CN101660000A - Hbv ymdd突变、前c区突变/bcp区突变和基因分型一体化检测dna微阵列芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列基因芯片。本发明采用固相载体基片，针对HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变位点和HBV基因型设计寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以一次性同时检测三项指标，并可以同时检测多个样本，将广泛应用于临床HBV感染治疗过程中的个体化用药指导。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列基因芯片。本发明采用固相载体基片，针对HBVYMDD突变、前C区/BCP区突变位点和HBV基因型设计寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以一次性同时检测三项指标，并可以同时检测多个样本，将广泛应用于临床HBV感染治疗过程中的个体化用药指导。
背景技术
乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。世界上有20亿人感染过HBV，目前慢性HBV感染患者至少有3.8亿，其中慢性HBV携带者75％分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.5亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年死亡的人已近50万。随着分子生物学的应用和发展，HBV DNA定性定量检测已常规应用于临床，以决定用药选择和疗效监测。但乙肝病毒具有高复制率(1012-13病毒粒/天)高突变率(1010-11点突变/天)特点，高突变是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。乙肝病毒这种高突变性造成乙肝病毒在治疗中产生种种困难。HBV基因组多态性和编码区基因突变是影响乙肝诊断、治疗和预后判断的重要因素，目前已受到临床上高度重视。对HBV基因组多态性研究主要集中在三个方面：HBV基因分型、HBV YMDD突变相关点突变、HBV前C区/BCP区突变。
拉米夫定(Lamivudine，LAM)是当前乙肝病毒治疗广泛应用的核苷类似物，它能显著降低乙肝病毒DNA水平，并可使ALT正常化和肝组织改善。其作用机理是抑制乙肝病毒的逆转录和复制。但在LAM长期治疗中，乙肝病毒会发生变异，产生耐药，其机理是LAM作用位点(YMDD)发生突变。迅速及时地检测乙肝病毒的YMDD突变，特别是能检测少量YMDD突变，可以帮助医生及时改变用药，防止拉米夫定出现严重的耐药性，减少由YMDD突变株引起的症状恶化。在乙肝患者接受治疗前检测聚合酶区基因突变可以决定治疗方案，如果发生变异，则不宜用拉米夫定治疗，治疗后每三个月检测一次变异情况，如果变异，则要调整用药，可以考虑联合或更换阿德福韦继续治疗。
乙型肝炎病毒(HBV)感染血清标志物5项检测(乙型肝炎两对半检测)是HBV免疫学检测的金标准，以往观念认为HBeAg是HBV复制的标志，抗-HBe转为阳性被认为疾病基本进入稳定阶段。然而，研究表明，不少血清HBeAg阴性而抗-HBe阳性患者含有较高水平的HBV-DNA，在部分HBeAg阴性患者中，前C区/BCP区A1896(nt1896G→A)变异、密码28终止变异，导致产生HBeAg合成和分泌的障碍，但是HBV仍在复制，A1899(nt1899G→A)变异常和A1896相伴出现，提示病毒有较高的复制水平和传染性。HBVC基因启动子(BCP)T1762、A1764(nt1762A→T、nt1764G→A)联合突变，可使HBeAg表达降低，和前C区/BCP区A1896变异协同影响血清学转换。此外，这些突变和干扰素的疗效及机体免疫应答关系密切，研究发现，T1762、A1764双变异与活动性肝脏炎症和肝功能损害程度相关，基因突变加剧了肝脏的纤维化和癌变的进程，可作为预后的评价指标。
乙肝病毒由于基因组变异和进化，可以分为不同的基因型。根据HBV全基因核苷酸序列异源性8％或S基因区核苷酸序列异源性4.2％，HBV基因型可分为A、B、C、D、E、F、G、H 8个型。HBV基因型的分布有明显的地域特征，欧美以A、D型为主，我国以及东南亚国家则以B、C型为主。研究发现，C型HBV感染者肝脏受损较严重，而B型感染者中年以前容易发展成肝细胞肝癌；C型HBV在肝硬化患者中的比例要比年龄相当的无症状携带者高得多，而且C型感染者发展至晚期肝病者显著多于B型感染者；C型HBV在年长人群中的感染率比较低，而B型在各年龄组的患病率相对恒定；另外，观察到B型病毒感染和50岁以下患者较早发生肝癌显著相关，C型病毒感染则和50岁以上患者肝癌的发病显著相关。不同基因型对治疗药物的反应也存在差异。α-干扰素对A型的治疗效果比D/E型好。B型和C型相比，C型干扰素治疗效果差，含C型的患者血清中ALT值高，比B型更易发生核心启动子序列突变，并且对α-干扰素治疗敏感性降低，而B型对α-干扰素有更好的应答。HBV基因型有明确的地域性分布的特征，且与临床表现、肝损害程度、病毒感染的状态、预后(如慢性、肝硬化和癌变倾向)存在密切相关性，基因型分析将会对乙肝的诊断、治疗和预后判断发挥积极的作用。
综上所述，乙肝的耐药性突变、前C区/BCP区突变和基因分型检测具有重要临床意义，是乙肝治疗过程中不可缺少的检测项目。
