CN101672818B - 检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，包括以下步骤：选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；制备糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液；制备纳米材料溶液；将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。将按上述方法制得的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极连接到电化学工作站，可对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。本发明的制备方法具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确性；所制备的分子印迹膜电极对细菌毒素具有高特异性、高灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，及采用所述的糖基功能化分子印迹膜电极检测环境样本中痕量细菌毒素的方法，属于环境污染物检测技术领域。
背景技术
细菌毒素主要有三种：外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时就具有很高的毒性。目前细菌毒素已成为迫切需要治理的新一代环境污染物，微量的细菌毒素即可对正常激素作用产生影响，干扰内分泌机能，引起哺乳动物及人类的生殖障碍、发育异常及某些病理性损伤。这类物质不仅存在于工业废水、废气和生活污水中，在农产品中也可能存在。如果细菌毒素残留不能得到及时、准确地检测，它们就可能进入机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢，给人类健康带来严重的危害。
建立一种高灵敏度和特异性的快速筛检细菌毒素残留的方法，便成为当前该研究领域亟需解决的问题之一。细菌毒素的检测分析方法主要有生物学方法，如：动物测毒法和细胞测毒法；免疫学方法，如：有反向被动血凝实验(RPHA)、被动免疫溶血试验(PIH)、毒素与抗毒素琼脂扩散试验、放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)；分子生物学方法，如：PCR法。这些检测方法虽然灵敏度较高，稳定性较好，但大多都有周期长，过程复杂，费时费力结果准确性低等缺点。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种检测速度快、灵敏度高的检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法
本发明的另一目的是提供采用上述糖基功能化分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
所述的检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；
(2)将模板分子细菌毒素、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按一定摩尔比混合均匀，制成糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液；
(3)选取纳米材料，按照现有方法制备出纳米材料溶液；
(4)利用电极表面修饰技术，将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上。
所述模板分子细菌毒素、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比为0.1～2∶2.5∶0.1～5∶40～80∶0.01～0.10∶1.0～15。
所述功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神经节苷脂或神经酰胺三己糖苷；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、杂环化合物酰胺或砜类；所述有机溶剂为二氯甲烷或四氯化碳。
所述纳米材料溶液为碳纳米管溶液、纳米金溶液或纳米铂溶液。
本发明所述将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面包括以下步骤：
(1)将工作电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再依次用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干；
(2)将制备的纳米材料溶液超声处理20-60min，得到分散的纳米溶液；
(3)将工作电极表面浸泡于分散的纳米溶液中5-10分钟，取出晾干；
(4)将步骤(3)中晾干的工作电极再浸泡于糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液中5-10分钟，然后取出用洗脱剂洗脱20-30分钟，直至去除表面的模板分子，再于室温下干燥5-10分钟；所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸；
(5)重复步骤(3)和步骤(4)过程4-7次，制得所述糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极。
为除去电极表面过量的糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物，可将制得的糖基功能化分子印迹膜电极浸入pH6.8-7.5缓冲液中，保存在4℃冰箱，12～24h后取出，用去离子水彻底清洗，即可使用。
所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。
本发明所述的采用上述糖基功能化分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法，包括以下步骤：将按上述方法制得的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。
本发明的有益效果：
1.糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极制备方法，将纳米材料的纳米增效作用引入到糖基功能化分子印迹膜电极的制备当中，使得所制备的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极具有更高的灵敏性和检测范围。
2.将表面修饰技术应用到糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备当中，使得纳米增效的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的制备具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确性。
3.本发明所得到的纳米增效的痕量糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极，可以实现对样本中细菌毒素的高特异性、高灵敏度、快速检测。
