CN101650370B - 一种集成微流控传感芯片及其对微流体进行检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种集成微流控传感芯片及对微流体进行检测的方法,包括刚性聚合物基底、聚二甲基硅氧烷流通层和表面等离子体谐振传感片,被测样品流经聚二甲基硅氧烷流通层的过滤通道的过滤微柱进行过滤分离,未通过过滤微柱的被测样品进入废液通道并从废液出口排除。通过过滤微柱分离后的被测样品进入芯片的传感检测通道与表面等离子体谐振传感片上的特定生物分子发生反应,通过表面等离子体谐振传感片对芯片上发生的生化反应进行免标记、实时定量检测。本发明集样品过滤预处理、分离和免标记传感检测于一体,具有集成度高、操作简单、检测灵敏度高、无需标记、样品消耗少特点。本发明适合于血液、尿液、唾液等成分复杂的体液的临床诊断分析。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域,具体涉及一种集样品过滤、分离和免标记传感检测于一体微流控传感芯片和分析方法。
背景技术
微流控芯片(microfluidic chip)是20世纪90年代在微电子机械***(MEMS)技术、生命科学、分析科学以及信息科学等多学科交叉、多技术融合的基础上发展起来的一种新型的生化分析技术。与传统的生化分析技术相比,微流控芯片具有体积小、试剂消耗少、分析速度快、分析过程自动化、易于集成化以及高通量等许多优点。它在疾病诊断、公共安全、航天航空、高通量药物筛选等诸多领域具有广阔的应用前景。目前已经成为分析学科领域最活跃的研究前沿,代表着未来生化分析仪器走向微型化、集成化、个性化和家用化的发展方向。在不远的将来,患者只要取一滴血、一滴尿,甚至一点唾液放在微流控芯片上就可以直接进行疾病诊断,使患者足不出户就可以完成就医的全过程。
尽管如此,微流控芯片的产业化进程并没有人们预想的那么迅速,制约其产业化的瓶颈技术之一是它的检测技术。激光诱导荧光法(laser-induced fuorescence,LIF)是当前微流控芯片检测中应用最广、灵敏度最高的检测方法,但是该检测装置存在体积大、结构复杂、通用性差(仅仅适用于少量能被荧光染料标记的生物样品的检测)等问题,无法满足微流控芯片检测的家用化和便携化要求。
发明内容
有鉴于此,为了解决现有技术的问题,本发明的目的是基于表面等离子体谐振(SPR)原理的免标记传感检测技术,是一种无需标记、灵敏度高、可实时监测的新型生化分析技术,为此,本发明提出一种集成化的微流控传感芯片及对微流体进行检测的方法,通过MEMS技术将样品过滤、分离和免标记传感检测等功能单元集成到一个芯片上,可实现对复杂生物样品如尿液、血液、唾液等体液的连续、快速、高灵敏度的检测。
为达成所述目的,本发明提出一种集成微流控传感芯片,由刚性聚合物基底、聚二甲基硅氧烷流通层以及表面等离子体谐振传感片组成,表面等离子体谐振传感片与刚性聚合物基底上的聚二甲基硅氧烷流通层形成可逆密封,并将其聚二甲基硅氧烷流通层固接在表面等离子体谐振传感检测***的棱镜上。
为达成所述目的,本发明提出一种利用微流控传感芯片对微流体进行检测的方法,将被测样品从样品入口泵入微流控传感芯片,被测样品流经过滤通道的微过滤柱阵列,被测样品中体积大的细胞和颗粒物进入样品的废液通道,从废液出口直接排除;被测样品通过过滤微柱阵列间隙分离后进入微流控传感芯片的检测通道,当被测样品流经检测通道的表面等离子体谐振传感片时,被测样品中的被检测的生物分子与表面等离子体谐振传感片上经过表面修饰、固定的生物分子发生反应,并在表面等离子体谐振传感片上形成特异性结合,表面等离子体谐振传感片上发生的特异性反应被表面等离子体谐振传感检测***实时监测,反应完的分析样品从废液出口直接排出。