目前，乙肝病毒耐药性突变检测试剂国内有厂家生产和销售，但乙肝病毒前C区/BCP区突变和基因分型检测试剂空缺；由于技术方法的局限，国内外均没有HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型三种检测一次性完成的一体化试剂，往往要多个试剂盒多次检测才能完成，繁杂又耗资耗时。
基因微阵列芯片技术，具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，应用到HBV三项指标多样本一次检测，从而解决了传统方法的缺陷。
本发明针对我国目前乙肝防治现状，研制了一种操作简单、准确可靠、可以HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型三种指标一次检测的产品，并能够一次性检测多个样本。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，克服现有技术的缺陷和不足，以及现有HBV检测产品不成体系的状况，制造具有高通量、高准确性的DNA微阵列芯片，可以一次性对多个样本同时进行HBV YMDD突变、前C突变和基因分型检测。
因此，本发明的目的是制备一种HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列基因芯片。
为此，本发明采用以下技术方案：采用固相载体基片，针对HBV YMDD突变、前C突变和基因分型分别设计的特异性的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，配以特殊PCR***，使得每张芯片可以一次性同时检测多个样本的HBV上述三项指标。
根据本发明一个优选的实施方案，针对HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型的相应目标基因序列，设计一套特异性寡核苷酸探针(见表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制10个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片，一张芯片可以检测8个临床样本以及阳性和阴性对照各一个。
根据本发明另一个优选的实施方案，在上述的DNA微阵列芯片的基础上再配以其它必要的组份，如PCR引物(见表2)，即组成完整的产品。在实际检测时，取8份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，在一管多重PCR体系中，扩增出HBV YMDD突变、前C突变和基因分型的CY3标记靶标片段。取DNA微阵列芯片一张，在10个杂交区分别加入8个样本PCR产物和阴阳性对照PCR产物2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度设定为55℃，杂交时间30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix 4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本检测结果。
根据本发明另一个优选的实施方案，DNA微阵列芯片的片基载体可以是玻片、尼龙膜或其它可以附着探针的载体。
表1寡核苷酸探针序列以及所对应的功能(特异性)
表2引物序列以及功能(特异性)
| 名称 | 序列(5’-3’) | 序列号 | 特异性 |
| P1 | AGTATGCCCTGAGCCTGAG | SEQ ID NO：43 | HBV基因分型上游引物 |
| P2 | TTTTTCCCGATCATCAGTTG | SEQ ID NO：44 | HBV基因分型下游引物，CY3标记 |
| P3 | TTTTTTCCCGACCACCAGT | SEQ ID NO：45 | HBV基因分型下游引物，CY3标记 |
| P4 | TAGACTCGTGGTGGACTTCTCT | SEQ ID NO：46 | HBV YMDD突变检测上游引物 |
| P5 | GACGTGCAGAGGTGAAGCGAAGT | SEQ ID NO：47 | HBV YMDD突变检测上游引物 |
| P6 | AGCCTTRTAAGTTGGCGAG | SEQ ID NO：48 | HBV YMDD突变检测下游引物，CY3标记 |
| P7 | GGCATACTTCAAAGACTG | SEQ ID NO：49 | HBV前C/BCP区突变检测上游引物 |
| P8 | CTCCAAATTCTTTATAAG | SEQ ID NO：50 | HBV前C/BCP区突变检测下游引物，CY3标记 |
附图说明
图1HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列芯片
1芯片整体外观(示意图)
2杂交区以及探针微阵列(示意图)
图2芯片矩阵中探针排列图
其中：PRC1-HBV分型阳性对照探针
PRC-2-HBV分型阴性对照探针
PRC-3-HBV YMDD突变阳性对照探针
PRC-4-HBV YMDD突变阴性对照探针
PRC-5-HBV前C区/BCP区突变阳性对照探针
PRC-6-HBV前C区/BCP区突变阴性对照探针
图3D型；YVDD感染(LAM耐药)；nt1762T/nt1764A，nt1896A/nt1899G样本检测结果扫描图(示意图)
图4HBV D基因型样品的检测结果扫描图(示意图)
图5HBV YVDD感染(LAM耐药)突变样本检测结果扫描图(示意图)
图6nt1762T/nt1764A，nt1896A/nt1899G HBV前C区/BCP区突变样本检测结果扫描图(示意图)
