CN101646424B - 用于控释艾赛那肽的组合物和微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了含有艾赛那肽作为活性成分的控释组合物和控释微球及其制备方法。更具体而言，所提供的控释组合物含有作为活性成分的艾赛那肽，具有特定粘度的生物可降解聚合物，以及涂层材料，所述组合物具有高生物利用度并表现出活性成分在一段时间内以有效的浓度持续释放，而不会出现过高的活性成分初始快速释放；所提供的控释微球包括一个含有活性成分艾赛那肽和生物可降解聚合物的核心和涂覆所述核心的涂层；所提供的制备缓释微球的方法包括下述步骤：混合艾赛那肽、生物可降解聚合物和溶剂，从混合物中除去溶剂而制备硬化的微球，以及涂覆硬化的微球以在每个微球表面形成涂层。

Description

用于控释艾赛那肽的组合物和微球及其制备方法
相关申请的交互引用 
本专利申请要求以2007年3月27日提交的韩国专利申请No.10-2007-0029586作为优先权基础，并且该申请的内容通过援引的方式全部纳入本文。 
技术领域
本发明涉及含有艾赛那肽作为活性成分的控释组合物和控释微球及其制备方法。 
背景技术
艾赛那肽(exendin)是高血糖素样肽1(GLP-1)激动剂，在体内作为GLP-1激素起作用，艾赛那肽-4与GLP-1(7-36)NH2的氨基酸序列具有53％的序列同源性(Goke，et al.、J.Biol.Chem.，268：19650-19655，1993)。 
GLP-1——一种代表性肠促胰岛素激素——是一种由肠内的L细胞分泌的肽，它在食物进入消化道时被分泌并通过刺激胰腺β细胞分泌胰岛素而降低血糖水平(Orskov，et al.，Diabetes，42：658-661，1993)。此外，GLP-1抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素(D’Alessio，et al.，J.Clin.Invest.，97：133-138，1996)并增加胃肠排空时间从而抑制食物摄入(Schira，et al.，J.Clin.Invest.，97：92-103，1996)。GLP-1的功能不仅是刺激胰腺β细胞分泌胰岛素，还能够提高β细胞的增殖率和存活率(Buteau，et al.，Diabetologia，42：856-864，1999)。然而，当GLP-1的N端区域被二肽基肽酶-4(DPP-4)切割后，它就会丧失功能并仅仅具有约2分钟的半衰期(Pridal，et al.，Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet.，21：51-59，1996；Deacon，et al.，Diabetes，47：764-769，1998)。 
已知艾赛那肽能够根据体内血糖水平而提高胰岛素分泌，从而抑制餐后胰高血糖素释放和降低胃肠排空速度，导致对食物摄入的抑制。此外，与GLP-1不同的是艾赛那肽的N端区域不会被DPP-4切割，因此艾赛那肽具有半衰期比GLP-1长的优势，这使得它在体内的作用时间可以比GLP-1更长(Thum，et al.，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes.，110：113-118，2002)。艾赛那肽发现于吉拉毒蜥和墨西哥毒蜥的唾液分泌物中，其中艾赛那肽-3发现于墨西哥毒蜥(Heloderma horridum)中，艾赛那肽-4发现于吉拉毒蜥(Heloderma suspectum)中(Eng，J.，et al.，J.Biol.Chem.，265：20259-62，1990；Eng.，J.，et al.，J.Biol.Chem.，267：7402-05、1992)。 
通过将艾赛那肽-4每天一次腹膜内注射至患糖尿病的ob/ob小鼠体内，已经证实艾赛那肽-4具有长时间的降低血糖水平的效果(Greig et al.，Diabetologia 42：45-50，1999)。近来，已经将艾赛那肽-4制成用作每天两次皮下注射的剂量为5μg或10μg的注射剂。虽然艾赛那肽对DPP-4酶稳定，但是已知当它被以0.2μg/kg或更高的剂量皮下注射至人体时，会产生例如呕吐、恶心和头痛等副作用(Drug Development Research，53：260-267，2001)。对于艾赛那肽的给药而言，由于初始快速释放和初始较高的血液浓度而产生的对剂量的限制是开发艾赛那肽控释制剂的最大障碍。 
通常，水性药物的控释制剂在给药后的初始阶段会产生相当高的释放，已有许多研究试图降低这种过高的初始快速释放。具体而言，在艾赛那肽控释制剂的开发中，为了防止由过高的初始快速释放导致的例如呕吐、恶心和头痛等的副作用，降低初始快速释放是必不可少的。 
已有研究显示，为了降低含有对肢端肥大症等具有治疗效果的奥曲肽的控释微球的初始快速释放，通过下述方法制备微粒，即制备所述药物与葡萄糖的初级乳液，然后进行双乳化方法。在该研究中发现，通过将药物与葡萄糖一起装载可以降低初始快速释放。然而，在微球的初始快速释放约为5％的制备条件下，加入葡萄糖并不能使得装载量增加，而会使得初始快速释放增加(J.Wang et al.、Biomaterials、25：1919-1927、2004)。 
因此，上述文献中公开的技术难以应用于艾赛那肽控释制剂的制备，因为为了降低初始快速释放引起的副作用，在制剂中的初始快速释放应为5％或更低。 
美国专利No.7164005和US2005/0271702公开了使用聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)通过相分离方法制备含有艾赛那肽的微球的方法，在所述共聚物中乳酸与乙醇酸的比例为50∶50。在上述文献中，由AlkermesInc.提供的聚合物3A(IV＝0.38dL/g)、聚合物4A(IV＝0.42dL/g)等，特别是聚合物4A被用作所述聚合物。在上述文献中，所述微球是通过下述方法制备的，即将肽药物和盐析组分(例如硫酸铵)和糖(例如蔗糖和甘露糖)相混合而制备初级乳液，用以提高由艾赛那肽和聚合物3A或4A组成的微球的生物利用度以及所述肽药物的稳定性。也就是说，上述文献试图通过加入添加剂例如糖或硫酸铵等来改进生物利用度，从而使得艾赛那肽可以从聚合物基质中充分释放。这样一来是可以在一定程度上改进生物利用度，但是Cmax值也会很高，从而产生由高初始快速释放导致的副作用问题。也就是说，当生物利用度变高时，初始快速释放会变得过高，而当初始快速释放降低时，生物利用度也会变低。 
如上所述，用于制备控释微球的现有技术存在的限制是：所制备的微球的初始快速释放过高而生物利用度不足，这使得它们不能被应用于制备含有艾赛那肽的控释微球，因为所述含有艾赛那肽的控释微球要求尽量使由于高初始快速释放导致的副作用最小，并且还要具有改进的生物利用度。 
因此，为了解决上述问题，必须开发具有低初始快速释放和改进的生物利用度的含有艾赛那肽的生物可降解制剂。 
发明内容
为满足上述需要，本发明提供了一种含有艾赛那肽作为活性成分和生物可降解聚合物作为载体、并具有高生物利用度的控释剂，其中现有控释剂中初始快速释放过高的问题得到了改善，并且本发明还提供了制备所述控释剂的方法。 
附图说明
图1显示了含有艾赛那肽的RG502H制剂在具有或不具有涂覆层时在大鼠体内产生的血药浓度的变化。 
图2显示了含有艾赛那肽的RG503H制剂在具有或不具有涂覆层时在大鼠体内产生的血药浓度的变化。 
图3显示了含有艾赛那肽的且RG502H∶RG503H为1∶1的制剂在具有或不具有涂覆层以及在使用不同种类的涂覆材料时在大鼠体内产生的血药浓度的变化。 
图4a为使用常规的双乳化方法制备的微球的电子显微镜照片。 
图4b为使用本发明的双乳化方法制备的具有特殊涂覆材料的微球的电子显微镜照片。 
图4c为使用在初级水相中含有涂覆材料的双乳化方法制备的微球的电子显微镜照片。 
图4d为使用在油相聚合物中溶解有涂覆材料的双乳化方法制备的微球的电子显微镜照片。 
具体实施方式
参考下述具体说明，可以更完全地理解本发明及本发明的多种附加的优势，本发明及本发明的多种附加的优势都会更加显而易见。 
