CN101661003B - 一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除h2o2能力的测定方法 - Google Patents

Abstract

一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法，将金纳米颗粒(GNPs)与氨基化的SiO₂胶体溶液混合经静电吸附作用得SiO₂/GNPs复合物颗粒，H₂O₂能够将氯金酸还原成金纳米颗粒并沉积在SiO₂/GNPs复合物颗粒表面，形成完整的金纳米壳，若先将不同浓度的抗氧化剂与H₂O₂混合反应，那么剩余的H₂O₂还原氯金酸后只能形成包覆不完整的金纳米壳，通过紫外-可见分光光度计对SiO₂/GNPs复合物颗粒和包覆程度不一的金纳米壳进行表征，比较它们的最大吸收波长，可得不同浓度抗氧化剂对H₂O时的浓度，取倒数即为清除H₂O₂能力的大小。本发明基于SiO₂/GNPs复合物颗粒长大过程中光学性质的变化，操作简便且检测灵敏度高。

Description

一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法

技术领域

本发明属于纳米生物分析技术领域，特别涉及一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法。

背景技术

机体代谢过程中活性氧物种(ROS)不断地通过非酶促反应和酶促反应产生，在正常生理情况下，ROS的生成与清除处于动态平衡，可维持有利无害的极低水平。由于内源性或外源性刺激使机体代谢异常而产生大量ROS，或机体抗氧化物质不足，使促氧化剂/抗氧化剂间平衡失常，则使机体处于氧化应激状态，可氧化损伤生物分子，并进一步引起细胞死亡和组织损伤，与很多疾病过程相关。由此可见，抗氧化剂对于ROS的清除能力是将其维持在一个较低水平，不会对人体产生健康威胁的重要考察指标。H₂O₂是一种重要的活性氧物种，它在人体生理条件下可通过多种过氧化物酶体产生，如葡萄糖氧化酶、D-氨基酸氧化酶等。此外，超氧自由基在超氧化物岐化酶的催化作用下也可产生H₂O₂。H₂O₂和超氧阴离子自由基(O₂ ^·-)一起可导致细胞损伤，并进一步转变成其他ROS，如羟自由基(OH)等。H₂O₂作为活性氧物种的重要组成部分，抗氧化剂对其清除能力的大小是评价蔬菜、水果及保健品等对人体健康和保健功效的重要指标，同时也是蔬菜、水果及保健品在生产和保存过程中质量评价的重要指标。目前，现有的评价抗氧化剂清除H₂O₂能力的方法主要包括以下几种：(1)利用H₂O₂本身在230nm处的紫外吸收现象，当存在抗氧化剂时，其吸收峰强度明显减弱。但由于待测样品在该波长处也有可能存在吸收峰，就降低了该检测方法的准确性。(2)H₂O₂可以在辣根过氧化物酶的作用下将7-羟基-6-甲氧基香豆素氧化成一种非荧光产物，当存在H₂O₂清除剂时，7-羟基-6-甲氧基香豆素的氧化被抑制，并且这种清除能力可以通过荧光光度计来检测。另一种广泛使用的荧光光度法基于homovanillic acid(HVA)在H₂O₂和辣根过氧化物酶的作用下形成一种稳定的具有荧光效应的联苯二聚体，而H₂O₂清除剂的存在会阻碍HVA的氧化。这类基于过氧化物酶的方法对于抗氧化剂是直接与H₂O₂反应还是与H₂O₂和酶反应的中间产物相作用不能做出明确的判定。此外，某些抗氧化剂，如抗坏血酸、栎精二水合物、硫醇等本身即是过氧化物酶的底物，那么对于其清除H₂O₂的能力也会产生错误的评价。(3)一种非酶的过氧草酸脂类化学发光检测法。该方法利用H₂O₂和咪唑催化的芳香草酸脂的氧化形成一种高能量的中间产物dioxetanedione，它再将能量传递给荧光团9，10-diphenylanthracene，该荧光团从激发态回到基态的过程即以光的形式释放出能量。当反应体系中存在清除H₂O₂的化合物时，该化学发光反应将会被抑制，可通过荧光计来定量检测。该反应是在非极性环境中进行的，因此该方法通常被用来检测亲脂性抗氧化剂清除H₂O₂的能力。该方法的主要缺陷在于被用作荧光团的9，10-diphenylanthracene是一种致癌物。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便且检测灵敏度高的基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明所述的测定抗氧化剂清除H₂O₂能力的方法，即利用在H₂O₂介导金纳米壳形成体系中加入抗氧化剂后光谱性质的变化来测定抗氧化剂清除H₂O₂的能力。

