CN101654659B - 一种延长大麦白粉病菌株保存期的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种延长大麦白粉病菌株保存期的方法，属于作物病原菌保存方法的技术领域。该方法包括：(1)单孢菌株的采集与扩繁；(2)感病大麦品种试管苗的培育；(3)大麦试管苗的接种与培养；(4)大麦白粉病菌株的保存与转接等步骤。本方法能显著延长大麦白粉病菌株的保存期，由常规方法的8-10天延长至60-70天；并能克服容易产生交互感染，导致一些特定致病型菌株的丢失及操作烦琐、耗费人力、物力较大等的缺陷，以确保大麦白粉病病原菌相关研究工作的正常开展。本发明可以在大麦病害研究与育种机构中推广应用。

Description

一种延长大麦白粉病菌株保存期的方法

技术领域

本发明涉及作物病原菌保存方法的技术领域，尤其涉及一种大麦白粉病菌单孢菌株的保存方法。

背景技术

大麦是世界主要的粮食作物之一，其播种面积仅次于小麦、水稻和玉米，居第四位。我国大麦面积和总产次于水稻、小麦、玉米和粟，居第5位。大麦可作饲用、食用、啤用和保健食品。大麦白粉病是大麦的主要病害之一，多发生在世界潮湿、半潮湿的大麦产区，在中国大部分大麦产区都有发生，主要发生在冬大麦区，尤其在西南地区和东南沿海地区发病较重。近年来，由于氮肥使用量增大，种植密度增高，种植品种单一及暖冬气候的影响，大麦白粉病害日益严重，可造成20～30％的产量损失。

大麦白粉病是由布氏白粉病菌大麦专化型(Blumeria graminisf.sp.Hordei L.，简称Bgh)引起的真菌病害，其病原菌是专化性的活体寄生菌，属子囊菌纲白粉菌目。该病菌主要危害叶片，严重时也可危害叶鞘、茎秆和穗部，从幼苗到成株，均可被病菌侵染。病原菌丝以吸器进入寄主细胞内吸收养分和水分生长扩展，寄主表面被菌丝体覆盖后，一方面影响了光合作用，另一方面其角质层被破损，气孔的作用丧失，呼吸作用和蒸腾作用失控，因而导致全株营养不良，麦苗早衰，易倒伏，麦粒秕瘦，产量降低。大麦白粉病菌与寄主之间存在着“基因对基因”的关系，因而可利用含有不同抗性基因的大麦鉴别寄主将大麦白粉菌单孢菌株区分为不同的致病型。但大麦白粉病菌的毒性变异较快，随着专化性抗病品种的大面积推广，其品种抗性几年内就会丧失。因此通过分析大麦白粉菌群体的毒性结构、分布和动态，可对抗病基因发挥作用的有效区域进行评价和预测，为前瞻性育种提供依据。用分离保存的不同大麦白粉病菌致病型菌株接种大麦品种，可全面、准确评价品种的抗病性，鉴定大麦品种的抗白粉病基因，寻找新抗源，通过合理利用和布局抗病基因可有效控制大麦白粉病。

分离和保存不同的大麦白粉病菌致病型菌株，是开展大麦白粉病菌毒性基因遗传学研究及病原和寄主互作关系研究的先决条件。但大麦白粉病菌是一种专性寄生菌，只能在活的寄主组织上生长发育。该菌生活史可分为有性生长阶段和无性生长阶段。其中，无性生长阶段的大麦白粉病菌营养体为菌丝体，主要在大麦叶表面寄生，通过产生分生孢子进行无性繁殖，并从无性生长发育后期的菌丛中产生有性繁殖器官闭囊壳，从而进入有性生长阶段。其中的雄器和产囊体配合后，通过质配、核配和减数***产生子囊孢子，子囊孢子生长发育后产生菌丝体后又进入到无性生长阶段。在适宜的温度、湿度和光照条件下，大麦白粉病菌无性生长阶段产生的分生孢子可寄生在有生活力的特定大麦品种的叶片上，并可重复产生；而大麦有性繁殖器官闭囊壳在菌丝无性生长发育后期产生，子囊孢子的生成则需要通过质配、核配和减数***，故其繁殖后代会发生变异，一般不宜通过有性繁殖保存菌株。因此，大麦白粉病菌株主要是利用其分生孢子侵染感病的活体大麦叶片，并每隔一段时间在活体大麦叶片上转接分生孢子的方式进行保存。因为大麦白粉菌在麦叶上进行无性生长的过程中会不断吸收营养，导致组织坏死，腐生菌孳生繁衍，营养体短时间内会污染失活，难以长时间保存，常规条件下只能保存8-10天；同时分生孢子在频繁转接过程中，一方面需耗费大量人力、物力，另一方面往往会产生交互感染，致使特定的致病型菌株会在无意中丢失。此外，目前文献报道中有关保存小麦白粉病菌株方法的还有：(1)将菌株接种到离体叶段上，置于盛有保鲜剂的水琼脂培养皿中，加盖，在低温下可保存40天；(2)将菌株接种到试管苗上，低温下可保存40天，但具体的操作方法未见详细说明；(3)盆钵中生长的麦苗套管隔离，将菌株接种到生长的麦苗上，低温下可保存60天，但该法占用的空间较大、耗能多，转接时需取出带菌叶片，费时且容易产生交互感染。