本发明涉及含有艾赛那肽的控释微球组合物，所述控释微球组合物在被给予至人体后具有高生物利用度和最小的药物初始快速释放。 
韩国专利No.140209公开了一种制备微球的方法，所述方法通过用特殊的碱性有机材料溶解水性药物而制备初级乳液，然后进行双乳化方法，从而抑制水性药物的初始快速释放。上述文献公开了通过生物可降解聚合物的酸性残基和药物的碱性残基之间的相互作用形成结实的层，从而提高药物装载效率并抑制不需要的高初始快速释放。如上述文献所述，上述方法可用于制备含有碱性或中性多肽(例如LHRH、TRH及其衍生物)的控释组合物。然而，如果待装载药物的特性不同，该方法可能就不适用了，具体而言，在制备含有例如艾赛那肽等分子量相对于LHRH和TRH而言较大的酸性药物的控释组合物时，上述方法就不适用。另外，在上述方法中， 加入碱性材料会使得所制备的微球表面的多孔性增大，这也使得该方法不适用于制备含有艾赛那肽的控释制剂，因为艾赛那肽具有由初始快速释放导致的多种副作用。 
本发明人证实，在使用生物可降解聚合物作为载体制备含有艾赛那肽的微球的过程中或制备之后，通过用特殊的涂覆材料涂覆所述微球，可以形成具有高生物利用度并且没有由于过高的初始快速释放而导致的副作用的微球，从而完成了本发明。 
首先，本发明提供了含有作为活性成分的艾赛那肽、具有特定粘度的生物可降解聚合物和涂覆材料的控释组合物，所述控释组合物具有高生物利用度，并且表现出在一段时间内持续释放有效浓度的活性成分，而不产生过高的活性成分的初始快速释放。 
另一方面，本发明提供了一种控释微球，所述控释微球含有包括作为活性成分的艾赛那肽和生物可降解聚合物的核心；和涂覆所述核心的涂覆材料。 
下面更详细地描述本发明。 
在本发明中，所述艾赛那肽可选自下列的一种或多种：艾赛那肽-3(SEQ ID NO：1)、艾赛那肽-4(SEQ ID NO：2)，以及它们的片段、衍生物和可药用盐。 
所述艾赛那肽衍生物可为由下述化学式I表示的化合物或其可药用盐。 
化学式I 
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 -Z1， 
其中： 
Xaa1为His、Arg、Tyr、Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸或4-咪唑并 
丙酰基(4-imidazopropionyl)； 
Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr； 
Xaa3为Ala、Asp或Glu； 
Xaa4为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸或Gly； 
Xaa5为Ala或Thr； 
Xaa6为Ala、Phe、Tyr或萘基丙氨酸； 
Xaa7为Thr或Ser； 
Xaa8为Ala、Ser或Thr； 
Xaa9为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸、Asp或Glu； 
Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met； 
Xaa11为Ala或Ser； 
Xaa12为Ala或Lys； 
Xaa13为Ala或Gln； 
Xaa14为Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met； 
Xaa15为Ala或Glu； 
Xaa16为Ala或Glu； 
Xaa17为Ala或Glu； 
Xaa19为Ala或Val； 
Xaa20为Ala或Arg； 
Xaa21为Ala、Leu或Lys-NH-R(其中R为Lys、Arg或C1-C10直链或支链烷酰基)； 
Xaa22为Ala、Phe、Tyr或萘基丙氨酸； 
Xaa23为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met； 
Xaa24为Ala、Glu或Asp； 
Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘基丙氨酸； 
Xaa26为Ala或Leu； 
Xaa27为Ala或Lys； 
Xaa28为Ala或Asn； 
Z1为-OH、 
-NH2、 
Gly-Z2、 
Gly Gly-Z2、 
Gly Gly Xaa31-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2或 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z2， 
其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别独立的选自：Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸，Xaa39为Ser或Tyr，并且Z2为-OH或-NH2， 
前提是：Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中Ala的数目不超过3个；并且当Xaa1为His、Arg或Tyr时，Xaa3、Xaa4和Xaa9中的一个或多个为Ala； 
在所述N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸中，优选地N-烷基基团可包括：优选地含有1至约6个碳原子、更优选地含有1至4个碳原子的低级烷基基团。由化学式I表示的化合物可包括PCT申请No.PCT/US98/24273的实施例1至89中所识别的化合物(分别为化合物1至89)和该申请实施例104和105中识别的相应化合物，所述PCT申请的申请日为1998年11月13日，发明名称为“Novel Exendin AgonistCompounds”，该申请通过援引的方式纳入本文。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可包括其中Xaa1为His、Ala、正缬氨酸或4-咪唑并丙酰基的化合物，其中更优选地Xaa1为His、Ala或4-咪唑并丙酰基，再更优选地Xaa1为His或4-咪唑并丙酰基。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa2为Gly的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa3为Ala的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa4为Ala的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa9为Ala的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa21为Lys-NHε-R(其中R为Lys、Arg或C1-C10直链或支链烷酰基)的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa25为Trp或Phe的化合物。 
优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa6为Ala、Phe或萘基丙氨酸，Xaa22为Phe或萘基丙氨酸和Xaa23为Ile或Val的化合物。另 外，优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为如下所述的化合物：其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别独立的选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸，并且更优选地Z1为-NH2和Z2为-NH2。 
