示，浓度为1.56mg和3.125mg的稻中产生的IGFBP-3能够以剂量依赖方式提高对MCF-7细胞的生长抑制作用。

实施例6

重组产生的蛋白质的纯化

用亲和层析进一步纯化前一实施例中所述的粗提取物。将IGF-I和IGFBP-3各自施加于色谱柱，该柱偶联于各抗体进行进一步纯化。通过柱洗涤杂质，通过调节pH和盐浓度洗提蛋白质。

通过修饰实施例1的构建物以包含标记蛋白，以简化纯化过程。

实施例7

提高重组蛋白产率

由实施例2所述的植物获得种子，再种植产生第二代和第三代作物。实现了重组IGF-I和IGFBP-3的产率提高。

序列表

<110>香港中文大学(The Chinese University of Hong Kong)

<120>在转基因单子叶植物中产生重组***-I(IGF-I)

     和***结合蛋白-3(IGFBP-3)

<130>549072000540

<150>US 11/677,866

<151>2007-02-22

<150>US 60/890,828

<151>2007-02-20

<160>6

<170>用于Windows的FastSEQ，4.0版

<210>1

<211>213

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>1

ggaccggaga cgctctgcgg ggctgagctg gtggatgctc ttcagttcgt gtgtggagac 60

aggggctttt atttcaacaa gcccacaggg tatggctcca gcagtcggag ggcgcctcag 120

acaggtatgg tggatgagtg ctgcttccgg agctgtgatc taaggaggct ggagatgtat 180

tgcgcacccc tcaagcctgc caagtcagct tag                              213

<210>2

<211>795

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>2

ggcgcgagct cggggggctt gggtcccgtg gtgcgctgcg agccgtgcga cgcgcgtgca 60

ctggcccagt gcgcgcctcc gcccgccgtg tgcgcggagc tggtgcgcga gccgggctgc 120

ggctgctgcc tgacgtgcgc actgagcgag ggccagccgt gcggcatcta caccgagcgc 180

tgtggctccg gccttcgctg ccagccgtcg cccgacgagg cgcgaccgct gcaggcgctg 240

ctggacggcc gcgggctctg cgtcaacgct agtgccgtca gccgcctgcg cgcctacctg 300

ctgccagcgc cgccagctcc aggaaatgct agtgagtcgg aggaagaccg cagcgccggc 360

agtgtggaga gcccgtccgt ctccagcacg caccgggtgt ctgatcccaa gttccacccc 420

ctccattcaa agataatcat catcaagaaa gggcatgcta aagacagcca gcgctacaaa 480

gttgactacg agtctcagag cacagatacc cagaacttct cctccgagtc caagcgggag 540

acagaatatg gtccctgccg tagagaaatg gaagacacac tgaatcacct gaagttcctc 600

aatgtgctga gtcccagggg tgtacacatt cccaactgtg acaagaaggg attttataag 660

aaaaagcagt gtcgcccttc caaaggcagg aagcggggct tctgctggtg tgtggataag 720

tatgggcagc ctctcccagg ctacaccacc aaggggaagg aggacgtgca ctgctacagc 780

atgcagagca agtag                                                  795

<210>3

<211>213

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学工程改造的人IGF-1

<400>3

ggtcctgaga ccctctgcgg tgctgagctc gttgatgctc tccagttcgt ttgcggagat 60

aggggttttt acttcaacaa gccaaccgga tacggttcta gcagcagaag ggcccctcag 120

actggtatcg tggatgagtg ctgcttcagg agctgcgatc tcagaaggct cgagatgtac 180

tgcgctccac tcaagcctgc caagtccgct tga                              213

<210>4

<211>795

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>化学工程改造的人IGFBP-3

<400>4

ggagctagct ctggaggttt gggtcccgtg gttaggtgcg agccttgcga tgccagagct 60

ctcgcccagt gcgctcctcc acccgccgtg tgcgctgagc tcgtgaggga gcctggatgc 120

ggttgctgcc ttacctgcgc tctcagcgag ggacagccct gcggtatcta caccgagagg 180

tgcggttccg gtcttaggtg ccagccttct cccgatgagg ccaggcccct ccaggctctc 240

ctcgatggta gaggactctg cgttaacgct agcgccgtta gcaggctcag agcctacctc 300

ctcccagctc ctccagctcc aggaaatgct agcgagtctg aggaagatag gagcgccgga 360

agcgtggaga gcccctccgt ttccagcacc cacagggtgt ctgatcccaa gttccacccc 420

ctccactcta agattatcat catcaagaaa ggtcacgcta aggatagcca gaggtacaaa 480

gttgattacg agtctcagag cactgatacc cagaacttct cctccgagtc caagagggag 540

actgaatacg gtccctgcag gagagaaatg gaggataccc tcaatcacct caagttcctc 600

aatgtgctca gccccagggg tgttcacatt cccaactgcg ataagaaggg attttacaag 660

aaaaagcagt gcaggccttc caaaggtagg aagaggggat tctgctggtg cgtggataag 720

tacggtcagc ctctcccagg atacaccacc aagggtaagg aggatgttca ctgctacagc 780

atgcagagca agtga                                                  795

<210>5

<211>70

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>5

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

 1               5                  10                  15

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

            20                  25                  30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