本发明所述的测定抗氧化剂清除H₂O₂能力的方法，即：

1.氨基化SiO₂胶体微球，再吸附金纳米颗粒(GNPs)形成SiO₂/GNPs复合物颗粒。

2.选择反应体系终浓度为200μM的H₂O₂和不同浓度的抗氧化剂混合反应，再加入SiO₂/GNPs复合物颗粒和氯金酸，SiO₂/GNPs复合物颗粒浓度为6.7×10^-11M，氯金酸浓度为3.3×10^-4M，混合搅拌。

3.利用加入抗氧化剂前后混合液中SiO₂/GNPs复合物颗粒光谱性质的变化来计算抗氧化剂清除H₂O₂的能力。

本发明具体采用如下技术方案来解决所提出的技术问题：

一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法，步骤为：

1.将金纳米颗粒与氨基化的SiO₂胶体溶液混合、搅拌，所加的金纳米颗粒的量应使金纳米颗粒在氨基化的SiO₂小球表面的覆盖率理论计算值不少于30％，金纳米颗粒通过静电吸附作用吸附于氨基化的SiO₂胶体颗粒表面，得SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液，在对SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液进行离心处理后，除去上层未被吸附的金纳米颗粒，再在除去未被吸附的金纳米颗粒后的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液中加纯水稀释，并使沉淀分散于纯水中得到纯化的SiO₂/GNPs复合物颗粒，SiO₂/GNPs复合物颗粒在稀释后的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液中的浓度为2×10¹⁰个/mL～2×10¹²个/mL；

2.在0.01M的磷酸盐缓冲溶液中加入碳酸钾作为反应体系的稳定剂和质量体积比浓度为1％的氯金酸溶液，磷酸盐缓冲溶液、碳酸钾及氯金酸溶液的体积mL、质量mg、体积mL比为20～500∶5～125∶0.3～7.5，搅拌均匀，于4℃陈化至少24h，得到碳酸钾做稳定剂的氯金酸溶液；

3.在0.01M的磷酸盐缓冲溶液中加入待检测的抗氧化剂与H₂O₂，(待检测的抗氧化剂在反应体系中的摩尔浓度为3μM～1200μM，H₂O₂在反应体系中的摩尔浓度为50μM～500μM)，磷酸盐缓冲溶液、待检测的抗氧化剂及H₂O₂的体积比为0.6～15∶0.02～0.5∶0.04～1，混合并反应1～5min后，再向其中加入SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液和步骤2所得的碳酸钾做稳定剂的氯金酸溶液，此时SiO₂/GNPs复合物颗粒在反应体系中的终摩尔浓度为1.34×10^-11M～13.4×10^-11M，氯金酸的终摩尔浓度为0.66×10^-4M～6.6×10^-4M，反应2～20min，剩余的H₂O₂将氯金酸还原成金纳米颗粒并沉积在SiO₂/GNPs复合物颗粒表面，形成包覆不完整的金纳米壳；将上述反应形成的包覆不完整的金纳米壳在紫外分光光度计下进行表征，记录包覆不完整的金纳米壳水溶液的最大吸收波长，记为W₁；将不加抗氧化剂时由相同浓度H₂O₂制备得到的金纳米壳水溶液的最大吸收波长记为W；将不加抗氧化剂和H₂O₂时相同浓度SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液的最大吸收波长记为W₀，通过公式

