CN101671627A - 一种玻璃化冷冻承载器及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保存生物物质的玻璃化冷冻承载器及其使用方法，所述玻璃化冷冻承载器包括内微管(3)、内帽(1)、内环(4)、薄膜(2)、外管(7)、外管孔(6)和外帽(5)，其中，所述内微管(3)上端开口与内帽(1)相连并穿过内帽(1)使其开口与外界相通且由外帽(5)封闭，内微管(3)下端开口与内环(4)相连。本发明承载器避免了生物物质与液氮的直接接触，减少液氮污染；且操作迅速、安全和便捷。

Description

一种玻璃化冷冻承载器及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种保存生物物质的冷冻承载器及其使用方法，具体涉及一种保存生物物质的玻璃化冷冻承载器及其使用方法。

背景技术

目前，用于保存生物物质的玻璃化冷冻承载器有多种，如Cryoloop，Cryoleaf，Cryotip，electron microscopic grid等，其应用效果相似，但是都有一个共同的缺点，就是不能隔离液氮。将细胞装入承载器后，细胞直接与液氮接触，容易造成液氮污染以及液氮与样品之间的交叉污染。目前，本领域技术人员对玻璃化承载器作了很多尝试，如用拉长的脉管或玻璃毛细管用作细胞或胚胎的承载器，虽然取得了一定的成功，但还是不能完全解决冷冻速率以及液氮污染等问题。

发明内容

针对以上技术缺陷，本发明涉及一种新的保存生物物质的玻璃化冷冻承载器，所述玻璃化冷冻承载器包括内微管3、内帽1、内环4、薄膜2、外管7、外管孔6和外帽5；其中，所述内微管3其上端开口与内帽1相连并穿过内帽1使其开口与外界相通且由外帽5封闭，内微管3下端开口与内环4相连。

本发明玻璃化冷冻承载器，所述薄膜2密闭内环4或密闭内微管3和内环4，或者与内环4为统一整体，其中本发明优选薄膜2密闭内微管3和内环4；薄膜2与内帽1可以相连也可以不相连。

其中，所述薄膜2为透明、高韧性、高热传导性的薄膜，具体如聚乙烯、聚丙烯薄膜，聚氟乙烯薄膜。本发明玻璃化冷冻承载器中，所述内微管3的内径为140-450μm，内微管3的长度为2cm-4cm。

本发明玻璃化冷冻承载器中，所述内环4的形状为密闭型的圆形、密闭型的椭圆形、密闭型的水滴形或者半开口弓形。密闭型内环即内环正好与内管形成统一的整体，没有断口；半开口弓形即其中一端与内管相连，另外一端与内管不相连，利用弓形材料的韧性使薄膜撑开。

本发明玻璃化冷冻承载器中，所述内帽1的直径大于外管7的内径且小于外管7的外径。

本发明玻璃化冷冻承载器中，所述外管7上端开有外管孔6，用以渗入液氮。

本发明玻璃化冷冻承载器中，所述内微管3、内帽1、外管7及外帽5由透明、耐超低温或具有高热传导性的材料制成，如聚氟管、聚碳酸酯管。

内环4由金属丝制成，例如铜丝、钢丝或者铂金丝等；本发明内环4也可以由其它的具有一定强度的丝状材料诸如塑料丝或者尼龙丝等制成。

本发明还提供一种玻璃化冷冻承载器的使用方法，所述方法包括如下步骤：

1)用拉细的巴斯德滴管或毛细管将生物物质8连带少量冷冻液通过内微管3放置于内环4内，然后用盖上内帽1；

2)将带有生物物质的内微管3、内环4、内帽1浸入液氮容器中的液氮中，其中内帽1的上端部分不完全浸入液氮，之后将外管7也浸入该液氮中，在该液氮中将带有生物物质的内微管3、内环4、内帽1装入外管7中，盖上外帽5，并于液氮中保存。

本发明中，所述生物物质为各种类型的细胞或者胚胎，或者直径大小为100-300μm的组织块。

本发明方法中，由于液体和薄膜之间的表面张力使得生物物质被紧夹于两层薄膜之间，并使得生物物质周围所含的液体量达到最少。

本发明玻璃化冷冻承载器避免了生物物质与液氮直接接触，减少了液氮污染，且操作迅速、安全和便捷；另外，采用本发明方法保存生物物质，由于液体与膜之间的表面张力，使得玻璃化冷冻时生物物质周围含有最少量的冷冻液，无需精确控制置于环上液体的量，提高了冷冻效果。