        35                  40                  45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

    50                  55                  60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala

65                  70

<210>6

<211>264

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>6

Gly Ala Ser Ser Gly Gly Leu Gly Pro Val Val Arg Cys Glu Pro Cys

 1               5                  10                  15

Asp Ala Arg Ala Leu Ala Gln Cys Ala Pro Pro Pro Ala Val Cys Ala

            20                  25                  30

Glu Leu Val Arg Glu Pro Gly Cys Gly Cys Cys Leu Thr Cys Ala Leu

        35                  40                  45

Ser Glu Gly Gln Pro Cys Gly Ile Tyr Thr Glu Arg Cys Gly Ser Gly

    50                  55                  60

Leu Arg Cys Gln Pro Ser Pro Asp Glu Ala Arg Pro Leu Gln Ala Leu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Gly Arg Gly Leu Cys Val Asn Ala Ser Ala Val Ser Arg Leu

                85                  90                  95

Arg Ala Tyr Leu Leu Pro Ala Pro Pro Ala Pro Gly Asn Ala Ser Glu

            100                 105                 110

Ser Glu Glu Asp Arg Ser Ala Gly Ser Val Glu Ser Pro Ser Val Ser

        115                 120                 125

Ser Thr His Arg Val Ser Asp Pro Lys Phe His Pro Leu His Ser Lys

    130                 135                 140

Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys Asp Ser Gln Arg Tyr Lys

145                 150                 155                 160

Val Asp Tyr Glu Ser Gln Ser Thr Asp Thr Gln Asn Phe Ser Ser Glu

                165                 170                 175

Ser Lys Arg Glu Thr Glu Tyr Gly Pro Cys Arg Arg Glu Met Glu Asp

            180                 185                 190

Thr Leu Asn His Leu Lys Phe Leu Asn Val Leu Ser Pro Arg Gly Val

        195                 200                 205

His Ile Pro Asn Cys Asp Lys Lys Gly Phe Tyr Lys Lys Lys Gln Cys

    210                 215                 220

Arg Pro Ser Lys Gly Arg Lys Arg Gly Phe Cys Trp Cys Val Asp Lys

225                 230                 235                 240

Tyr Gly Gln Pro Leu Pro Gly Tyr Thr Thr Lys Gly Lys Glu Asp Val

                245                 250                 255

His Cys Tyr Ser Met Gln Ser Lys

            260

<210>7

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<220>

<221>肽

<222>(1)...(4)

<223>四肽

<400>7

Lys Asp Glu Leu

 1

Claims (18)

1.一种在单子叶植物细胞中产生蛋白质的方法，所述蛋白质是简称IGFBP-3的***结合蛋白-3，所述方法包括培养如下所述的单子叶植物细胞：该植物细胞经修饰包含用于表达编码IGFBP-3的核苷酸序列的DNA构建物，所述DNA构建物中，所述编码核苷酸序列与控制序列操作性连接以使所述编码序列在单子叶植物细胞中得以表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IGFBP-3是人蛋白。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述控制序列包含在单子叶植物种子中可操作的启动子和在单子叶植物种子中可操作的终止序列。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在N末端延伸有编码导致内质网分泌途径的信号肽的核苷酸序列。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在C末端延伸有编码内质网保留信号的核苷酸序列。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞是稻细胞。

7.一种在单子叶植物中产生IGFBP-3的方法，所述方法包括培养如下所述的转基因植物，该植物经修饰而含有表达编码IGFBP-3的核苷酸序列的DNA构建物，所述DNA构建物中，所述编码核苷酸序列与控制序列操作性连接以使所述编码序列在单子叶植物细胞中得以表达。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述IGFBP-3是人蛋白。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述控制序列包含在单子叶植物种子中可操作的启动子和在单子叶植物种子中可操作的终止序列。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在N末端延伸有编码导致内质网分泌途径的信号肽的核苷酸序列。

11.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在C末端延伸有编码内质网保留信号的核苷酸序列。

12.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述植物是稻。

13.一种在植物部分中产生IGFBP-3的方法，所述方法包括培养如下所述的植物部分，该植物部分经修饰而含有表达编码IGFBP-3的核苷酸序列的DNA构建物，所述DNA构建物中，所述编码核苷酸序列与控制序列操作性连接以使所述编码序列在单子叶植物细胞中得以表达。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述IGFBP-3是人蛋白。

15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述控制序列包含在单子叶植物种子中可操作的启动子和在单子叶植物种子中可操作的终止序列。

16.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在N末端延伸有编码导致内质网分泌途径的信号肽的核苷酸序列。

17.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述编码核苷酸序列在C末端延伸有编码内质网保留信号的核苷酸序列。

18.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述植物部分是稻的种子。

Images