另一方面，优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为如下所述的化合物：其中Xaa1为Ala、His或Tyr，并且更优选地为Ala或His；Xaa2为Ala或Gly；Xaa6为Phe或萘基丙氨酸；Xaa14为Ala、Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa22为Phe或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别独立的选自：Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸；Xaa39为Ser或Tyr并且更优选地为Ser；并且优选地Z1为-NH2。 
根据一个特别优选的方面，特别优选的化学式I的艾赛那肽衍生物可为如下所述的化合物：其中Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe或萘基丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、Gly GlyXaa31-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2、Gly GlyXaa31 Ser Ser Gly-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2、Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2、Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别独立地为Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸；Xaa39为Ser或Tyr，并且更优选地为Ser；并且Z2为-OH或-NH2；前提是：Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中Ala的数目不超过3个，并且当Xaa1为His、Arg或Tyr时，Xaa3、Xaa4和Xaa9中的至少一个可为Ala。 
特别优选的化学式I的化合物可包括具有PCT申请No. PCT/US98/25728中SEQ ID No：5至93所示的氨基酸序列的化合物或美国临时申请60/066029中所述的化合物，上述文献通过援引的方式纳入本文。 
根据特别优选的实施方案，提供了如下所述的化合物：其中Xaa14为Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，并且更优选地为Leu或戊基甘氨酸；Xaa25为Ala、Phe、Tyr或萘基丙氨酸，并且更优选地为Phe或萘基丙氨酸。所述化合物在体内或体外条件下以及在化合物合成过程中对于氧化降解更不敏感。 
另一方面，所述艾赛那肽衍生物可包括化学式II所示的化合物或其可药用盐。 
化学式II： 
Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Xaa24 Xaa25 Xaa26 X1-Z1， 
其中 
Xaa1为His、Arg、Tyr、Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸或4-咪唑并丙酰基； 
Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr； 
Xaa 3为Ala、Asp或Glu； 
Xaa4为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸或Gly； 
Xaa5为Ala或Thr； 
Xaa6为Ala、Phe、Tyr或萘基丙氨酸； 
Xaa7为Thr或Ser； 
Xaa 8为Ala、Ser或Thr； 
Xaa9为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸、Asp或Glu； 
Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met； 
Xaa11为Ala或Ser； 
Xaa12为Ala或Lys； 
Xaa13为Ala或G ln； 
Xaa14为Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met； 
Xaa15为Ala或Glu； 
Xaa16为Ala或Glu； 
Xaa17为Ala或Glu； 
Xaa19为Ala或Val； 
Xaa20为Ala或Arg； 
Xaa21为Ala、Leu或Lys-NHε-R(其中、R为Lys、Arg、C1-C10直链或支链烷酰基或环烷基-烷酰基)； 
Xaa22为Phe、Tyr或萘基丙氨酸； 
Xaa23为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met； 
Xaa24为Ala、Glu或Asp； 
Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘基丙氨酸； 
Xaa26为Ala或Leu； 
X1为Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、Asn Lys-NHε-R、Lys-NHε-R Ala、Ala Lys-NHε-R(其中R为Lys、Arg、a C1-C10直链或支链烷酰基或者环烷基烷酰基)； 
Z1为：-OH、 
-NH2、 
Gly-Z2、 
Gly Gly-Z2、 
Gly Gly Xaa31-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z2、 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z2或 
Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z2， 
(其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别独立的选自：Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸，Xaa39为Ser或Tyr，Z2为-OH或-NH2)， 
前提是：Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25和Xaa26中Al a的数目不超过3个，并且当Xaa1为His、Arg、Tyr 或4-咪唑并丙酰基时，Xaa3、Xaa4和Xaa9中的至少一个为Ala。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可包括如下所述的化合物：其中Xaa1为His、Ala、正缬氨酸或4-咪唑并丙酰基，优选地为His、4-咪唑并丙酰基或Ala，更优选地为Hi s或4-咪唑并丙酰基。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa2为Gly的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa4为Ala的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa9为Ala的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa25为Trp或Phe的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa6为Ala、Phe或萘基丙氨酸、Xaa22为Phe或萘基丙氨酸和Xaa23为Ile或Val的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Z1为-NH2的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别独立的选自：Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa39为Ser或Tyr，优选地为Ser的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Z2为-NH2的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Z1为-NH2的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中Xaa21为Lys-NHε-R(其中R为Lys、Arg或C1-C10直链或支链烷酰基)的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可为其中X1为Lys Asn、Lys-NHε-R Asn或Lys-NHε-R Ala(其中R为Lys、Arg或C1-C10直链或支链烷酰基)的化合物。 