因此，人们迫切希望在实验室条件下，寻求一种操作简便、省时省力、节能、并能减少交互感染，大幅延长大麦白粉病菌株保存时间的方法，以便于开展大麦白粉菌毒性变异及寄主和病原菌互作关系的研究。

发明内容

本发明目的是，针对现行大麦白粉病原菌在大麦活体保存上所存在的保存期短、费时、费工及在频繁转接过程中易产生交互感染等的缺陷，提出一种操作简便、省时省力、并能减少不同菌株间的交互感染，能较长时间保存大麦白粉病菌株的方法，以确保大麦白粉病病原菌相关研究工作的正常开展。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种延长大麦白粉病菌保存期的方法，该方法按以下步骤进行：

(1)单孢菌株的采集与扩繁：于菌株采集前8-10天先播种广谱高感大麦白粉病菌品种至二叶一心期，备用；从田间采集带有单个或多个清晰菌丝体而尚无孢子产生的叶片，将该叶片剪成单段或多段各带有单个单孢菌落长2-3cm的叶段，并按带菌面朝上各放入一只盛有保鲜剂的培养皿中、加盖，在18-22℃、自然光照下，培养1-2d至单孢菌落产生分生孢子；另取上述广谱高感大麦白粉病菌品种植株的第一叶剪成长2-3cm的新鲜叶段，按一段/每皿放入盛有同上保鲜剂的培养皿中；在超净工作台隔离条件下，将上述已产生分生孢子的叶段按一皿/一段，置于新鲜叶段的上方、敲打几下后，加盖；将接种后培养皿放入光照培养箱内，于16-18℃，相对湿度90％-95％，每天16h，2500-3000lx光照条件下进行扩繁培养8-10d，至有大量分生孢子产生，备用；

(2)感病大麦试管苗的培育：将广谱高感大麦白粉病菌品种种子，用蒸馏水浸种后，滤干，18℃培养24小时至发芽，备用；另准备一批长28厘米、直径5厘米，底部设有0.5厘米小孔，管口分别制作成可匹配对接的直口与翻口的试管，备用；将灭菌后营养土盛入管口形状相同的试管中，至每支试管管长的1/4，营养液浇透，放入8-10粒发芽大麦种子/支试管后，再盖上薄层营养土，用无菌膜封口；经18-22℃培育8-10天至麦苗2叶1心期，备用；

(3)大麦试管苗的接种与培养：取步骤(2)试管苗垂直置于超净工作台上，先用营养液喷湿叶片，再用镊子夹住步骤(1)扩繁后带有大量大麦白粉菌分生孢子的叶段，伸入试管口内，通过振动将孢子接种到试管苗上后，管口用无菌膜封住；放入光照培养箱内，于16-18℃，每天16h，2500-3000lx光照培养24h；每结束一支大麦试管苗的接种后用75％酒精对超净工作台进行灭菌，以防下一菌株接种时产生交互感染；

(4)大麦白粉病菌株的保存与转接：将步骤(3)经接种、培养后的试管苗置于培养箱中，在5℃，每天16h，2500-3000lx光照下该菌种可生长、保存60-70天；一般保存至60天后，即将该感菌的试管苗拆封口并倒置，另取一支步骤(2)的管口形状与该感菌试管苗管口相匹配的大麦试管苗，置于其下方并将上下两试管管口相对接，通过振动将大麦白粉菌孢子转接到下方的试管苗上，管口用75％酒精灭菌后，用无菌膜封住；对超净工作台消毒后，在同上方式、条件下进行其它菌株的转接、培养与保存；如此循环，以实现实验室长久保存大麦白粉病菌株。

所述保鲜剂由1％水琼脂与苯并咪唑按1000g∶40mg比例配制而成。

所述营养液由1g/L NaNO₃、0.25g/L KNO₃、0.25g/L MgSO₄、0.25g/L KH₂PO4、0.01g/L FeCl₃、余量为蒸馏水配制而成。