计算得该浓度的抗氧化剂对H₂O₂的清除率百分数；

4.根据步骤3计算所得的抗氧化剂对H₂O₂的清除率数值大小，通过增加和/或减小抗氧化剂的浓度，得到不少于4个不同浓度的抗氧化剂，分别重复步骤3，计算得不同浓度下抗氧化剂对H₂O₂的清除率，以所得到的抗氧化剂对H₂O₂的清除率中最小值为下限、最大值为上限，构成抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围，如果抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围不能覆盖抗氧化剂的IC₅₀值，即抗氧化剂清除50％H₂O₂所需要的浓度，则重复步骤4，直到IC₅₀值落入抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围；

5.根据步骤3-步骤4得到的抗氧化剂对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的抗氧化剂浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时抗氧化剂的浓度为c，单位为M，c即为所选抗氧化剂的IC₅₀值，将c取倒数，即1/c为抗氧化剂清除H₂O₂能力的大小，单位为M^-1。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明在紫外-可见分光光度计的操作下即可完成，操作简便，不需要复杂的仪器设备。

2.实验操作过程中不涉及酶反应，实验原理明确，也不涉及有毒有害致癌物质等，对于环境和人体不会产生任何危害作用。

3.实验成本低，所需试剂均为实验室常见试剂，纳米材料的制备方便，单个反应只需几分钟即可完成，操作时间短。

4.本发明中将金纳米壳的等离激元共振吸收峰波长用于检测信号，与以往将吸光度作为检测信号的光学测定方法相比，峰波长从可见光区迁移至近红外区域，迁移量大，检测更加灵敏，从说明书附图的图4单宁酸检测实例中可以看出，从a～g的光谱变化中，吸收峰的峰波长迁移了大约220nm，而吸光度的迁移值只有0.523。

5.由于峰波长的变化对应于溶液颜色的明显变化，而之前以吸光度作为检测信号的方法中，溶液颜色变化不明显，故该方法还可用于定性的可视化检测中。

6.本发明对于水溶性和脂溶性抗氧化剂均适用，检测范围广泛。

附图说明

图1是实验过程原理示意图。

图2是抗氧化剂清除H₂O₂能力计算原理图。

图3是6种抗氧化剂对H₂O₂的清除率与浓度关系曲线图。

图4是反应体系中加入不同浓度单宁酸后的紫外-可见光谱图(a：SiO₂/GNPs，b-g：单宁酸浓度依次减小从200μM～0μM)。

图5是(a)SiO₂/GNPs复合物颗粒的TEM图及(b)-(d)是反应体系中加入不同浓度单宁酸后SiO₂/GNPs复合物颗粒生长状态的TEM图，(b)200μM，(c)25μM，(d)0μM。

图6是实验步骤示意图。

具体实施方式

实施例1

一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法，步骤为：

1.将金纳米颗粒与氨基化的SiO₂胶体溶液混合、搅拌，所加的金纳米颗粒的量应使金纳米颗粒在氨基化的SiO₂小球表面的覆盖率理论计算值不少于30％，例如：本实施例分别选择30％、50％、70％、90％，金纳米颗粒通过静电吸附作用吸附于氨基化的SiO₂胶体颗粒表面，得SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液，在对SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液进行离心处理后，除去上层未被吸附的金纳米颗粒，再在除去未被吸附的金纳米颗粒后的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液中加纯水稀释，并使沉淀分散于纯水中得到纯化的SiO₂/GNPs复合物颗粒，SiO₂/GNPs复合物颗粒在稀释后的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液中的浓度为2×10¹⁰个/mL～2×10¹²个/mL，例如，本实施例分别稀释到2×10¹⁰个/mL、1×10¹¹个/mL、5×10¹¹个/mL、2×10¹²个/mL；

2.在0.01M的磷酸盐缓冲溶液中加入碳酸钾作为反应体系的稳定剂和质量体积比浓度为1％的氯金酸溶液，磷酸盐缓冲溶液、碳酸钾及氯金酸溶液的体积mL、质量mg、体积mL比为20～500∶5～125∶0.3～7.5，例如，本实施例分别选择20∶5∶0.3，100∶25∶1.5，200∶75∶5，500∶125∶7.5，搅拌均匀，于4℃陈化至少24h，例如，本实施例分别选择24h、36h、48h，60h，得到碳酸钾做稳定剂的氯金酸溶液；