4.本发明的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极的特异性强，样品中其它非特异性分子对检测结果无影响；灵敏度高，可以达到ng级；检测速度快，完成一个基本检测过程仅需1-2分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选；成本低，检测1个样品仅需几分钱。
5.糖基功能化细菌毒素分子印迹膜电极检测细菌毒素的方法，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。
附图说明
图1为纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面过程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种检测白喉毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与白喉毒素合成糖基功能化MIPs的功能单体A-D-吡喃糖基甘露糖；
(2)碳纳米管溶液制备：在超声搅拌的条件下，将2mg多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)加入到1ml二甲基亚砜溶液中，从而获得黑色悬浊液即MWCNTs溶液；
(3)取制备好的MWCNTs溶液20μl，超声30min，得到均匀分散的MWCNTs溶液；
(4)模板分子白喉毒素，功能单体A-D-吡喃糖基甘露糖，交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔剂氯仿，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比为0.1∶2.5∶0.5∶70∶0.05∶2.0的比例混合均匀，得到白喉毒素糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将工作电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在分散的MWCNTs溶液中5分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在白喉毒素糖基功能化分子印迹聚合物溶液中5分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱工作电极表面20分钟，直至把这一层中的模板分子白喉毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在MWCNTs溶液中5分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在白喉毒素糖基功能化MIPs溶液中5分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面20分钟，直至把这一层中的模板分子白喉毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程5次。
(7)将玻璃碳电极浸入到pH 6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中12h，以便除去电极表面过量的白喉毒素糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功白喉毒素分子印迹膜修饰电极。
将制得白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的白喉毒素进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加MWCNTs溶液，制备白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站，对环境样品提取液中的白喉毒素分子进行实际检测，结果见表1。
从表1中结果可以看出：MWCNTs修饰的白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极比普通白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极(未加MWCNTs修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例2(破伤风毒素)
一种检测破伤风毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与破伤风毒素合成糖基功能化MIPs的功能单体唾液酸神经节苷脂；
(2)纳米金溶液的制备：取50mL 0.01％HAuCl4加热至沸腾，迅速加入1mL1％柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4℃冰箱保存备用；
(3)取制备好的纳米金溶液20μl，超声20min，得到均匀分散的纳米金溶液；
(4)模板分子破伤风毒素，功能单体唾液酸神经节苷脂，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，致孔剂二氯甲烷，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比0.5∶2.5∶3∶45∶0.1∶5，混合均匀，得到破伤风毒素糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在破伤风毒素糖基功能化MIPs溶液中10分钟，然后将工作电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面25分钟，直至把这一层中的模板分子破伤风毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min。再将玻璃碳电极浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在破伤风毒素糖基功能化分子印迹聚合物溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面25分钟，直至把这一层中的模板分子破伤风毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程6次。
(7)将玻璃碳电极浸入到pH 6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中18h，以便除去电极表面过量的破伤风毒素糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功破伤风毒素分子印迹膜修饰电极。
将制得破伤风毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的破伤风毒素进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加纳米金溶液，制备破伤风毒素糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站，对样品中的破伤风毒素分子进行实际检测，结果见表1。
从表2中结果可以看出：纳米金修饰的破伤风毒素糖基功能化分子印迹膜电极比普通破伤风毒素糖基功能化分子印迹膜电极(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例3(肉毒杆菌毒素)
一种检测肉毒杆菌毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与肉毒杆菌毒素合成糖基功能化MIPs的功能单体N-乙酰糖胺；