优选的化学式II的艾赛那肽衍生物可包括具有PCT申请公布WO99/025728中SEQ ID Nos：95-110所示的氨基酸序列的化合物。化学式II的艾赛那肽衍生物可包括具有PCT申请PCT/US98/24210(1998年11月13日提交，名称为“Novel exendin Agonist Compounds”)中SEQ IDNo：5-93所示的氨基酸序列的化合物。另一方面，化学式II的艾赛那肽衍生物可包括具有PCT申请公布WO99/007404中SEQ ID No：37-40所示的 氨基酸序列的化合物。上述文献均以援引的方式纳入本文。 
化学式I和II中所使用的所写的含义如下： 
“ACN”和“CH3CN”为乙腈。 
“Boc”、“tBoc”和“Tboc”为叔丁氧基羰基。 
“DCC”为N，N’-二环己基碳二亚胺。 
“Fmoc”为笏甲氧基羰基。 
“HBTU”为2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲六氟磷酸酯。 
“HOBt”为1-羟基苯并***一水合物。 
“homoP”和“hPro”为高脯氨酸。 
“MeAla”和“Nme”为N-甲基丙氨酸。 
“naph”为萘基丙氨酸。 
“pG”和“pGly”为戊基甘氨酸。 
“tBuG”为叔丁基甘氨酸。 
“ThioP”和“tPro”为硫代脯氨酸. 
“3Hyp”为3-羟基脯氨酸。 
“4Hyp”为4-羟基脯氨酸。 
“NAG”为N-烷基甘氨酸。 
“NAPG”为N-烷基戊基甘氨酸。 
“Norval”为正缬氨酸。 
在一个优选实施方案中，所述艾赛那肽的片段或衍生物的C端可被酰胺基团取代或未被其取代，可为选自下列的化合物：艾赛那肽-4(1-28)(SEQ ID NO：3)、艾赛那肽-4(1-28)酰胺、艾赛那肽-4(1-30)(SEQ ID NO：4)、艾赛那肽-4(1-30)酰胺、艾赛那肽-4(1-31)(SEQ ID NO：5)、艾赛那肽-4(1-31)酰胺、14Leu25Phe艾赛那肽-4(SEQ ID NO：6)、14Leu25Phe艾赛那肽-4酰胺，以及它们的可药用盐。 
根据一个优选实施方案，在每100重量份数的含有艾赛那肽、生物可降解聚合物和涂覆材料的组合物或微球中，所含有的活性成分艾赛那肽的量为0.1至10重量份数，更优选地为0.8至6重量份数。如果本发明的组合物或微球中含有的艾赛那肽的量低于上述范围，则不能实现艾赛那肽的有效效力；如果艾赛那肽的量高于上述范围，则会增加艾赛那肽的初始快速释放，从而引起由于过高的初始快速释放导致的副作用；因此，优选 地，艾赛那肽的含量在上述范围内。 
所述生物可降解聚合物为对人体无害的所有聚合物，因为该聚合物在被给予至体内后会被缓慢地降解和排出。所述生物可降解聚合物可包括选自下列的一种或多种：聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚原酸酯、聚酐、聚羟基丁酸、聚己内酯和聚烷基碳酸酯，以及一种或多种聚合物与聚乙二醇(PEG)的共聚物，其中所述一种或多种聚合物可为共聚物或简单混合物的形式。 
例如，所述生物可降解聚合物可为选自下列的一种或多种：由乳酸∶乙醇酸的比例为1∶1的RG502H(IV＝0.16至0.24dL/g)、RG503H(IV＝0.32至0.44dL/g)和RG504H(IV＝0.45至0.60dL/g)以及乳酸∶乙醇酸的比例为75∶25的RG752H(IV＝0.14至0.22dL/g)组成的聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)，聚乳酸(PLA)、R202H(IV＝0.16至0.24dL/g)和R203H(IV＝0.25至0.35dL/g)(以上聚合物可购自Boehringer Ingelheimcompany，Germany)；聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物、乳酸∶乙醇酸的比例为1∶1的5050DL 2A(IV＝0.15至0.25dL/g)、5050DL 3A(IV＝0.25至0.43dL/g)和5050DL 4A(IV＝0.38至0.48dL/g)(以上共聚物可购自LakeshoreBiomaterials Company(其前身为Alkermes Company)，USA)等等。 
另一方面，所述生物可降解聚合物可为聚合物-糖复合物，其中的糖与选自下列的聚合物相偶联： 
聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚原酸酯、聚酐、聚羟基丁酸、聚己内酯和聚烷基碳酸酯； 
至少两种所述聚合物基团的共聚物；或 
聚乙二醇(PEG)与一种所述聚合物基团的共聚物。 
在本发明的一个实施方案中，所述聚合物-糖复合物可为其中糖的羟基被所述聚合物取代形成的复合物。所述糖可包括单糖和含有1至8个糖单元的多糖(其中每个糖单元包括3至6个羟基)和含有3至6个羟基并且分子量不大于20000的直链糖醇。所述糖醇可包括甘露糖醇、季戊四醇、山梨糖醇、核糖醇和木糖醇。所述聚合物与糖中含有的三个或更多个羟基相偶联。 
上述实施方案中的聚合物-糖复合物在体内的性质与所述与糖偶联的聚合物的性质相似，它们依赖于所用的聚合物的种类而具有不尽相同的降解速度，可在体内降解为无害的聚合物和糖，因此它们适于用作生物可降 解聚合物。在一个优选实施方案中，所述聚合物-糖复合物可为PLA-葡萄糖复合物、PGA-葡萄糖复合物或PLGA-葡萄糖复合物，其中所述PLGA-葡萄糖复合物可为具有下述结构的复合物： 
Figure G200880009933XD00141
在本发明的控释微球中，在微球表面形成的涂覆层使得可以有效地控制艾赛那肽的初始快速释放，从而防止了由于过高的初始快速释放导致的副作用。所用的生物可降解聚合物可以没有任何粘度的限制。 
在本发明的控释组合物中，所述生物可降解聚合物的作用是作为储存活性成分艾赛那肽的基质，其中如果所述聚合物的粘度过低，则不能有效地储存活性成分，从而导致初始快速释放增高；如果所述聚合物的粘度过高，则会使得活性成分的总释放量降低，从而导致其生物利用度降低。在本发明中，不仅是组合物中所含的生物可降解聚合物起控制药物释放的作用，组合物中所含的涂覆材料也起到控制药物释放的作用，因此可以使用具有相对较低粘度的生物可降解聚合物。因此，为了有效控制药物的初始快速释放并改善其生物利用度，所述生物可降解聚合物的固有粘度(IV)优选地为0.1至0.6dL/g、更优选地为0.15至0.31dL/g、再更优选地为0.16至0.24dL/g，所述固有粘度是将所述生物可降解聚合物以1％(W/V)的浓度溶于氯仿，并在25℃±0.1℃的温度下使用Ubbelohde粘度计测得的。 
在本发明的组合物或微球中，所述生物可降解聚合物的作用是作为储存活性成分的基质和控制释放速度的作用，在每100重量份数的含有艾赛那肽、生物可降解聚合物和涂覆材料的组合物或微球中，所述生物可降解聚合物的含量优选地为85至99.89重量份数，更优选地为91至99重量份数。 