所述营养土为全元素有机培养基，偏酸性，由东北长白山清河草炭基地生产，经灭菌锅，121℃加热30分钟后使用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所设计提出的试管管口匹配结构和以试管苗活体进行接种的方法，这既简单实用，操作方便，大大提高了接种效率，又有效防止了不同菌株间的交互感染；如试管内播种一定数量的种子，利用适量的营养土和营养液培育麦苗，麦苗生长健旺，根系发达，牢固保土，接种时试管苗虽需倒置操作，但土和苗仍不会脱落；试管底部设有0.5厘米的小孔，既能排除多余的营养液或水分，当试管苗缺水时仅需将管底浸入水中即可由该小孔吸水补充，操作便利，省时省力，并减少交互感染；同时本发明将保存菌株试管苗存放在光照培养箱中，具有占用空间小，耗能少，明显降低了菌种的保存成本。

(2)本发明利用的主要原理，一方面是采用试管苗活体进行接种，能不断补充水分与营养而大大延迟了接种载体的坏死时间；另一方面是先在常温下接种、培养24小时内，当白粉病菌孢子芽管生成产生侵入丝，侵入麦叶表皮细胞形成初生吸器后，及时降低了感菌试管苗的保存温度(5℃)，这既使麦苗和菌株在低温下缓慢生长，也更推迟了麦苗组织的衰败时间，从而取得了明显延长大麦白粉病菌株保存期的有益效果，由常规方法的8-10天，延长至本发明的60-70天。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

营养土：全元素有机培养基，偏酸性，东北长白山清河草炭基地生产；

苯并咪唑：化学纯，国药集团化学试剂有限公司；

琼脂：化学纯，北京鼎国生物技术有限公司；

NaNO₃：分析纯，杭州精细化工有限公司；

KNO₃：分析纯，汕头西陇化工有限公司；

MgSO₄：分析纯，温州市化学用料厂；

KH₂PO₄：分析纯，湖州湖试化学试剂有限公司；

FeCl₃：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

无菌膜：上海稼丰园艺用品有限公司生产；

大麦广谱高感白粉病品种：浙秀12，浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所大麦分中心育种、鉴定。

实施例1：(一种延长大麦白粉病菌保存期的方法1)

该方法按以下步骤进行：

(1)单孢菌株的采集与扩繁：菌株采集前8-10天先播种广谱高感大麦白粉病菌品种“浙秀12”至二叶一心期后，备用；从田间采集仅带有单个清晰菌丝体，而尚无孢子产生的叶片；从叶片中剪下带有该单个单孢菌落长2-3cm的叶段，并按带菌面朝上放入盛有由1％水琼脂与苯并咪唑按1000g∶40mg比例配制而成保鲜剂的培养皿中、加盖，置室温18-22℃、自然光照条件下培养1-2d，即该叶段尚未发生霉菌感染败坏，而单孢菌落已产生分生孢子时；另取上述二叶一心期广谱高感品种植株的第一叶，将叶片剪成长2-3cm的新鲜叶段3-5段，在隔离条件下，按一段/每皿分别放入盛有同上保鲜剂的培养皿中；在超净工作台上，将上述田间采集的已产生分生孢子的叶段按一皿/一段，置于新鲜叶段的上方、敲动几下进行接种后，加盖；将接种后培养皿放入光照培养箱内，于16-18℃，相对湿度90％-95％，每天16h，2500-3000lx光照条件下进行扩繁培养8-10d，至有大量分生孢子产生，而叶片仍持绿，未被霉菌感染，备用；

(2)感病大麦试管苗的培育：将广谱高感大麦白粉病菌品种种子，用蒸馏水浸种24h后(种子量根据转接保存的菌株数量确定)，滤干水分后种子再放入烧杯中，种子上面盖两层滤纸放入生化培养箱中，18℃培养24小时发芽，备用；另准备一批长28厘米、直径5厘米，底部设有0.5厘米小孔，管口分别制作成可匹配对接的直口与翻口，备用；将东北长白山清河草炭基地生产的营养土经灭菌锅121℃加热30分钟灭菌后，盛入直口或翻口试管中至管长的1/4，营养液浇透至部分从小孔流出，按每支放入8-10粒发芽大麦种子后，盖上薄层营养土，管口用无菌膜封住；经18-22℃培育8-10天，至麦苗2叶1心期，备用；

所述营养液由1g/L NaNO₃、0.25g/l KNO₃、0.25g/l MgSO₄、0.25g/l KH₂PO4、0.01g/l FeCl₃、余量为蒸馏水配制而成；

(3)大麦试管苗的接种与培养：取步骤(2)试管苗垂直置于超净工作台上，先用同上营养液喷湿叶片，再用镊子(经过75％的酒精消毒)夹住步骤(1)扩繁后带有大量大麦白粉菌分生孢子的叶段，伸入试管口内5厘米处，通过振动将孢子接种到试管苗上，管口经75％酒精擦过灭菌后，用无菌膜封口；放入光照培养箱内，于16-18℃，2500-3000lx光照16h条件下培养24h，至孢子发芽并侵入麦叶表皮细胞；每结束一支大麦试管苗的接种后用75％酒精对超净工作台上空间喷雾，落下孢子灭菌，以备下一个菌株接种，防止交互感染；