3.在0.01M的磷酸盐缓冲溶液中加入待检测的抗氧化剂与H₂O₂，(待检测的抗氧化剂在反应体系中的摩尔浓度为3μM～1200μM，例如，本实施例分别选择3μM、200μM、500μM、1200μM，H₂O₂在反应体系中的摩尔浓度为50μM～500μM，例如，本实施例分别选择50μM、100μM、200μM、500μM)，磷酸盐缓冲溶液、待检测的抗氧化剂及H₂O₂的体积比为0.6～15∶0.02～0.5∶0.04～1，例如，本实施例分别选择0.6∶0.02∶0.04，1∶0.1∶0.06，3∶0.2∶0.1，15∶0.5∶1，混合并反应1～5min后，例如，本实施例分别选择1min，2min，3min，5min，再向其中加入SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液和步骤2所得的碳酸钾做稳定剂的氯金酸溶液，此时SiO₂/GNPs复合物颗粒在反应体系中的终摩尔浓度为1.34×10^-11M～13.4×10^-11M，例如，本实施例分别选择1.34×10^-11M，5×10^-11M，10×10^-11M，13.4×10^-11M，氯金酸的终摩尔浓度为0.66×10^-4M～6.6×10^-4M，例如，本实施例分别选择0.66×10^-4M，2×10^-4M，4×10^-4M，6.6×10^-4M，反应2～20min，例如，本实施例分别选择2min，5min，10min，20min，剩余的H₂O₂将氯金酸还原成金纳米颗粒并沉积在SiO₂/GNPs复合物颗粒表面，形成包覆不完整的金纳米壳；将上述反应形成的包覆不完整的金纳米壳在紫外分光光度计下进行表征，记录包覆不完整的金纳米壳水溶液的最大吸收波长，记为W₁；将不加抗氧化剂时由相同浓度H₂O₂制备得到的金纳米壳水溶液的最大吸收波长记为W；将不加抗氧化剂和H₂O₂时相同浓度SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液的最大吸收波长记为W₀，通过公式

计算得该浓度的抗氧化剂对H₂O₂的清除率百分数；

4.根据步骤3计算所得的抗氧化剂对H₂O₂的清除率数值大小，通过增加和/或减小抗氧化剂的浓度，得到不少于4个不同浓度的抗氧化剂，分别重复步骤3，计算得不同浓度下抗氧化剂对H₂O₂的清除率，以所得到的抗氧化剂对H₂O₂的清除率中最小值为下限、最大值为上限，构成抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围，介于0-100％之间，如果抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围不能覆盖抗氧化剂的IC₅₀值，则重复步骤4，直到IC₅₀值落入抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围；

5.根据步骤3-步骤4得到的抗氧化剂对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的抗氧化剂浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时抗氧化剂的浓度为c，单位为M，c即为所选抗氧化剂的IC₅₀值，将c取倒数，即1/c为抗氧化剂清除H₂O₂能力的大小，单位为M^-1。

实施例2

1.金纳米颗粒(GNPs)的制备

利用还原氯金酸的方法制备金纳米颗粒。将1g氯金酸溶于100mL纯水中，得1％氯金酸水溶液，4℃冷藏。取200mL预冷的纯水，加入3mL浓度为1％的氯金酸水溶液和1mL浓度为0.2M的碳酸钾水溶液，搅拌混匀，再向其中迅速加入9mL浓度为0.5mg/mL的硼氢化钠水溶液，混合溶液由深褐色变为酒红色，即得粒径在5nm左右的金纳米颗粒。再搅拌10min，将制备得到的金纳米颗粒水溶液置于4℃冷藏保存。

2.SiO₂胶体的氨基化

取40mL浓度为0.013g/mL的SiO₂醇溶胶，向其中加入60μL的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于70℃下搅拌反应3h，反应结束后，将上述溶液置于离心管中，以10000rpm离心20min，取底部SiO₂溶质，加无水乙醇超声分散，以上步骤重复3次，以除去多余的APTES。