(2)纳米铂溶液的制备：取4ml 5％的H2PtCl6·6H2O溶液被加入到340ml的双蒸水中，然后在80℃下边搅拌边加热，加入60ml 1％的柠檬酸钠溶液以后，得到的溶液即纳米铂溶液在80±0.5℃，保温大约4小时，该过程通过吸附光谱记录，当PtCl6 2-的吸附带消失的时候表明反应结束，即得到纳米铂溶液；
(3)取制备好的纳米铂溶液20μl，超声40min，得到均匀分散的纳米铂溶液；
(4)模板分子肉毒杆菌毒素，功能单体N-乙酰糖胺，交联剂N、N-亚甲基二丙烯酰胺，致孔剂甲醇，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比1∶2.5∶5∶65∶0.08∶15，混合均匀，得到肉毒杆菌毒素糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在纳米铂溶液中10min，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在肉毒杆菌毒素糖基功能化MIPs溶液中10min，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱工作电极表面20min，直至把这一层中的模板分子肉毒杆菌毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在纳米铂溶液中10min，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在肉毒杆菌毒素类糖基功能化分子印迹聚合物溶液中10min，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面20min，直至把这一层中的模板分子肉毒杆菌毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程7次。
(7)将(6)中制备的电极浸入到pH7.2的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中24h，以便除去电极表面过量的肉毒杆菌毒素糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功肉毒杆菌毒素分子印迹膜修饰电极。
将制得肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中肉毒杆菌毒素进行检测。结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加纳米铂溶液，制备肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站，对环境样品提取液中肉毒杆菌毒素分子进行实际检测，结果见表1。
从表3中结果可以看出：纳米铂修饰的肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹膜电极比普通肉毒杆菌毒素糖基功能化分子印迹膜电极(未加纳米铂修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例4(志贺氏毒素)
一种检测志贺氏毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与志贺氏毒素合成糖基功能化MIPs的功能单体神经酰胺三己糖苷；
(2)纳米铂溶液的制备：取4ml 5％的H2PtCl6·6H2O溶液加入到340ml的双蒸水中，然后在80℃下边搅拌边加热，加入60ml 1％的柠檬酸钠溶液以后，得到的溶液即纳米铂溶液；在80±0.5℃，保温大约4小时，该过程通过吸附光谱记录，当PtCl6 2-的吸附带消失的时候表明反应结束，即得到纳米铂溶液；
(3)取制备好的纳米铂溶液20μl，超声40min，得到均匀分散的纳米铂溶液；
(4)模板分子志贺氏毒素，功能单体神经酰胺三己糖苷，交联剂3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸，致孔剂异丙醇，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷按摩尔比0.8∶2.5∶1∶80∶0.1∶12，混合均匀，得到志贺氏毒素糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在纳米铂溶液中10分钟，然后将工作电极取出在室温下干燥8min，再将玻璃碳电极浸泡在志贺氏毒素糖基功能化MIPs溶液中8分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面，直至把这一层中的模板分子志贺氏毒素分子完全洗掉，在室温下干燥8min，再将玻璃碳电极浸泡在纳米铂溶液中8分钟，然后将电极取出在室温下干燥8min，再将电极浸泡在志贺氏毒素糖基功能化MIPs溶液中8分钟，然后将电极取出，用乙腈和乙酸混合液洗脱电极表面55分钟，直至把这一层中的模板分子志贺氏毒素分子完全洗掉，在室温下干燥8min。如此循环，重复上述过程5次。
(7)将(6)中制备的电极浸入到pH7.5的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中22h，以便除去电极表面过量的志贺氏毒素糖基功能化分子印迹聚合物，当工作电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功志贺氏毒素分子印迹膜修饰电极。
将制得志贺氏毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中志贺氏毒素进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加纳米铂溶液，制备志贺氏毒素糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站，对环境样品提取液中志贺氏毒素分子进行实际检测，结果见表1。
从表4中结果可以看出：纳米铂修饰的志贺氏毒素糖基功能化分子印迹膜电极比普通志贺氏毒素糖基功能化分子印迹膜电极(未加纳米铂修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例5(中毒性休克毒素1)
一种检测中毒性休克毒素1的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与中毒性休克毒素1分子合成糖基功能化MIPs的功能单体N-乙酰乳糖胺；
(2)纳米金溶液的制备：取50mL 0.01％HAuCl4加热至沸腾，迅速加入1mL1％柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4℃冰箱保存备用；
(3)取制备好的纳米金溶液20μl，超声50min，得到均匀分散的纳米金溶液；
(4)按摩尔比0.5∶2.5∶3∶40∶0.08∶2.2称取模板分子中毒性休克毒素1，功能单体N-乙酰乳糖胺，交联剂季戊四醇三丙烯酸酯，致孔剂砜类，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到中毒性休克毒素1糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在中毒性休克毒素1分子糖基功能化MIPs溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面25min，直至把这一层中的模板分子中毒性休克毒素1分子完全洗掉，在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在中毒性休克毒素1分子糖基功能化MIPs溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱工作电极表面25分钟，直至把这一层中的模板分子中毒性休克毒素1分子分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程6次。