所述涂覆材料用于防止过高的释放并提高活性成分的生物利用度，在本发明的微球中，所述涂覆材料的形式可为微球表面的涂层。所述涂覆材料可为选自碱性氨基酸、多肽和有机氮化物的一种或多种。所述碱性氨基酸可包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸以及它们的衍生物。所述多肽可包括2 至10个氨基酸，更优选地包括2至5个氨基酸，包括选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸的一种或多种氨基酸。所述多肽中的碱性氨基酸数目可大于酸性氨基酸的数目，从而使所述多肽表现为碱性。例如所述多肽可为L-Ala-L-His-L-Lys、L-Arg-L-Phe、Gly-L-His、Gly-L-His-Gly、Gly-L-His-L-Lys、L-His-Gly、L-His-Leu、L-Lys-L-Tyr-L-Lys、L-His-L-Val、L-Lys-L-Lys、L-Lys-L-Lys-L-Lys、L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser等等。此外，所述有机氮化物可为肌酸、肌酸酐、尿素等等。 
在本发明中，在每100重量份数的含有艾赛那肽、生物可降解聚合物和涂覆材料的组合物或微球中，所述组合物中含有的或在所述微球表面涂覆的所述涂覆材料的含量优选地为0.01至5重量份数，更优选地为0.015至3重量份数。如果涂覆材料的含量低于上述范围，则不能够有效地控制药物释放；即使涂覆材料的含量增加至高于上述范围，对于初始快速释放的控制效果也不会再增加。因此，上述涂覆材料的含量范围是优选的。 
本发明的每一个控释微球都具有被所述涂覆材料涂覆的光滑表面，并且所述微球的平均直径为1至50μm，优选地为5至30μm(见图4-b)。所述微球的这种光滑表面可以使得实现对初始快速释放的有效控制以及优异的生物利用度。 
与常规的形式不同，本发明的控释微球或使用本发明的组合物制备的微球的表面涂覆有涂覆材料，这使得它们能够具有常规的含艾赛那肽的微球所不具有的防止过高的初始快速释放以及提高生物利用度的性质。具体而言，艾赛那肽过高的初始快速释放会导致各种副作用，例如呕吐、恶心和头痛等，因此将其初始快速释放的量降低至5％或更低的水平是十分重要的。本发明的控释微球或使用本发明的组合物制备的微球可以使得在初始24小时之内的释放量降低至5％或更低的水平。为了降低由于给予含艾赛那肽的控释微球所导致的副作用，在初始小时内所述初始快速释放的量优选地为5％或更低，更优选地为1％或更低，所述初始快速释放的量按照本文所述的体外释放测试方法进行测量。 
对于常规方法制备的含艾赛那肽的微球，已经进行了各种降低其艾赛那肽的过高初始快速释放的尝试。然而，多数这类成功防止过高初始快速释放的尝试所存在的问题是在降低初始快速释放的同时也降低了总释放量，因而使得药物的生物利用度也明显地降低。但是，本发明的微球表面 具有涂覆材料的涂覆层，使得可以有效地控制初始快速释放，从而避免了由于过高的初始快速释放导致的副作用，同时还能获得药物的持续和充足的释放从而实现优异的生物利用度。 
在本发明的实施方案中，所述组合物或微球还可含有赋形剂，例如保护性胶质和/或稳定剂。 
所述组合物或微球还可含有选自下列的一种或多种保护性胶质：聚乙烯醇、清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和明胶等等。虽然所述保护性胶质对于防止微球中所含的艾赛那肽的过高初始快速释放没有特别的效果，但是它可以起到防止微球之间聚集和改善分散度的作用。考虑到这种作用，所述保护性胶质的含量优选地为0.02％(W/W)至1.0％(W/W)，以含有艾赛那肽、生物可降解聚合物和涂覆材料的组合物或微球的重量为基础。 
此外，为了改进所述微球在冻干过程中的稳定性，本发明的组合物或微球还可含有选自甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠等的赋形剂，所述赋形剂的含量为5％(W/W)至30％(W/W)，更优选地为10％(W/W)至20％(W/W)，以含有艾赛那肽、生物可降解聚合物和涂覆材料的组合物或微球的重量为基础。 
此外，本发明的组合物或微球还可含有常规用在药物制剂中的任何添加剂和赋形剂，相关领域的技术人员可以容易地确定所述添加剂和赋形剂的种类和含量。 
另一方面，本发明提供了制备上述含艾赛那肽的控释微球的方法。本发明的含艾赛那肽的控释微球可由多种方法制备，例如通过在制备微球的过程中或其后将所述微球悬浮于所述涂覆材料溶液中来涂覆微球表面，以制备所述控释微球。制备本发明的微球的方法可以使用双乳化法(W/O/W方法)、单乳化法(O/W方法)、相分离方法、喷雾干燥法等方法来进行。 
特别地，制备含艾赛那肽的控释微球的方法可包括如下步骤： 
混合艾赛那肽和生物可降解聚合物，从而制备W/O型乳液或均一的混合物；和 
通过将所述乳液或均一混合物加入至涂覆材料的水性溶液中以形成涂覆层来进行乳化。 
更特别地，如果使用双乳化法，本发明的方法可包括下述步骤：通过将艾赛那肽水性溶液与溶于有机溶剂的生物可降解聚合物相混合以形成初级乳液(W/O型)来进行乳化；将所述乳液悬浮于涂覆材料的水性溶液中 以形成至W/O/W型乳液；加热所述W/O/W型乳液以除去溶剂并硬化所得的微球；收集并洗涤硬化的微球；以及冻干所述微球。所述有机溶剂可为任何有机溶剂，只要它能够溶解所述生物可降解聚合物并且随后能够与水性溶液相混合而形成乳液即可；例如所述有机溶剂可为选自氯仿、乙酸乙酯、亚甲基氯和甲乙酮的一种或多种，优选的溶剂是亚甲基氯。在这种情况下，所述在第二水相(W/O/W乳液的外层水相)中含有所述涂覆材料，这样在除去有机溶剂后能够在含有艾赛那肽和生物可降解聚合物的微球外面形成涂覆层。 
或者，如果使用单乳化法，本发明的方法可包括下述步骤：将艾赛那肽和生物可降解聚合物溶于有机溶剂形成均一混合物；将含有涂覆材料的水性溶液加入至所得的混合物中以形成乳液；加热所述乳液以除去溶剂并硬化所得的微球；收集并洗涤硬化的微球；以及冻干所述微球。所述有机溶剂可为任何有机溶剂，只要它能够完全混合艾赛那肽和所述生物可降解聚合物而形成均一混合物，并且随后能够与水性溶液相混合形成乳液即可。例如所述有机溶剂可为混合溶剂，其中将选自具有1至5个碳原子的醇、冰乙酸、甲酸、二甲亚砜和n-甲基吡咯烷酮的一种或多种溶剂与选自氯仿、乙酸乙酯、甲乙酮和亚甲基氯的一种或多种溶剂相混合，优选的是其中将甲醇和亚甲基氯相混合的混合溶剂。在这种情况下，通过对所述生物可降解聚合物和与艾赛那肽的均一混合物进行乳化，并将所述涂覆材料加入至水性溶液中以除去有机溶剂，可以使得最后所得的微球表面具有涂覆层。 
另一方面，本发明的制备含艾赛那肽的控释微球的方法可包括如下步骤： 
混合艾赛那肽和生物可降解聚合物以形成乳液或均一混合物； 
固化所得的乳液或均一混合物，以制备初级微球；并且 
将所得的初级微球悬浮于涂覆材料的水性溶液中，以在每个微球的表面形成涂覆层。 
所述固化方法没有什么限制，可以为相关领域中常规使用的任何固化方法，例如相分离方法或喷雾干燥法。 
更具体而言，如果在固化步骤中使用相分离方法，本发明的方法可包括下述步骤： 
将艾赛那肽水性溶液与溶于有机溶剂的生物可降解聚合物相混合，以 形成乳液；或者将艾赛那肽和生物可降解聚合物在混合溶剂中混合，以形成均一混合物溶液； 
将油(例如硅油)加入至所得的乳液或溶液中，以制备初级微球； 
加入对于所述生物可降解聚合物而言的非溶剂，例如含有1至5个碳原子的醇和含有1至12个碳原子的烷的混合溶剂(优选的是乙醇和庚烷的混合溶剂)，以除去微球中的有机溶剂并硬化所述微球； 
将所得的微球悬浮于涂覆材料的水性溶液中，以在每个微球的表面形成涂覆层；和 
收集、洗涤和冻干带有涂覆层的微球。 
所述有机溶剂可为选自氯仿、乙酸乙酯、甲乙酮和亚甲基氯的一种或多种溶剂，优选的是亚甲基氯。所述混合溶剂可为其中将选自具有1至5个碳原子的醇、冰乙酸、甲酸、二甲亚砜和n-甲基吡咯烷酮的一种或多种溶剂与选自氯仿、乙酸乙酯、甲乙酮和亚甲基氯的一种或多种溶剂相混合所得的溶剂，优选的是甲醇和亚甲基氯的混合溶剂。 
或者，如果使用喷雾干燥法，本发明的方法可包括如下步骤： 
将艾赛那肽水性溶液与溶于有机溶剂的生物可降解聚合物相混合，以形成乳液；或者将艾赛那肽和生物可降解聚合物在单一溶剂或混合溶剂中混合，以形成均一混合物溶液； 
喷雾干燥所得的乳液或溶液，以制备初级微球； 
将所得的初级微球悬浮于涂覆材料的水性溶液中，以在每个微球的表面形成涂覆层；和 