3.SiO₂/GNPs复合物颗粒的制备

取500μL氨基化的SiO₂醇溶胶，加入20mL无水乙醇稀释，将稀释后的SiO₂醇溶胶逐滴加入200mL金纳米颗粒中，约30min滴完，不断搅拌，带负电荷的金纳米颗粒通过静电作用吸附于带正电荷的SiO₂小球表面，形成SiO₂/GNPs复合物颗粒，继续搅拌1h后，将上述混合液置于离心管中，以3000rpm离心20min，取底部SiO₂/GNPs复合物颗粒，加纯水超声分散，以上步骤重复3次，得纯化的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液。

4.K₂CO₃/HAuCl₄混合溶液的配制

取100mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，向其中加入25mg K₂CO₃，搅拌10min，再向其中加入1.5mL浓度为1％的氯金酸溶液，搅拌20min后置于4℃陈化至少24h后使用。

5.阿魏酸清除H₂O₂能力的测定

取3mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，向其中加入0.1mLH₂O₂和0.2mL阿魏酸，H₂O₂在反应体系中的终浓度为200μM，阿魏酸在反应体系中的终浓度为3μM，搅拌2min，再分别向其中加入0.5mL SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液和3mL K₂CO₃/HAuCl₄混合溶液，反应5min，剩余的H₂O₂将氯金酸还原成金纳米颗粒并沉积在SiO₂/GNPs复合物颗粒表面，形成包覆不完整的金纳米壳。反应后溶液用紫外-可见分光光度计进行表征，最大吸收波长记为W₁。参比实验将0.2mL的阿魏酸替换为0.2mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，其余不变，由相同浓度H₂O₂制备得到的金纳米壳水溶液的最大吸收波长记为W。对照实验将0.1mL的H₂O₂和0.2mL的阿魏酸替换为0.3mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，其余不变，记录相同浓度SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液的最大吸收波长为W₀。利用公式

计算得3μM的阿魏酸对H₂O₂的清除率百分数为14.3％。

增加阿魏酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为5μM，10μM，50μM，100μM。其余操作步骤同上，计算得5μM，10μM，50μM，100μM的阿魏酸对H₂O₂的清除率百分数分别为27.4％，65.9％，83.4％，90.1％。

6.根据上述实验得到的不同浓度阿魏酸对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的阿魏酸浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时阿魏酸的浓度为8μM，即阿魏酸的IC₅₀值为8μM，将IC₅₀值取倒数，得12.5×10^-2μM^-1，即为阿魏酸清除H₂O₂能力的大小。

实施例3

1.同实施例2步骤1。

2.同实施例2步骤2。

3.同实施例2步骤3。

4.同实施例2步骤4。

5.酒石酸清除H₂O₂能力的测定

选择酒石酸在反应体系中的终浓度为1200μM，其余实验操作步骤同实施例2步骤5，计算得1200μM的酒石酸对H₂O₂的清除率百分数为92.5％。减小酒石酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为800μM，400μM，200μM，50μM。重复以上操作步骤，计算得800μM，400μM，200μM，50μM的酒石酸对H₂O₂的清除率百分数分别为90.1％，62.9％，36.7％，9.1％。

6.根据上述实验得到的不同浓度酒石酸对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的酒石酸浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时酒石酸的浓度为273μM，即酒石酸的IC₅₀为273μM，将IC₅₀值取倒数，得0.36×10^-2μM^-1，即为酒石酸清除H₂O₂能力的大小。

实施例4

1.同实施例2步骤1。

2.同实施例2步骤2。

3.同实施例2步骤3。

4.同实施例2步骤4。

5.柠檬酸清除H₂O₂能力的测定

选择柠檬酸在反应体系中的终浓度为100μM，其余实验操作步骤同实施例2步骤5，计算得100μM的柠檬酸对H₂O₂的清除率百分数为48.7％。增加、减小柠檬酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为400μM，150μM，20μM，5μM。重复以上操作步骤，计算得400μM，150μM，20μM，5μM的柠檬酸对H₂O₂的清除率百分数分别为92.7％，76.1％，22.2％，3.4％。

6.根据上述实验得到的不同浓度柠檬酸对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的柠檬酸浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时柠檬酸的浓度为106μM，即柠檬酸的IC₅₀为106μM，将IC₅₀值取倒数，得0.94×10^-2μM^-1，即为柠檬酸清除H₂O₂能力的大小。