(7)将(6)中制备的电极浸入到pH 6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中过夜，以便除去电极表面过量的中毒性休克毒素1分子糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功中毒性休克毒素1分子印迹膜修饰电极。
将制得中毒性休克毒素1糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的中毒性休克毒素1进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加纳米金溶液，制备中毒性休克毒素1糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站进行实际检测，结果见表1。
从表5中结果可以看出：纳米金修饰的中毒性休克毒素1糖基功能化分子印迹膜电极比普通中毒性休克毒素1糖基功能化分子印迹膜电极(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例6(链球菌致热外毒素)
一种检测有链球菌致热外毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与链球菌致热外毒素分子合成糖基功能化MIPs的功能单体N-乙酰糖胺；
(2)碳纳米管溶液的制备：在超声搅拌的条件下，将2mg MWCNTs加入到1ml二甲基亚砜溶液中，从而获得黑色悬浊液即MWCNTs溶液；
(3)取制备好的MWCNTs溶液20μl，超声60min，得到均匀分散的MWCNTs溶液；
(4)按摩尔比为2∶2.5∶4∶60∶0.03∶15称取模板分子链球菌致热外毒素，功能单体N-乙酰糖胺，交联剂二乙烯基苯(DVB)，致孔剂二氯甲烷，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到链球菌致热外毒素糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/LNaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在MWCNTs溶液中5分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在链球菌致热外毒素糖基功能化MIPs溶液中5分钟，然后将电极取出，用乙腈-乙酸洗脱电极表面20min，直至把这一层中的模板分子链球菌致热外毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在MWCNTs溶液中5分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在链球菌致热外毒素糖基功能化MIPs溶液中5分钟，然后将电极取出，用乙腈-乙酸混合液洗脱工作电极表面20分钟，直至把这一层中的模板分子链球菌致热外毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程5次。
(7)将(6)中制备的电极浸入到pH 7.5的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中12h，以便除去电极表面过量的链球菌致热外毒素糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功链球菌致热外毒素分子印迹膜修饰电极。
将制得的链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中链球菌致热外毒素进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加MWCNTs溶液，制备链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站，对环境样品提取液中链球菌致热外毒素进行实际检测，结果见表1。
从表6中结果可以看出：MWCNTs修饰的链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹膜电极比普通链球菌致热外毒素糖基功能化分子印迹膜电极(未加MWCNTs修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例7(霍乱毒素)
一种检测霍乱毒素的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与霍乱毒素分子合成糖基功能化MIPs的功能单体唾液酸神经节苷脂；
(2)纳米金溶液的制备：取50mL 0.01％HAuCl4加热至沸腾，迅速加入1mL1％柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4℃冰箱保存备用；
(3)取制备好的纳米金溶液20μl，超声50min，得到均匀分散的纳米金溶液；
(4)按摩尔比0.2∶2.5∶2∶50∶0.06∶10称取模板分子霍乱毒素，功能单体唾液酸神经节苷脂，交联剂季戊四醇三丙烯酸酯，致孔剂杂环化合物酰胺，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到霍乱毒素糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在霍乱毒素糖基功能化MIPs溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面25min，直至把这一层中的模板分子霍乱毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在霍乱毒素糖基功能化MIPs溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱工作电极表面25分钟，直至把这一层中的模板分子霍乱毒素分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程7次。
(7)将(6)中制备的电极浸入到pH 7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中20h，以便除去电极表面过量的霍乱毒素糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功霍乱毒素分子印迹膜修饰电极。
将制得的霍乱毒素糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中霍乱毒素进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加纳米金溶液，制备霍乱毒素糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站进行实际检测，结果见表1。