洗涤和冻干形成涂覆层的微球。 
所述有机溶剂可为选自氯仿、乙酸乙酯、甲乙酮和亚甲基氯的一种或多种溶剂，优选的是亚甲基氯。所述单一溶剂可为选自冰乙酸或甲酸中的一种或多种，所述混合溶剂可为其中将选自具有1至5个碳原子的醇、冰乙酸、甲酸、二甲亚砜和n-甲基吡咯烷酮的一种或多种溶剂与选自氯仿、乙酸乙酯、甲乙酮和亚甲基氯的一种或多种溶剂相混合所得的溶剂，优选的是甲醇和亚甲基氯的混合溶剂。 
本发明的方法还可包括通过任意常规方法加入保护性胶质物质的步骤，优选的，可在使用涂覆材料涂覆微球的步骤中加入保护性胶质物质。 
溶于水相或水性溶液的涂覆材料的优选浓度可为0.01M至1M，优选的为0.1M至0.5M。如果涂覆材料的浓度低于上述范围，则可能所述涂 覆材料不能完全涂覆所述微球的表面；如果涂覆材料的浓度高于上述范围，可能导致形成涂覆材料的超饱和溶液，这将使得不能实现控制初始快速释放的改进效果；因此，所述涂覆材料的浓度优选地落在上述范围内。 
在本发明的方法中，所述艾赛那肽、生物可降解聚合物和涂覆材料的种类与含量如上所述。 
本发明的含艾赛那肽的组合物可通过口服途径或肠胃外途径给药，优选地通过肠胃外途径给药，例如静脉内途径、皮下途径、肌肉内途径、腹膜内途径等等。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述含艾赛那肽的组合物可以以分散溶液的形式作为注射液使用。所述组合物的有效量可以根据受试者的年龄、疾病的种类和严重程度以及受试者的情况进行适当地调整，所述组合物中的活性成分的剂量可为0.01至100μg/kg/天，更优选地为0.1至10μg/kg/天，所述剂量可以一次性给药或分几次给药。 
参照下述实施例更详细地解释本发明。然而这些实施例不应被解释为以任何形式限制对本发明的范围。 
实施例1 
<实施例1>通过喷雾干燥法制备含艾赛那肽-4的微球 
将4.850g生物可降解聚合物RG502H(Lot No.1009848，IV＝0.19dL/g)和0.150g艾赛那肽-4(Polypeptide Laboratories，USA)均匀地溶解于97mL冰乙酸中。将使用活塞泵以1.5mL/min的流速所制备的溶液装入带有超声喷嘴(Sono-tek，120kHz)的喷雾干燥器(SODEVA，France)中，同时供给180℃的干燥空气，用以制备微球。将所制备的微球分别悬浮于0.5M赖氨酸水溶液中(制得制剂1-1)、悬浮于0.01M赖氨酸水溶液中(制得制剂1-2)、悬浮于0.1M组氨酸水溶液中(制得制剂1-3)以及悬浮于0.5M精氨酸水溶液中(制得制剂1-4)，其中所述溶液中含有1％(W/V)的聚乙烯醇(聚乙烯醇，Gohsenol，EG-50)作为保护性胶质，搅拌3小时后收集，用蒸馏水洗涤然后冻干。为进行比较，用相同的悬浮、搅拌、洗涤和干燥步骤制备另一制剂(制剂1)，区别仅在于所使用的1％(W/V)的聚乙烯醇水溶液中不含涂覆材料。 
<实施例2>依赖于不同聚合物的组合物的效果 
按照与实施例1所述相同的方法制备含艾赛那肽-4的微球，区别仅在于所使用的作为生物可降解聚合物的聚合物分别为：RG503H(Lot No.1006370，IV＝0.38dL/g，制剂2、2-1和2-2)、等量RG502H和RG503H(LotNo.1009848∶Lot No.1006370＝1∶1，IV＝0.29dL/g，制剂3和3-1)的混合物、RG504H(Lot No.1016605，IV＝0.51dL/g，制剂4和4-1)、5050DL2A(Lot No.LP-207，IV＝0.18dL/g，制剂5和5-1)和5050DL 4A(Lot No.LP-206，IV＝0.46dL/g，制剂6和6-1)。 
<实验实施例1-1>测试微球涂覆层的效果 
使用下述方法定量测量实施例1和2中制备的微球中艾赛那肽的含量。将艾赛那肽-4(Polypeptide Laboratories，USA)溶于DMSO(二甲亚砜)，并分别用DMSO稀释至浓度为2、5和10μg/mL，所述溶液被用作标准溶液，并且使用荧光光度计(Cary Eclipse，Varian，USA)以Ex 280nm和Em 350nm进行荧光测量以得到测量曲线。将所制备的微球溶于DMSO中至浓度为150μg/mL，然后也同样进行荧光测量，并由上述测量曲线外推而测得微球中的艾赛那肽含量。 
使用荧光胺定量方法测定本发明的组合物中所用的涂覆材料的含量，具体而言是微球表面含有的赖氨酸、精氨酸、组氨酸等等的含量。将其中将所获得微球溶于DMSO中至浓度为150μg/mL微球的溶液与0.01％(W/V)的荧光胺丙酮溶液和0.5M硼酸钠溶液(pH 9.5)相混合，在室温下孵育20分钟，然后用荧光光度计(Cary Eclipse，Varian，USA)以Ex 392nm和Em 480nm进行荧光测量。使用相同的方法，将所用的涂覆材料溶于DMSO，并分别用DMSO稀释至浓度为2、5和10μg/mL以制得标准溶液。然后进行荧光测量以获得测量曲线，并由此定量测量微球表面的涂覆材料。 
为了证实所述微球抑制初始快速释放的效果，分别测量了涂覆有涂覆材料的微球和不含有涂覆层的现有技术的微球的体外释放量。将每种微球各取10mg，悬浮于1mL测试溶液(10mM HEPES，pH 7.5，100mM NaCl)中，在37℃下和5rpm的转速下进行孵育。在1小时和24小时后收集各样本并离心。使用Ex 280nm和Em 350nm的荧光测量来测定上清液中艾赛那肽的释放量。 
如上所述测定本实施例中所制备微球的含量和体外初始快速释放，并且将所获得的结果总结于下表1中。表1显示了依赖于涂覆材料和生物可 降解聚合物的种类而产生的体外初始快速释放的降低。 
表1 
  制剂编号   聚合物   悬液  TL(％)   DC(％)   碱性有机物的  表面含量   1小时  释放(％)   24小时  释放(％)
  1   502H   1％PVA   3   2.76   -   4.50   9.90
  1-1   502H   1％PVA+0.5M lys   3   2.73   0.249   0.79   3.84
  1-2   502H   1％PVA+0.01M lys   3   2.72   0.099   3.76   5.66
  1-3   502H   1％PVA+0.1M his   3   2.71   0.015   1.53   3.51
  1-4   502H   1％PVA+0.5M erg   3   2.58   0.156   1.46   4.60
  2   503H   1％PVA   3   2.88   -   1.40   1.50
  2-1   503H   1％PVA+0.5M lys   3   2.96   0.057   0.00   0.29
  2-2   503H   1％PVA+0.1M lys   3   2.85   0.132   0.00   0.58
  3   502H:503H   1％PVA   3   2.75   -   2.80   4.00
  3-1   502H:503H   1％PVA+0.5M lys   3   2.91   0.056   0.00   0.75
  4   504H   1％PVA   3   2.46   -   1.23   2.25
  4-1   504H   1％PVA+0.5M lys   3   2.47   0.018   0.81   0.84
  5   5050DL 2A   1％PVA   3   2.53   -   1.31   1.95
  5-1   5050DL 2A   1％PVA+0.5M lys   3   2.54   0.034   1.02   1.66
  6   5050DL 4A   1％PVA   3   2.40   -   1.21   2.03
  6-1   5050DL 4A   1％PVA+0.5M lys   3   2.51   0.018   0.79   0.82
*TL(％)：目标装载量％ 
DC(％)：实际药物含量％ 