实施例5

1.同实施例2步骤1。

2.同实施例2步骤2。

3.同实施例2步骤3。

4.同实施例2步骤4。

5.水杨酸清除H₂O₂能力的测定

选择水杨酸在反应体系中的终浓度为10μM，其余实验操作步骤同实施例2步骤5，计算得10μM的水杨酸对H₂O₂的清除率百分数为1.2％。增加水杨酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为20μM，50μM，100μM，200μM。重复以上操作步骤，计算得20μM，50μM，100μM，200μM的水杨酸对H₂O₂的清除率百分数分别为3.2％，7.6％，12.3％，21.8％。

水杨酸对H₂O₂的清除率范围没有覆盖IC₅₀值，继续增加水杨酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为400μM，600μM，800μM，重复以上实验操作步骤，计算得400μM，600μM，800μM的水杨酸对H₂O₂的清除率百分数分别为45.3％，68.7％，90.5％。

6.根据上述实验得到的不同浓度水杨酸对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的水杨酸浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时水杨酸的浓度为470μM，即水杨酸的IC₅₀为470μM，将IC₅₀值取倒数，得0.21×10^-2μM^-1，即为水杨酸清除H₂O₂能力的大小。

实施例6

1.同实施例2步骤1。

2.同实施例2步骤2。

3.同实施例2步骤3。

4.同实施例2步骤4。

5.单宁酸清除H₂O₂能力的测定

选择单宁酸在反应体系中的终浓度为200μM，其余实验操作步骤同实施例2步骤5，计算得200μM的单宁酸对H₂O₂的清除率百分数为88.1％。减小单宁酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为100μM，50μM，25μM，10μM。重复以上操作步骤，计算得100μM，70μM，50μM，25μM的单宁酸对H₂O₂的清除率百分数分别为87.5％，86.2％，85.2％，79.1％。单宁酸对H₂O₂的清除率范围没有覆盖IC₅₀值，继续减小单宁酸的浓度，使其在反应体系中的终浓度分别为10μM，5μM，3μM，重复以上实验操作步骤，计算得10μM，5μM，3μM的单宁酸对H₂O₂的清除率百分数分别为64.7％，53.3％，38.6％。

6.根据上述实验得到的不同浓度单宁酸对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的单宁酸浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时单宁酸的浓度为7μM，即单宁酸的IC₅₀为7μM，将IC₅₀值取倒数，得14.28×10^-2μM^-1，即为单宁酸清除H₂O₂能力的大小。

验证例

1.金纳米颗粒(GNPs)的制备

利用还原氯金酸的方法制备金纳米颗粒。将1g氯金酸溶于100mL纯水中，得1％氯金酸水溶液，4℃冷藏。取200mL预冷的纯水，加入3mL浓度为1％的氯金酸水溶液和1mL浓度为0.2M的碳酸钾水溶液，搅拌混匀，再向其中迅速加入9mL浓度为0.5mg/mL的硼氢化钠水溶液，混合溶液由深褐色变为酒红色，即得粒径在5nm左右的金纳米颗粒。再搅拌10min，将制备得到的金纳米颗粒水溶液置于4℃冷藏保存。

2.SiO₂胶体的氨基化

取40mL浓度为0.013g/L的SiO₂醇溶胶，向其中加入60μL的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于70℃下搅拌反应3h，反应结束后，将上述溶液置于离心管中，以10000rpm离心20min，取底部SiO₂溶质，加无水乙醇超声分散，以上步骤重复3次，以除去多余的APTES。

3.SiO₂/GNPs复合物颗粒的制备

取500μL氨基化的SiO₂醇溶胶，加入20mL无水乙醇稀释，将稀释后的SiO₂醇溶胶逐滴加入200mL金纳米颗粒中，约30min滴完，不断搅拌，带负电荷的金纳米颗粒通过静电作用吸附于带正电荷的SiO₂小球表面，形成SiO₂/GNPs复合物颗粒，继续搅拌1h后，将上述混合液置于离心管中，以3000rpm离心20min，取底部SiO₂/GNPs复合物颗粒，加纯水超声分散，以上步骤重复3次，得纯化的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液。

