CN101657469A - 抗igf-1r的新抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合IGF－1R特别是hIGF－1R。还公开了包含本发明抗体或抗原结合片段的抗体制剂。制备此类抗体或抗原结合片段的方法以及它们的应用也包含在本发明范围内。

Description

抗IGF-1R的新抗体
本发明涉及特异结合人***受体(hIGF-1R)的抗体及其抗原结合片段。本发明还涉及以所述抗体及其抗原结合片段、包含所述抗体及其抗原结合片段的药物组合物治疗疾病或疾患的方法和制造方法。
背景技术
人***受体(也被称为IGF-1R、CD221或EC 2.7.112)是一种与胰岛素受体具有70％同源性的酪氨酸激酶受体。该受体被两个以高亲和力结合到该受体的配体IGF-I和IGF-II活化。该受体是二硫键连接的αβ二聚体，表示为(αβ)2。α-链全部位于细胞外，而β-链则横跨细胞膜，并具有胞外域和胞内信号传导域。配体介导的受体活化引发胞内事件，包括MAPK和PI3K-蛋白激酶B途径的活化。尽管已知IGF-1R在正常的胚胎和出生后的生长发育中具有重要作用，但它在癌症生物学中也发挥重要作用，参与许多生物途径，例如有丝***发生、转化和凋亡保护(Baserga等人(1997)Endocrine，7(1)：99-102，Baserga(2003)Int JCancer，107(6)：873-7；Larsson等人(2005)Br J Cancer，92(12)：2097-101；Romano(2003)Drug News Perspect，16(8)：525-31进行了广泛的综述)。而且，已知受体表达水平在各种肿瘤类型中上调(Khandwala等人(2000)Endocr Rev.，21(3)：215-44综述)，并且配体IGF-I水平升高与发生***癌的风险升高有联系(Chan等人(1998)Science，279(5350)：563-6)。
已知IGF-1R信号传导途径的拮抗剂具有体外和体内的抗肿瘤效应(Hofmann等人(2005)Drug Discov Today，10(15)：1041-7和Zhang等人(2004)Expert Opin Investig Drugs，13(12)：1569-77综述)。方法包括中和抗体(参阅Kull等人(1983)J Biol Chem.，258(10)：6561-6；Li等人(1993)Cancer Immunol Immunother.，49(4-5)：243-52；Xiong等人(1992)Proc NatlAcad Sci U S A.，89(12)：5356-60；Burtrum等人(2003)Cancer Res.，63(24)：8912-21；Cohen等人(2005)Clin Cancer Res.，11(5)：2063-73；Maloney等人(2003)Cancer Res.，63(16)：5073-83；Jackson-Booth等人(2003)Horm Metab Res.，35(11-12)：850-6)、反义(参阅Resnicoff等人(1994)Cancer Res.，54(18)：4848-50；Lee等人(1996)Cancer Res.，56(13)：3038-41；Muller等人(1998)Int J Cancer.，77(4)：567-71；Trojan等人(1993)Science，259(5091)：94-7；Shapiro等人(1994)J Clin Invest.，94(3)：1235-42)、显性失活突变体(Prager等人(1994)Proc Natl Acad Sci US A.，91(6)：2181-5)和小分子酪氨酸激酶抑制剂(参阅Hopfner等人(2006)Biochem Pharmacol.2006，71(10)：1435-48和IGF-结合蛋白(IGFBPs-参阅Nickerson等人(1997)Biochem Biophys Res Commun.，237(3)：690-3))。已知的单克隆抗体包括WO99/60023、WO03/100008、WO02/053596、WO04/071529、EP0629240B、WO03/059951、WO03/106621、WO04/083248、WO04/087756、US2006452167A所描述的单克隆抗体。但是，仍需要具有改进的效应子功能例如具有改进的ADCC和/或CDC功能的抗体。
抗体结构为本领域所熟知，特别是已知重链恒定区具有糖基化的糖链，它可为N-糖苷连接的糖链例如N-乙酰葡糖胺，它可被岩藻糖基化或不被岩藻糖基化。
测量岩藻糖基化水平的方法为本领域熟知，例如对于一个抗体群，可使用酸水解除去抗体糖基化糖链的单糖，它们可用染料例如2-氨基苯甲酸(2-AA)标记。随后可进行反相高效液相色谱和荧光检测，构建用于样品定量的标准曲线。随后可计算每抗体群的岩藻糖与甘露糖的比例。
附图简述
图1：ELISA测定的纯化鼠单克隆抗体对人IGF-1R的结合。
图2A-E：ELISA测定的纯化6E11嵌合抗体和6E11人源化抗体对人IGF-1R的结合。在图2A中，由于抗体浓度极低，无法精确定量，因此H0L0的结合曲线偏移到右侧。在图2D中，虽然总体走向相似，但与其他测定相比，信号发生下降。
图3：以抗人IGF-1R的纯化6E11鼠单克隆抗体对3T3/LISN c4细胞温育24小时后，IGF-1R受体的下调。
图4：以抗人IGF-1R的人源化H0L0抗体对NCI-H838细胞温育长达24小时后，IGF-1R受体的下调。
图5：以H0L0、H0L0IgG1m(AA)或非靶向的人IgG温育NCI-H838细胞24小时后，IGF-1R受体和胰岛素受体的下调。
图6：以H0L0在4℃和37℃下温育后，粒细胞和淋巴细胞群体的IGF-1R荧光强度水平的直方图。
图7：与同种型对照相比，以H0L0在4℃和37℃下温育后，粒细胞和淋巴细胞群体的IGF-1R荧光强度水平的直方图。
图8：纯化鼠单克隆单体6E11、5G4和15D9介导的受体磷酸化的抑制。
图9：显示了与6E11c相比，H1L0介导的受体磷酸化抑制的实例。
图10：显示了H0L0、H0L0 IgG1m(AA)、H1L0和H10L0 IgG1m(AA)介导的受体磷酸化抑制的实例。
图11A：显示了各种纯化鼠单克隆抗体在竞争性ELISA中活性的实例。
图11B：显示了与6E11c相比，H1L0在竞争性ELISA中活性的实例。
图12A-C：竞争性ELISA显示了纯化6E11鼠单克隆抗体或6E11嵌合抗体或6E11人源化抗体抑制IGF-1R受体与第二中和抗体的结合。
图13A：ELISA测定的纯化鼠单克隆抗体对重组食蟹猴IGF-1R的结合。
图13B：与6E11嵌合抗体(6E11c)相比，纯化人源化单克隆抗体对重组食蟹猴IGF-1R的结合。
图14：采用纯化鼠单克隆抗体进行的胰岛素受体结合ELISA。
图15：采用纯化人源化抗体进行的胰岛素受体结合ELISA。
图16：FACS测定显示抗体识别Colo205肿瘤细胞系。
图17：FACS测定显示抗体识别NCI-H838肺癌肿瘤细胞系。
图18：FACS测定显示抗体识别MCF7肿瘤细胞系和A549肺癌细胞系。
图19：采用纯化鼠单克隆抗体对肿瘤冰冻组织样品和正常***样品进行的免疫组织化学。
图20：采用纯化鼠单克隆抗体对乳腺癌样品的冰冻组织样品进行的免疫组织化学。
图21：采用纯化的H1L0人源化单克隆抗体和6E11嵌合单克隆抗体对乳腺癌样品的冰冻组织样品进行的免疫组织化学。
图22：采用生物素化H0L0抗体对乳腺癌样品的冰冻组织样品进行的免疫组织化学。
图23：纯化鼠单克隆抗体对IGF-I介导的3T3/LISN c4细胞增殖的抑制。
图24：纯化H1L0人源化单克隆抗体或6E11嵌合单克隆抗体对IGF-I介导的3T3/LISN c4细胞增殖的抑制。
图25A-E：纯化人源化或纯化鼠6E11单克隆抗体对IGF-I介导的3T3/LISN c4细胞增殖的抑制。
图26：碘化丙啶染色和流式细胞术测定的纯化鼠单克隆抗体对IGF-I介导的细胞周期的抑制。
图27：鼠6E11单克隆抗体逆转IGF-1介导的对喜树碱诱导的NCI-H838细胞凋亡的保护。
图28：选择的抗体逆转IGF-1介导的对喜树碱诱导的A549细胞凋亡的保护。
图29：纯化鼠单克隆抗体在交联抗体的存在下没有激动活性。
图30：与阴性对照抗体相比，H0L0抗体在对分化的前脂肪细胞中基础水平磷酸化-AKT的活性。
图31：H0L0抗体对A549细胞中基础水平磷酸化-AKT的活性。
图32：人源化抗体对3T3/LISNc4细胞中基础水平的IGF-1R受体磷酸化的活性。
图33：交联人源化抗体对3T3/LISn c4细胞中基础水平的IGF-1R受体磷酸化的活性。
图34：人源化抗体在没有配体刺激的存在下对NCI-H929细胞增殖的活性。
图35：以6E11单克隆抗体处理后，裸鼠3T3/LISN c4肿瘤生长的抑制。
图36：以6E11单克隆抗体处理后，裸鼠3T3/LISN c4肿瘤生长的抑制。
图37：以6E11和人源化单克隆抗体处理后，裸鼠3T3/LISN c4肿瘤生长的抑制。
图38：以6E11单克隆抗体处理后，裸鼠Colo205肿瘤生长的抑制。
图39：采用以H0L0温育的NCI-H838细胞时受体结合的动力学。
图40：采用抗6E11、6E11c和H0L0 mIgG(AA)抗体的Colo-205细胞和重组NIH-3T3细胞进行的IGF-1R/IR异型二聚体结合测定。
图41：NCI-H929细胞在6E11和H0L0存在下的增殖。
图42：H0L0在血清中的稳定性测定。
图43：以H0L0或6E11处理后，IGR-1R在LISN/3T3 c4细胞体内的下调。
表格简述
表1：杂交瘤可变重链和可变轻链的SEQ ID编号。
表2：选择的抗体在磷酸化测定中的IC50值。
表2a：选择的抗体在磷酸化测定中的IC50值。
表3：鼠单克隆抗体的动力学数据。
表4：人源化单克隆抗体的动力学数据。
表5：野生型和缺陷型(disabled)Fc的人源化单克隆抗体的动力学数据。
表6：人源化单克隆抗体的动力学数据。
表7：人源化单克隆抗体的动力学数据。
表8：抗IGF-1R抗体与人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R的动力学数据。
表9：200RU的IGF-1表面的抑制值。
表10：4000RU的IGF-1表面的抑制值。
表11：受体与配体结合的中和。
表12：肿瘤组织微阵列的免疫组织化学分析的总结。
表13：各种抗体在AKT磷酸化测定中的活性。
表14：各种抗体在AKT磷酸化测定中的活性。
发明概述
在一个实施方式中，本发明提供了特异结合IGF-1R的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3或在CDRH3上含有1或2个氨基酸置换的变体。
在一个实施方式中，本发明提供了特异结合IGF-1R、特别是hIGF-1R并中和hIGF-1R活性的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ.ID.NO：1的CDR H3的重链可变域或其变体，其中CDR H3内的1个或2个氨基酸残基不同于SEQ.ID.NO：1相应位置处的氨基酸残基。
还提供了一种产生本文所述抗体的方法，该方法包括在细胞系中表达抗体或其抗原结合片段。
在另一实施方式中，提供了包含本文所述的组合物以及使用说明的试剂盒(kit-of-parts)。
还提供了一种治疗罹患癌症的人患者的方法，该方法包括给予本文所述的、治疗有效量的抗体制剂的步骤。
发明详述
本发明提供了特异结合IGF-1R、例如特异结合hIGF-1R的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个实施方式中，提供了特异结合hIGF-1R和中和hIGF-1R活性的抗体或其抗原结合片段，其包含特异结合IGF-1R的重链可变域，包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3或其变体，其中CDR H3内的1个或2个氨基酸残基不同于SEQ.ID.NO：1相应位置处的氨基酸残基。
在本发明的一个实施方式中，氨基酸残基的这些差异是保守置换。
在本发明的另一实施方式中，提供了特异结合IGF-1R并含有CDRH3的抗体或其抗原结合片段，其中CDRH3是SEQ ID NO：1列出序列的变体，其中所述变体的所述CDRH3内的1个或2个残基不同于SEQID NO：1位置7和/或位置9的相应位置的残基(第1个残基是位置1，即W，而最后1个残基V是位置14)。
在本发明的又一实施方式中，提供了特异结合IGF-1R并含有CDRH3的抗体或其抗原结合片段，其中CDRH3是序列SEQ ID NO：1列出序列的变体，其中所述变体的所述CDRH3的1个或2个残基不同于SEQ ID NO：1相应位置处的残基，其中位置7的R被置换为S或位置9的K被置换为R，或位置7的R被置换为S且位置9的K被置换为R。
在本发明的另一实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其还包含一种或多种下列序列：SEQ.ID.NO：2列出的CDRH2、SEQ.ID.NO：3列出的CDRH1、SEQ.ID.NO：4列出的CDRL1、SEQ.ID.NO：5列出的CDRL2和SEQ.ID.NO：6列出的CDRL3。
本发明的一个实施方式中，提供了抗体或抗原结合片段，其中CDRH1、H2和H3以及CDR L1和L3来自6E11，而CDR L2来自9C7。
在本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR可包含以上列出的序列所列出的各种CDR的变体。每个变体CDR将包含1个或2个不同于所列序列相应位置处的氨基酸残基的氨基酸残基。这类氨基酸残基置换可为保守置换，例如以一个疏水氨基酸置换另一个疏水氨基酸，例如以亮氨酸置换缬氨酸或异亮氨酸。
在本发明的又一实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含CDRH3，还包含一个或多个下列序列：CDRH2：SEQ.ID.NO：2、CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6。
在本发明的又一实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含CDRH3，还包含一个或多个下列序列：CDRH2：SEQ.ID.NO：2、CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6，其中一个或多个CDR可被其变体替换，每个变体CDR含有1个或2个氨基酸置换。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3和SEQ.ID.NO：3的CDR H1。在又一实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1的CDRH3和SEQ ID NO：7的CDR L2。在又一实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3和SEQ.ID.NO：3的CDR H1以及SEQ.ID.NO：7的CDR L2。
在本发明的另一实施方式中，提供了本文所述的抗体及其抗原结合片段，其还包含下列CDR：
CDRH1：SEQ.ID.NO：3
CDRH2：SEQ.ID.NO：2
CDRH3：SEQ.ID.NO：1
CDRL1：SEQ.ID.NO：4
CDRL2：SEQ.ID.NO：7
CDRL3：SEQ.ID.NO：6
在本发明的另一实施方式中，提供了特异结合IGF-1R并包含上面列出序列的变体的CDR的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的另一实施方式中，提供了特异结合IGF-1R的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ.ID.NO：8的重链可变域和SEQ.ID.NO：9的轻链可变域，或SEQ.ID.NO：10的重链可变域和SEQ.ID.NO：11的轻链可变域，或SEQ.ID.NO：12的重链可变域和SEQ.ID.NO：13的轻链可变域，或SEQ.ID.NO：14的重链可变域和SEQ.ID.NO：16的轻链可变域，或SEQ.ID.NO：15的重链可变域和SEQ.ID.NO：16的轻链可变域。
在本发明的另一实施方式中，提供了分离的抗体重链可变域，其包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15，例如它包含SEQID NO：12。
在本发明的另一实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含本文所述依据本发明的CDR，或本文所述依据本发明的重链或轻链可变域，其中抗体或其抗原结合片段来自大鼠、小鼠、灵长类(例如食蟹猴、旧大陆猴或类人猿)或人类。
在本发明的另一实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还结合灵长类IGF-1R，例如食蟹猴IGF-1R。
在本发明的另一实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个采用人框架的下列CDR：SEQ.ID.NO：1列出的CDRH3、SEQ.ID.NO：2列出的CDRH2、SEQ.ID.NO：3列出的CDRH1、SEQ.ID.NO：4列出的CDRL1、SEQ.ID.NO：5列出的CDRL2和SEQ.ID.NO：6列出的CDRL3，例如人源化抗体或嵌合抗体。
在本发明的一个实施方式中，人源化重链可变域在受体抗体框架内包含SEQ ID NO：1-3列出的CDR，其框架区与SEQ ID NO：59的人受体序列的框架区的同源性大于80％、或大于85％、或大于90％、或大于95％、或大于98％、或大于99％。
在本发明的一个实施方式中，人源化轻链可变域在受体抗体框架内包含SEQ ID NO：4-6列出的CDR，其框架区与SEQ ID NO：60的人受体序列的框架区的同源性大于80％、或大于85％、或大于90％、或大于95％、或大于98％、或大于99％。
CDR序列在SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60中的位置以Xaa表示。
在本发明的一个实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含本文所述的依据本发明的CDR，或本文所述的依据本发明的重链或轻链可变域，其中该抗体在鼠动物模型中的半衰期至少为5天，或至少为7天，或至少为9天。
在本发明的另一实施方式中，提供了抗体或其抗原结合片段，其包含本文所述的依据本发明的CDR，或本文所述的依据本发明的重链或轻链可变域，其中该抗体还包含恒定区，其可为可为任何同种型或亚类。在一个实施方式中，重链恒定区是IgG同种型例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或它们的变体的重链恒定区。在一个实施方式中，抗体是IgG1。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的抗体，其包含恒定区，使得该抗体具有下降的ADCC和/或补体激活或效应子功能。在一个这样的实施方式中，重链恒定区可含有IgG2或IgG4同种型的天然失效恒定区或突变的IgG1恒定区。EP0307434描述了适宜修饰的实例。一个实例包含位置235和237的丙氨酸残基的置换(EU索引编号)。
在本发明的另一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的抗体，其中该抗体至少具有部分效应子功能，例如其中它至少具有部分ADCC和/或CDC功能。在本发明的一个实施方式中，提供了包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段，抗体或其抗原结合片段特异结合IGF-1R例如人IGF-1R，并包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3或其变体，其中该变体在CDRH3上含有1个或2个氨基酸置换的变体，例如包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段包含选自CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRH2：SEQ.ID.NO：2、CDRH3：SEQ.ID.NO：1、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6的CDR，而且还包含IgG1野生型、IgG2野生型、IgG3野生型、IgG4野生型或它们的增强型的恒定区。
在本发明的一个实施方式中，包含恒定区的本文所述的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段特异结合选自IGF-1R、EGFR、HER-2或HER-3的生长因子受体，例如特异结合HER-2或HER-3或例如特异结合IGF-1R或EGRF，例如人IGF-1R。
在一个实施方式中，本发明的抗体被连接到一个或多个特异针对VEGF或EGFR的结构域抗体上。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段，在其重链恒定区内含有一个或多个突变，使得该抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能。例如，其中它具有增强的ADCC或增强的CDC，或其中它同时具有增强的ADCC和CDC效应子功能。Shields等人J.Biol.Chem(2001)276：6591-6604；Lazar等人PNAS(2006)103：4005-4010和US6737056、WO2004063351以及WO2004029207描述了适宜的修饰实例。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其特异结合IGF-1R，例如人IGF-1R。抗体或其抗原结合片段可包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3或其变体，其中该变体的CDR H3上的1个或2个氨基酸残基不同于SEQ.ID.NO：1相应位置处的氨基酸残基，并包含突变的重链恒定区，使得该抗体或其抗原结合片段与野生型相比具有增强的效应子功能。例如特异结合IGF-1R的抗体或其抗原结合片段包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3，例如抗体或其抗原结合片段包含选自CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRH2：SEQ.ID.NO：2、CDRH3：SEQ.ID.NO：1、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6的CDR，并包含突变的重链恒定区，使得该抗体或其抗原结合片段与野生型相比具有增强的效应子功能。
在本发明的一个实施方式中，这类突变位于选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置，或位于其他IgG同种型的对应位置。适宜突变的实例是S239D、I332E和A330L。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段在位置239和332发生突变，例如S239D和I332E，例如它在选自239、332和330的3个或更多位置处发生突变，例如S239D、332E和A330L。
在本发明的另一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66所列出的恒定区，例如包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的可变域以及SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：66所列出的重链恒定区的抗体或抗原结合片段，例如包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：64。在本发明的又一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含选自SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66所列出的重链恒定区，例如包含SEQ ID NO：14和SEQID NO：16的可变域以及SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：66所列出的重链恒定区的抗体或抗原结合片段，例如包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：64的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含具有改变的糖基化概况的重链恒定区，使得该抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能。例如，其中它具有增强的ADCC或增强的CDC，或其中它同时具有增强的ADCC和CDC效应子功能。产生具有改变的糖基化概况的抗体的适宜方法的实例在WO2003011878、WO2006014679和EP1229125中进行了描述。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其特异结合IGF-1R，例如人IGF-1R。抗体或其抗原结合片段可包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3或其变体，其中该变体的CDR H3上的1个或2个氨基酸残基不同于SEQ.ID.NO：1相应位置处的氨基酸残基，并包含具有改变的糖基化概况(profile)的重链恒定区，使得该抗体或其抗原结合片段与野生型相比具有增强的效应子功能。