如表1所示可以看出，与喷雾干燥后仅在保护性胶质聚乙烯醇溶液中悬浮而制得的制剂1、2、3、4、5和6相比较，本发明的涂覆有涂覆材料的制剂在初始的1小时和24小时内的释放量有所降低。这一效果的获得并不依赖于聚合物的粘度范围，并且所述效果对于防止在给予含艾赛那肽的控释微球后因血液中药物浓度立即突然升高而导致的副作用十分重要。 
<实验实施例1-2>根据聚合物的粘度和涂覆材料的不同而产生的给药后初始阶段中血药浓度的下降 
由于艾赛那肽的副作用是由给药后初始阶段血药浓度的突然升高导致的，因此防止由于直接给药后药物初始释放而产生的血药浓度升高就十分重要。已经发现本发明制剂的血药浓度在给药后1小时内达到峰值浓度，随后下降。为了测定实施例1和2所制备的制剂在给药后的初始血药浓度(1小时浓度)的生物利用度和峰值，将所述制剂给予雄性S.D.大鼠(350±20g)。将如上所述制备的含艾赛那肽的微球悬浮于介质中(0.5％(W/W)羧甲基纤维素钠、5％(W/W)甘露糖醇和0.1％(W/W)的Tween 80)，然后用***麻醉大鼠，并以0.6mg(艾赛那肽)/kg的剂量皮下注射。通过尾静脉 分别在给药后时间为0和给药后1小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天和28天时收集血液，将血液在4℃下以12,000rpm离心10分钟。然后从中收集血清并储存于-20℃下。使用酶联免疫试剂盒(EK-070-94，Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，USA)定量测定血清中的艾赛那肽的含量，并通过所获得的时间-血药浓度曲线的曲线下面积(AUC)来比较相关的生物利用度。 
所得的血药浓度曲线示于图1至图3，所得的结果总结于表2。表2显示了给药后的初始阶段血药浓度的下降，以及不同涂覆材料和聚合物粘度的AUC的比较。 
表2 
  制剂编号   聚合物   悬液   DC(％)   1小时浓度   AUC
  1   502H   1％PVA   2.76   10969(1h)   24169
  1-1   502H   1％PVA+0.5M lys   2.73   900(1h)   26681
  2   503H   1％PVA   2.88   3561(1h)   5401
  2-1   503H   1％PVA+0.5M lys   2.96   159(1h)   5569
  3   502H:503H   1％PVA   2.75   6363(1h)   8030
  3-1   502H:503H   1％PVA+0.5M lys   2.91   320(1h)   10909
*DC(％)：实际药物含量％ 
AUC：曲线下面积(pg×天/mL) 
如图1至3和表2所示可以看出，与经涂覆的制剂相比，在给药后的初始阶段，未涂覆的制剂表现出的峰值血药浓度更高。另外还可以看出，具有最低粘度的聚合物RG502H表现出最高的AUC值，即最高的生物利用度，而且，使用高分子量聚合物的制剂和使用低分子量聚合物的制剂均可以通过涂覆材料的涂覆而改进其生物利用度。总之，虽然生物利用度依赖于所使用的聚合物的粘度，但是通过使用本发明的涂覆材料进行涂覆，可以实现由常规方法制备的现有制剂所不能实现的对初始快速释放的有效抑制。 
<实施例3>具有各种药物装载量的微球的制备 
将生物可降解聚合物RG502H和艾赛那肽-4混合，使得艾赛那肽-4的含量分别为1％(w/w)(制剂7和7-1)和7％(w/w)(制剂8和8-1)，将混合 物溶于冰乙酸。与使用实施例1所述相同的方法对所得的溶液进行喷雾干燥。将所制备的微球分别悬浮于1％聚乙烯醇水溶液中(制剂7和8)和1％聚乙烯醇+0.5M赖氨酸的水溶液中(制剂7-1和8-1)，3小时后收集微球，用蒸馏水洗涤并冻干。 
<实验实施例2>各种药物装载量下的初始快速释放的降低 
使用与实验实施例1-1所述相同的方法定量测定实施例3中制备的微球的初始快速释放，所得的结果总结于表3。表3显示了不同药物含量下涂覆材料的涂覆效果。 
表3 
  制剂编号   TL(％)   DC(％)   碱性有机材料的  表面含量(％)   1小时  释放(％)   24小时  释放(％)
  7   1   0.85   -   3.06   3.87
  7-1   1   0.81   0.295   2.63   3.68
  1   3   2.76   -   4.50   9.90
  1-1   3   2.73   0.249   0.79   3.84
  8   7   5.79   -   8.00   11.34
  8-1   7   5.85   1.636   2.04   5.47
如表3所示，未经涂覆的制剂1、7和8表现出，随生物可降解聚合物中所装载的艾赛那肽量的升高而升高的初始快速释放，而经过涂覆材料涂覆的制剂1-1、7-1和8-1表现出与不依赖于生物可降解聚合物中所装载的艾赛那肽量的明显下降的初始快速释放。 
<实施例4>通过双乳化方法制备含艾赛那肽-4的微球 
将970mg的RG502H溶于3.23mL二氯甲烷(Junsei Chem.)中。然后将30mg艾赛那肽-4溶于0.3mL蒸馏水中，并加入至所得的RG502H溶液中，对混合物进行超声处理以制备初级W/O乳液。在以5000rpm搅拌的条件下，将所得的乳液注入270mL的0.5％(w/v)聚乙烯醇水溶液中，以制备W/O/W乳液。将所得的乳液在40℃下以4000rpm搅拌悬浮1小时，以除去二氯甲烷并使聚合物硬化，然后收集所得的微球。将收集的微球用蒸馏水洗涤两次并冻干，从而制得微球。在使用上述方法制备微球的过程中，将用于注射初级乳液的悬液继续分别悬浮于1％PVA中(制剂9)、0.5M 赖氨酸水溶液+1％PVA中(制剂9-1)、0.5M Tris水溶液+1％PVA中(制剂9-2)、0.5M尿素水溶液+1％PVA中(制剂9-3)、0.05M肌酸酐水溶液+1％PVA中(制剂9-4)以及0.5M肌酸水溶液+1％PVA中(制剂9-5)，1小时后收集所述微球，用蒸馏水洗涤并冻干。 
图4a和4b显示了上文所得微球的电子显微镜照片。图4a显示的是未被涂覆材料涂覆的制剂9的照片，图4b显示的是经过涂覆材料涂覆的制剂9-1的照片。从图4b中可以看出，本发明的制剂具有光滑的表面。 
<实验实施例3>由不同种类的涂覆材料所产生的初始快速释放的降低 
使用与实验实施例1-1所述相同的方法，定量测量了实施例4中制备的微球在给药后初始24小时内的药物释放，所得结果总结于表4。表4显示了各种涂覆材料所产生的降低的初始快速释放。 
表4 
Figure DEST_PATH_GSB00000887094700011
如表4所示，虽然初始快速释放的下降量会随着所用的涂覆材料的种类略有变化，但是与未经涂覆材料涂覆的微球制剂9相比，经过涂覆材料涂覆的微球制剂9-1至9-5均表现出显著下降的初始快速释放。 
<比较实施例>装载有艾赛那肽-4和涂覆材料的微球的制备以及初始快速释放的测量 
将970mg的RG502H溶于3.23mL二氯甲烷(Junsei Chem.)中。将30mg艾赛那肽-4和6.68mg赖氨酸溶于0.3mL蒸馏水中，并加入至所得的RG502H溶液中，以制备初级W/O乳液。将所得的乳液悬浮于1％PVA 水溶液中，按照与实施例4相同的方法制得微球制剂10。另外，将970mg的RG502H和6.68mg赖氨酸溶于3.23mL二氯甲烷(Junsei Chem.)中。向所得的溶液中加入30mg艾赛那肽-4溶于0.3mL蒸馏水所得的溶液，以制备初级W/O乳液。将所述乳液悬浮于1％PVA水溶液中，制得微球制剂11。 
如上所述制备的制剂10和11的电子显微镜照片示于图4c和4d。如图4c所示，比较实施例中制备的微球表面具有许多孔。 
使用与实验实施例1-1中所述相同的方法，分别测量了比较实施例中制备的微球在给药后初始1小时和24小时内的药物释放，所得结果总结于表5。表5显示了由于在制备微球时加入涂覆材料的方法不同而导致的初始快速释放量的变化。 
表5 
  制剂编号   初级乳液   悬液   1小时   释放(％)   24小时   释放(％)