4.K₂CO₃/HAuCl₄混合溶液的配制

取100mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，向其中加入25mg K₂CO₃，搅拌10min，再向其中加入1.5mL浓度为1％的氯金酸溶液，搅拌20min后置于4℃陈化至少24h后使用。

5.阿魏酸清除H₂O₂能力的测定

取3mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，向其中加入0.1mLH₂O₂和0.2mL阿魏酸，H₂O₂在反应体系中的终浓度为200μM，阿魏酸在反应体系中的终浓度依次为3μM，5μM，10μM，50μM，100μM，搅拌2min，再分别向其中加入0.5mL SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液和3mL K₂CO₃/HAuCl₄混合溶液，反应5min，剩余的H₂O₂将氯金酸还原成金纳米颗粒并沉积在SiO₂/GNPs复合物颗粒表面，形成包覆不完整的金纳米壳。反应后溶液用紫外-可见分光光度计进行表征，最大吸收波长记为W₁。参比实验将0.2mL的阿魏酸替换为0.2mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，其余不变，由相同浓度H₂O₂制备得到的金纳米壳水溶液的最大吸收波长记为W。对照实验将0.1mL的H₂O₂和0.2mL的阿魏酸替换为0.3mL浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，其余不变，记录相同浓度SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液的最大吸收波长为W₀。利用公式

计算得3μM，5μM，10μM，50μM，100μM浓度的阿魏酸对H₂O₂的清除率百分数。

将各阿魏酸浓度所对应的清除率百分数利用ORIGIN绘图软件绘制曲线，如说明书附图的图3中阿魏酸数据曲线图所示。其相应的可检测浓度范围，IC₅₀值和H₂O₂清除能力值如表1中阿魏酸数据所示。阿魏酸的IC₅₀值和H₂O₂清除能力值分别为8μM和12.5×10^-2μM^-1。

现有一种采用过氧草酸脂类化学发光法来检测抗氧化剂清除H₂O₂能力的方法，该方法检测原理在于：H₂O₂能够在荧光团的作用下将一种芳香草酸脂类化合物氧化形成芳香草酸脂/荧光团复合物，在这个过程中将一个电子转移给一种高能中间产物，然后，这个电子又被转移给荧光团使它处于一种高能激发态，从而产生化学发光现象，发光强度可通过荧光强度检测，当反应体系中含有抗氧化剂时，一部分H₂O₂被清除，发光强度被抑制。利用该方法检测出来的阿魏酸清除50％H₂O₂所需要的浓度，即IC₅₀值为10.37μM，H₂O₂清除能力值为9.7×10^-2μM^-1。与我们的检测方法相比较，首先两种检测方法的检测原理是不一样的，现有方法是基于化学激发发光，而我们的方法是基于纳米材料的光学吸收特性；其次，具体操作步骤和反应条件也是完全不一样的，两种方法得出来的数据不可能完全一致。因此，虽然最终数据结果有差异，但是仍然在实验允许的变化范围之内。说明我们的方法是正确的，有效的。

表16种抗氧化剂可检测浓度范围，IC₅₀值和H₂O₂清除能力值

对比实验：

1.本实验方法：由于我们将金纳米颗粒的生长置于SiO₂小球的表面，形成了一种纳米级的核壳结构，在金纳米颗粒的生长过程中，除了吸光度的变化，波长也在几百纳米范围内迁移，我们首次采用波长的变化做为光学检测信号，当H₂O₂在反应体系中的终浓度在0-200μM之间变化时，波长迁移了约220nm，即每变化1μM的H₂O₂浓度，波长变化约1.1nm，一般紫外-可见分光光度计的参数设置中，波长的分辨率最小可达到0.1nm，也就是说若采用波长做为检测信号，是完全可以分辨出每1μM的H₂O₂浓度所引起的波长变化值的。

2.现有方法：将制备好的金纳米颗粒做为种子在溶液中继续生长，也采用H₂O₂做为反应体系的还原剂，现有方法将金纳米颗粒生长过程中吸光度的变化做为光学检测信号，实验操作中当H₂O₂在反应体系中的终浓度在0-600μM之间变化时，吸光度变化了约0.55，即每变化1μM的H₂O₂浓度，吸光度变化值约为0.00092，一般紫外-可见分光光度计的参数设置中，吸光度的分辨率最小可达到0.001，也就是说若采用吸光度做为检测信号，是无法分辨出每1μM的H₂O₂浓度所引起的吸光度变化值的。