例如特异结合IGF-1R例如人IGF-1R的抗体或其抗原结合片段包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3，例如抗体或其抗原结合片段包含选自CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRH2：SEQ.ID.NO：2、CDRH3：SEQ.ID.NO：1、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6的CDR，并包含具有改变的糖基化概况的重链恒定区，使得该抗体或其抗原结合片段与野生型相比具有增强的效应子功能。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体制剂，其中岩藻糖与甘露糖在所述抗体中的比例是0.8∶3或更低，例如0.7∶3或更低，或0.6∶3或更低，或0.5∶3或更低，或0.4∶3或更低，或0.3∶3或更低，或0.2∶3或更低，或0.1∶3或更低。在一个实施方式，抗体制剂含有很少或不含有结合岩藻糖。
在本发明的另一实施方式中，提供了包含抗体或其抗原结合片段的抗体制剂，该抗体制剂包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：16的可变域，其中岩藻糖与甘露糖在所述抗体制剂中的比例是0.8∶3或更低，例如0.7∶3或更低，或0.6∶3或更低，或0.5∶3或更低，或0.4∶3或更低，或0.3∶3或更低，或0.2∶3或更低，或0.1∶3或更低。在一个实施方式，抗体制剂含有很少或不含有结合岩藻糖。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含突变的重链恒定区和改变的糖基化概况，使得该抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如其中它具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中它具有增强的ADCC功能。
在本发明的一个实施方式中，提供了抗体制剂，其包含本文所述的、含有免疫球蛋白重链恒定区的抗体或其连接到免疫球蛋白重链恒定区的抗原结合片段，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为该抗体或抗原结合片段提供(confer)效应子功能，其中所述抗体或抗原结合片段特异结合生长因子受体，其中所述免疫球蛋白重链恒定区至少在2个位置处发生突变，并具有改变的糖基化概况，使得岩藻糖与甘露糖的比例为0.8∶3或更低，这样与具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等价抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能。所述抗体制剂的改变的糖基化概况不是所述免疫球蛋白重链突变的结果。
例如，这类抗体或其抗原结合片段特异结合IGF-1R例如人IGF-1R并包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3，例如抗体或其抗原结合片段包含选自CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRH2：SEQ.ID.NO：2、CDRH3：SEQ.ID.NO：1、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6的CDR，并包含突变的重链恒定区，并具有改变的糖基化概况，使得该抗体或其抗原结合片段具有增强的效应子功能。例如，这类抗体或抗原结合片段可包含SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：16的可变域。
在一个这样的实施方式中，突变位于选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置，或位于其他IgG同种型的对应位置。适宜突变的实例是S239D、I332E和A330L。在一个实施方式中，包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段具有239和332处的突变，例如S239D和I332E，或还可在选自239、332和330的三个或更多位置处含有突变，例如S239D、I332E和A330L。
在一个实施方式中，岩藻糖与甘露糖在所述抗体制剂中的比例是0.8∶3或更低，例如0.7∶3或更低，或0.6∶3或更低，或0.5∶3或更低，或0.4∶3或更低，或0.3∶3或更低，或0.2∶3或更低，或0.1∶3或更低。在一个实施方式，抗体制剂含有很少或不含有结合岩藻糖。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含嵌合的重链恒定区，例如其中它包含至少一个来自IgG3的CH2结构域，使得该抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如其中它具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中它具有增强的CDCC。例如抗体或抗原结合片段可包含来自IgG3的一个CH2结构域，或两个CH2结构域可均来自IgG3。
在本发明的又一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含突变的嵌合重链恒定区，例如其中它包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域，其中IgG1CH2结构域在选自239、332和330的位置处具有一个或多个突变，例如突变选自S239D、I332E和A330L，使得该抗体具有增强的效应子功能，例如其中它具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中它具有增强的ADCC和增强的CDCC。在一个实施方式中，IgG1CH2结构域具有S239D和I332E突变。
在本发明的一个实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，其包含嵌合的重链恒定区和改变的糖基化概况，使得该重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域，并具有改变的糖基化概况，使得岩藻糖与甘露糖的比例为0.8∶3或更低，这样与具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等价抗体或抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能，使得抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如其中它具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中它具有增强的ADCC和增强的CDCC。
在一个替代实施方式中，抗体或抗原结合片段具有至少一个IgG3CH2结构域和至少一个来自IgG1的重链恒定域，其中两个IgG CH2结构域依据本文描述的限制发生突变。
在本发明的一个实施方式中，提供了抗体制剂，其包含含有重链恒定区的抗体或其连接到重链恒定区的抗原结合片段，该抗体制剂包含突变的嵌合重链恒定区，其中所述抗体制剂具有改变的糖基化概况，使得该抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能，例如其中它具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC。在一个实施方式中，突变选自239、332和330位置，例如突变选自S239D、I332E和A330L。在又一实施方式中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域。在一个实施方式中，重链恒定区具有改变的糖基化概况，使得岩藻糖与甘露糖的比例为0.8∶3或更低，这样与具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等价非嵌合抗体或其抗原结合片段相比，所述抗体或抗原结合片段具有增强的效应子功能。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种重组、转化、转染或转导的宿主细胞，其包含至少一个表达盒，例如其中该表达盒包含编码本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸，还包含编码本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸，或有两个表达盒，第一个编码轻链，而第二个编码重链。例如在一个实施方式中，第一个表达盒包含编码本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段的重链的多核苷酸，其中该抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区，还包含第二个表达盒，其中第二个表达盒包含编码本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸，其中该抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区，例如第一个表达盒包含编码选自SEQ.ID.NO：40、SEQ.ID.NO：41或SEQ.ID.NO：67或SEQ.ID.NO：70的重链的多核苷酸，而第二个表达盒包含编码选自SEQ.ID.NO：42或SEQ.ID.NO：69的轻链的多核苷酸。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种包含载体的稳定转化的宿主细胞，其中载体包含一个或多个编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的表达盒，其中抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区。例如，这类宿主细胞可包含编码轻链的第一载体和编码重链的第二载体，例如第一载体编码选自SEQ.ID.NO：37、SEQ.ID.NO：38或SEQ.ID.NO：68的重链，而第二载体编码轻链，例如SEQ ID NO：39的轻链。
在本发明的另一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的宿主细胞，其中细胞是真核细胞，例如细胞是哺乳动物细胞。这类细胞系的实例包括CHO或NS0。
在本发明的另一实施方式中，提供了产生本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其中抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区，其中该方法包括以培养基例如无血清培养基培养宿主细胞的步骤。
还提供了一种产生本文所述的抗体的方法，其包括在细胞系中表达抗体或其抗原结合片段，其中该细胞系已被改造，以调节岩藻糖是否结合到结合免疫功能分子的N-糖苷连接的糖链上。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种本文所述的依据本发明的方法，其中与含有所述抗体的无血清培养基相比，所述抗体被进一步纯化到至少95％或更高(例如98％或更高)。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的依据本发明的含有恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段以及药用载体。
在本发明的另一实施方式中，提供了包含本文所述的依据本发明的组合物以及使用说明的试剂盒。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种治疗患有类风湿性关节炎的人患者的方法，其中该方法包括给予治疗有效量的本文所述的依据本发明的抗体或其抗原结合片段的步骤，该抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区。包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段可与药用载体组合在一起。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种治疗患有癌症的人患者的方法，其中该方法包括给予治疗有效量的本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的步骤，该抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区。包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段可与药用载体组合在一起。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种治疗患有糖尿病视网膜病变的人患者的方法，其中该方法包括给予治疗有效量的本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的步骤，该抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区。包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段可与药用载体组合在一起。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种治疗患有黄斑变性的人患者的方法，其中该方法包括给予治疗有效量的本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的步骤，该抗体包含恒定区，其抗原结合片段被连接到恒定区。包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段可与药用载体组合在一起。
在本发明的又一实施方式中，提供了一种治疗患有癌症的人患者的方法，其中该方法包括给予治疗有效量的药物组合物的步骤，该药物组合物包含本文所述的依据本发明的包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段和药用载体。
在本发明的另一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的包含恒定区的抗体或其连接到恒定区的抗原结合片段在生产用于治疗疾病或疾患的药物中的用途，其中疾病或疾患选自于由新生血管性疾病例如增殖性糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼和年龄相关性黄斑变性(AMD)组成的组，疾病或疾患还选自于由类风湿性关节炎、银屑病或癌例如急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌，艾滋病相关癌、艾滋病相关淋巴瘤、***癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、结肠直肠癌、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、脑肿瘤(例如脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤(SupratentorialPrimitive Neuroectodermal Tumors)、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、胃肠道类癌、不明原发性中枢神经***癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、***、儿童期癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞源性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族瘤(Ewing′s Family of Tumors)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤眼癌(IntraocularMelanoma Eye Cancer)、视网膜母细胞瘤眼癌、胆囊癌、胃癌(胃)癌、胃肠道类癌、生殖细胞肿瘤(例如颅外、性腺外和卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(例如成人、儿童脑干、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视通路和下丘脑)、多毛细胞白血病、头颈部癌、肝(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、白血病(例如急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性髓细胞源性和多毛细胞)、唇癌和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病相关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金和原发性中枢神经***)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、髓细胞源性白血病、慢性髓细胞源性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增殖性疾病、鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌(Islet Cell Pancreatic Cancer)、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征、非黑色素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌(Merkel Cell Skin Carcinoma)、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤(Thyrnoma)、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠滋养细胞肿瘤、原发部位不明癌(Carcinoma of UnknownPrimary Site)、原发部位不明癌(Cancer of Unknown Primary Site)、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、视通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤组成的组。
在本发明的另一实施方式中，提供了本文所述的依据本发明的方法，其中患者患有增殖性糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎、银屑病、结肠直肠癌、乳腺癌、***癌、肺癌或骨髓瘤中的一种或多种疾病。
定义
术语“抗体”在本文中使用最宽泛的含义，具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。这些将在下文进一步详细解释。
本文使用的术语“单克隆抗体”系指从一群基本同源的抗体获得的抗体，即组成该群体的单个抗体除了可能出现的少量自发突变以外均是相同的。单克隆抗体针对单个抗原结合位点具有高度特异性。而且，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体只针对抗原上的单个决定簇。
对于多核苷酸和多肽(正如本文这种情况)，“相同性”是指采用下面的(1)和(2)提供的算法计算得到的比较结果：
(1)规定了相同性百分数的整数除以100，再乘以给定序列的核苷酸总数目，随后从所述序列的所述核苷酸总数目中减去该乘积，计算出多核苷酸的相同性，或：
nn≤xn-(xn·y)，
其中nn是核苷酸变化的数目，xn是给定序列的核苷酸总数目，对于95％、97％或100％，y分别是0.95、0.97或1.00，·是乘法运算符的符号，其中xn和y的任何非整数乘积从xn中减去之前，被四舍五入到个位。编码多肽的多核苷酸序列的变化可在该编码序列内产生无义突变、错义突变或移码突变，因而发生这些变化后，可改变该多核苷酸编码的多肽。
规定了相同性百分数的整数除以100，再乘以氨基酸总数目，随后从所述氨基酸总数目中减去乘积，计算出多肽的相同性，或：
na≤xa-(xa·y)，
其中na是氨基酸变化的数目，xa是序列的氨基酸总数目，对于95％、97％或100％，y分别是0.95、0.97或1.00，·是乘法运算符的符号，其中xa和y的任何非整数乘积从xa中减去之前，被四舍五入到个位。
本文使用的术语“变体”系指分别不同于对照多核苷酸或多肽但保留基本属性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体与另外的对照多核苷酸具有不同的核苷酸序列。变体的核苷酸序列的变化可改变或可不改变对照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。正如下文讨论，核苷酸变化可导致对照序列编码的多肽的氨基酸置换、添加、删除、融合蛋白和截短。多肽的典型变体与另外的对照多肽具有不同的氨基酸序列。一般而言，差异是有限的，使得对照多肽和变体的序列总体高度相似，并在许多区域是相同的。变体和对照多肽的氨基酸序列可具有任何组合的一个或多个置换、添加、删除的差异。置换的或***的氨基酸残基可为或可不为遗传密码编码的氨基酸残基。本领域一般认为，某些氨基酸置换被视为是“保守的”。根据常见的侧链属性，氨基酸被分成不同的组，保持所有或基本保持所有本发明抗体或其抗原结合片段的结合亲和力的置换被认为是保守置换，参见下表：
侧链                    成员
疏水                    Met，Ala，Val，Leu，Ile
中性亲水                Cys，Ser，Thr
酸性                    Asp，Glu
碱性                    Asn，Gln，His，Lys，Arg
影响链取向的残基        Gly，Pro
芳香族                  Trp，Tyr，Phe
在本发明的一些方面，可包括以任何组合被置换、删除或添加的几个例如5-10、1-5、1-3、1-2氨基酸残基或1个氨基酸残基的变体。多核苷酸或多肽的变体可为天然存在的，例如等位基因变体，或者它可为已知天然不存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可通过诱变技术、直接合成和其他技术人员知晓的重组技术制得。
“分离的”是指其天然状态被“人类之手”改变，已发生变化或从其最初环境除去，或二者均有。例如，生物中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从其自然状态下的共存物质分离出的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”，包括但不限于这类多核苷酸或多肽被重新导入细胞时，即使细胞与原来分离出该多核苷酸或多肽的细胞的物种或类型相同。
在本说明书和随附的权利要求中，术语“包含”和“包括”涵盖了“由......组成”和“组成为”。即这些词语旨在表达没有具体列举而上下文许可的情况下可能纳入的其他要素或整体。
本文使用的术语“糖基化概况”系指抗体群的糖基化水平。
本说明书用于指本发明的抗体及其抗原结合片段的术语“特异结合”是指抗体结合人IGF-1R(hIGF-1R)，而不结合或不明显结合到其他人蛋白。但是该术语不排除本发明的抗体也可与其他形式的IGF-1R例如灵长类IGF-1R发生交叉反应的事实。
本说明书用于指本发明的抗体及其抗原结合片段的术语“中和”是指与缺乏这类抗体及其抗原结合片段时的IGF-1R活性相比，存在本发明的抗体及其抗原结合片段时，IGF-1R的生物活性被降低。中和可源自但不限于封闭配体结合、阻止配体激活受体、下调IGF-1R或影响效应子功能其中的一种或多种。中和水平可用几种方式测量，例如使用下文实施例列出的测定，例如LISN细胞增殖测定，该测定可依据实施例23所描述的方法进行。在该测定中，通过评价在中和抗体的存在下降低的肿瘤细胞增殖来测量IGF-1R的中和。
中和水平还可用例如磷酸化测定来测量，该测定可依据实施例13描述的方法进行。在该测定中，通过评价在中和抗体的存在下受体磷酸化的抑制来测量IGF-1R的中和。
如果抗体或其抗原结合片段可发生中和，则表明人IGF-1R结合蛋白例如hIGF-I或hIGF-II与其受体之间相互作用的抑制。被认为具有中和人IGF-1R活性的抗体在实施例23和实施例13分别列出的LISN细胞增殖测定或受体磷酸化测定中具有小于10微克/ml、或小于5微克/ml、或小于2微克/ml、或小于1微克/ml的IC50。
在本发明的一个替代方面，提供了具有相当于本文例示抗体中和活性的抗体或其抗原结合片段，例如实施例23和13分别列出的LISN细胞增殖测定或受体磷酸化测定中保留H0L0、H0L0 IgG1m(AA)、H1L0和H10L0 IgG1m(AA)中和活性的抗体。5
在本说明书中，抗体序列的氨基酸残基依据Kabat方案进行编号。同样，术语″CDR″、″CDRL1″、″CDRL2″、″CDRL3″、″CDRH1″、″CDRH2″、″CDRH3″采用了Kabat等人；Sequences of proteins of ImmunologicalInterest NIH，1987提出的Kabat编号***。存在CDR序列的替代定义例如Chothia等人(1989)提出的CDR序列定义对于本领域技术人员是显而易见的。
对本领域技术人员显而易见的是，术语“源自”不仅旨在确定材料的物理来源，而且还旨在确定结构与材料相同(就氨基酸一级序列而言)但不是来自对照来源的材料。因此“衍生出CDRH3的供体抗体的残基”不一定需要从供体抗体纯化。
本说明书用于指本发明的抗体和其抗原结合片段的术语“稳定性”是指以直接结合ELISA测定时，抗体或抗原结合片段在血清中温育12天后在-20℃、4℃或37℃下的活性类似于EC-50的初始值。
“嵌合抗体”系指一类基因工程抗体，其含有与源自受体抗体的轻链和重链恒定区结合的源自供体抗体的天然可变域(轻链和重链)。