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：HBV YMDD突变、前C区/BCP突变和基因分型一体化检测DNA微阵列芯片PCR引物和探针的设计
(1)HBV分型：设计上游引物一条，下游引物2条，下游引物CY3荧光标记，采用不对称PCR扩增体系；设计HBV A、B、C、D分型的特异性探针15条，涵盖这四个型别。
(2)HBVYMDD突变：为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的目的基因，从Gene Bank中调出A～H型乙型肝炎病毒全基因组DNA序列，针对乙型肝炎病毒逆转录酶基因在核苷酸类似物药物选择压力下易于变异的位点，采用primerpremier5.0和oligo6.0软件分别设计正向引物2条，反向引物一条，反向引物CY3荧光标记，采用不对称PCR反应体系，扩增杂交模板；在HBV YMDD耐药突变点基因序列区域，设计21条野生型和突变性特异探针，涵盖所有目标突变点。
(3)HBV前C区/BCP区突变：为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的乙型肝炎病毒(HBV)基因，从Gene Bank中调出乙型肝炎病毒(HBV)基因DNA序列，针对包含编码乙型肝炎病毒(HBV)基因第1762位、1764位、1896位和1899位核苷酸的多态性位点序列，按照引物设计的一般性原则，并采用PrimerExpress2.0、primer premier5.0等软件分别设计正反向2条引物，反向引物CY3荧光标记，采用不对称PCR体系扩增突变区目标模板；针对影响HBV e抗原表达的基因第1762、1764和1896、1899位核苷酸相对应的多态性位点，设计6条探针特异性探针，涵盖HBV基因组nt1762、nt1764和nt1896、nt1899位核苷酸相对应的多态性位点。
实施例2：HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列芯片的制备
采用基因芯片自动点样仪，将42条检测探针和6条对照探针(对照探针是分别针对三个检测目标保守区设计的阳性和阴性对照探针)，点制到玻片的特定区域，制成DNA微阵列。
点样探针溶液：将探针稀释到5×SSC、0.05％SDS溶液中，终浓度为30μM；
点样矩阵：(参见附图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复2点点制在杂交区内，每行12点，共8行，96个点；杂交区分成10个区，可以同时检测8份样本(9、10杂交区为对照区)。
实施例3：使用本发明产品检测8份临床样本
取8份样本和2份对照，提取病毒DNA，先进行DNA测序，确定HBV分型、耐药和前C区/BCP区突变结果，再使用本发明产品检测验证。
采用本发明的DNA微阵列芯片对以上8份样本进行一次性检测。取10管多重PCR反应液，分别加入10管提取的DNA，5ul/管，总反应体系50ul，PCR循环参数为：94℃5’；94℃30”，55℃30”，72℃30”，45循环；72℃5’。
取一张微阵列芯片，分别取10管PCR产物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入杂交液(5×SSC)8μl，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度50℃，杂交时间40分钟。杂交后自动洗涤和风干。
采用GenePix 4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。采用分析软件，自动将以上数据自动分析转换成检测结果，结果与样本测序结果完全相符。见表3。
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检测8个样本，可以同时检测样本HBV基因型、YMDD耐药突变、前C区/BCP区及BCP区突变)和检测准确性方面的可靠性(检测结果与样本测序结果完全相符)。
表3本次检测结果与样本测序结果的比较
序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
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<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>41
gctttagggcatgg
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>42
gctttaggacatgga
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>43
agtatgccctgagcctgag
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>44
tttttcccgatcatcagttg
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>45
ttttttcccgaccaccagt
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>46
tagactcgtggtggacttctct
<210>47
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>47
gacgtgcagaggtgaagcgaagt