  9   502H，   艾赛那肽-4   1％PVA   7.45   13.88
  9-1   502H，   艾赛那肽-4   1％PVA+0.5M lys   0.87   1.87
  10   502H，艾赛那肽-4+赖氨酸   (水相)   1％PVA   65.63   71.64
  11   502H+赖氨酸(油相)  艾赛那肽-4   1％PVA   80.31   87.00
如表5所示，当涂覆材料仅简单地与艾赛那肽一起装载而不是先形成涂覆层时，或者当涂覆材料与聚合物仅简单地混合使用时，均会产生过高的初始快速释放，这是使艾赛那肽难以被配制为控释形式制剂的关键性缺陷。 
如图4c和4d所示，在初级乳液的油相或水相中加入涂覆材料均会增加微球表面的多孔性。总之，在微球内加入涂覆材料会增加表面的多孔性，最终导致其中所含药物的过高快速初始释放。相反地，按照本发明使用涂覆材料涂覆的微球表面的多孔性并未有任何增加，并且与未经涂覆而具有光滑表面的制剂9相比，本发明的经涂覆的微球具有更低的初始快速释放。 
总之，使用常规方法(例如韩国申请No.140209公开的方法)制备的现有的含艾赛那肽制剂不能实现所需要的降低初始快速释放的效果，因此 由于过高的快速初始释放会导致副作用，使得它们不能有利地用作有效的含艾赛那肽制剂。与之相反，本发明的组合物非常适用于开发需要具有极其严格受控的初始释放的含艾赛那肽的微球。此外，本发明可以实现含艾赛那肽制剂的高生物利用度，这也是常规用于控制含艾赛那肽制剂的初始快速释放的技术所不能实现的。 
<实施例5>通过喷雾干燥方法制备含艾赛那肽-3的微球 
将4.850g生物可降解聚合物RG502H(Lot No.1009848，IV＝0.19dL/g)和0.150g艾赛那肽-3(Peptron Inc.，South Korea)均匀地溶解于97mL冰乙酸中。使用活塞泵以1.5mL/min的流速将所制备的溶液装入带有超声喷嘴(Sono-tek，120kHz)的喷雾干燥器(SODEVA，France)中，同时供给180℃的干燥空气，用以制备微球。将所制备的微球悬浮于添加有1％(W/V)聚乙烯醇(聚乙烯醇，Gohsenol，EG-50)作为保护性胶质的0.5M赖氨酸水溶液中，搅拌3小时后收集，用蒸馏水洗涤然后冻干。 
<实施例6>通过喷雾干燥方法制备含艾赛那肽-4(1-28)酰胺的微球 
将4.850g生物可降解聚合物RG502H(Lot No.1009848，IV＝0.19dL/g)和0.150g艾赛那肽-4(1-28)酰胺(Peptron Inc.，South Korea)均匀地溶解于97mL冰乙酸中。使用活塞泵以1.5mL/min的流速将所制备的溶液装入带有超声喷嘴(Sono-tek，120kHz)的喷雾干燥器(SODEVA，France)中，同时供给180℃的干燥空气，用以制备微球。将所制备的微球悬浮于添加有1％(W/V)聚乙烯醇(聚乙烯醇，Gohsenol，EG-50)作为保护性胶质的0.5M的L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser水溶液中，搅拌3小时后收集，用蒸馏水洗涤，悬于10mL D-甘露糖醇10％(W/W)水溶液中，然后冻干。 
<实施例7>通过相分离方法制备含艾赛那肽-4的微球 
将0.1g艾赛那肽-4(Peptide Laboratories，USA)溶于1.86mL蒸馏水中，缓慢注入至将1.86g的RG502H(Lot No.1009848，IV＝0.19dL/g)溶于23.32mL二氯甲烷形成的溶液中，超声处理以制备初级乳液。通过向所得的乳液中加入58.8g硅油以使其均质化，从而形成雏形微球。在温度保持为3℃和以500rpm搅拌的条件下，将400g庚烷和50g乙醇的 混合物缓慢加入至所形成的雏形微球中，以使得所述雏形微球硬化。在搅拌约1小时后，倒去溶剂。然后再加入200g庚烷并搅拌1小时，用以从所述雏形微球中除去硅油和二氯甲烷。将所得的微球在4℃下过滤、收集和用庚烷洗涤，然后真空干燥，从而制得微球。将所制备的微球悬浮于含0.5％(W/V)聚乙烯醇和0.5M赖氨酸的水溶液中1小时，然后收集、用蒸馏水洗涤并冻干，制得所述制剂。 
如上述实施例所述，本发明提供了新的含艾赛那肽的控释微球，本发明通过用涂覆材料涂覆微球表面，使得所述微球具有降低的副作用以及改进的生物利用度，从而降低了给药后初始阶段中过高的药物释放。 
Figure IYZ000006068736600021

Claims (12)

1.一种控释组合物，包括一种带有涂层的控释微球，所述微球包括：
含有作为活性成分的艾赛那肽和固有粘度为0.15至0.31dL/g的生物可降解聚合物的核心，和
用涂覆材料涂覆所述核心的涂覆层，
其中所述艾赛那肽为SEQ ID NO:2的多肽--即艾赛那肽-4，
所述生物可降解聚合物为聚乳酸即PLA或聚(乳酸-共-乙醇酸)即PLGA，
所述涂覆材料为选自下列的物质：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、肌酸、肌酸酐和尿素，并且所述每100重量份数组合物中所述涂层的含量为0.01至5重量份数。
2.根据权利要求1的控释组合物，其中每100重量份数组合物中所述艾赛那肽的含量为0.1至10重量份数。
3.一种带有涂层的控释微球，包括：
含有作为活性成分的艾赛那肽和生物可降解聚合物的核心，和
用涂覆材料涂覆所述核心的涂覆层，
其中所述艾赛那肽为SEQ ID NO:2的多肽--即艾赛那肽-4，
所述生物可降解聚合物为聚乳酸即PLA或聚(乳酸-共-乙醇酸)即PLGA，
所述涂覆材料为选自下列的物质：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、肌酸、肌酸酐和尿素，并且每100重量份数的微球中所述涂层的含量为0.01至5重量份数。
4.根据权利要求3的控释微球，其中所述生物可降解聚合物具有0.1至0.6dL/g的固有粘度。
5.根据权利要求3的控释微球，其中所述生物可降解聚合物具有0.15至0.31dL/g的固有粘度。
6.根据权利要求3的控释微球，其中每100重量份数的微球中所述艾赛那肽的含量为0.1至10重量份数。
7.根据权利要求3的控释微球，还包括选自下列的一种或多种：可药用的保护性胶质和赋形剂。
8.一种制备权利要求3的含有艾赛那肽并带有涂覆层的控释微球的方法，
所述方法包括下述步骤：
混合艾赛那肽和一种生物可降解聚合物，从而制备W/O型乳液或均一的混合物；和
通过将所述乳液或均一混合物加入至涂覆材料的水性溶液中进行乳化，以形成涂覆层，
其中所述艾赛那肽为SEQ ID NO:2的多肽--即艾赛那肽-4，
所述生物可降解聚合物为聚乳酸即PLA或聚(乳酸-共-乙醇酸)即PLGA，
所述涂覆材料为选自下列的物质：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、肌酸、肌酸酐和尿素，并且每100重量份数的微球中所述涂层的含量为0.01至5重量份数。
9.根据权利要求8的方法，其中所述涂覆材料的水性溶液的浓度为0.01M至1M。
10.一种制备权利要求3的含有艾赛那肽并带有涂覆层的控释微球的方法，所述方法包括下述步骤：
混合艾赛那肽和一种生物可降解聚合物，从而制备乳液或均一的混合物；
固化所得的乳液或均一的混合物，从而制备初级微球；和
将所得的初级微球悬浮于涂覆材料的水性溶液中，以在每个微球上形成涂覆层，
其中所述艾赛那肽为SEQ ID NO:2的多肽--即艾赛那肽-4，
所述生物可降解聚合物为聚乳酸即PLA或聚(乳酸-共-乙醇酸)即PLGA，
所述涂覆材料为选自下列的物质：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、肌酸、肌酸酐和尿素，并且每100重量份数的微球中所述涂层的含量为0.01至5重量份数。
11.根据权利要求10的方法，其中所述固化步骤是通过相分离方法或喷雾干燥方法进行。
12.根据权利要求10的方法，其中所述涂覆材料的水性溶液的浓度为0.01M至1M。
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