“人源化抗体”系指一类基因工程抗体，其CDR源自非人类供体免疫球蛋白，该分子其余源自免疫球蛋白的部分源自一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，可改变框架支持残基，以保持结合亲和力(例如参阅Queen等人Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)；Hodgson等人Bio/Technology，9：421(1991))。适宜的人受体抗体可为根据与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性从常规数据库例如
Figure G2008800119704D00211
数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白质数据库选择的抗体。具有与供体抗体的框架区同源性(基于氨基酸)特征的人抗体可适合于提供***供体CDR的重链恒定区和/或重链可变框架区。可以类似的方式选择可提供轻链恒定区或可变框架区的适宜受体抗体。应注意的是，受体抗体的重链和轻链无需源自相同的受体抗体。现有技术描述了几种产生这类人源化抗体的方式-例如参阅EP-A-0239400和EP-A-054951。
术语“供体抗体”系指为第一免疫球蛋白伴侣提供其可变域、CDR或其他功能片段或其类似物的氨基酸序列的抗体(单克隆和/或重组)，以提供改变的免疫球蛋白编码序列，导致具有供体抗体特征性的抗原特异性和中和活性的已改变抗体的表达。
术语“受体抗体”系指与供体抗体不同源的抗体(单克隆和/或重组)，其向第一免疫球蛋白伴侣提供编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部(或任何部分，但优选为全部)氨基酸序列。人抗体是受体抗体。
“CDR”定义为抗体互补决定区的氨基酸序列，它们是免疫球蛋白重链和轻链的高变域。例如参阅Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health (1987)。免疫球蛋白的可变部分有三条重链CDR和三条轻链CDR(或CDR区)。因此，本文使用的“CDR”系指所有的三条重链CDR，或所有的三条轻链CDR(或在适宜情况下同时指所有的重链CDR和所有的轻链CDR)。抗体的结构和蛋白折叠可指其他残基被认为是抗原结合区的一部分，这点会被技术人员所理解。例如参阅Chothia等人(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariabledomains；Nature 342，877-883页。
CDR提供了用于抗体结合到抗原或表位的大多数接触残基。本发明的目的CDR源自供体抗体的可变重链和轻链序列，包括天然CDR的类似物，这些类似物还共有或保留与衍生出这些类似物的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
术语“VH”和“VL”在本文中分别系指抗体的重链可变域和轻链可变域。
本文使用的术语“效应子功能”是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用和经FcRn受体的抗体循环其中的一种或多种。抗体恒定区和各种Fc受体(FcR)之间的相互作用被认为介导了抗体的效应子功能。显著的生物效应可以是效应子功能特别是抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)、补体结合(补体依赖性细胞毒作用即CDC)、吞噬作用(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用即ADCP)和抗体半衰期/清除的结果。通常，介导效应子功能的能力需要抗体结合到抗原上，不是所有的抗体都介导每种效应子功能。
效应子功能可用许多方式测量，包括例如通过FcγRIII对自然杀伤细胞的结合，或通过FcγRI对单核细胞/巨噬细胞的结合来测量ADCC效应子功能。例如在自然杀伤细胞测定中，与等价野生型抗体或其抗原结合片段相比，本发明的抗体或其抗原结合片段具有增强的ADCC效应子功能。这类测定的实例可见于Shields等人2001 The Journal of BiologicalChemistry，Vol.276，6591-6604页；Chappel等人1993The Journal ofBiological Chemistry，Vol 268，25124-25131页；Lazar等人2006 PNAS，103；4005-4010。
测量CDC功能的测定实例包括1995 J Imm Meth 184：29-38所描述的测定。
根据所需的效应物属性，可对抗体的重链恒定区进行各种修饰。基本缺乏a)经典途径的补体活化；和b)介导抗体依赖性细胞的细胞毒作用的功能的人恒定区包含IgG4恒定区和IgG2恒定区。含有特异突变的IgG1恒定区已被分别描述可减少对Fc受体的结合，从而降低ADCC和CDC(Duncan等人Nature 1988，332；563-564；Lund等人J.Immunol.1991，147；2657-2662；Chappel等人PNAS 1991，88；9036-9040；Burton和Woof，Adv.Immunol.1992，51；1-84；Morgan等人Immunology 1995，86；319-324；Hezareh等人J.Virol.2001，75(24)；12161-12168)。含有特异突变或残基Asn297上糖基化改变的人IgG1恒定区也被描述可增强对Fc受体的结合。这些在一些例子中已被表明可增强ADCC和CDC(Lazar等人PNAS 2006，103；4005-4010；Shields等人J Biol Chem 2001，276；6591-6604；Nechansky等人Mol Immunol，2007，44；1815-1817)。
对于IgG抗体，包括ADCC和ADCP在内的效应子功能是由重链恒定区与免疫细胞表面上的Fcγ受体家族的相互作用介导的。人类的这些Fcγ受体包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。结合抗原的抗体与Fc/Fcγ复合物形成之间的相互作用诱导一系列效应，包括细胞毒性、免疫细胞活化、吞噬作用和炎症细胞因子的释放。恒定区的特异置换(包括S239D/I332E)已知可增加重链恒定区对某些Fc受体的亲和力，从而增强抗体的效应子功能(Lazar等人PNAS 2006)。
1.抗体结构
1.1完整抗体
完整抗体包括含有至少两条重链和两条轻链的异型多聚糖蛋白。除了IgM，完整抗体通常是约150Kda的异型四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。一般而言，每条轻链通过一个共价二硫键连接到一条重链上，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目各有不同。每条重链和轻链还具有链内二硫键。每条重链在一端具有可变域(VH)，随后是多个恒定区(CH1、CH2、CH3)。每条轻链在另一端具有可变域(VL)和恒定区；轻链的重链恒定区与重链的第一个恒定区比对(aligne)，而轻链的可变域与重链的可变域比对。根据恒定区的氨基酸序列，来自大多数脊椎动物抗体的轻链可划分到名为κ和λ两种类型中的一种。根据它们重链的重链恒定区的氨基酸序列，人抗体可划分为五种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可进一步划分为亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。具有至少IgG2a和IgG2b的小鼠和大鼠存在物种变体。抗体的可变域为抗体提供结合特异性，其中某些区域表现出特别高的变异性，被称为互补决定区(CDR)。可变域上更为保守的部分被称为框架区(FR)。完整重链和轻链的可变域各自包含由三个CDR相连的四个FR。每条链的CDR通过FR区被紧密地保持在近距离内，同时利用来自其他链的CDR促进抗体的抗原结合位点的形成。恒定区没有直接参与到抗体对抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、通过与Fcγ受体结合的吞噬作用、通过新生Fc抗体(FcRn)的半衰期/清除率，和通过补体级联的C1q组分的补体依赖性细胞毒作用。
1.1.2人抗体
可通过本领域技术人员知晓的许多方法产生人抗体。可采用人骨髓瘤或小鼠-人杂交瘤细胞系经杂交瘤方法制备人抗体，参阅KozborJ.Immunol 133，3001，(1984)和Brodeur， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，51-63页(Marcel Dekker Inc，1987)。替代方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，二者均利用人可变域文库(参阅Winter G，(1994)，Annu.Rev.Immunol 12，433-455；Green LL(1999)，J.Immunol.methods 231，11-23)。
几种转基因小鼠品系现在可供使用，其中它们的小鼠免疫球蛋白位点已被替换为人免疫球蛋白基因片段(参阅Tomizuka K，(2000)PNAS97，722-727；Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14，845-851；MendezMJ，1997，Nature Genetics，15，146-156)。抗原激发后，这些小鼠可产生人抗体库，从中可选择目的抗体。特别值得注意的是TrimeraTM***(参阅Eren R等人(1998)Immunology 93：154-161)，其中人淋巴细胞被移植到照射小鼠体内；选择性淋巴细胞抗体***(SLAM，参阅Babcook等人，PNAS(1996)93：7843-7848)，其中人(或其他物种)淋巴细胞有效地历经大规模混合体外抗体产生步骤和逐级限制稀释和选择步骤；以及Xenomouse IITM(Abgenix Inc)。一种替代方法来自Morphotek Inc，其采用了MorphodomaTM技术。
噬菌体展示技术可用于产生人抗体(及其片段)，参阅McCafferty；Nature，348，552-553(1990)和Griffiths AD等(1994)EMBO13：3245-3260。根据该技术，抗体可变域基因依据读框被克隆到丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并作为抗体的功能性抗原结合片段展示(通常借助辅助噬菌体)到噬菌体颗粒的表面。基于抗体功能属性的选择意味着选择编码表现出这些属性的抗体的基因。噬菌体展示技术可用于从文库中选择抗原特异性抗体，其中以取自患有上述疾病或疾患的个体或取自未免疫人供体的人B细胞制备得到文库(参阅Marks；J.Mol.Bio.222，581-597，1991)。若需含有恒定域的完整人抗体，需要将噬菌体展示的衍生片段重新克隆到包含所需恒定区的哺乳动物表达载体上，并建立稳定表达细胞系。
亲和力成熟技术(Marks；Bio/technol 10，779-783(1992))可用于提高结合亲和力，其中通过依次将H链和L链可变域替换为天然变体以及基于提高的结合亲和力进行选择，提高人初次抗体的亲和力。还可利用该技术的变体例如“表位印记”，参阅WO 93/06213。另外参阅Waterhouse；Nucl.Acids Res 21，2265-2266(1993)。
1.2嵌合抗体和人源化抗体
使用完整非人类抗体治疗人类疾病或疾患可能带来现在已确立的免疫原性问题，即患者的免疫***可将非人类完整抗体识别为非自我，从而发动中和反应。多次给予患者非人类抗体后，这一问题特别明显。多年来已开发了各种技术来克服这些问题，这些技术一般包括降低完整抗体中非人类氨基酸序列的组成，同时保留从免疫动物例如小鼠、大鼠或兔获得非人类抗体的相对简单性。大致使用了两种方法来实现这一目标。第一种是嵌合抗体，它们一般包含与人恒定区融合的非人(例如啮齿类如小鼠)可变域。由于抗体的抗原结合位点位于可变域内，嵌合抗体保留了其对抗原的结合亲和力，但又得到了人恒定区的效应子功能，因此可执行例如上文描述的效应子功能。一般采用重组DNA方法产生嵌合抗体。采用常规方法(例如采用可特异结合本发明抗体的H链和L链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序编码抗体的DNA(例如cDNA)。杂交瘤细胞用作这类DNA的典型来源。分离后，DNA被置入表达载体，随后表达载体被转染到原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞体内例如E.Coli、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞，以得到抗体合成。可将相应的非人(例如鼠)的H和L恒定区置换为人L链和H链的编码区，进行DNA修饰，例如参阅Morrison；PNAS 81，6851(1984)。
第二种方法包括产生人源化抗体，其中通过使可变域人源化，降低抗体的非人类组成。两种人源化技术应用较多。第一种是CDR移植人源化。CDR在靠近抗体N端处形成环，它们在这里形成表面，位于框架区所提供的支架上。抗体的抗原结合特异性主要由其CDR表面的拓扑结构和化学特性决定。这些特点反过来又由单个CDR的构象、CDR的相对位置以及组成CDR的残基的侧链性质和位置决定。仅将非人类(例如鼠)抗体(“供体”抗体)的CDR移植到人框架区(“受体框架”)和恒定区上，可实现免疫原性的大幅降低(参阅Jones等人(1986)Nature321，522-525和Verhoeyen M等人(1988)Science 239，1534-1536)。但是，CDR移植本身可能不会导致抗原结合属性的完全保留，通常发现如果要恢复显著的抗原结合亲和力，需在人源化分子中保留供体抗体的一些框架残基(有时称为“回复突变”)(参阅Queen C等人(1989)PNAS 86，10，029-10，033；Co，M等人(1991)Nature 351，501-502)。在这种情况下，从数据库中选择表现出与非人类供体抗体最大序列同源性的人类可变域，以提供人类框架(FR)。可从人共有抗体或单个人抗体选择人FR。若有需要，则将来自供体抗体的关键残基置换到人受体框架，以保留CDR构象。可使用抗体的计算机建模，帮助鉴定这类结构重要的残基，参阅WO99/48523。
或者，可通过“镶饰(veneering)”方法实现人源化。独特人和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变域的统计分析揭示，人抗体和鼠抗体的暴露残基的精确样式是不同的，大多数个体表面位置具有对少数不同残基的偏好性(参阅Padlan E.A.等人；(1991)Mol.Immunol.28，489-498和Pedersen J.T.等人(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。因此，有可能通过替换其框架区内不同于通常见于人抗体的暴露残基，降低非人类Fv的免疫原性。由于蛋白抗原性可能与表面可及性相关，表面残基的替换可能足以使得人免疫***“看不见”小鼠可变域(同样参阅Mark G.E.等人1994)inHandbook of Experimental Pharmacology vol.113：The pharmacology ofmonoclonal Antibodies，Springer-Verlag，105-134页)。这种人源化方法被称为“镶饰”，因为仅仅是抗体表面发生变化，而支持残基不受干扰。
1.3双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同的表位具有结合特异性的抗体。制备这类抗体的方法为本领域知晓。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白H链-L链对的共表达，其中这两个H链具有不同的结合特异性，参阅Millstein等人，Nature 305 537-539(1983)、WO93/08829和Traunecker等人EMBO，10，1991，3655-3659。由于H链和L链的随机分配，产生10种不同抗体结构的潜在混合物，其中仅有1种具有所需的结合特异性。一种替代性方法包括将具有所需结合特异性的可变域与包含至少部分铰链区、CH2和CH3区的重链恒定区融合在一起。在一个实施方式中，含有轻链结合所需位点的CH1区出现在其中至少一种融合体中。编码这些融合体的DNA和L链(若需要)被***到不同的表达载体上，随后被共转染到适宜的宿主生物体内。但有可能将两条或全部三条链的编码序列***到一个表达载体上。在一种方法中，双特异性抗体由在一条臂上具有第一种结合特异性的H链和H-L链对组成，另一条臂提供第二种结合特异性，参阅WO94/04690。另外参阅Suresh等人Methods in Enzymology 121，210，1986。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种双特异性抗体，其中所述抗体的至少一种结合特异性是针对hIGF-1R的，所述抗体中和hIGF-1R的活性。这类抗体还可包含IgG同种型例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人恒定区。本发明的抗体还可为多特异性的，例如由许多抗原结合片段组合形成的多特异性抗体。
1.4抗原结合片段
这类抗原结合片段包含部分的重链或轻链可变序列(例如免疫球蛋白可变域氨基端或羧基端的少量删除)，其中可变序列保留了与衍生出该片段的抗体相同的抗原结合特异性和相同或相似的中和能力。
在本发明的某些实施方式中，提供了中和hIGF-1R活性的抗原结合片段。这些片段可为完整和/或人源化和/或嵌合抗体的功能性抗原结合片段，例如上述抗体的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、ScFv片段。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化例如木瓜蛋白酶消化，产生这类片段(例如参阅WO 94/29348)，但也可直接从重组的转化宿主细胞产生。对于ScFv的产生，参阅Bird等人；(1988)Science，242，423-426。此外，可采用例如下文描述的各种工程技术产生抗原结合片段。
Fv片段两条链的相互作用能似乎要比Fab片段要低。为了稳定VH和VL域之间的结合，它们被肽(Bird等人，(1988)Science 242，423-426；Huston等人，PNAS，85，5879-5883)、二硫键(Glockshuber等人(1990)Biochemistry，29，1362-1367)和“孔穴结(knob in hole)”突变(Zhu等人(1997)，Protein Sci.，6，781-788)连接在一起。可通过本领域技术人员熟知的方法产生ScFv片段，参阅Whitlow等人(1991)Methods companionMethods Enzymol，2，97-105和Huston等人(1993)Int.Rev.Immunol 10，195-217。ScFv可在细菌细胞例如大肠杆菌中产生，但更优选在真核细胞中产生。ScFv的一个缺点是产物的单价性(阻止了由于多价结合而产生的亲和力增加)和它们短暂的半衰期。克服这些问题的尝试包括从含有附加C末端半胱氨酸的ScFV通过化学偶联产生的双价(ScFv′)2(Adams等人(1993)Can.Res 53，4026-4034和McCartney等人(1995)Protein Eng.8，301-314)，或通过含有未配对的C末端半胱氨酸残基的ScFV的自发位点特异性二聚化产生双价(ScFv′)2(参阅Kipriyanov等人(1995)Cell.Biophys 26，187-204)。或者，可将肽接头缩短为3至12个残基，迫使ScFv形成多聚体以形成“双链抗体”，参阅Holliger等人PNAS(1993)，90，6444-6448。减少接头还可形成ScFV三聚体(“三链抗体”，参阅Kortt等人(1997)Protein Eng，10，423-433)和四聚体(“四链抗体”，参阅Le Gall等人(1999)FEBS Lett，453，164-168)。还可采用蛋白二聚化基序经遗传融合实现双价ScFV分子的构建，以形成“微抗体”(参阅Pack等人(1992)Biochemistry 31，1579-1584)和″minibodies″(参阅Hu等人1996)，CancerRes.56，3055-3061)。还可以第三个肽接头连接两个ScFv单位，产生ScFv-Sc-Fv串联((ScFV)2)，参阅Kurucz等人(1995)J.Immol.154，4576-4582。
可通过两个单链融合产物的非共价结合产生双特异性抗体，其中单链融合产物由通过短接头连接到另一抗体VL域的一个抗体的VH域组成，参阅Kipriyanov等人(1998)，Int.J.Can 77，763-772。
可通过引入上文所述的二硫键或“孔穴结(knob in hole)”突变或通过形成单链的双链抗体(ScDb)增加这类双特异性抗体的稳定性，其中两个杂交ScFv片段由肽接头连接在一起，参阅Kontermann等人(1999)J.Immunol.Methods 226 179-188。
可通过例如将ScFv片段经铰链区融合到IgG分子的CH3结构域或Fab片段，得到四价双特异分子，参阅Coloma等人(1997)NatureBiotechnol.15，159-163。
或者，已通过双特异单链双链抗体的融合产生四价双特异分子(参阅Alt等人(1999)FEBS Lett 454，90-94)。
还可通过ScFv-ScFv串联与含有螺旋-环-螺旋基序的接头(DiBiminiantibodies，参阅Muller等人(1998)FEBS Lett 432，45-49)或包含具有阻止分子内配对取向的四个抗体可变域(VH和VL)的单链分子(串联双链抗体，参阅Kipriyanov等人，(1999)J.Mol.Biol.293，41-56)的二聚化形成更小的四价双特异分子。可通过Fab′片段的化学偶联或通过经亮氨酸拉链的异二聚化，产生双特异F(ab′)2片段(参阅Shalaby等人，(1992)J.Exp.Med.175，217-225和Kostelny等人(1992)，J.Immunol.148，1547-1553)。
短语“免疫球蛋白单可变域”系指独立于不同V区或V域以外并特异结合抗原或表位的抗体可变域(VH，、VHH，、VL)。免疫球蛋白单可变域可与其他不同的可变区或可变域一同出现(例如同多聚体或异多聚体)，其中单个免疫球蛋白可变域的抗原结合不需要其他区或域(即免疫球蛋白单可变域独立结合抗原，无需其他的可变域)。
还可使用分离的VH和VL域(Domantis plc)，参阅US 6,248,516、US 6,291,158、US 6,172,197，这些也被称为结构域抗体。“结构域抗体”或“dAb”与可结合到抗原的“免疫球蛋白单可变域”是相同的，正如该术语在本文中的使用。免疫球蛋白单可变域可为人抗体可变域，但还包括来自其他物种例如啮齿类的单个抗体可变域(例如WO 00/29004公开的抗体可变域，铰口鲨和骆驼科VHH dAb)。骆驼科VHH是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和原驼在内的物种的免疫球蛋白单可变域多肽，这些物种产生天然缺乏轻链的重链抗体。可依据本领域的标准技术使这类VHH域人源化，根据本发明这类结构域仍被认为是“结构域抗体”。本文使用的VH包括骆驼科VHH域。
在一个实施方式中，提供了上文所述的特异结合hIGF-1R并中和hIGF-1R活性的抗原结合片段(例如ScFv、Fab、Fab′、F(ab′)2)或基因工程抗原结合片段。抗原结合片段可包含一种或多种下列序列：SEQ.ID.NO：1列出的CDRH3、SEQ.ID.NO：2列出的CDRH2、SEQ.ID.NO：3列出的CDRH1、SEQ.ID.NO：4列出的CDRL1、SEQ.ID.NO：5列出的CDRL2和SEQ.ID.NO：6列出的CDRL3。
1.5异型结合抗体
异型结合抗体也构成本发明的一个实施方式。异型结合抗体由两个共价结合的抗体组成，可采用任何方便的交联方法形成。例如参阅US4,676,980。
此外，抗体和抗原结合片段的组合包括在本发明内，例如一种或多种结合单克隆抗体的结构域抗体和/或ScFv。
1.6其他修饰
抗体恒定区和各种Fc受体(FcγR)之间的相互作用被认为介导了抗体的效应子功能，包括抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)、补体结合、吞噬作用和抗体的半衰期/清除。根据所需的属性，可对本发明抗体的恒定区进行各种修饰。例如，EP 0629 240B1和EP 0307 434B2详细介绍了恒定区上可使得原本裂解的抗体变得不裂解的特异突变，或可向抗体掺入拯救受体结合表位，以增加血清半衰期，参阅US 5,739,277。目前认为有5种人Fcγ受体：FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生FcRn。Shields等人，(2001)J.Biol.Chem 276，6591-6604证明，一组常见的IgG1残基参与了所有FcγR的结合，而FcγRII和FcγRIII利用该常见组以外的显著位点。一组IgG1残基变为丙氨酸时降低了对所有FcγR的结合：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239。全部位于IgG的CH2域，聚集在连接CH1和CH2的铰链区附近。虽然FcγRI只利用常见组的IgG1残基进行结合，但FcγRII和FcγRIII除了与该常见组相互作用外，还与显著残基相互作用。一些残基的改变只降低对FcγRII(例如Arg-292)或FcγRIII(例如Glu-293)的结合。一些变体表现出对FcγRII或FcγRIII的增强结合，但不影响对其他受体的结合(例如Ser-267Ala增强了对FcγRII的结合，但对FcγRIII的结合不受影响)。其他变体表现出对FcγRII或FcγRIII的增强结合，同时减少对其他受体的结合(例如Ser-298Ala增强了对FcγRIII的结合，但降低了对FcγRII的结合)。对于FcγRIIIa，结合最强的IgG1变体联合了Ser-298、Glu-333和Lys-334的丙氨酸置换。新生FcRn受体被认为同时参与了抗体清除和组织间的胞吞转运作用(参阅Junghans R.P(1997)Immunol.Res 16.29-57和Ghetie等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766)。已测定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。本部分所述的这些位置其中任何一个的交换可使得本发明抗体延长血清半衰期和/或改变效应物属性。