(4)大麦白粉菌株的保存与转接：将步骤(3)经接种、培养后的带菌试管苗放入光照培养箱中，于5℃、每天16h、2500-3000lx光照下培养，可以生长、保存60-70天；一般当保存至60天后，即将感菌的试管苗拆封口并倒置，另取一支步骤(2)的管口形状(如直口)与该感菌试管苗管口(如翻口)相匹配的大麦试管苗，置于其下方并将上下两试管的管口相对接，通过振动将大麦白粉菌分生孢子转接到下方的试管苗上，管口用75％酒精灭菌后，无菌封口膜封口；并用75％酒精对超净工作台上空间喷雾，落下孢子灭菌，以备下一菌株接种保存，防止交互感染；同上方法培养后再保存约60-70天后，再用同法转接、保存，如此循环，可在实验室长久保存大麦白粉病菌株。

实施例2：(一种延长大麦白粉病菌保存期的方法2)

本实施例方法，除在步骤(1)从田间采集带有多个清晰菌丝体而尚无孢子产生的叶片，并将该叶片剪成多段各带有单个单孢菌落长2-3cm的叶段外，其余的步骤、方法、工艺同于实施例1。

Claims (4)

1.一种延长大麦白粉病菌保存期的方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)单孢菌株的采集与扩繁：于菌株采集前8-10天先播种广谱高感大麦白粉病菌品种至二叶一心期，备用；从田间采集带有单个或多个清晰菌丝体而尚无孢子产生的叶片，将该叶片剪成单段或多段各带有单个单孢菌落长2-3cm的叶段，并按带菌面朝上各放入一只盛有保鲜剂的培养皿中、加盖，在18-22℃、自然光照下，培养1-2d至单孢菌落产生分生孢子；另取上述广谱高感大麦白粉病菌品种植株的第一叶剪成长2-3cm的新鲜叶段，按一段/每皿放入盛有同上保鲜剂的培养皿中；在超净工作台隔离条件下，将上述已产生分生孢子的叶段按一皿/一段，置于新鲜叶段的上方、敲打几下后，加盖；将接种后培养皿放入光照培养箱内，于16-18℃，相对湿度90％-95％，每天16h，2500-3000lx光照条件下进行扩繁培养8-10d，至有大量分生孢子产生，备用；

(2)感病大麦试管苗的培育：将广谱高感大麦白粉病菌品种种子，用蒸馏水浸种后，滤干，18℃培养24小时至发芽，备用；另准备一批长28厘米、直径5厘米，底部设有0.5厘米小孔，管口分别制作成可匹配对接的直口与翻口的试管，备用；将灭菌后营养土盛入管口形状相同的试管中，至每支试管管长的1/4，营养液浇透，放入8-10粒发芽大麦种子/支试管后，再盖上薄层营养土，用无菌膜封口；经18-22℃培育8-10天至麦苗2叶1心期，备用；

(3)大麦试管苗的接种与培养：取步骤(2)试管苗垂直置于超净工作台上，先用营养液喷湿叶片，再用镊子夹住步骤(1)扩繁后带有大量大麦白粉菌分生孢子的叶段，伸入试管口内，通过振动将孢子接种到试管苗上后，管口用无菌膜封住；放入光照培养箱内，于16-18℃，每天16h，2500-3000lx光照 培养24h；每结束一支大麦试管苗的接种后用75％酒精对超净工作台进行灭菌，以防下一菌株接种时产生交互感染；

(4)大麦白粉病菌株的保存与转接：将步骤(3)经接种、培养后的试管苗置于培养箱中，在5℃，每天16h，2500-3000lx光照下该菌种可生长、保存60-70天；一般保存至60天后，即将该感菌的试管苗拆封口并倒置，另取一支步骤(2)的管口形状与该感菌试管苗管口相匹配的大麦试管苗，置于其下方并将上下两试管管口相对接，通过振动将大麦白粉菌孢子转接到下方的试管苗上，管口用75％酒精灭菌后，用无菌膜封住；对超净工作台消毒后，在同上方式、条件下进行其它菌株的转接、培养与保存；如此循环，以实现实验室长久保存大麦白粉病菌株。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述保鲜剂由1％水琼脂与苯并咪唑按1000g∶40mg比例配制而成。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述营养液由NaNO₃、KNO₃、MgSO₄、KH₂PO4、FeCl₃、蒸馏水配制而成。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述营养土为全元素有机培养基，偏酸性，由东北长白山清河草炭基地生产，经灭菌锅，121℃加热30分钟后使用。