Claims (1)

1.一种基于金纳米壳的抗氧化剂清除H₂O₂能力的测定方法，其特征在于，步骤为：

1)将金纳米颗粒与氨基化的SiO₂胶体溶液混合、搅拌，所加的金纳米颗粒的量应使金纳米颗粒在氨基化的SiO₂小球表面的覆盖率理论计算值不少于30％，金纳米颗粒通过静电吸附作用吸附于氨基化的SiO₂胶体颗粒表面，得SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液，在对SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液进行离心处理后，除去上层未被吸附的金纳米颗粒，再在除去未被吸附的金纳米颗粒后的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液中加纯水稀释，并使沉淀分散于纯水中得到纯化的SiO₂/GNPs复合物颗粒，SiO₂/GNPs复合物颗粒在稀释后的SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液中的浓度为2×10¹⁰个/mL～2×10¹²个/mL；

2)在0.01M的磷酸盐缓冲溶液中加入碳酸钾作为反应体系的稳定剂和质量体积比浓度为1％的氯金酸溶液，磷酸盐缓冲溶液、碳酸钾及氯金酸溶液的体积mL、质量mg、体积mL比为20～500∶5～125∶0.3～7.5，搅拌均匀，于4℃陈化至少24h，得到碳酸钾做稳定剂的氯金酸溶液；

3)在0.01M的磷酸盐缓冲溶液中加入待检测的抗氧化剂与H₂O₂，待检测的抗氧化剂在反应体系中的终摩尔浓度为3μM～1200μM，H₂O₂在反应体系中的终摩尔浓度为50μM～500μM，磷酸盐缓冲溶液、待检测的抗氧化剂及H₂O₂的体积比为0.6～15∶0.02～0.5∶0.04～1，混合并反应1～5min后，再向其中加入SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液和步骤2)所得的碳酸钾做稳定剂的氯金酸溶液，此时SiO₂/GNPs复合物颗粒在反应体系中的终摩尔浓度为1.34×10^-11M～13.4×10^-11M，氯金酸的终摩尔浓度为0.66×10^-4M～6.6×10^-4M，反应2～20min，剩余的H₂O₂将氯金酸还原成金纳米颗粒并沉积在SiO₂/GNPs复合物颗粒表面，形成包覆不完整的金纳米壳；将上述反应形成的包覆不完整的金纳米壳在紫外分光光度计下进行表征，记录包覆不完整的金纳米壳水溶液的最大吸收波长，记为W₁；将不加抗氧化剂时由相同浓度H₂O₂制备得到的金纳米壳水溶液的最大吸收波长记为W；将不加抗氧化剂和H₂O₂时相同浓度SiO₂/GNPs复合物颗粒水溶液的最大吸收波长记为W₀，通过公式

计算得该浓度的抗氧化剂对H₂O₂的清除率百分数；

4)根据步骤3)计算所得的抗氧化剂对H₂O₂的清除率数值大小，通过增加和/或减小抗氧化剂的浓度，得到不少于4个不同浓度的抗氧化剂，分别重复步骤3)，计算得不同浓度下抗氧化剂对H₂O₂的清除率，以所得到的抗氧化剂对H₂O₂的清除率中最小值为下限、最大值为上限，构成抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围，如果抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围不能覆盖抗氧化剂的IC₅₀值，则重复步骤4)，直到IC₅₀值落入抗氧化剂对H₂O₂的清除率范围；

5)根据步骤3)-步骤4)得到的抗氧化剂对H₂O₂的清除率数据，采用ORIGIN绘图软件，绘制出H₂O₂的清除率与相应的抗氧化剂浓度的关系曲线，并从图中读出清除率为50％时抗氧化剂的浓度为c，单位为M，c即为所选抗氧化剂的IC₅₀值，将c取倒数，即1/c为抗氧化剂清除H₂O₂能力的大小，单位为M^-1。

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