其他的修饰包括本发明抗体的糖基化变体。抗体在其恒定区保守位置处的糖基化已知对抗体功能具有深刻的效应，特别是效应子功能，例如上文所述的效应子功能，例如参阅Boyd等人(1996)，Mol.Immunol.32，1311-1318。本发明抗体或其抗原结合片段的糖基化变体，其中预见了加入、置换、删除或修饰一个或多个碳水化合物部分。引入天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序产生酶促连接碳水化合物部分的潜在位点，并可因此用于操作抗体的糖基化。在Raju等人(2001)Biochemistry40，8868-8876中，采用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α-2，3-唾液酸转移酶经重新半乳糖苷化和/或重新唾液酸化的过程，增加TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。增加末端唾液酸化被认为可增加免疫球蛋白的半衰期。与大多数糖蛋白一样，抗体一般作为糖型的混合物产生。当在真核细胞特别是在哺乳动物细胞中产生抗体时，这种混合物特别明显。已开发出各种方法来生产确定的糖型，参阅Zhang等人Science(2004)，303，371；Sears等人，Science，(2001)291，2344；Wacker等人(2002)Science，298 1790；Davis等人(2002)Chem.Rev.102，579；Hang等人(2001)Acc.Chem.Res 34，727。
因此本发明预见了本文所述的多种(单克隆)抗体(可为IgG同种型，例如IgG1)，其包含确定数目(例如7个或更少，例如5个或更少，例如2个或1个)糖型的所述抗体或其抗原结合片段。
本发明的其他实施方式包括偶联到非蛋白聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯的本发明抗体或其抗原结合片段。蛋白与PEG的缀合是一种增加蛋白半衰期以及降低蛋白抗原性和免疫原性的成熟技术。已采用完整抗体以及Fab′片段研究具有不同分子量和类型(线性或分支)的聚乙二醇化的使用，参阅Koumenis I.L.等人(2000)Int.J.Pharmaceut.198：83-95。
2.产生方法
本发明的抗体可产生为多克隆群体，但更优选则产生为单克隆群体(即一群基本同源的针对一个特异抗原结合位点的相同抗体)。当然对于本领域技术人员显而易见的是，一群意味着一种以上的抗体实体。可在转基因生物例如山羊(参阅Pollock等人(1999)，J.Immunol.Methods231：147-157)、鸡(参阅Morrow KJJ(2000)Genet.Eng.News 20：1-55)、小鼠(参阅Pollock等人)或植物(参阅Doran PM，(2000)Curr.OpinionBiotechnol.11，199-204，Ma JK-C(1998)，Nat.Med.4；601-606，Baez J等人，BioPharm(2000)13：50-54，Stoger E等人；(2000)Plant Mol.Biol.42：583-590)中产生本发明的抗体。还可通过化学合成产生抗体。但是，一般采用本领域技术人员熟知的重组细胞培养技术产生本发明的抗体。分离编码抗体的多核苷酸，***到可复制的载体例如质粒上，进行进一步的克隆(扩增)或表达。一种有用的表达***是谷氨酸合成酶***(例如Lonza Biologics所销售的谷氨酸合成酶***)，特别是宿主细胞为CHO或NS0的表达***(见下文)。采用常规方法(例如寡核苷酸探针)容易分离和测序编码抗体的多核苷酸。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是典型的实施方式。一般而言，这些载体还含有可操作地连接到轻链和/或重链多核苷酸以促进表达的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。编码轻链和重链的多核苷酸可被***到不同的载体，并转染到相同的宿主细胞体内，或如需要，重链和轻链可均被***到相同的载体上以转染宿主细胞。因此，根据本发明的一个方面，提供了一种构建编码本发明抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的载体的方法，该方法包括向载体***编码本发明抗体轻链和/或重链的多核苷酸。
本领域技术人员已知，可通过改变用于基因的密码子来设计编码与天然基因或野生型基因相同蛋白的合成基因。
这些设计技术包括将基因中哺乳动物基因极少使用的这些密码子替换为哺乳动物基因更常用于该氨基酸的密码子。这一方法被称为密码子优化，使用目的是与用野生型序列转染时的水平相比，用密码子优化的基因转染时，宿主细胞产生的蛋白总水平要更高。已发表了几种方法(Nakamura等人，Nucleic Acids Research 1996，24：214-215；W098/34640；W097/11086)。
可从文献来源得到许多物种高度表达基因的密码子频率(例如参阅Nakamura等人Nucleic Acids Research 1996，24：214-215)。人类密码子使用表也已发表(WO2005025614)。
对于本领域技术人员立即显而易见的是，由于遗传密码的简并性，还可获得编码本发明多肽的本文所公开多核苷酸的替代多核苷酸(特别是密码子被优化以用于给定宿主细胞内表达的这些多核苷酸)。
3.1信号序列
本发明的抗体可产生为具有异源信号序列的融合蛋白，该融合蛋白在成熟蛋白的N端具有特异的切割位点。信号序列应被宿主细胞识别和加工。对于原核宿主细胞而言，信号序列可为例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素II的前导序列。为了便于酵母分泌，信号序列可为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列，例如参阅WO90/13646。在哺乳动物细胞***中，病毒分泌性前导序列例如单纯疱疹病毒gD信号序列和天然的免疫球蛋白信号序列可能是适宜的。一般而言，信号序列按阅读框被连接到编码本发明抗体的DNA上。
3.2复制起点
复制起点为本领域所熟知，其中pBR322适合大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒适合大多数酵母和各种病毒来源，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒，VSV或BPV适合大多数哺乳动物细胞。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分，但可使用SV40，因为它含有早期启动子。
3.3选择标记
典型的选择基因编码(a)提供抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素抗性的蛋白或(b)弥补营养缺陷或供应复合培养基不含有的营养物的蛋白。选择方案可包括抑制宿主细胞生长。由于例如选择标记提供的抗药性，已成功被编码本发明抗体的基因转化的细胞存活下来。另一实例是所谓的DHFR选择标记，其中在甲氨蝶呤的存在下培养转化体。在典型的实施方式中，在递增量的甲氨蝶呤的存在下培养细胞，以扩增目的外源基因的拷贝数。CHO细胞是对于DHFR选择特别有用的细胞系。另一实例是谷氨酸合成酶表达***(Lonza Biologics)。一种适合用于酵母的选择基因是trp1基因，参阅Stinchcomb等人Nature282，38，1979。
3.4启动子
表达本发明抗体的适宜启动子被可操作地连接到编码抗体的DNA/多核苷酸。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子***、碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子例如Tac。适合于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶。诱导型酵母启动子包括醇脱氢酶、异细胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶。
用于在哺乳动物细胞***中表达的启动子包括病毒启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是立即早期基因启动子)、反转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猿猴病毒40。当然，启动子的选择是基于与用于表达的宿主细胞的适宜相容性的。因此在一个实施方式中，提供了包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码本发明轻链可变域(VL)的DNA、κC区以及新霉素和氨苄青霉素抗性选择标记的的第一质粒和包含RSV或SV40启动子、编码本发明重链可变域(VH)的DNA、编码γ1恒定区的DNA、DHFR和氨苄青霉素抗性标记的第二质粒。
3.5增强子元件
在适宜情况下，例如对于高等真核生物表达，可使用可操作地连接到载体上的启动子元件的增强子元件。适宜的哺乳动物启动子序列包括来自珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子(100-270bp处)、巨细胞病毒立即早期启动子的增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠IgG2a位点(参阅WO04/009823)。增强子可位于载体上启动子上游的位置。
3.5.5多腺苷酸化信号
在真核生物***中，多腺苷酸化信号被可操作地连接到编码本发明抗体的DNA/多核苷酸上。这类信号一般位于开放阅读框的3’。在哺乳动物***中，非限制性实例包括源自生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如SV40)基因或反转录病毒长末端重复的信号。在酵母***中，多腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脱氢酶1(ADH)基因的信号。在原核生物***中，一般不需要多腺苷酸化信号，相反通常使用更短和更确定的终止子序列。当然，多腺苷酸化/终止序列的选择是基于与用于表达的宿主细胞的适宜相容性的。
3.6宿主细胞
适合于编码本发明抗体的克隆载体或表达载体的宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。适宜的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科，例如埃希氏菌属，例如大肠杆菌(例如ATCC 31，446；31，537；27，325)、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属(Klebsiella)、变性杆菌属(Proteus)、沙门菌属例如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌、志贺氏菌属以及杆菌属例如枯草杆菌和地衣芽孢杆菌(参阅DD 266710)、假单胞菌属例如铜绿假单胞菌和链霉菌属。在酵母宿主细胞中，还预见了酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、克鲁维酵母菌属(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56，500)、yarrowia(EP402,226)、毕赤酵母(EP183,070,另外参阅Peng等人J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌属、里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)、Penicillin、Tolypocladium、曲霉属宿主例如构巢曲霉和黑曲霉。
尽管本发明特别预见了原核和酵母宿主细胞，但本发明的宿主细胞是高等真核细胞。适宜的高等真核宿主细胞包括哺乳动物细胞例如COS-1(ATCC NO：CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、人胚肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL10314)、293(ATCC NO：CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-K1，ATCC NO：CCL 61)、DHFR-CHO细胞系例如DG44(参阅Urlaub等人，(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12，555-556))、特别是改造用于悬浮培养的这些CHO细胞系，小鼠塞托利细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL 75)、Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞例如NS0(参阅US 5,807,715)，Sp2/0，Y0。
因此在本发明的一个实施方式中，提供了稳定转化的宿主细胞，其包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的载体。这类宿主细胞包含编码轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。
细菌发酵
细菌***特别适合于抗原结合片段的表达。这类片段位于细胞内部或位于周质内。可依据本领域技术人员知晓的方法提取和重新折叠不溶的周质蛋白，形成活性蛋白，参阅Sanchez等人(1999)J.Biotechnol.72，13-20和Cupit PM等人(1999)Lett Appl Microbiol，29，273-277。
3.7细胞培养方法
可用本领域技术人员知晓的任何方法培养以编码本发明抗体或其抗原结合片段的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可培养在转瓶、滚瓶或中空纤维***中，但对于大规模生产，则特别使用搅拌釜反应器，用于悬浮培养。优选情况下，采用喷雾器、挡板或低剪切叶轮改造搅拌釜，便于曝气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可使用空气或氧气泡进行直接曝气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，培养基添加了细胞保护剂，例如pluronic F-68，以帮助防止曝气过程带来的细胞损害。根据宿主细胞的特点，对于贴壁依赖性细胞系可使用微载体作为生长基底，或者可使细胞适应悬浮培养(一般做法)。宿主细胞的培养，特别是无脊椎宿主细胞可使用各种操作方式，例如分批补料、反复分批工艺(参阅Drapeau等人(1994)cytotechnology 15：103-109)、延长分批工艺或灌注培养。虽然可在含有血清例如胎牛血清(FCS)的培养基中培养重组转化的哺乳动物宿主细胞，但是这类宿主细胞可培养在合成的无血清培养基例如Keen等人(1995)Cytotechnology 17：153-163公开的培养基，或市售培养基例如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)，如有需要则添加能源例如葡萄糖和合成的生长因子例如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可能需要这些细胞适应在无血清条件下生长。一种改造方法是将这类宿主细胞培养在含有培养基的血清中，并且反复地将80％培养基更换为无血清培养基，使得宿主细胞学会适应无血清条件(例如参阅ScharfenbergK等人(1995)in Animal Cell technology：Developments towards the 21 stcentury(Beuvery E.C.等人eds)，619-623页，Kluwer Academic publishers)。
可采用各种技术回收和纯化分泌到培养基中的本发明抗体，以提供适合目的用途的纯度。例如使用本发明抗体治疗人患者一般要求至少95％纯度，更一般为98％或99％或更高纯度(与粗培养基相比)。在第一种情况下，一般先采用离心，随后采用例如微量过滤、超滤和/或深层过滤的上清澄清步骤，除去细胞培养基中的细胞碎片。可使用各种其他技术，例如透析和凝胶电泳以及层析技术，例如羟基磷灰石(HA)、亲和层析(任选包含亲和标记***例如多组氨酸)和/或疏水作用层析(HIC，参阅US 5,429,746)。在一个实施方式中，在各个澄清步骤之后，采用蛋白A或蛋白G亲和层析和随后的其他层析步骤例如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、尺寸排阻色谱法和硫酸铵沉淀捕获本发明抗体。一般情况下，还使用了各种病毒清除步骤(例如采用如DV-20滤膜进行纳滤)。完成这些不同步骤后，提供了包含至少75mg/ml或更高例如100mg/ml或更高的本发明抗体或其抗原结合片段的纯化(优选为单克隆)制剂，因此构成本发明的一个实施方式。适宜情况下，这类制剂基本不含聚集形式的本发明抗体。
4.药物组合物
上述的本发明抗体的纯化制剂(特别是单克隆制剂)可掺入到用于治疗下列任疾病和疾患的药物组合物中，例如风湿性关节炎、银屑病或癌症例如急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌、艾滋病相关淋巴瘤、***癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、结肠直肠癌、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、脑肿瘤(例如脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、胃肠道类癌瘤、不明原发性中枢神经***癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、***、儿童期癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞源性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤眼癌(IntraocularMelanoma Eye Cancer)、视网膜母细胞瘤眼癌、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠道类癌、生殖细胞肿瘤(例如颅外、性腺外和卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(例如成人、儿童脑干、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视通路和下丘脑)、多毛细胞白血病、头颈部癌、肝(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、白血病(例如急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性髓细胞源性和多毛细胞)、唇癌和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病有关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金和原发性中枢神经***)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、恶性骨纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、髓细胞源性白血病、慢性髓细胞源性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增殖性疾病、鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征、非黑色素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠滋养细胞肿瘤、原发部位不明癌、原发部位不明癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、视通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
一般而言，这类组合物包含可接受的药物实践所知晓和要求的药用载体，例如参阅Remingtons Pharmaceutical Sciences，16th edition，(1980)，Mack Publishing Co。这类载体的实例包括以适宜缓冲液将pH缓冲至5-8范围的无菌载体例如生理盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
适宜情况下，用于注射(例如静脉、腹膜内、皮内、皮下、肌内或门静脉)或连续输注的药物组合物不含可见颗粒物，可包含0.1ng-100mg的抗体，例如5mg-25mg的抗体。制备这类药物组合物的方法为本领域技术人员所熟知。在一个实施方式中，药物组合物包含0.1ng-100mg单位剂型的本发明抗体，任选包含使用说明。可依据本领域技术人员熟知或显而易见的方法，在给药前将本发明的药物组合物进行冻干(冻干)，以备重建。当本发明的实施方式包含具有IgG1同种型的本发明抗体时，可在药物组合物中加入铜螯合剂例如柠檬酸(例如柠檬酸钠)或EDTA或组氨酸，以降低铜介导的该同种型抗体的降解程度，参阅EP0612251。
用于给予本发明抗体或其抗原结合片段的有效剂量和治疗方案一般由经验确定，并取决于年龄、体重、患者健康状况和需治疗疾病或疾患等因素。这些因素处于主治医师知晓的范围内。选择适宜剂量的指南可见于例如Smith等人(1977)Antibodies in human diagnosis and therapy，Raven Press，New York，但一般为1mg-1000mg。
在方便的情况下，本发明还预见了包含本发明抗体或其抗原结合片段和其他药物以及使用说明的各个部分的药物组合物。
本发明还预见了包含本文所述的治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗对IGF-1和IGF-1R之间或IGF-II和IGF-IR之间相互作用中和作出响应的疾病。
根据本发明，提供了一种包含治疗有效量的单克隆人源化抗体的药物组合物，其中该抗体包含选自于由SEQ ID NO：14组成的组的VH域和选自于由SEQ ID NO：16组成的组的VL域。
根据本发明，提供了一种包含治疗有效量的单克隆人源化抗体的药物组合物，其中该抗体包含选自于由SEQ ID NO：15组成的组的VH域和选自于由SEQ ID NO：16组成的组的VL域。
在方便的情况下，本发明还预见了包含本发明抗体或其抗原结合片段以及其他这类药物和任选的使用说明各个部分的药物组合物。
本发明还预见了包含本文所述的治疗有效量的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其用于治疗对中和IGF-1R活性作出响应的疾病。
在本发明的另一实施方式中，一种药物组合物，其包含结合其他治疗剂或放射疗法的抗体，例如结合其他类型的药物，包括有丝***抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗生存剂、生物反应调节剂、抗激素剂和抗血管生成剂包括抗生长因子受体拮抗剂例如曲妥珠单抗(赫赛汀)、爱必妥(西妥昔单抗)、抗生长因子抗体例如贝伐单抗(阿瓦斯丁)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、神经生长因子(NGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)拮抗剂、小分子酪氨酸激酶抑制剂包括拉帕替尼、吉非替尼等、化疗剂包括吉西他滨、依立替康、紫杉醇、顺铂、阿霉素、拓扑替康、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、达卡巴嗪、柔红霉素、氨基喜树碱、依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、噻替哌、泰索帝、白消安、环磷酰胺、紫杉醇、甲氨蝶呤、长春碱、博莱霉素、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D，该药物组合物用于治疗人疾病或疾患，例如风湿性关节炎、银屑病或癌症例如急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌、艾滋病相关淋巴瘤、***癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、结肠直肠癌、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、脑肿瘤(例如脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、胃肠道类癌、不明原发性中枢神经***癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、***、儿童期癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞源性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤眼癌、视网膜母细胞瘤眼癌、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠道类癌、生殖细胞肿瘤(例如颅外、性腺外和卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(例如成人、儿童脑干、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视通路和下丘脑)、多毛细胞白血病、头颈部癌、肝(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、白血病(例如急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性髓细胞源性和多毛细胞)、唇癌和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病有关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金和原发性中枢神经***)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、恶性骨纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、髓细胞源性白血病、慢性髓细胞源性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增殖性疾病、鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征、非黑色素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠滋养细胞肿瘤、原发部位不明癌、原发部位不明癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、视通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