附图说明

图1为玻璃化冷冻承载器的结构示意图；

图2为玻璃化冷冻承载器的局部示意图。

具体实施方式

下面结合附图和优选实施例对本实用新型作进一步的说明，但本发明并不仅受其限制：

如图1和图2所示的一种玻璃化冷冻承载器，图2为玻璃化冷冻承载器的局部结构示意图。该承载器包括内微管3、内帽1、内环4、薄膜2、外管7及外帽5。其中，内微管3上端开口与内帽1相连并穿过内帽1使其开口与外界相通且由外帽5封闭，内微管3下端开口与内环4相连，环内中央为生物物质8；薄膜2封闭内微管3和内环4，外管7中充满液氮9，并在外管7的上部开有外管孔6。

实施例1：将人***置于玻璃化承载器中的冷冻

(1)将2-3枚人***在成分为改良人输卵管液(mHTF)+20％血清替代物(sss)+7.5％乙二醇(EG)+7.5％二甲基亚砜(DMSO)的液体中处理4-5分钟后，转移至最终冷冻液(mHTF+20％sss+15％EG+15％DMSO+0.5M蔗糖(Sucrose)中；

(2)将***连带少量的冷冻液一起吸入外径180±20μm、内径160±20μm的巴斯德滴管内；

(3)将拉细的巴斯德滴管头部沿着内径为220μm内微管3***密闭内环4内，并将***及少量的冷冻液置于环内聚乙烯薄膜2上；

(4)将带有***的内环4、内微管3及内帽1部分浸入液氮容器中的液氮中，其中内帽1的上端部分不完全浸入液氮，之后将外管7也浸入该液氮中，在该液氮中将带有生物物质的内微管3、内环4、内帽1装入外管7中，盖上外帽5，液氮中进行保存。

实施例2：人8-细胞胚胎半开口弓形内环内玻璃化冷冻

(1)将2-3枚人8-细胞胚胎在成分为mHTF+20％sss+7.5％EG+7.5％PROH(1，2丙二醇)的液体中处理4-5分钟后，转移至最终冷冻液(mHTF+20％sss+15％EG+15％PROH+0.5M Sucrose)中；

(2)将胚胎连带少量的冷冻液一起吸入外径180±20μm、内径160±20μm的巴斯德滴管内；

(3)将拉细的巴斯德滴管头部沿着内径为220μm的内微管3***半开口弓形内环4内，并将胚胎及少量的冷冻液置于环内聚丙烯薄膜2上；

(4)将带有胚胎的内环4、内微管3及内帽1部分浸入液氮容器中的液氮中，之后将外管7也浸入该液氮中，在该液氮中将带有生物物质的内微管3、内环4、内帽1装入外管7中，盖上外帽5，液氮中进行保存。

Claims (10)

1.一种玻璃化冷冻承载器，其特征在于，所述承载器包括内微管(3)、内帽(1)、内环(4)、薄膜(2)、外管(7)、外管孔(6)和外帽(5)。

2.根据权利要求1所述的承载器，其特征在于，所述内微管(3)上端开口与内帽(1)相连并穿过内帽(1)使其开口与外界相通且由外帽(5)封闭，内微管(3)下端开口与内环(4)相连。

3.根据权利要求2所述的承载器，其特征在于，所述薄膜(2)密闭内环(4)、或密闭内微管(3)和内环(4)，或者与内环(4)为统一整体。

4.根据权利要求3所述的承载器，其特征在于，所述内微管(3)的长度为2-4cm；内微管(3)的内径为140-450μm。

5.根据权利要求4所述的承载器，其特征在于，所述内环(4)的形状为密闭型的圆形、密闭型的椭圆形、密闭型的水滴形或者半开口弓形。

6.根据权利要求5所述的承载器，其特征在于，所述内帽(1)的直径大于外管(7)的内径且小于外管(7)的外径。

7.根据权利要求6所述的承载器，其特征在于，所述外管(7)上端开有外管孔(6)。

8.根据权利要求7所述的承载器，其特征在于，所述薄膜(2)为具有透明、高韧性、高热传导性的薄膜。

9.根据权利要求8所述的承载器，其特征在于，所述内微管(3)、内帽(1)、外管(7)及外帽(5)由透明、耐超低温或具有高热传导性的材料制成；内环(4)由金属丝、塑料丝或者尼龙丝制成。

10.权利要求1-9任一项所述玻璃化冷冻承载器的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用拉细的巴斯德滴管或毛细管将生物物质连带少量冷冻液通过内微管(3)放置于内环(4)内，然后用盖上内帽(1)；

2)将带有生物物质的内微管(3)、内环(4)、内帽(1)浸入液氮，之后将外管(7)浸入液氮中，在液氮中将带有生物物质的内微管(3)、内环(4)、内帽(1)装入外管(7)中，盖上外帽(5)，并于液氮中保存。

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