从表1中结果可以看出：纳米金修饰的霍乱毒素糖基功能化分子印迹膜电极比普通霍乱毒素糖基功能化分子印迹膜电极(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例8(绿脓杆菌外毒素a)
一种检测绿脓杆菌外毒素a的糖基功能化分子印迹膜电极制备方法，包括以下步骤：
(1)选择能与绿脓杆菌外毒素a合成糖基功能化MIPs的功能单体神经酰胺三己糖苷；
(2)纳米金溶液的制备：取50mL 0.01％HAuCl4加热至沸腾，迅速加入1mL1％柠檬酸钠溶液还原，所制备亮玫红色即纳米金溶液，放入4℃冰箱保存备用；
(3)取制备好的纳米金溶液20μl，超声50min，得到均匀分散的碳纳米管溶液；
(4)按摩尔比0.5∶2.5∶3∶40∶0.1∶1.5称取模板分子绿脓杆菌外毒素a，功能单体神经酰胺三己糖苷，交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，致孔剂二氯甲烷，引发剂偶氮二异丁腈，有机溶剂二氯甲烷，混合均匀，得到绿脓杆菌外毒素a糖基功能化MIPs溶液；
(5)工作电极选用玻璃碳电极，将电极表面用0.05μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再分别用1mol/L HNO3，1mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干，保证电极表面光亮无杂质；
(6)如图1所示将玻璃碳电极表面浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在绿脓杆菌外毒素a糖基功能化MIPs溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面20min，直至把这一层的模板分子绿脓杆菌外毒素a分子完全洗掉，在室温下干燥10min，再将玻璃碳电极浸泡在纳米金溶液中10分钟，然后将电极取出在室温下干燥10min，再将电极浸泡在绿脓杆菌外毒素a MIPs溶液中10分钟，然后将电极取出，用甲醇和乙酸混合液洗脱电极表面20分钟，直至把这一层中的模板分子绿脓杆菌外毒素a分子完全洗掉，在室温下干燥10min。如此循环，重复上述过程5次。
(7)将(6)中制备的电极浸入到pH 6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液中，保存在4℃的冰箱中16h，以便除去电极表面过量的绿脓杆菌外毒素a糖基功能化MIPs，当电极用去离子水彻底清洗以后，制备成功绿脓杆菌外毒素a分子印迹膜修饰电极。
将制得的绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中绿脓杆菌外毒素a进行检测，结果见表1。
利用上述同样方法，但电极表面未加纳米金溶液，制备绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹膜电极，连接电化学工作站，对环境样品提取液中绿脓杆菌外毒素a分子进行实际检测，结果见表1。
从表1中结果可以看出：纳米金修饰的绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹膜电极比普通绿脓杆菌外毒素a糖基功能化分子印迹膜电极(未加纳米金修饰)具有更快的响应时间、更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
表1本发明白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极与普通白喉毒素糖基功能化分子印迹膜电极检测效果对比
Claims (7)
1.一种检测细菌毒素的纳米增效糖基功能化分子印迹膜电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 选择能与细菌毒素合成糖基功能化分子印迹聚合物的功能单体；
(2) 将细菌毒素的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按一定摩尔比混合均匀，制成糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液；
(3) 选取纳米材料，按照现有方法制备出纳米材料溶液；
(4) 利用电极表面修饰技术，将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面上；
所述功能单体为Α-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神经节苷脂或神经酰胺三已糖苷；
所述细菌毒素的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂的摩尔比为0.1～2∶2.5∶0.1～5∶40～80∶0.01～0.10∶1.0～15。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、杂环化合物酰胺或砜类；所述有机溶剂为二氯甲烷或四氯化碳。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述纳米材料溶液为碳纳米管溶液、纳米金溶液或纳米铂溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述将纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物修饰到传感器电极表面包括以下步骤：
(1) 将工作电极表面用0.05 μm的氧化铝粉打磨，超声波清洗，再依次用1 mol/L HNO3，1 mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗数次，吹干；
(2) 将制备的纳米材料溶液超声处理20-60min，得到分散的纳米溶液；
(3) 将工作电极表面浸泡于分散的纳米溶液中5-10分钟，取出晾干；
(4) 将步骤(3)中晾干的工作电极再浸泡于糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物溶液中5-10分钟，然后取出用洗脱剂洗脱20-30分钟，直至去除表面的模板分子，再于室温下干燥5-10分钟；
(5) 重复步骤(3)和步骤(4)过程4-7次，制得所述糖基功能化分子印迹膜电极。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：将制得的糖基功能化分子印迹膜电极浸入pH6.8-7.5缓冲液中，保存在4℃冰箱，12~24h后取出，用去离子水彻底清洗。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸；所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。
7.一种检测痕量细菌毒素的方法，其特征在于包括以下步骤：将按权利要求1~6任意一种方法制得的糖基功能化分子印迹膜电极连接到电化学工作站，对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。
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| 张丽芬.分子印迹技术及其在痕量分析的应用.《河北北方学院院报（自然科学版）》.2005,第21卷(第3期),第13-17页. * |
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