本发明的抗体或其抗原结合片段可与一种或多种其他治疗活性剂或辐射联合使用，例如与其他类型的药物联合使用，其中包括有丝***抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗生存剂、生物反应调节剂、抗激素剂和抗血管生成剂包括抗生长因子受体拮抗剂例如曲妥珠单抗(赫赛汀)、爱必妥(西妥昔单抗)、抗生长因子抗体例如贝伐单抗(阿瓦斯丁)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、神经生长因子(NGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)拮抗剂、小分子抗IGF-1R剂、小分子酪氨酸激酶抑制剂包括拉帕替尼、吉非替尼等、化疗剂包括吉西他滨、依立替康、紫杉醇、顺铂、阿霉素、拓扑替康、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、柔红霉素、氨基喜树碱、依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、噻替哌、泰索帝、白消安、环磷酰胺、紫杉醇、甲氨蝶呤、长春碱、博莱霉素、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D。
因此本发明在又一实施方式中提供了这种组合在治疗疾病中的用途(其中IGF-1受体信号传导促进疾病或其中中和受体活性是有益的)和抗体或其抗原结合片段在生产用于联合治疗下列疾病的药物中的用途，例如风湿性关节炎、银屑病或癌症例如急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌、艾滋病相关淋巴瘤、***癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、结肠直肠癌、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、脑肿瘤(例如脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、胃肠道类癌、不明原发性中枢神经***癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、***、儿童期癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞源性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因家族瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤眼癌、视网膜母细胞瘤眼癌、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠道类癌、生殖细胞肿瘤(例如颅外、性腺外和卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(例如成人、儿童脑干、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视通路和下丘脑)、多毛细胞白血病、头颈部癌、肝(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、白血病(例如急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性髓细胞源性和多毛细胞)、唇癌和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病有关、伯基特、皮肤T细胞、霍奇金、非霍奇金和原发性中枢神经***)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、恶性骨纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、髓细胞源性白血病、慢性髓细胞源性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增殖性疾病、鼻腔癌和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征、非黑色素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠滋养细胞肿瘤、原发部位不明癌、原发部位不明癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、视通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
当本发明的抗体或其抗原结合片段与其他治疗活性剂联合使用时，可通过任何方便的途径依次或同时、联合或单独给予各组分。
上述组合可方便地以药物制剂的形式使用，因此包含上述定义组合的药用制剂以及优选的药用载体或赋形剂组成了本发明的又一实施方式。这类组合的单个组分可以在分离或组合的药物制剂中与一起或分离地、依次或同时的给予。
当组合在相同的制剂中时，应理解的是，两个组分必须是稳定的，并且相互之间以及与制剂的其它组分之间配伍，并且可以配成制剂用于给药。当分开配制时，可将它们提供为任何方便的制剂，即本领域已知用于抗体及其抗原结合片段的方便方式。
当与治疗相同疾病的第二种治疗剂组合时，每个组分的剂量可不同于抗体或其抗原结合片段单独使用时的剂量。本领域技术人员会轻易地领悟到适宜的剂量。
因此本发明在又一实施方式中提供了一种组合，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及另一种治疗活性剂。
上述组合可方便地以药物制剂的形式使用，因此包含上述定义组合的组合及其药用载体代表了本发明的又一实施方式。
下列实施例阐述了本发明的各个方面。这些实施例没有限制由附带的权利要求所限定的本发明范围。
实施例
实施例1-单克隆抗体的产生
一般依据E Harlow和D Lane，Antibodies a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988提出的方法以杂交瘤细胞产生单克隆抗体(mAb)。SJL小鼠腹腔注射配制于RIBI佐剂中的重组人IGF-1R(R&DSystems，#305-GR)，进行初次免疫和加强免疫。收集应答动物的脾脏，与X63Ag8653GFP1L5骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤。采用FMAT(ABI8200)和BIAcore A100筛查杂交瘤上清物质对IGF-1R的结合。使用ABI8200确认对重组IGF-1R(R&D Systems-305-GR-050和391-GR-050)和HEK293T表达的人IGF-1R、HEK293T表达的食蟹猴IGF-1R的结合和缺乏对HEK293T所表达的人胰岛素受体的结合。使用BIAcore A100估算杂交瘤产生的抗体对重组IGF-1R(R&D Systems，#305-GR)的结合动力学。采用兔抗小鼠IgG(BR-1005-14，Biacore AB)将抗体捕获到芯片表面。采用半固体培养基(甲基纤维素溶液)、Omnitrays和ClonePix FL***进行目的杂交瘤的单克隆。
实施例2-杂交瘤物质和单克隆抗体的扩增和纯化。
对待扩增的杂交瘤进行组织培养，使其扩增至4个铺满的225cm2培养瓶的规模。此时400g离心5分钟收集细胞。沉淀重新悬浮在100ml无血清培养基(JRH610)中以洗涤细胞。细胞随后以400g离心5分钟。吸出上清，弃去。加入150ml新鲜无血清培养基，重新悬浮细胞沉淀。细胞悬浮液随后转移到干净的225cm2培养瓶，在培养箱中放置5天。随后收集上清，400g离心20分钟。收集上清，0.2μM滤膜无菌过滤，以备纯化。采用蛋白A树脂柱纯化抗体。纯化的抗体以PBS pH7.4进行透析。
实施例3-IGF-1R表达载体的构建
全长人IGF-1R的表达盒的产生
除核苷酸3510处发生变化以外，人IGF-1R cDNA表达盒与GenbankX04434相同。这导致编码甘氨酸1170的密码子发生从“GGC”到“GGG”的沉默变化。人IGF-1R cDNA在pcDNA3.1(-)载体(Invitrogen)上表达。SEQID NO 44列出了人IGF-1R的序列。
全长鼠IGF-1R的表达盒的产生
除核苷酸3522处发生变化以外，鼠IGF-1R cDNA表达盒与GenbankAF056187相同。这导致编码甘氨酸1174的密码子发生从“GGT”到“GGG”的沉默变化。鼠IGF-1R cDNA在pcDNA3.1D-V5-His TOPO载体(Invitrogen)上表达。SEQ ID NO 46列出了鼠IGF-1R的序列。
全长食蟹猴(Macaca fascicularis)IGF-1R的表达盒的产生
从食蟹猴肾cDNA文库经PCR克隆用于食蟹猴IGF-1R的新序列。引物基于人IGF-1R数据库的条目NM 000875。将PCR引物的5′端设计为Kozak基序，两侧设计为BamHI和NotI限制酶切位点。BamHI-NotIPCR产物被克隆到pCDNA3.1D上，该载体的T7序列靠近IGF-1R编码序列的5’端。获得的cDNA与人序列在蛋白水平的相似性为99.6％(与人的序列有4个氨基酸的差异)SEQ ID NO 45列出了食蟹猴IGF-1R的序列。
全长人胰岛素受体(B型)的表达盒的产生
编码B型人胰岛素受体(SEQ ID NO 53)的DNA盒被克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)。比较而言，SEQ ID NO 53的编码序列与Genbank条目：M10051给出的序列是相同的，除了下列变化不同以外：
核苷酸编号基于起始甲硫氨酸的“A”是核苷酸1(对应于M10051核苷酸序列的139位置)。
核苷酸    氨基酸    SEQ ID No 53    M10051
511       171       TAC(Tyr)        CAC(His)
783       261       GAT(Asp)        GAC(Asp)
909       303       CAG(Gln)        CAA(Gln)
1343      448       ATC(Ile)        ACC(Thr)
1474      492       CAG(Gln)        AAG(Lys)
1638      546       GAC(Asp)        GAT(Asp)
1650      550       GCA(Ala)        GCG(Ala)
3834      1278      AAC(Asn)        AAG(Lys)
采用标准方案和Lipofectamine试剂(Invitrogen)在293HEK-T细胞中瞬时表达人、鼠和食蟹猴IGF-1R和B型人胰岛素受体的载体。
实施例4-采用BacMam产生和表达重组蛋白
pFastBacMam载体骨架的构建
以SnaBI和Hpa1消化pFastBac 1(Invitrogen)，除去多角体蛋白启动子。载体与来自pcDNA3(Invitrogen)的3.1kb NruI-Bst1107I片段连接，该片段含有具有多接头和BGH polyA位点的食蟹猴立即早期(CMV IE)启动子和驱动G418抗性基因表达的SV40启动子。该载体允许杆状病毒的产生，该病毒在哺乳动物细胞中表达处于CMV启动子控制下的基因。还有可能将细胞置于G418选择下来选择稳定衍生物。
人IGF-1R-Fc融合蛋白
构建用于表达人IGF-1R胞外域序列的质粒，这些序列与Xa因子切割位点和来自IgG1的人Fc序列融合在一起。编码人IGF-1R cDNA胞外域(1-935氨基酸)的序列经PCR进行扩增，随后融合到Xa因子切割位点和来自人IgG1的Fc序列。随后整个***物作为HindIII-BamHI片段被亚克隆到pFastBacMam表达载体上。SEQ ID NO 47列出了人IGF-1R-Fc融合蛋白的序列。
食蟹猴(Macaca fascicularis)IGF-1R-Fc融合蛋白
构建用于表达食蟹猴IGF-1R胞外域序列的质粒，这些序列与Xa因子切割位点和来自IgG1的人Fc序列融合在一起。采用XbaI切割和重连接，除去载体骨架的82bp XbaI片段，修饰人IGF-1R表达质粒。这步除去了第二个NotI位点。食蟹猴IGF-1R(1-935氨基酸)胞外域的编码序列作为HindIII-NotI片段经PCR进行扩增，随后连接到修饰的人IGF-1R表达质粒，该表达质粒已用HindIII和Not I切割除去了人序列。SEQ IDNO 48列出了食蟹猴IGF-1R-Fc融合蛋白的序列。
采用BacMam表达重组蛋白
使用编码与Xa因子切割位点和来自人IgG1的Fc序列融合在一起的人和食蟹猴IGF-1R胞外域的质粒载体，利用BacMam***指导蛋白表达。采用Invitrogen Bac-to-Bac***产生杆状病毒。采用标准步骤将初始的P0储备液放大到1升的P1储备液。采用所需的BacMam病毒(感染复数一般为10-100∶1，但该值通常被优化以使蛋白产生最大化)感染1-5升悬浮培养的HEK293-F细胞，启动蛋白产生。培养2-3天后，收集细胞培养上清，离心除去细胞，随后从澄清的上清中纯化表达的蛋白。
实施例5-IGF-1R配体表达质粒的构建
优化用于加工形式的IGF-I(氨基酸49-118，Swiss-prot P01343)和IGF-II(氨基酸25-91，Swiss-prot P01344)的基因序列的密码子，以用于在大肠杆菌中表达。将重叠的寡核苷酸逐步连接起来，从头制备基因，克隆到pET-21b(Novagen)的NdeI-BamHI位点。为了产生生物素化的IGF-1R配体，该基因的构建还包含C-末端15个氨基酸的生物素化标记序列(GLNDIFEAQKIEWHE，参考：Schatz(1993)Biotechnology(N Y)，11(10)：1138-43)SEQ ID NO：17。
SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 51分别列出了人IGF-I配体和IGF-II配体的序列。
实施例6-IGF-1R配体的表达和纯化
质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞，随后采用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基和随后以1mM IPTG在37℃下诱导16小时，进行表达。离心收集细胞沉淀。细胞沉淀重新悬浮在50mM Tris pH8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT中，分离不溶包涵体形式的IGF-1R配体，超声裂解，随后离心回收包涵体组分。包涵体以50mM TrispH8.0，6M盐酸胍溶解，快速稀释到100倍过量体积的50mM Tris pH8.0，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽，随后在4℃下混合16小时，产生可溶的IGF-1R配体。浓缩可溶蛋白，离心除去不溶物质，随后采用Spherisorb C6柱(Waters)和乙腈梯度以反相HPLC纯化具有生物活性的IGF-1R配体。
对于具有生物素化标记的IGF-1R配体，向纯化蛋白加入5mM ATP，5mM MgCl2，1mM d-生物素和1μM生物素连接酶，进行生物素化。混合物在室温下温育3小时。采用Superdex 75柱(GE Healthcare)以尺寸排阻色谱法纯化生物素化的IGF-1R配体。纯化的IGF-1R配体以PBS透析，采用BSA标准和基于BioRad coomassie的蛋白测定进行定量，随后-80C分装保存。纯化蛋白的分子量以质谱确认。SEQ ID NO 50和SEQ ID NO52分别列出了人标记IGF-I配体和标记IGF-II配体的序列。
实施例7-杂交瘤可变域的测序
采用来自Qiagen(#74106)的RNeasy试剂盒提取每个杂交瘤克隆约106个细胞的沉淀的总RNA。使用Promega AccessQuick RT-PCR System(A1702)，利用特异针对鼠前导序列和鼠IgG1/K或IgG2b/K恒定区的简并引物，产生可变重链区和可变轻链区的cDNA。采用TA克隆试剂盒(Invitrogen(K2030-40))克隆纯化的RT-PCR片段，通过序列比对、数据库检索和与KABAT(Sequences of Proteins of Immunological Interest，4thEd.，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes ofHealth(1987)列出的已知免疫球蛋白可变序列的比对，获得每个杂交瘤的共有序列。
下表1显示了杂交瘤6E11、9C7、2B9、15D9和5G4可变域的序列编号：
杂交瘤    可变重链区的    可变轻链区的
          SEQ ID编号      SEQ ID编号
6E11      8               9
9C7       18              19
2B9       10              11
5G4       20              21
15D9      22              23
表1-杂交瘤可变重链区和可变轻链区的SEQ I.D编号。注意：表1所示的序列不包含信号序列。
实施例8：嵌合抗体的构建
以PCR克隆构建嵌合抗体，其包含移植到人IgG1/κ野生型恒定区的亲本鼠可变域。根据共有序列，设计用于扩增鼠可变域的引物，同时掺入促进克隆到哺乳动物表达载体所需的限制酶切位点。SEQ I.D.NO：24和SEQ I.D.NO：25给出了6E11嵌合抗体(6E11c)的全长重链和轻链。
实施例9：人源化策略
通过将来自鼠6E11抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1和CDRL3和来自鼠9C7抗体的CDRL2移植到适宜的人框架序列的这一过程，产生人源化抗体。
(SEQ I.D.NO：16)给出了L0的人源化可变轻链域序列。
SEQ I.D.NO：14和SEQ I.D.NO：15分别给出了H0和H1的人源化可变重链域序列。SEQ ID NO：34(H0)、35(H1)和36(L0)显示了编码这些序列的优化核苷酸序列。SEQ ID NO：61和62分别给出了替代性的L0和H0可变域序列，SEQ ID NO：69和70给出了替代性的L0轻链和H0重链序列。
人源化抗体载体的构建
采用基于PCR的策略和重叠寡核苷酸从头构建编码人源化可变重链区和可变轻链区的DNA片段。PCR产物被分别克隆到含有人γ1恒定区和人κ恒定区的哺乳动物表达载体上。这是野生型Fc区。
采用类似的策略，可变重链区也被克隆到含有两个丙氨酸置换L235A和G237A(EU索引编号)的人γ1恒定区变体。这些构建体在本文中被称为IgG1m(AA)。H0L0 IgG1m(AA)(SEQ ID NO 54和SEQ ID NO 39)和H1L0 IgG1m(AA)(SEQ ID NO 56和SEQ ID NO 39)列出了包含IgG1m(AA)变体的两个人源化构建体。
除非另有说明，本文实施例所使用的所有人源化构建体都包含野生型人γ1恒定区。
实施例10-重组抗体在CHO细胞中的表达
分别编码嵌合抗体或人源化抗体重链和轻链的表达质粒被瞬时共转染到CHO-K1细胞内。在一些情况下，上清物质用作结合和活性测定中的受试物。在其他的情况下，无菌过滤上清物质，采用蛋白A经亲和层析回收抗体。抗体还在稳定的多克隆CHO细胞***中表达。编码重链和轻链的DNA载体被共电穿孔到悬浮的CHO细胞内。细胞在MR1基础选择性培养基上于摇瓶(37℃、5％CO2、130-150rpm)中进行传代，直到提高细胞活性和细胞数目。CHO细胞随后接种到MR1基础x2选择性培养基上，在34℃、5％CO2、130-150rpm下温育10到14天。离心沉淀细胞，无菌过滤上清。以蛋白A纯化法回收抗体。
杂交瘤和/或嵌合mAb和/或人源化mAb之间的比较数据
实施例11-受体结合ELISA
0.4μg/mL组氨酸标记的重组人IGF-1R(R&D Systems，#305-GR-050)被捕获到包被0.5-1μg/mL抗6xHis的兔多克隆抗体(Abcam，#ab9108)的ELISA平板上。来自受试上清或纯化物质的抗-IGF-1R抗体被滴定到平板上。以结合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG抗体(Dako，P0260)或山羊抗人κ轻链过氧化物酶结合物(Sigma，A7164)进行处理，检测受体结合的水平。采用二盐酸邻苯二胺(OPD)过氧化物酶底物(Sigma，P9187)使ELISA显色。
图1显示了鼠抗体6E11、5G4和15D9的结合曲线。
图2显示了H0L0、H1L0、H0L0 IgG1m(AA)和H1L0 IgG1m(AA)的结合曲线，证实它们与6E11嵌合抗体相比具有类似的结合活性。检测了其他的单克隆抗体(数据未显示)。
实施例12-受体下调
3T3/LISN c4细胞(表达人IGF-1R的鼠NIH 3T3细胞系，参阅Kaleko等人(1990)Molecular and Cellular Biology，10(2)：464-473))与5μg/mL抗体在37℃下温育24小时，随后收集细胞。这些细胞沉淀的裂解物在SDSPAGE凝胶上电泳，随后转移到PVDF膜(蛋白印迹)。以兔抗IGF-1RβC-20抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-713)处理，随后以结合HRP的抗兔二抗(P0217)处理，检测IGF-1R，随后采用增强化学发光(ECL)试剂(GEHealthcare)检测。
图3显示以单克隆抗体6E11温育3T3/LISN c4细胞导致IGF-1Rβ链的下调。
在一个类似的实验中，以H0L0处理后，测定NCI-H838细胞中受体的水平。表达人IGF-1R的NCI-H838细胞(1×106/孔)以5μg/孔的H0L0温育不同时间，最长为24小时。随后收集细胞，裂解细胞沉淀，进行SDS PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜，采用兔抗IGF-1Rβ c-20抗体(Santa Cruz，sc713)检测IGF-1R印迹。以抗兔HRP抗体(Dako，PO217)检测结合。从左到右蛋白印迹的泳道分别为：无抗体对照(24小时后收集)、其次为0、0.2、0.5、1、1.5、3、6和24小时后的收集物。图4显示早在暴露后30分钟(0.5h)，H0L0就诱导了降解，但需要3小时持续暴露，IGF-1R水平才能达到基础水平。在另一实验中，以各种抗体包括6E11亲本抗体、6E11嵌合抗体、H0L0温育Colo205细胞导致蛋白印迹测得的受体水平显著下降，其中蛋白印迹检测IGF-1R β-链(数据未显示)。
在后续实验中，以人源化治疗性抗IGF-1R抗体处理NCI-H838肺癌细胞。NCI-H838细胞以血清饥饿(starve)处理24小时，随后或未处理(对照)，或以120nM H0L0、H0L0 IgG1m(AA)或非靶向人IgG(对照)处理24小时。细胞以冰冷PBS洗涤两次，随后以1％NP40裂解缓冲液冰上裂解10分钟，16400rmp、4℃离心20分钟进行澄清，50μg可溶细胞蛋白随后在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上进行还原性SDS PAGE。电泳后，蛋白转移到PVDF膜，免疫印迹检测IGF-1R或胰岛素受体。还采用免疫印迹检测膜上的α-微管蛋白，评测每个泳道的上样。使用荧光标记二抗，采用LI COR Odyssey成像***对IGF-1R、胰岛素受体和α-微管蛋白进行定量。使用的一抗和二抗选自Alexa680山羊抗兔(Molecular Probes #A-21076)。使用的1/20000＝每10ml加入0.5ml(45min，25℃)，IRDye800，驴抗小鼠(Rockland#610-732-124)。使用的1/10000＝每10ml加入1ml(45min，25℃)，IRDye800，驴抗兔(Rockland #611-732-127)。使用的1/10000＝每5ml加入0.5ml(45min，25℃)。