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>48
agccttrtaagttggcgag
<210>49
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>49
ggcatacttcaaagactg
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400>50
ctccaaattctttataag
Claims (5)
1、一种DNA微阵列芯片，采用DNA微阵列基因芯片技术，对HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因型进行一体化检测，其特征在于将将一组HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和HBV基因型特异性寡核苷酸探针，点制在载体上，制成DNA微阵列芯片，再配以PCR引物以及其它组分，组成完整的试剂盒。
2、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于：(1)设计HBV分型上游引物一条，下游引物2条；(2)针对乙型肝炎病毒逆转录酶基因在核苷酸类似物药物选择压力下易于变异的位点，设计正向引物2条，反向引物一条；(3)针对包含编码乙型肝炎病毒(HBV)基因第1762位、1764位、1896位和1899位核苷酸的多态性位点序列，设计正、反向引物各一条，以上引物序列分别是：
3、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于：其中采用42条寡核苷酸探针，点制在载体上，制成DNA微阵列，用于与样本PCR产物的杂交反应，42条寡核苷酸探针的序列分别是：
4、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于其中寡核苷酸探针点样的载体可以是玻片、尼龙膜或者其它可以固着探针的载体。
5、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片，其特征还在于主要应用于临床HBV感染治疗过程中的个体化用药指导。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810198008A CN101660000A (zh) | 2008-08-27 | 2008-08-27 | Hbv ymdd突变、前c区突变/bcp区突变和基因分型一体化检测dna微阵列芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810198008A CN101660000A (zh) | 2008-08-27 | 2008-08-27 | Hbv ymdd突变、前c区突变/bcp区突变和基因分型一体化检测dna微阵列芯片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101660000A true CN101660000A (zh) | 2010-03-03 |
Family
ID=41788254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200810198008A Pending CN101660000A (zh) | 2008-08-27 | 2008-08-27 | Hbv ymdd突变、前c区突变/bcp区突变和基因分型一体化检测dna微阵列芯片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101660000A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102140534A (zh) * | 2010-12-15 | 2011-08-03 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种hbv基因的核苷酸突变位点的检测方法 |
| CN103451319A (zh) * | 2013-08-22 | 2013-12-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | Hbv b 基因型1799g>c 突变作为分子标记的应用及试剂盒 |
| CN105358715A (zh) * | 2013-07-03 | 2016-02-24 | 伊鲁米那股份有限公司 | 正交合成测序 |
-
2008
- 2008-08-27 CN CN200810198008A patent/CN101660000A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN105358715A (zh) * | 2013-07-03 | 2016-02-24 | 伊鲁米那股份有限公司 | 正交合成测序 |
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| CN103451319A (zh) * | 2013-08-22 | 2013-12-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | Hbv b 基因型1799g>c 突变作为分子标记的应用及试剂盒 |
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