本发明的有益效果:本发明提出的集样品过滤、分离、检测于一体的微流控传感芯片,本发明将MEMS技术与生物传感技术结合起来,以免标记、高灵敏度的SPR生物传感检测技术为基础,发展了一种集样品预处理、分离和检测于一体的集成化微流控传感芯片,实现了对被测生物样品的快速、实时、定量分析。该芯片具有集成度高、免标记、分析速度快、灵敏度高、试样消耗少等优点,与便携式SPR传感器结合起来,可以发展成为面向临床床边诊断(Point of care,POCT)的便携式诊断***。可实时监测的新型生化分析技术,在疾病诊断、药物筛选、食品安全等领域得到广泛的应用,适用于对成分复杂的血样、尿液、唾液等体液的快速、免标记检测。
附图说明
图1为本发明的集成微流控传感芯片示意图。
主要元件说明
(1)为刚性聚合物基底, (2)为聚二甲基硅氧烷流通层,
(3)为表面等离子体谐振传感片, (4)和(41)为样品入口,
(5)为过滤通道, (6)为过滤通道中的过滤微柱阵列,
(7)为传感检测通道, (8)为废液通道,
(9)和(91)为废液出口。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明技术方案中所涉及的各个细节问题。应指出的是,所描述的实施例仅旨在便于对本发明的理解,而对其不起任何限定作用。
本发明提出的基于MEMS技术加工制造的集成微流控传感芯片,主要由刚性聚合物基底1、聚二甲基硅氧烷(PDMS)流通层2以及表面等离子体谐振(SPR)传感片3等三部分组成,其中刚性聚合物基底1包括样品入口4和废液出口9,在刚性聚合物基底1两对角端部分别设有样品入口4和废液出口9;聚二甲基硅氧烷流通层2包括本体上具有样品入口41和废液出口91,样品入口41和废液出口91与刚性聚合物基底1的样品入口4和废液出口9相对应放置,过滤通道5的一端部与样品入口41连接,传感检测通道7以及废液通道8的一端分别与过滤通道5的另一端部连接,传感检测通道7和废液通道8的另一端分别与废液出口91连接。其中过滤通道5中有过滤微柱阵列6,且过滤微柱阵列6的微柱排列方向与过滤通道5轴向平行。当被测样品从样品入口4进入过滤通道5时,只有通过过滤微柱阵列6间隙的被测样品才能进入样品传感检测通道7,当检测被测样品从表面等离子体谐振传感片3表面流过时,待检测的被测样品目标物质与固定在表面等离子体谐振传感片3上的生物分子发生特异性结合,反应信号通过表面等离子体谐振传感片3实时读取,检测后的样品从废液出口9排出,而未通过过滤微柱阵列6间隙进入传感检测通道7的样品直接通过废液通道8从废液出口9排出。
传感检测通道7的流通路径短于与废液通道8的流通路径或传感检测通道7的流通截面大于废液通道8的流通截面,使得传感检测通道7的流动阻力小于或等于废液通道8的流动阻力,如传感检测通道7的流通截面为1.5mm×0.7mm,而废液通道8的流通截面为0.6mm×0.7mm。
本发明中,刚性聚合物基底1的材料可以是有机玻璃(PMMA)、聚碳酸酯(PC)等具有一定刚性特征的高分子聚合材料。
本发明中,聚二甲基硅氧烷流通层2中过滤微柱阵列6包括许多与过滤通道5轴向平行排列的过滤微柱,每一个过滤微柱的截面是长方形、正方形、菱形或圆形等,过滤微柱的尺寸在几微米到几百微米之间,过滤微柱与过滤微柱之间的间隙可以在几百纳米到几十微米之间。
本发明中,利用微流控传感芯片对被测生物样品的流通检测模式可以是静态检测也可以是动态检测,即流动注射检测。
本发明中,利用微流控传感芯片对被测生物样品的检测方法可以采用直接检测法、竞争检测法以及抑制检测法等。
使用本发明的微流控传感芯片,微流体进行分析检测的方法如下:
将含有被测样品如尿液、血液等在微泵的驱动下从样品入口4进入微流控传感芯片,当被测样品流经过滤通道5的微过滤柱阵列6时,细胞等体积大的颗粒物因不能通过过滤微柱阵列6的间隙而进入样品废液通道8,从废液出口9直接排除。而通过了过滤微柱阵列6间隙分离后的样品进入传感检测通道7,当被测样品流经传感检测通道7的表面等离子体谐振传感片3时,被测样品中的被检测的生物分子与表面等离子体谐振传感片3上经过表面修饰、固定的特定生物分子发生反应,并在表面等离子体谐振传感片3上形成特异性结合,表面等离子体谐振传感片3上发生的特异性反应被表面等离子体谐振传感检测***(是本发明之外的)实时监测,反应完的分析样品从废液出口9直接排出。
上述方法中,被测样品可以是尿液、血液、唾液和汗液等生物液体,样品中被测样品的浓度控制为0.1ng/mL-100μg/mL。
上述方法中,被测样品的流速为0.1-100μL/min。
上述方法中,利用微流控传感芯片在表面等离子体谐振(SPR)传感检测***上,对被测样品检测可以是直接检测法、竞争法、抑制法等。
实施例:利用该微流控传感芯片检测尿液中的微量白蛋白(HSA)。如图1所示,微流控传感芯片的刚性聚合物基底1采用有机玻璃加工而成22mm(长)×22mm(宽)×15mm(高)有机玻璃支撑基底。表面等离子体谐振传感片3是通过利用磁控溅射技术在20mm×20mm,厚度为170μm的盖玻片上沉积一层大约2nm的铬,然后再沉积一层50nm的金制作而成,本实验采用竞争免疫法进行检测,主要实验步骤如下:
1、本发明的芯片羧甲基葡聚糖修饰:首先用5×10-3mol/L的11-mercapto-1-undecanol溶液浸泡表面等离子体谐振传感片3过液,提高金膜表面的亲水性,然后将传感芯片3放入0.6mol/L表氯醇溶液(溶剂为按1∶1比例混合的0.1mol/L NaOH和diglyme)中25℃下反应4hr。取出芯片后彻底水洗、乙醇洗,再水洗,吹干芯片后将0.2g/mL葡聚糖碱性溶液(溶剂为1.0mol/L NaOH溶液)滴在芯片的金膜一面上,25℃下反应20h。去离子水清洗后将芯片浸没在1mol/L溴乙酸溶液(溶剂为0.2mol/L的NaOH)中进行羧甲基修饰。25℃下反应16hr后取出,去离子水清洗芯片,放入HBS缓冲液(0.01mol/L HEPES(C8H18N2O4S,238.3),0.15mol/L NaCl(58.44),0.05%Tween 20(1227.54),pH7.4)中,4℃冷藏保存即可。
2、本发明的芯片安装:将修饰了羧甲基葡聚糖的表面等离子体谐振传感片3的镀金面与有机玻璃基底1上的聚二甲基硅氧烷流通层2形成可逆密封,其未镀金面通过香柏油安装在本发明之外的表面等离子体谐振(SPR)传感检测***的棱镜上;
3、本发明的芯片活化:通入PBS缓冲液,待基线稳定后,将在通入等体积新鲜混合的EDC(0.4mol/L)和NHS(0.1mol/L)溶液对传感芯片3进行活化,流速为10μL/min。5min后PBS清洗;
4、在线固定:在pH值为4.6醋酸缓冲液中通入浓度为80μg/mL的人血清白蛋白(HSA),实现HSA在表面等离子体谐振传感片3表面的在线固定;
5、灭活:用1mol/L的乙醇胺溶液对本发明的芯片进行灭活处理,5min后用PBS缓冲液清洗至基线稳定;
6、标准曲线测试与绘制:配置不同浓度梯度的HSA溶液,与一定量的抗HSA抗体混合反应,形成标准溶液,并用上述标准溶液依次通过本发明的芯片,测试出SPR标准检测曲线;
7、真实被测样品分析:尿液用PBS缓冲液稀释100倍,并与一定量的抗HSA抗体进行反应,反应时间为10分钟左右。然后,通过微泵将稀释的被测样品尿液从样品入口4过滤通道5,被测样品尿液在过滤通道5中发生分离,通过过滤微柱阵列间隙的尿液进入传感检测通道7,与表面等离子体谐振传感片3上固定的HAS发生特异性结合。
8、本发明的芯片再生:本发明的芯片再生时,通入0.1MNaOH对其进行再生处理,本发明的芯片可以反复多次使用。