图5显示了IGF-1R的97kDaβ亚基和200kDa全长的IGF-1R、胰岛素受体的95kDaβ亚基、200kDa全长胰岛素受体和50kDa的α微管蛋白。以人源化抗体温育导致IGF-1R水平显著下降——与对照抗体处理的样品相比下降约80％(图5)。这种下降同时伴有胰岛素受体水平的下降，最有可能是因IGF-1R/胰岛素受体异型四聚体的降解引起。
采用基于FACS的全血测定(除去红细胞)也显示了LISN/3T3c4细胞的受体下调。4℃或37℃下向来自一位供体(供体90263)的全血样品加入H0L0，处理24小时。图6显示了4℃(实线)和37℃(虚线)粒细胞和淋巴细胞群体荧光强度的叠加直方图(采用前向散射角和侧向散射角进行设门)。温育后，采用PE标记的抗IGF-1R抗体1H7(BD Pharmingen，#555999)测定受体水平。在一个不同的实验中，4℃或37℃下向来自一位不同供体(供体90691)的全血样品加入H0L0或对照IgG，处理24小时。图7显示了与同种型对照相比4℃和37℃下的粒细胞群体荧光强度的叠加直方图。在两位供体中，与相同细胞系在4℃下的温育相比，37℃下温育4小时导致平均荧光强度显著下降。以来自其他几位供体的全血样品重复该测定，得到类似的整体效果，虽然受体表达和下降的大小在供体之间各有不同。少数供体表现出不受抗体温育影响的极低的受体表达。
实施例13-IGF-1或IGF-II的抑制刺激受体磷酸化
3T3/LISN c4细胞以10000细胞/孔的密度被铺板到96孔平板，在完全DMEM(DMEM-Hepes改良培养基+10％FCS)中生长1-2天。向细胞加入抗hIGF-1R抗体(杂交瘤上清或纯化抗体)，温育1小时。向处理的细胞加入30-50ng rhIGF-1(R&D Systems 291-G1或50ng/ml rhIGF-I(参阅实施例5和6)或100ng/ml rhIGF-2(R&D Systems 292-G2)(参阅实施例5和6)，又温育20-30分钟以刺激受体磷酸化。细胞以PBS洗涤一次，随后加入RIPA裂解缓冲液(150mM NaCl，50mM TrisHCl，6mM脱氧胆酸钠，1％Tween 20)以及蛋白酶抑制剂混合物(Roche 11697498001)进行裂解。平板冷冻30分钟或过夜冷冻。冻融后，每孔的裂解物被转移到96孔ELISA平板，其中ELISA平板已被2μg/ml的抗IGF-1R捕获抗体(R&D Systems MAB391)预包被，并以4％BSA/TBS封闭。在一些实验中，使用了替代捕获抗体(以1μg/ml的2B9 SEQ ID NO：10和11进行包被)。平板4℃温育过夜。平板以TBST(TBS+0.1％Tween 20)洗涤，每孔加入以1/2500稀释在4％BSA/TBS中、铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体(PerkinElmer DELFIA Eu-N1 PT66)。温育1小时后，洗涤平板，加入DELFIA增强(PerkinElmer 1244-105)溶液。温育10分钟后，采用设定测量铕时间分辨荧光(TRF)的酶标仪测定受体磷酸化的水平。
图8显示了纯化鼠单克隆抗体6E11、5G4和15D9介导的受体磷酸化抑制的实例，并列放置来自不同平板同时进行的实验的数据。
图9显示了与6E11嵌合抗体(6E11c)相比H1L0介导的受体磷酸化抑制的实例。
图10显示了H0L0和H1L0在野生型IgG1Fc区和取代的IgG1Fc区(IgG1m(AA))的背景下所介导的受体磷酸化抑制的实例。
在一组采用类似方法的不同实验中，获得受体磷酸化抑制的IC50值，证实人源化和6E11鼠亲本抗体对IGF-I和IGF-II介导的受体磷酸化抑制表现出类似的效应(表2)。
表2-选择的抗体在IGF-I和IGF-II刺激磷酸化测定中的IC50值，95％上和下置信区间
抗体           IGF-1刺激的IC50  IGF-II刺激的IC50
               (ug/ml)          (ug/ml)
H0L0           0.06069          0.08145
H1L0           0.08359          0.10546
H0L0IgG1m(AA)  0.08485          0.09968
H1L0IgG1m(AA)  0.08263          0.10546
6E11亲本抗体   0.02445          n/a
在一组采用类似方法的不同实验中，获得受体磷酸化抑制的IC50值，证实人源化抗体H0L0和鼠亲本抗体6E11表现出类似的活性。同时，采用经改造表达人胰岛素抗体的3T3细胞系检测抗胰岛素受体的抗体的活性。在该实验中，没有抗体表现出对胰岛素诱导的受体磷酸化的抑制。
Table 2a选择的抗体在IGF-IR和IR DELFIA测定中的IC50值。每个值代表两个数据点的平均值。阴性对照抗体是杂交IgG1。
          IGF-1R DELFIA-IC50(nM)  IR DELFIA-IC50(nM)
抗体      平板A     平板B         平板A    平板B
H0L0      0.25      0.19          ＞133nM  ＞133nM
6E11      0.18      0.16          ＞133nM  ＞133nM
阴性对照  ＞133nM   ＞133nM       ＞133nM  ＞133nM
实施例14-竞争性ELISA
ELISA平板以2μg/ml的抗人IGF-1R拮抗抗体(MAB391，R&DSystems)包被，并以4％BSA/PBS封闭。在纯化单克隆抗体的存在下加入400ng/ml的多组氨酸标记的重组人IGF-1R(R&D Systems #305-GR)，室温温育1小时。平板以TBST(TBS+0.1％ Tween 20)洗涤，随后加入12-30μg/ml的HRP标记的抗多组氨酸抗体(Sigma A7058-1VC)。平板温育1小时，随后再次洗涤，以OPD底物显色(Sigma P9187)。加入2M硫酸终止反应，测量490nm处的吸光度。
图11A显示了各种纯化鼠单克隆抗体在竞争性ELISA中的活性的实例。并列放置自同时进行的实验的数据。
图11B显示了与6E11嵌合抗体(6E11c)相比，H1L0在竞争性ELISA中活性的实例。并列放置自同时进行的实验的数据。
图12A显示了与鼠亲本抗体(6E11)和嵌合抗体(6E11c)相比，各种纯化的人源化抗体在竞争性ELISA中活性的实例。在图12A中，与图12B和12C所显示的重复测定相比，H0L0和H0L0 IgG1m(AA)表现出升高的信号。
图12B-C显示了各种纯化的人源化抗体在竞争性ELISA中活性的实例。
实施例15-食蟹猴IGF-1R结合ELISA
96孔ELISA平板以1-2μg/ml的重组食蟹猴IGF-1R(参阅实施例4)过夜包被，并以4％BSA/PBS封闭。加入纯化的抗hIGF-1R抗体，室温温育1小时。平板以TBST洗涤，每孔加入0.6-1.0μg/ml的结合HRP的抗小鼠Ig(DAKO#P0260)。平板室温温育1小时，TBST洗涤，OPD底物(Sigma P9187)或TMB底物(Sigma T8665)显色。加入2M硫酸终止反应，通过测量490nm(OPD)和450nm(TMB)处的吸光度测定结合水平。对于含有人IgG1/Cκ恒定区的抗体，结合HRP的抗小鼠Ig检测抗体被替换为山羊抗人κ轻链过氧化物酶结合物(Sigma，A7164)。
图13A显示了纯化鼠单克隆抗体结合到重组食蟹猴IGF-1R的实例。并列放置自同时进行的实验的数据。
图13B显示了与6E11嵌合抗体(6E11c)相比，纯化人源化单克隆抗体与重组食蟹猴IGF-1R结合的实例。
实施例16-胰岛素受体结合ELISA
96孔ELISA平板以0.5μg/ml的重组人胰岛素受体(R&D Systems1544-IR)过夜包被，并以4％BSA/PBS封闭。向平板加入纯化的抗hIGF-1R抗体或小鼠抗人胰岛素受体抗体(R&D Systems MAB15441)，室温温育1小时，随后以TBST洗涤。每孔加入以4％BSA/PBS配制的1/500或1/2000的结合HRP的抗小鼠Ig(DAKO #P0260)，平板温育1小时。洗涤平板，加入TMB底物(Sigma T8665)或OPD(Sigma P9187)进行显色。加入2M硫酸终止反应，测量450nm或490nm处的吸光度，检测结合。为了检测含有人IgG1/Cκ恒定区的抗体，上文列出的检测抗体(结合HRP的抗小鼠Ig)被替换为山羊抗人κ轻链过氧化物酶结合物(Sigma，A7164)。
图14显示了采用纯化鼠单克隆抗体进行的胰岛素受体结合ELISA的实例。与阳性对照抗体(R&D Systems MAB15441)不同的是，纯化抗体6E11、5G4和15D9在多达10μg/ml的浓度下没有表现出对胰岛素受体的结合。并排放置实验数据。
在一个不同的实验中，采用类似方法检测各种人源化抗体的胰岛素受体结合谱。虽然阳性对照抗体(R&D systems AF1544)表现出良好的结合，但没有检测到浓度高达50μg/ml的人源化抗体对重组胰岛素受体的结合(图15)。
实施例17-结合动力学的测定
采用BiacoreTM***测量抗IGF-1R抗体对人IGF-1R的结合动力学。采用抗体捕获方法进行动力学分析。简而言之，使用抗小鼠IgG抗体(Biacore，目录号BR-1005-14)用于分析小鼠亲本抗体，使用蛋白A用于人源化抗体。根据BiacoreTM标准方案，利用机器软件自带的immobilisation Wizard facility(一般固定处的共振单位(RU)水平为3000-4000)通过伯胺偶联将抗小鼠抗体或蛋白A固定到CM5 Biosensor芯片上。随后直接从杂交瘤上清或从纯化物质捕获抗IGF-1R抗体。上清的捕获水平取决于杂交瘤的初始浓度，这些浓度在约20RU到650RU的范围内变动。对于纯化物质，受试抗体的捕获水平一般为20-600RU。捕获后，在重组IGF-1R之前使基线值稳定下来，随后来自R&D Systems(目录号305-GR)的组氨酸标记的物质以确定的浓度(一般范围为0-256nM)通过表面。由于相互作用的高亲和力，使用了长达1小时的解离时间。采用100mM磷酸或10mM甘氨酸(pH 1.5)经酸洗脱进行再生，再生不会显著影响表面捕获抗体以进行其他分析步骤的能力。分别在25℃和37℃下进行实验。采用T100控制分析软件在T100 BiacoreTM***上进行实验。实验数据拟合为机器分析软件自带的1∶1结合模型。
表3-7显示了以上清和纯化物质开展的一系列实验
表3-选择的纯化鼠IGF-1R单克隆抗体在25℃和37℃下的动力学数据
  抗体   亲和力(nM)25℃(实验1-T0011R6)   亲和力(nM)37℃(实验2-T0011R4)   亲和力(nM)25℃(实验3-T0022 R5)
  6E11   0.09   0.164   0.14
  5G4   3.0   5.9   未检测
  15D9   0.233   0.558   未检测
表4-与6E11c相比，H1L0和H0L0的上清物质的动力学数据实验(T0037 R3)在37℃下进行。
  抗体   Ka   Kd   KD(nM)
  H1L0   7.56e4   3.52e-5   0.47
  6E11c上清   8.14e4   3.13e-5   0.38
  6E11c纯化   8.52e4   3.32e-5   0.39
表5-与6E11c相比，H0L0、H0L0 IgG1m(AA)、H1L0、H10L0IgG1m(AA)上清物质的动力学数据实验(T0040R2)在37℃下进行。
实验1
  抗体   Ka   Kd   KD(nM)
  H1L0(上清)   7.56e4   3.52e-5   0.47
  6E11c(上清)   8.14e4   3.13e-5   0.38
  6E11c(纯化)   8.52e4   3.32e-5   0.39
实验2
  抗体   Ka   Kd   KD(nM)
  H1L0(上清)   6.82e4   4.28e-5   0.63
  6E11c(纯化)   7.59e4   3.25e-5   0.43
H1L0上清在实验1和2中是相同的，而纯化6E11c则是不同的批)
表6-与6E11嵌合抗体(6E11c)相比，纯化H0L0和H1L0的动力学数据实验(T0041R1)在37℃下进行。
  抗体   Ka   Kd   KD(nM)
  H0L0   6.24e4   3.93e-5   0.63
  H1L0   6.54e4   2.95e-5   0.45
  6E11c   6.60e4   2.45e-5   0.37
表7-与6E11嵌合抗体(6E11c)相比，纯化H0L0、H0L0IgG1m(AA)、H1L0、H10L0 IgG1m(AA)的动力学数据37℃下进行了三次独立的实验
Figure G2008800119704D00571
在一个不同的实验中使用了下列方法。根据生产商的标准方案通过伯胺偶联将蛋白A固定在CM5表面。抗IGF-1R的抗体被捕获到该表面上，稳定一段时间后，在该捕获表面注入重组的人或食蟹猴IGF-1R。一般而言，使用的IGF-1R浓度是256-16nM，对于双重参照，根据Biacore动力学分析的最佳实践，还使用0nM注射液(仅含缓冲液)。采用Biacore机器自带的1∶1模型分析数据，采用HBS-EP流动缓冲液在37℃下进行这一工作。结果证实，人源化变体H0L0和H0L0IgG1m(AA)对重组人和食蟹猴IGF-1R表现出高亲和力结合(～300-600pM)和与6E11嵌合抗体类似的动力学。
表8-抗IGF-1R抗体对重组人IGF-1R和食蟹猴IGF-1R在37℃下的动力学比较。显示的数据来自单个实验
               人IGF-1R                 食蟹猴IGF-1R
               ka      Kd       KD(nM)  ka      Kd       KD(nM)
6E11嵌合抗体   1.22e5  2.61e-5  0.21    1.10e5  2.14e-5  0.19
H0L0           1.07e5  2.73e-5  0.25    9.18e4  2.56e-5  0.28
H0L0IgG1m(AA)  1.14e5  3.20e-5  0.28    1.07e5  2.73e-5  0.25
进行了类似实验，证实H0L0、H0L0 IgG1m(AA)和6E11嵌合抗体表现出类似的结合动力学。但是总体亲和力比之前所有实验(分别为1.88、1.84和1.52nM)所观察到的亲和力要低。不清楚出现这种明显差异的原因。
实施例18-采用Biacore测定配体结合的抑制
采用两种不同密度的捕获生物素化IGF-I进行实验。简而言之，200或4000RU被稳定地捕获到链霉亲和素传感器芯片上。为了检测抗IGF-1R抗体的中和能力，不同浓度的抗体与固定浓度的重组IGF-1R进行预混合。作为对照，非生物素化的IGF-1也与相同浓度的IGF-1R混合。该混合物随后通过IGF-I表面，测量最大结合的点。随后将该读数与具有相同浓度的组氨酸标记的IGF-1R但没有抗IGF-1R抗体的样品进行比较。中和抗体的存在阻断了IGF-1R对IGF-1的结合，降低了最大的观测结合。比较数值，计算抑制百分比。采用两个脉冲的4M氯化镁进行再生。实验在Biacore 3000***上进行。
下表9和10显示得到的抑制百分数，还详细给出了用于得到这些结果的抗体、IGF-1和IGF-1R的浓度。
表9-200 RU的IGF-1表面的抑制值
抗体+IGF-1R复合物               ％抑制
IGF1(125nM)+His IGF-1R(25nM)    69
IGF1(500nM)+His IGF-1R(25nM)    89
6E11(125nM)+His IGF-1R(25nM)    48
6E11(500nM)+His IGF-1R(25nM)    50
表10-4000RU的IGF-1表面的抑制值
抗体+IGF-1R复合物               ％抑制
IGF1(5μM)+His IGF-1R(50nM)     93
IGF1(500nM)+His IGF-1R(50nM)    86
6E11(500nM)+His IGF-1R(50nM)    48
在一个不同的实验中，采用基于Biacore的方法利用捕获的生物素化配体(IGF-I、IGF-2)测量人源化抗体直接阻断配体结合的能力。大约300RU和350RU的生物素化IGF-1或IGF-2被分别固定到链霉亲和素生物传感器芯片上。IGF-1R以50nM单独通过表面，或以含有250nM抗IGF-1R抗体(IGF-1实验)或500nM抗IGF-1R抗体(IGF-2实验)的50nM预混合溶液通过表面。在天然配体IGF-1和IGF-2(均未生物素化)的存在下还进行了IGF-1R结合。采用100mM磷酸再生表面。采用25℃的HBS-EP缓冲液在Biacore 3000上进行实验。注意：部分抗体对单独的IGF-2表面表现出非特异结合这一事实增加了IGF-2测定数据的分析难度。对于固定的IGF-I，受体结合最有效的抑制剂是未标记的IGF-I，而IGF-2和H0L0表现出约60％的抑制(表11)。对于固定的IGF-2，受体结合最有效的抑制剂是未标记的IGF-I或IGF-2。在该测定中，中和抗体包括H0L0表现出对IGF-2结合的部分抑制(表11)。
表11-受体与配体结合的中和
  样品 ％受体与IGF-I结合的中和   ％受体与IGF-2结合的中和
  H0L0   60   37
  H0L0 IgG1m(AA)   58   17
  6E11嵌合抗体   44   20
  IGF-1   87   98
  IGF-2   68   92
实施例19-荧光激活细胞分选(FACS)分析
Colo205细胞(2×107细胞/ml)以10μg/ml的抗hIGF-1R纯化抗体在FACS缓冲液中染色(含4％FCS的PBS)。细胞另外以适宜的阴性对照小鼠抗体染色(Sigma#I5154)。细胞以FACS缓冲液洗涤，随后以1∶100的抗小鼠IgG PE二抗(Sigma P8547)染色。FACS缓冲液洗涤和Cell Fix(Becton Dickinson)固定后，细胞以流式细胞术分析。
图16显示了抗体6E11可识别人肿瘤细胞系表面天然表达的IGF-1R。
在一个不同的实验中，检测人源化抗体对已知过表达IGF-1R的各种人肿瘤细胞系的染色能力。NCI-H838肺癌细胞以100μg/ml的选择抗体在4℃下染色45min。以结合PE的抗人IgG抗体(Sigma P8047)检测结合。采用Becton Dickinson FACscan流式细胞仪经流式细胞术分析样品。图17所示的结果证实人源化变体可结合NCI-H838。采用MCF7乳腺癌细胞和A549肺癌细胞获得类似的结果(图18)。
实施例20-冰冻组织切片的免疫组织化学
将组织切片，置于载玻片上，丙酮固定2分钟，随后放到自动染片机(DakoCytomation S3400)上。随后采用标准的免疫组织化学染色方法，封闭玻片，并以鼠抗(一抗)和抗小鼠的Ig-HRP二抗(DakoCytomationEnvision Kit)染色。二抗温育后，洗涤玻片，采用DakoCytomation EnvisionDAB溶液显色玻片，漂洗，脱水，盖片观察。无关的对照抗体(从MOPC21杂交瘤纯化的小鼠IgG1)用作阴性对照。
除了这些抗体被生物素化以便于检测之外，以类似方式分析人源化抗体和嵌合抗体。但是，发现生物素标记的存在可降低ELISA测得的这些抗体的活性(数据未显示)，因此使用的一抗浓度增加到高达100ug/ml。上文列出的二抗(DakoCytomation Envision Kit-抗小鼠Ig-HRP结合物)被替换为链霉亲和素-HRP(DakoCytomation，目录号1016)。另一个无关抗体也被生物素化，用作阴性对照(Sigma #I5154)。
样品分析如下。采用校正载波(#69935000，05041103097)校正仪器后，玻片放置到ChromaViso自动细胞成像***上，以10X扫描。进行数据分析，计算染色组织的百分数(定义为褐色/褐色+蓝色*100)。
图19和20显示了6E11使人肿瘤组织样品染色。使用阳性对照抗体作为参照(Abcam，#4065)。
图21显示6E11嵌合抗体(6E11c)和H1L0使人肿瘤组织样品染色。
在一个不同的实验中，采用得自Cytomyxx(阵列ID：MB-1002)的冰冻组织微阵列检测人源化H0L0识别人肿瘤组织样品上的人IGF-1R的能力。该阵列含有10个肺癌核心、10个乳腺癌核心、10个结肠癌核心和10个***癌核心。H0L0被生物素化以便于检测。冰冻微阵列玻片(Cytomyxx MB-1002)以4℃丙酮/乙醇(50∶50)溶液固定5分钟，洗涤，随后以3％过氧化氢处理5分钟，除去任何内源过氧化物酶。玻片以7.0μg/ml生物素化的抗IGF-1R H0L0在室温下染色1小时。洗涤后，加入链霉亲和素过氧化物酶，处理20分钟，随后以DAB(二氨基联苯胺)显色2分钟。最后，洗涤切片，以Mayer苏木精复染，自来水漂洗，脱水，透明，封片。肿瘤样品如下：肺癌(右嵌图：鳞状细胞癌；左嵌图：腺癌)；乳腺癌(右嵌图：导管上皮腺癌；左嵌图：侵袭性腺癌)；结肠癌(右嵌图：高分化腺癌，左嵌图：高分化腺癌)；***癌(右嵌图：腺癌，左嵌图：腺癌)。结果证实，H0L0对存活切片表现出中等/强染色，正如下表12所总结。图22显示了肺癌、乳腺癌、结肠癌和***癌的代表性高分辨率图像(200x)，证实生物素化的H0L0抗体主要对上皮细胞染色。
表12-肿瘤组织微阵列的免疫组织化学分析总结
肿瘤类型    阳性染色       无染色    丢失样品
            (中等/强烈)
肺癌        4              3         3
乳腺癌      7              3         0
结肠癌      6              3         1
***癌    6              0         4
实施例21-AKT信号传导的抑制
Costar 96孔平板(#3598)以50μl的2％明胶PBS溶液包被，37℃培养箱温育至少1个小时。使用前，平板以PBS漂洗1次。胰蛋白酶消化原代人前脂肪细胞，离心，吸取培养基，弃去。细胞重新悬浮在10mL加热的前脂肪细胞生长培养基(ZenBio，#PM-1)中。细胞密度调节为每mL前脂肪细胞生长培养基含150,000个细胞。含有50mL培养基的两个T225 Costar培养瓶各自接种1百万个细胞。采用Multidrop384或类似仪器将余下细胞用于接种包被明胶的96孔平板(100μl＝15,000细胞/孔)。细胞在37℃、5％CO2气氛、90％湿度下过夜温育。第二天除去培养基，加入200μl的诱导培养基，平板以Breath-Easy透气膜(Sigma#Z380059)覆盖。平板在37℃、5％CO2气氛、90％湿度下温育6天。6天后，吸出培养基，加入200μl的分化培养基。平板以Breath-Easy透气膜覆盖，在37℃、5％CO2气氛、90％湿度下温育7天。细胞分化后，吸出培养基，细胞200μL PBS漂洗一次。加入75μl脂肪细胞饥饿培养基，覆盖平板，在37℃、5％CO2气氛、90％湿度下温育过夜。受试样品以脂肪细胞饥饿培养基稀释到4X终浓度。每孔加入25μL稀释的受试化合物，37℃下温育1小时。IGF-I配体(R&D Systems，#291-G1)以脂肪细胞饥饿培养基稀释到30nM，每孔加入20μL的30nM IGF-I(终浓度5nM)。平板在37℃下精确温育5分钟，随后将培养基轻轻倒入水槽，除去上清。平板以纸毛巾干燥。
每孔加入65μl的完全裂解缓冲液(含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的MSD裂解缓冲液)，平板以平板热封仪密封。平板或-80℃储存(以备后续分析)或室温置于振荡器(约500rpm)上15分钟，随后进行MSD测定。
采用MSD磷酸化测定试剂盒(#K111CAD)测量磷酸化AKT(pSer473)的水平。简而言之，MSD测定平板每孔加入150μL封闭液(MSD封闭剂A溶解在MSD Tris洗涤缓冲液中)。密封平板，采用台式平板振荡器将平板置于300rpm的振荡器上，室温振荡1小时。除去MSD平板的封闭液，平板以200μL/孔的1x MSD Tris洗涤缓冲液洗涤四次。细胞平板50μL/孔的细胞裂解物被转移到MSD平板的相应孔内，封闭。采用台式平板振荡器以300rpm室温振荡平板1小时。采用1x MSD Tris洗涤缓冲液(ELx405)按每孔200μL的比例将MSD平板洗涤四次。
MSD平板每孔加入25μL稀释的检测抗体混合物(10nM终浓度)。采用台式平板振荡器以300rpm室温振荡平板1小时，随后采用1x MSDTris洗涤缓冲液(ELx405)按照每孔200μL的比例洗涤平板四次。每孔加入150μL含有表面活性剂的读数缓冲液T，平板以MSD 6000 SECTOR读数仪进行读数。虽然读数缓冲液中的信号强度随时间降低，但信号窗口一般保持约20-30分钟的稳定。
下表13显示了来自三块不同平板的数据总结，表明纯化的鼠亲本Mab、嵌合Mab和人源化Mab抑制IGF-I介导的对AKT磷酸化的诱导。平板1和2同时检测。平板3在不同的日期检测。数值表示为pIC50(＝-log10(IC50)(g/ml))。
表13-各种纯化抗体在AKT磷酸化测定中的活性
抗体          平板1    平板2    平板3
6E11亲本抗体  7.75     7.79     7.67
H0L0          7.65     7.76     7.34
H1L0          7.62     7.68     7.30
6E11c         7.59     7.32     7.34
阴性对照      6.05     6.25     ＜5.82
在两个不同的实验中，检测各种人源化抗体对IGF-I或胰岛素刺激引起的AKT磷酸化的抑制。对于表14显示的IGF-I结果，数值表示为pIC50平均值，其中pIC50＝-log10(IC50)，g/ml。Vmax＝最大抑制，表示为无配体时的信号百分比。实验1是4次实验的平均值。实验2是3次实验的平均值。实验1和实验2间隔时间约为6个月。对于某些抗体(**H0L0)，平行检测材料的不同批次。与阴性对照抗体相比。所有的抗IGF-1R抗体都表现对AKT磷酸化的剂量依赖性抑制，其中人源化抗体H0L0表现出与6E11小鼠亲本抗体或6E11嵌合抗体类似的活性(表14)。
表14-各种纯化抗体在AKT磷酸化测定中的活性
               实验1                     实验2
抗体           pIC50平均值  Vmax平均值   pIC50平均值   Vmax平均值
               (g/ml)+/-SD  (g/ml)+/-SD  (g/ml)+/-SD   (g/ml)+/-SD
6E11亲本抗体   ND           ND           7.58(017)     113(26)
                                         7.42(0.14)**  106(3.6)
H0L0**         7.33(0.11)   107(9.5)
                                         7.53(0.15)**  100(7.9)
H1L0IgG1m(AA)  7.24(0.14)   116(11.0)    ND            ND
6E11嵌合抗体   7.34(0.08)   114(14.1)    ND            ND
IR3            7.17(015)    105(7.0)     7.45(0.07)    108(10.6)
阴性对照       7.17(0.30)   57.2(94)     7.30(0.89)    52(1.2)
由于该测定***对胰岛素介导的AKT磷酸化(通过胰岛素受体)也是敏感的，除上述的IGF-I实验以外还测量了人源化抗体对胰岛素信号传导的效应。与IGF-I刺激结果不同的是，除了以阴性对照抗体所观察到的非特异效应以外，人源化抗体没有表现出对胰岛素受体信号传导的抑制(数据未显示)。在两个独立的实验中观察到了这些结果(总共进行七次实验)。
实施例22-MCF7细胞的增殖测定
MCF-7细胞(ATCC HBT-22)以10000个细胞/孔的密度接种到96孔平板，并以完全培养基(MEM+Earles盐+10％FCS+0.1mg/ml牛胰岛素(Sigma I0516)))培养2天。洗涤细胞，以无血清MEM(无血清、无胰岛素)温育4小时。除去培养基，替换为以无血清培养基稀释的一系列浓度范围的纯化抗体(0.014-10μg/ml)(100μl/孔)。细胞温育1小时，随后加入终浓度为50ng/ml的IGF-I(R&D Systems #291-G1)。所有处理重复3次。细胞在37℃、5％CO2下温育5天。温育后，每孔加入15μl MTT染液(Promega #G402A)，平板又温育4小时。每孔加入100μl终止/增溶液(Promega #G401A)，室温过夜轻轻振荡平板。第二天采用酶标仪测量570nm处吸光度，测定增殖水平。
图23显示了各种纯化鼠单克隆抗体抑制肿瘤细胞增殖的活性。
并列放置实验数据
实施例23-LISN细胞的增殖测定
LISN细胞(3T3 hIGF-1R)以10000细胞/孔的密度接种到96孔平板(Corning 3610)，并以完全培养基(DMEM-Hepes改良培养基+10％ FCS)培养1天。除去培养基，细胞以无血清DMEM温育4小时。除去培养基，替换为以无血清培养基稀释(50μl/孔)的一系列浓度范围的纯化抗体(0.014-3μg/ml终浓度)。细胞温育1小时，随后又加入终浓度为50-60ng/ml的50μl/孔IGF-1(R&D Systems 291-G1或IGF-I-参阅实施例5和6)。所有处理重复3次。细胞在37℃、5％CO2下温育0-3天。温育后，每孔加入100μl新鲜配制的Promega Cell Titre-Glo试剂(Promega G7571)，平板振荡2min。平板在室温下又温育10min，以使采用Wallac Victor酶标仪测量发光信号前信号稳定下来。
图24和25A-E显示了纯化的6E11鼠单克隆抗体、6E11c H0L0、H0L0 IgG1m(AA)、H1L0和H1L0 IgG1m(AA)的活性。数据证实，H0L0和H1L0可抑制体外肿瘤细胞增殖。并列放置实验数据。
实施例24-细胞周期的抑制
NCI-H838(ATCC CRL-5844)细胞以2X105个细胞/孔的密度接种到24孔微孔板，以1ml完全RPMI(RPMI+10％FCS)过夜培养。第二天细胞以SFM(无血清RPMI培养基)洗涤，并以1ml相同培养基温育4小时。吸出细胞培养基，加入含有20μg/ml纯化抗体(10μg/ml终浓度)的500μlSFM。细胞温育1小时。在一些孔中加入终浓度为50ng/ml配制在SFM中的IGF-I(R&D Systems 291-G1)。过夜温育处理的细胞。第二天细胞以PBS轻轻洗涤，随后加入200μl维尔烯溶液(Invitrogen #15040)进行收集。细胞悬浮液转移到96孔V形底平板。离心沉淀细胞后，加入冰冷的80％乙醇，冰上温育30min，固定细胞。沉淀细胞，重新悬浮于200μl 50μg/ml碘化丙啶，0.1mM EDTA，0.1％ Triton X-100，0.05mg/ml核糖核酸酶A。冰上暗处温育细胞，随后以流式细胞术进行分析。
图26显示了在IGF-I的存在下各处理组的细胞周期状态，细胞被诱导进入细胞周期。在6E11抗体的存在下，细胞周期被抑制到类似于IGF-I不存在时的细胞周期水平。
实施例25-凋亡保护
NCI-H838细胞(ATCC CRL-5844)以10000个细胞/孔的密度接种到96孔微孔板，并以100μl完全RPMI培养基培养2天。细胞随后以SFM(无血清的RPMI)洗涤，以100μl SFM温育4-5个小时。除去培养基，随后以无抗体、阴性对照抗体或20μg/ml的纯化抗hIGF-1R抗体(6E11)进行处理。细胞又分别以单独的SFM、SFM+20ng/mlIGF-1、SFM+5μM喜树碱或SFM+5μM喜树碱+20ng/mlIGF-1进行处理。所有处理重复检测3次，终体积为100μl。平板随后温育20小时。吸出培养孔的培养基，加入200μl PBS配制的0.5％NP-40裂解细胞，随后室温振荡温育5min。20μl裂解物被转移到来自Roche Cell Death ELISA Kit准备好的微孔板上，加入80μl温育缓冲液。采用试剂盒插页(Roche目录号∶1 544 675)描述的方案，采用酶标仪测量405nm处的吸光度。
图27显示了IGF-I的存在为NCI-H838细胞免受喜树碱诱导的凋亡提供了一些保护。6E11的加入逆转了IGF-1介导的凋亡保护。
在一个不同的实验中，检测选择的抗体防止IGF-1拯救A549细胞免受喜树碱诱导的凋亡的能力。A549细胞以1×104铺板到96孔平板上进行培养，并以20μg/ml选择的抗体在无血清条件下处理1小时。一同加入15ng/ml的IGF-1和5μg/ml的喜树碱，过夜温育细胞。采用估测DNA片段化相对水平的Roche Cell Death Detection ELISA kit(Roche11774425001)测量凋亡水平。正如图28所示，所有的人源化抗体阻止了IGF-1诱导的凋亡拯救。
实施例26-无论交联抗体存在与否，均不存在激动作用
3T3/LISN c4细胞以10000个细胞/孔的密度接种到96孔微孔板，并以完全DMEM(DMEM Hepes改良培养基+10％FCS)培养2天。向完全DMEM中的细胞加入纯化的抗IGF-1R的抗体，每个稀释度重复检测3次。在一些实验中加入了据报道具有激动活性的抗体(#556000，BDBiosciences)和/或50ng/ml IGF-I(温育20-30min)，作为阳性对照。加入无关抗体和单独培养基作为阴性对照。在其他实验中，在抗体滴定中按2∶1[抗IGF-I Ab]∶[交联Ab]的比例加入了抗小鼠的交联抗体(SigmaM8144)或抗人的交联抗体(Sigma I3382)。平板温育30min。吸取培养基，细胞以PBS轻轻洗涤一次，随后加入RIPA裂解缓冲液(150mM NaCl，50mM TrisHCl，6mM脱氧胆酸钠，1％Tween 20)以及蛋白酶抑制剂混合物(Roche 11 697 498 001)进行裂解。平板-20℃放置过夜。冻融后，100μl裂解物样品被转移到96孔ELISA平板，其中平板已被2μg/ml的抗IGF-1R捕获抗体(2B9)预包被，并以4％BSA/TBS封闭。平板4℃温育过夜。平板以TBST(TBS+0.1％ Tween 20)洗涤四次，每孔加入以1/2500稀释在4％ BSA/TBS中、铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体(DELFIA Eu-N1PT66，PerkinElmer)。温育1小时后，同上洗涤平板，加入100μl DELFIA增强液(PerkinElmer 1244-105)。温育10分钟后，采用设定测量铕时间分辨荧光(TRF)的酶标仪测定受体磷酸化的水平。
图29显示了浓度高达10μg/ml的6E11在交联抗体的存在下没有激动活性。并列放置实验数据。
在一个不同的实验中，使用前脂肪细胞测定***来检测6E11系列的人源化抗IGF-1R抗体是否调节磷酸化Akt的基础水平，而这可能提示存在激动属性。在该实验中，按照实施例21描述的方法分化和处理前脂肪细胞。但取消了刺激步骤，以评估在人源化抗体的存在下AKT磷酸化的基础水平。结果表明，采用浓度高达20μg/ml的人源化抗体时，AKT基础磷酸化水平没有升高(图30)。
在一组采用肺癌细胞系A549的平行实验中，测量了在0-20μg/ml抗体存在下和配体不存在下的AKT基础磷酸化水平。两个不同批次的H0L0、阴性对照样品和11C11(表现出对受体磷酸化的中等激活，参阅图31)。Y轴表示任意单位的AKT磷酸化水平。与实施例21给出的数据一致的是，H0L0剂量依赖性地抑制了IGF-I介导的AKT磷酸化(IC50处于200-500ng/ml的范围，数据未显示)。但是，浓度升高的抗体在配体不存在时似乎引起了磷酸化Akt基础水平的小幅升高。但是，采用两个不同批次的材料时的信号似乎稳定在不高于3倍静息水平的水平。不清楚信号小幅升高的原因，该数据没有得到其他任何实验数据的支持。
在一组采用LISN-c43T3细胞的平行试验中，在配体刺激不存在下测量了人源化抗体对受体磷酸化基础水平的效应。LISN细胞在一系列浓度范围(27ng/ml-20μg/ml)内的选择抗体的存在下温育30min。还包括已知激动抗体11C11和BD556000(Becton Dickinson)的滴定。可包括以100ng/ml的IGF-2刺激的对照孔。采用先前描述的DELFIA测定来测量IGF-1R的磷酸化。与诱导受体磷酸化剂量依赖性升高的两个阳性对照抗体11C11和BD556000不同的是，人源化抗体没有表现出磷酸化受体基础水平的升高(图32)。由于表面结合抗体的交联具有诱导受体信号传导的潜力，因此在交联抗体的存在下重复了该实验。LISN细胞以一系列浓度范围的选择抗体温育30min，其中选择的抗体与适宜的交联抗体以2∶1的比例混合(Sigma I3382与人源化抗体混合，Sigma M8144与小鼠抗体混合)。采用先前描述的DELFIA测定来测量IGF-1R的磷酸化。结果表明，与增加磷酸化受体水平的11C11不同的是，人源化抗体没有表现出磷酸化受体基础水平的升高(图33)。
还检测了在配体不存在下加入人源化抗体对LISN-c4和NCI-H929(人多发性骨髓瘤细胞系)增殖的效应。NCI-H929细胞以4×104个细胞/孔的密度接种到96孔平板上的无血清培养基中。加入20-0.019μg/ml范围内的选择抗体的稀释液。细胞在37℃下温育4天，随后采用Promega Cell Titre B1ue测定试剂盒(Promega G8081)测量增殖。图34显示H0L0没有刺激NCI-H929细胞在无血清培养基中的增殖。使用LISN-c4细胞观察到了类似结果(数据未显示)。
实施例27-3T3/LISN c4同种异体移植模型
利用3T3/LISN c4细胞的体内肿瘤模型被用于确认6E11鼠单克隆抗体抑制无胸腺裸鼠体内预先植入的肿瘤生长的能力。采用类似Cohen等人，Clinical Cancer Research 11：2063-2073((2005)发表的方法诱导肿瘤。概况而言，悬浮在0.1ml MatrigelTM中的2.5×106个LISN细胞被皮下接种到4-6周龄的无胸腺CD1nu/nu小鼠体内。一旦肿瘤大小达到约150mm3，小鼠腹腔注射以0.2ml PBS配制的250μg抗体，每周两次，持续三周。每周三次以游标卡尺测量肿瘤纵横的两个直径，采用公式(长度×[宽度]2)/2计算体积。数据分析如下：Log10转化肿瘤的体积以随机系数回归分析进行分析。这估算了每组的截距(基线值)和斜率(肿瘤生长的速率)。与PBS处理组相比，6E11组的生长速率下降31％(图35，p＝0.0007)。
在一个类似的实验中，裸鼠皮下移植基质胶(Matrigel)中的2.5×106个细胞。移植18天后，肿瘤体积为100-200mm3的小鼠被随机分成8只动物/处理组。腹腔注射给予250μg/小鼠和100μg/小鼠剂量的抗IGF-1R抗体6E11，每周两次，连续三周。按照相同时间表给予对照动物生理盐水。每周测量两次肿瘤大小和小鼠体重。与生理盐水处理组相比，第35天时，100μg/小鼠组和250μg/小鼠组测得的肿瘤体积分别下降了56％和70％(图36)。
在一个不同的研究中，检测了各种抗体相对于PBS阴性对照组的活性。每只CD1 nu/nu小鼠皮下移植悬浮在基质胶中的2.5×106个LISN/3T3-c4细胞，以游标卡尺测量肿瘤大小，以下列等式计算体积：肿瘤体积＝长度×(宽度)2×0.5。一旦肿瘤达到约150mm3的平均体积，动物被随机分成具有类似肿瘤大小的各组，每只动物皮下给予配制于PBS中的250μg适宜单克隆抗体，每周两次，连续三周。处理组为6E11(小鼠亲本mAb)、两个不同批次的H0L0 IgGm(AA)和H0L0。PBS单独处理用作这些研究的溶剂对照。该研究的组大小最少为14只动物。数据表示为抗体处理后天数的平均肿瘤体积±标准误。6E11和H0L0分别使肿瘤生长速率显著下降52％(P＜0.0001)和60％(P＜0.0001)(图37)。与之前的一项研究一致的是(数据未显示)，与PBS对照组相比，两批H0L0 IgG1m(AA)抗体均没有显著改变肿瘤生长速率。
除了肿瘤生长速率下降以外，与PBS对照相比，以6E11和H0L0组处理的小鼠的时程淘汰(时程淘汰)也得到了改善。与肿瘤生长数据一致的是，H0L0IgGm(AA)没有表现出延迟时程淘汰的益处(数据未显示)。
采用6E11和H0L0抗体重复了该研究，除了未使用基质胶以外。该研究的结果印证了之前研究的结果，其中与PBS对照相比，6E11和H0L0分别使肿瘤生长速率显著下降20％(p＝0.0464)和29.7％(p＝0.0037)。与PBS对照相比，以6E11和H0L0组处理的小鼠的时程淘汰生存也得到了改善。一个无关抗体在该实验中用作对照，表现出与PBS组类似的效应(数据未显示)。
实施例28-6E11小鼠亲本抗体对Colo205细胞肿瘤生长的抑制
利用Colo205细胞的体内肿瘤模型被用于确认6E11鼠单克隆抗体抑制HRLN雌性nu/nu小鼠体内预先植入的肿瘤生长的能力。1×106个Colo205细胞悬浮在50％的基质胶中，随后被皮下移植到裸鼠两侧。一旦肿瘤大小达到大约80-120mm3(相当于图38中的第1天)，小鼠每三天腹腔注射10mg/kg抗体，一共注射10次。肿瘤以游标卡尺测量，采用公式(长度×[宽度]2)/2计算体积。数据分析如下：Log10转化肿瘤的体积以随机系数回归分析进行分析。这估算了每组的截距(基线值)和斜率(肿瘤生长的速率)。与溶剂处理组(PBS)相比，6E11抗体使生长速率下降58％(图38，p＝0.0019)。
在不同时间进行与上述实验类似的实验。但是，在这个采用Colo205细胞的第二个实验中，没有在6E11处理的动物上观察到肿瘤生长的抑制。不清楚6E11没有产生抑制的原因(数据未显示)。
采用移植1×107个A549细胞的小鼠还进行了与上述实验类似的实验。但是，在该实验中，没有在6E11处理的动物上观察到肿瘤生长的抑制。不清楚6E11没有产生抑制的原因(数据未显示)。
虽然后两个实验的数据似乎表明，本发明抗体没有抑制肿瘤在这些模型中的生长，但相信前两个肿瘤模型(同种异体移植模型和第一个colo205模型)更有说服力。在前两个模型中给出阳性信号(即表现出肿瘤生长的抑制)的对照抗体在第二个Colo205肿瘤模型研究或A549肿瘤模型研究中没有表现出抑制，因此我们更相信前两个肿瘤模型的数据比后两个模型的数据更能说明受试抗体的活性。
采用6E11或其人源化变体进行了其他三次异种移植研究。在第一个研究中，6E11的活性与Colo205模型中的H0L0 IgGm(AA)进行比较。与图38给出的结果不同的是，与PBS对照组相比，6E11或H0L0IgGm(AA)处理后没有肿瘤生长抑制的证据。在一个重复研究中，其中处理组是PBS、6E11、H0L0、阳性对照抗体和无关抗体对照，各组均未表现出抑制肿瘤生长的证据，除了与PBS相比使肿瘤生长速率下降23％的阳线对照以外(p＝0.003)。但是，与PBS相比，无关抗体表现出对肿瘤生长15％的抑制(p＝0.053)。与无关抗体对照相比，没有抗体表现出对肿瘤生长的抑制。
在一个不同的异种移植模型中(MCF-7乳腺肿瘤模型)，以PBS、6E11、H0L0、阳性对照抗体和无关抗体对照处理动物。在该研究中，各处理组与PBS或无关抗体对照没有差别。在两个研究中，紫杉醇处理显著抑制了肿瘤生长(数据未显示)。
在一项研究后分析中，以免疫组织化学测量所有3项研究结束时收集的肿瘤样品的受体表达。采用生物素化的H0L0探针没有观察到IGF-1R受体表达的证据，而相同标记的抗体对LISN/3T3 c4肿瘤样品和患者肿瘤样品进行了阳性染色。
不清楚图38给出的最初Colo205研究、LISN模型(IGF-1R-11和IGF-1R-12研究)in-house结果和其他没有表现出抗体介导的肿瘤生长抑制的三项研究的结果之间抗体活性存在明显差异的原因。但是，源自至少部分Colo205和MCF-7细胞系的肿瘤在研究结束时是受体阴性的(包括PBS对照组)，这一事实引起了对评估抗IGF-1R抗体体内效应的这些具体实验有效性的关注。
实施例29-受体循环动力学
为了研究停用抗体后受体的重新出现，NCI-H838细胞在图39给出的1.67μg/ml H0L0(H0L0)抗体的存在下以生长培养基温育。加入抗体0.5小时后收集首份细胞样品。加入抗体3小时后，所有其他样品以PBS彻底洗涤，随后重新加入生长培养基。随后在加入抗体3、4、5、6、7和24小时后收集细胞，采用兔抗IGF-1Rβc20抗体(Santa Cruz，sc713)经蛋白印迹法测量IGF-1R的表达。采用HRP抗体检测结合，IgG1 kappa用作阴性对照抗体。泳道1-7分别为0.5、3、4、5、6、7、24小时的收集物。泳道8和9分别为3小时后收集的无抗体的对照和阴性对照抗体(Sigma I5154)。泳道10显示了Magic Mark(Sigma，LC5602)。除去抗体后(t＝3小时)，蛋白印迹显示t＝7小时时(泳道6)，没有IGF-1R表达的证据。相反，到t＝24小时时(泳道7，除去抗体21小时后)，出现对应于IGF-1Rβ链的强烈条带。
第二个实验(数据未显示)证实受体的重新出现在48、72和96小时得到保持。这些数据提示，多数受体的重新出现发生在抗体除去后的首个4-21小时内。
实施例30-IGF-1R/IR异型二聚体结合测定
在同时表达IGF-1R和胰岛素受体(胰岛素受体)的细胞内，已表明存在杂合受体IGF-1R：胰岛素受体(InsR)(Pandini等人(1999)Clin CancerRes.，5(7)：1935-44)。最近表明，不与胰岛素受体发生交叉反应的抗IGF-1R抗体减少了胰岛素受体的水平，最有可能是通过内化和降解杂合受体(Sachdev等人(2006)Cancer Res.，66(4)：2391-402)。
采用免疫共沉淀测定来测量人源化抗体抗杂合受体的活性。在图40A所示的第一个实验中，表达人胰岛素受体的COLO-205结肠癌细胞和重组NIH-3T3细胞以1％NP40裂解缓冲液在冰上裂解，随后16400rpm、4℃离心20分钟，沉淀细胞。以抗IGF-1R(6E11、6E11嵌合抗体、H0L0 IgG1m(AA)、IGF-1Rβ、胰岛素受体(β)或非靶向人IgG(对照)的5μg抗体免疫沉淀可溶的细胞蛋白(500μg)。免疫沉淀的蛋白在4-12％的聚丙烯酰胺凝胶上进行还原性SDS PAGE，转移到PVDF膜，免疫印迹检测IGF-1R或胰岛素受体。使用荧光标记的二抗，采用LI COR Odyssey***对IGF-1R/胰岛素受体免疫印迹进行成像。在采用类似于上述方法的不同实验(图40B)中，比较H0L0和H0L0 IgG1m(AA)。注意未结合的组分与免疫沉淀后的上清物质有关。图片显示了IGF-1R的97kDa β亚基、200kDa全长的IGF-1R和胰岛素受体的95kDa β亚基和200kDa全长胰岛素受体。正如图40A和40B所示，人源化抗体可免疫共沉淀来自Colo205人癌细胞系的胰岛素受体和IGF-1R，免疫共沉淀水平与6E11嵌合抗体类似。相同的抗体在IGF-1R不存在时没有免疫共沉淀胰岛素受体(参阅图40A，第四嵌图，泳道1-5)，表明抗体不与胰岛素受体反应。虽然以抗IGF-1R抗体进行免疫共沉淀后细胞裂解物中的大多数IGF-1R被除去，进一步表明了人源化抗体可结合异型二聚体IGF-1R：胰岛素受体和同型二聚体IGF-1R受体(图40B，上嵌图，泳道3-5)，但IP后细胞裂解物中仍保留了较高比例的胰岛素受体(最可能是同型二聚体部分)(图40B，下嵌图，泳道3-5)。
实施例31-NCI-H929细胞的增殖
在各种浓度的选择抗体的存在下，以IGF-1刺激无血清培养基中的人骨髓瘤细胞系NCI-H929。NCI-H929细胞以无血清培养基洗涤，并以4×104个细胞/孔的密度接种到96孔平板。37℃下加入20-0.019μg/m1范围内的选择抗体的稀释液，处理1hr，随后加入固定浓度的IGF-1(25ng/ml)。细胞在37℃下温育4天，随后采用Promega Cell Titre Blue测定试剂盒(Promega G8081)测量增殖。图41显示了H0L0和亲本6E11对IGF-1驱动的NCI-H929细胞增殖的剂量依赖性抑制。
实施例32-血清中的稳定性
为了研究H0L0在人血清中的稳定性，100μg/mL的500ml等份抗体在-20℃、4℃和37℃下在人100％血清中温育不同时间，最长为12天。12天后以直接结合ELISA测定活性。计算EC-50值，并与来自许多之前的结合ELISA的历史EC-50值进行比较。下图42显示的结果证实，H0L0在-20℃、4℃或37℃下在血清中温育长达12天时没有表现出活性的下降。
实施例33-异种移植模型中的受体下调的药效动力学
为了证实H0L0可以下调体内IGF-1R受体，根据他人发现(Cohen等人(2005)Clin Cancer Res.，11(5)：2063-73)，目前正在开发基于LISN/3T3 c4细胞系的体内测定。在第一项研究中，无胸腺的CD1 nu/nu小鼠植入基质胶(Becton Dickinson)中的2.5×106个3T3/LISN细胞。肿瘤大小达到400-500mm3时，给予小鼠125μg剂量的对照抗体或H0L0。给药T＝16、24、48、72或120小时后，处死小鼠。切除肿瘤，立即放于液氮冷冻。称重的肿瘤样品以RIPA缓冲液以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂进行均浆，离心后对裂解物进行蛋白测定。进行DELFIA测定(参阅实施例34)，测量肿瘤样品中总IGF-1R的相对水平。正如图43A所示，H0L0处理似乎对24-72小时时间段的总受体具有一些影响，但该效应的大小要大大低于之前报道的效应大小(Cohen，2005)。
在第二个研究中，各组小鼠(n＝6)同上植入细胞。肿瘤大小达到400-500mm3时，间隔72小时两次给予小鼠250ug剂量的对照抗体或H0L0。给予最后一次剂量24小时后，静脉给予10μg人重组IGF-1。10min后，切除肿瘤，液氮冷冻。按照实施例34描述方法进行总IGF-1R的DELFIA测定。虽然动物以IGF-1处理，但与未处理的对照组相比，没有观察到磷酸化受体水平的的一致性变化。但是，以抗IGF-1R抗体(6E11，H0L0)处理的组表现出受体总水平的下降(图43B)。在来自疗效研究的末期肿瘤样品上观察到了类似的效应(数据未显示)。一项探讨受体磷酸化和受体总水平随时间变化的效应的联合研究没有得出定论(数据未显示)。
实施例34-总IGF-1R DELFIA测定
将含有10或25μg蛋白的100μl肿瘤裂解物加入到之前已包被抗IGF-1R捕获抗体2B9的ELISA平板(参阅实施例13)上。平板4℃过夜温育，随后TBST洗涤。每孔加入以4％BSA/TBS配制的400ng/ml的100μl多克隆抗IGF-1R生物素化抗体(R&D Systems BAF391)，室温温育1小时。平板以TBST洗涤，每孔加入1/1000稀释的100μl Eu标记的链霉亲和素(Perkin Elmer 1244-360)，室温温育1小时。平板以TBST洗涤，每孔加入100μl DELFIA增强液(Perkin Elmer 1244-105)，温育10分钟。采用Wallac Victor多标记酶标仪测量时间分辨荧光信号。
序列表
多核苷酸或氨基酸序列：   序列标识符(SEQ.I.D.NO)
  6E11 VH CDR3   1
  6E11 VH CDR2   2
  6E11 VH CDR1   3
  6E11 VL CDR1   4
  6E11 VL CDR2   5
  6E11 VL CDR3   6
  9C7 VL CDR2   7
  6E11 VH可变域   8
  6E11 VL可变域   9
  2B9 VH可变域   10
  2B9 VL可变域   11
  6E11嵌合抗体VH可变域   12
  6E11嵌合抗体VL可变域   13
  H0可变域   14
  H1可变域   15
  L0可变域   16
  生物素化标记序列   17
  9C7 VH可变域   18
  9C7 VL可变域   19
  5G4 VH可变域   20
  5G4 VL可变域   21
  15D9 VH可变域   22
  15D9 VL可变域   23
  6E11嵌合抗体重链   24
  6E11嵌合抗体轻链   25
  6E11 VH可变域(多核苷酸序列)   26
  6E11 VL可变域(多核苷酸序列)   27
  9C7 VH可变域(多核苷酸序列)   28
  9C7 VL可变域(多核苷酸序列)   29
  6E11嵌合抗体VH可变域(多核苷酸序列)   30
  6E11嵌合抗体VL可变域(多核苷酸序列)   31