以上所述,仅为本发明中的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内,可理解想到的变换或替换,都应涵盖在本发明的包含范围之内,因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种集成微流控传感芯片,其特征在于,由刚性聚合物基底(1)、聚二甲基硅氧烷流通层(2)以及表面等离子体谐振传感片(3)组成,表面等离子体谐振传感片(3)的镀金面与刚性聚合物基底(1)上永久性粘接的聚二甲基硅氧烷流通层(2)形成可逆密封,其未镀金面通过香柏油贴在表面等离子体谐振传感检测***的棱镜上;
在聚二甲基硅氧烷流通层(2)本体上具有样品入口(41)和废液出口(91),过滤通道(5)的一端部与样品入口(41)连接,传感检测通道(7)以及废液通道(8)的一端分别与过滤通道(5)的另一端部连接,传感检测通道(7)和废液通道(8)的另一端分别与废液出口(91)连接;在过滤通道(5)中设有过滤微柱阵列(6),且过滤微柱阵列(6)微柱的排列方向与过滤通道(5)轴向平行,只有通过过滤微柱阵列(6)间隙的样品才能进入传感检测通道(7),未能通过的样品直接进入废液通道(8)。
2.根据权利要求1所述的芯片,其特征在于,在刚性聚合物基底(1)两对角端部分别设有样品入口(4)和废液出口(9)。
3.根据权利要求1或2所述的芯片,其特征在于,刚性聚合物基底(1)的材质是有机玻璃或聚碳酸酯。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的芯片,其特征在于,在聚二甲基硅氧烷流通层(2)主体上的样品入口(41)和废液出口(91)与刚性聚合物基底(1)样品入口(4)和废液出口(9)相对应。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的芯片,其特征在于,传感检测通道(7)的流通路径短于废液通道(8)的流通路径或传感检测通道(7)的流通截面大于废液通道(8)的流通截面,使得传感检测通道(7)的流动阻力小于或等于废液通道(8)的流动阻力。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的芯片,其特征在于,过滤微柱阵列(6)包括多个过滤微柱,每一个过滤微柱的截面是正方形、菱形或圆形,过滤微柱间的间隙在几百纳米到几十微米之间。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的芯片,其特征在于,表面等离子体谐振传感片(3)是固定有生物分子的表面等离子体谐振传感片与聚二甲基硅氧烷流通层(2)形成可逆密封。
8.一种利用权利要求1的集成微流控传感芯片对微流体进行检测的方法,其特征在于:
将被测样品从样品入口泵入微流控传感芯片,被测样品流经过滤通道的微过滤柱阵列,被测样品中体积大的细胞和颗粒物进入样品的废液通道,从废液出口直接排除;被测样品通过过滤微柱阵列间隙分离后进入微流控传感芯片的检测通道,当被测样品流经检测通道的表面等离子体谐振传感片时,被测样品中的被检测的生物分子与表面等离子体谐振传感片上经过表面修饰、固定的生物分子发生反应,并在表面等离子体谐振传感片上形成特异性结合,表面等离子体谐振传感片上发生的特异性反应被表面等离子体谐振传感检测***实时监测,反应完的分析样品从废液出口直接排出。
9根据权利要求8所述检测的方法,其特征在于:所述被测物样品是尿液、血液、唾液、汗液、生物液体和污染水质,样品中被测物的浓度控制为0.1ng/mL-100μg/mL,样品的流速为0.1-100μL/min。
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