  6E11嵌合抗体重链(多核苷酸序列)   32
  6E11嵌合抗体轻链(多核苷酸序列)   33
  H0可变域(多核苷酸序列)   34
  H1可变域(多核苷酸序列)   35
  L0可变域(多核苷酸序列)   36
  H0重链   37
  H1重链   38
  L0轻链   39
  H0重链(多核苷酸序列)   40
  H1重链(多核苷酸序列)   41
  L0轻链(多核苷酸序列)   42
  Campath前导序列   43
  人IGF-1R   44
  食蟹猴IGF-1R   45
  小鼠IGF-1R   46
  人IGF-1R-Fc融合蛋白   47
  食蟹猴IGF-1R-Fc融合蛋白   48
  IGF-1   49
  标记IGF-1   50
  IGF-2   51
  标记IGF-2   52
  B型人胰岛素受体   53
  H0 IgG1m(AA)重链   54
  H0 IgG1m(AA)重链(多核苷酸序列)   55
  H1 IgG1m(AA)重链   56
  H1 IgG1m(AA)重链(多核苷酸序列)替代L0轻链(多核苷酸序列)   5758
 人受体框架序列-VH区   59
 人受体框架序列-VL区   60
 H0人源化可变域(多核苷酸序列)   61
 L0人源化可变域(多核苷酸序列)   62
 重链恒定区(S239D，I332E)(多核苷酸序列)   63
 重链恒定区(S239D，I332E)   64
 重链恒定区(S239D，I332E，A330L)(多核苷酸序列)   65
 重链恒定区(S239D，I332E，A330L)增强区   66
 H0重链(S239D，I332E)(多核苷酸序列)   67
 H0重链(S239D，I332E)   68
 替代L0轻链(多核苷酸序列)   69
 替代L0重链(多核苷酸序列)   70
序列表
SEQ ID 1：
WILYYGRSKWYFDV
SEQ ID 2：
NINPNNGGTNYNQKFKD
SEQ ID 3：
DYYMN
SEQ ID 4：
RSSQSIVQSNGDTYLE
SEQ ID 5：
RISNRFS
SEQ ID 6：
FQGSHVPYT
SEQ ID 7：
RVSNRFS
SEQ ID 8：
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID 9：
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
SEQ ID 10：
QVQLKQSGPGLVQSSQSLSITCTISGFSLTSHGIYWLRQSPGKGLEWLGVIWSGGSADYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSPYYYRSSLYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID 11：
NIVLTQSPKSMSMSIGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKAEQSPKLLIYGASNRHTGVPDRFTGSGSSTDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSDPLTFGAGTKLELKRA
SEQ ID 12：
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSS
SEQ ID 13：
DVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRT
SEQ ID 14：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID 15：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID 16：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRT
SEQ ID 17：
GLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID 18：
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGPGTTVTVSS
SEQ ID 19：
DVLMTQSPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
SEQ ID 20：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQTHGRSLEWMANINPNTGGTNYNQKFRGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWILYYGSSRWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID 21：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
SEQ ID 22：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWMANINPNTGGTNYNQKFTGKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWILYYGSSKWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID 23：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRA
SEQ ID 24：
MGWSWIFFFLLSETAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYAFTDYYMNWVKQSHGKSLEWVANINPNNGGTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID 25：
MKLPVRLVVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID 26：
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
SEQ ID 27：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
SEQ ID 28：
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG
SEQ ID 29：
GATGTTTTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
SEQ ID 30：
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID 31：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACG
SEQ ID 32：
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTTTCTTCCTCCTGTCAGAAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACGCGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGGTGGCAAATATTAATCCCAACAATGGTGGTACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGATTCTTTACTACGGTCGTAGCAAATGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID 33：
ATGAAGTTGCCTGTTCGGCTCGTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCACGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGTATTGTTCAAAGTAATGGAGACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAATTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID 34：
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACACATTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID 35：
CAGGTCCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCAGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCTAGCGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCAGGCTACGCCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGCCTCGAGTGGATGGGCAACATCAACCCCAACAATGGCGGGACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGATCGCGTGACCATGACCACCGACACTAGCACCTCAACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGCGGAGCGATGACACTGCCGTGTACTACTGTGCCAGGTGGATTCTGTACTACGGGAGGAGCAAGTGGTACTTCGACGTCTGGGGAAGAGGGACACTAGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID 36：
GACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACG
SEQ ID 37：
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID 38：
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID 39：
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVQSNGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID 40：
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SEQ ID 41：
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SEQ ID 42：
ATGGGATGGTCCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCAACTGCCACTGGAGTCCACTCCGACATCGTCATGACCCAGAGCCCACTGTCACTCCCCGTGACACCCGGAGAGCCCGCTAGCATCAGCTGTAGAAGCTCCCAGAGCATCGTGCAGTCTAACGGCGATACCTACCTCGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGACAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTACCGCGTCAGCAATCGCTTTTCCGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGCTCAGGAAGCGGAACCGACTTCACCCTGAAGATCTCAAGGGTGGAGGCTGAGGATGTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGATCTCACGTGCCTTACACCTTCGGACAGGGCACAAAGCTCGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
SEQ ID 43：
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ ID 44：
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SEQ ID 45：
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SEQ ID 46：
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SEQ ID 47：
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SEQ ID 48：
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SEQ ID 49：
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SEQ ID 50：
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SEQ ID 51：
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE
SEQ ID 52：
MAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGLNDIFEAQKIEWHE
SEQ ID 53：
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SEQ ID 54：
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SEQ ID 55：
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SEQ ID 56：
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SEQ ID 57：
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SEQ ID 58：
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SEQ ID 59：
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SEQ ID 60：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaWYLQKPGQSPQLLIYXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaFGQGTKLEIKRT
SEQ ID 61：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGT
SEQ ID NQ 62：
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACG
SEQ ID NO：63
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
SEQ ID NO：64
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：65
ACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTCTGCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
SEQ ID NO：66
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：67
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTCACCGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCCGACGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCGAGGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAGTGA
SEQ ID NO：68
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGNINPNNGGTNYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWILYYGRSKWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：69
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAGAAGCAGCCAGAGCATCGTCCAGAGCAACGGCGACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAGAGTGAGCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCTTTCAAGGCAGCCACGTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGA
Seq ID NO：70
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCAACATCAACCCCAACAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGGGTCACCATGACCACCGACACCAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTGGATCCTGTACTACGGCCGGTCCAAGTGGTACTTCGACGTGTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAGTGATGA

Claims (38)

1.一种特异结合IGF-1R的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ.ID.NO：1的CDR H3或其在CDRH3含有1个或2个氨基酸置换的变体。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中SEQ.ID.NO：1的氨基酸残基差异是选自7和9的一个或多个位置的置换。
3.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中SEQ.ID.NO：1的氨基酸残基差异是选自位置7的R到S和位置9的K到R的一个或多个置换。
4.如权利要求1到3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含一个或多个下列序列：CDRH2：SEQ.ID.NO：2或CDRH1：SEQ.ID.NO：3、CDRL1：SEQ.ID.NO：4、CDRL2：SEQ.ID.NO：7和CDRL3：SEQ.ID.NO：6。
5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中一个或多个所述CDR可被替换为其变体，其中每个变体CDR含有1个或2个氨基酸置换。
6.如权利要求4或5所述的抗体或抗原结合片段，其还包含SEQ.ID.NO：3的CDR H1。
7.如权利要求4或权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其还包含SEQ.ID.NO：7的CDR L2。
8.如权利要求1到7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其还包含下列CDR：
CDRH1：SEQ.ID.NO：3
CDRH2：SEQ.ID.NO：2
CDRH3：SEQ.ID.NO：1
CDRL1：SEQ.ID.NO：4
CDRL2：SEQ.ID.NO：7
CDRL3：SEQ.ID.NO：6
9.一种特异结合IGF-1R和包含SEQ.ID.NO：8的重链可变区和SEQ.ID.NO：9的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
10.一种特异结合IGF-1R和包含SEQ.ID.NO：10的重链可变区和SEQ.ID.NO：11的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
11.一种特异结合IGF-1R和包含SEQ.ID.NO：12的重链可变区和SEQ.ID.NO：13的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
12.一种特异结合IGF-1R和包含SEQ.ID.NO：14的重链可变区域和SEQ.ID.NO：16的轻链可变区域的抗体或其抗原结合片段。
13.一种特异结合IGF-1R和包含SEQ.ID.NO：15的重链可变区和SEQ.ID.NO：16的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。
14.一种包含权利要求1到8任一项所述的CDR或权利要求9到13任一项所述的重链或轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段来自大鼠、小鼠、灵长类(例如食蟹猴、旧大陆猴或类人猿)或人类。
15.如权利要求1到14任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人源化或嵌合抗体。
16.如权利要求1到15任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还结合灵长类IGF-1R。
17.如权利要求1到16任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含恒定区。
18.如权利要求17所述的抗体，其中所述抗体包含IgG同种型的恒定区。
19.如权利要求18所述的抗体，其中所述抗体是IgG1。
20.如权利要求1到19任一项所述的抗体，其包含恒定区域，使得所述抗体具有下降的ADCC和/或补体激活或效应子功能。
21.如权利要求1到19任一项所述的抗体，其包含突变的恒定域或具有改变的糖基化概况的恒定域，使得所述抗体具有增强的效应子功能/ADCC和/或补体激活。
22.如权利要求1到17任一项所述的抗原结合片段，其中所述片段是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微抗体、minibody、分离的VH或分离的VL。
23.如权利要求1到21任一项所述的抗体或如权利要求1到22任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段可具有至少一些效应子功能，例如它可具有一些ADCC或CDC功能。
24.一种包含至少一个表达盒的重组转化、转染或转导的宿主细胞，其中所述表达盒包含编码本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的重链的多核苷酸，还包含编码本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的轻链的多核苷酸。
25.一种包含至少一个表达盒的重组转化、转染或转导的宿主细胞，其中第一个表达盒包含编码本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的重链的多核苷酸，还包含第二个表达盒，其包含编码本文所述的依据本发明的抗体或抗原结合片段的轻链的多核苷酸。
26.如权利要求24或25所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。
27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
28.如权利要求27所述的宿主细胞，其中所述细胞是CHO或NSO。
29.一种产生权利要求1到21所述的抗体或权利要求1-22任一项所述的其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括在无血清培养基中培养权利要求24-28任一项所述的宿主细胞的步骤。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述抗体被所述宿主细胞分泌到培养基中。
31.如权利要求30所述的方法，其中与含有所述抗体的培养基相比，所述抗体被进一步纯化到至少95％或更高(例如98％或更高)。
32.一种包含任何上述权利要求所述的抗体或其抗原结合片段和药用载体的药物组合物。
33.包含权利要求32所述的组合物和使用说明的试剂盒。
34.一种治疗患有癌症的人患者的方法，其中所述方法包括给予任何上述权利要求所述的治疗有效量的抗体或其抗原结合片段或权利要求32所述的组合物的步骤。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述患者患有***癌。
37.任何上述权利要求所述的抗体或其抗原结合片段在生产用于治疗选自于由类风湿性关节炎、乳腺癌、***癌、肺癌或骨髓瘤组成的组的疾病或疾患的药物中的用途。
38.一种如任何上述权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体中和IGF-1R的活性。
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