CN101627065B - 颗粒和其在分离核酸的方法或分离磷蛋白的方法中的应用 - Google Patents

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Abstract

包含聚苯乙烯或聚丙烯酸酯的单分散性聚合物微颗粒，其中所述颗粒具有至少一种过渡金属氧化物形成的涂层，或者包含聚苯乙烯或聚丙烯酸酯的多孔聚合物微颗粒，其中所述颗粒具有至少一种过渡金属氧化物形成的涂层。也描述这样的颗粒在从包含磷蛋白的样品分离磷蛋白的方法中的应用，或者这样的颗粒在从包含核酸的样品分离核酸的方法中的应用。

Description

颗粒和其在分离核酸的方法或分离磷蛋白的方法中的应用
本发明涉及涂有过渡金属氧化物特别是氧化钛和氧化锆的磁性聚合物颗粒，并且涉及生产其的方法。本发明进一步涉及使用涂覆的磁性聚合物颗粒与特定的缓冲液组合，以用于纯化、提取、俘获、分析或合成。 
磁性颗粒在各种医学、生物化学和环境领域是通用的，例如作为用于递送药剂产品、诊断或分析目的、分离分析物和合成目的的运输载体。为了发挥这些功能，这样的颗粒依赖于它们的磁性。例如，在分析中，应用磁场到包含颗粒结合分析物等的样品能够分离分析物而无需使用离心或过滤。 
对于磁性，本文指聚合颗粒能够被磁场吸引。典型地，这样的聚合颗粒包括铁磁晶体、超顺磁晶体或它们的混合物。 
磁性聚合物颗粒是已知的，并且可以例如根据US-A-4,654,267(Ugelstad)描述的方法进行制备，其内容通过引用并入本文。这些方法提供相似大小(单分散性)和具有同种磁性特性的磁性聚合物颗粒。 
这些颗粒的表面可以容易地官能化以携带不同的基团，其可用于结合样品中分析物的亲和配体。例如，经改性以携带链霉抗生物素的珠是已知的。然而，本领域普通技术人员正寻找其它的方法改性聚合物颗粒，以使它们应用于多种快速的不基于配体的吸附方法。 
为了最小化已知的从聚合物颗粒沥滤磁性晶体的问题——所述问题减少它们寿命并可能污染样品，US-A-4,654,267提倡利用具有用于将铁离子吸引入聚合颗粒的表面官能团的聚合物颗粒。这些官能团可以由在生产聚合物颗粒中应用官能化共聚单体产生，或者由用于通过例如偶联到颗粒表面上的现有基团，或者转化颗粒表面上的现有基团来引入官能团的聚合物颗粒的聚合后处理产生。 
虽然在US-4,654,267中公开的发明的确减少沥滤的量，但是超顺磁晶体从聚合物颗粒的一些沥滤仍然发生。而且，利用特定的表面官能团吸引入铁离子，对可以提供在聚合物颗粒上的表面官能度的性质有明显的限制。这又使颗粒(例如具有配体)的官能化作用更困难。因此，颗粒的多功能性减少，并且聚合物颗粒可以使用的应用范围受到限制。 
我们现在已经意外地发现，具有由至少一种过渡金属氧化物形成的涂层的、任选多孔的、任选磁性的聚合物微颗粒，解决了沥滤问题以及可选官能化的聚合物颗粒的供应问题。过渡金属氧化物涂层的存在不但最小化潜在的沥滤问题，而且过渡金属氧化物涂层的使用使聚合物颗粒容易与生物聚合物结合，这使颗粒在分析方法中非常有用。 
具有金属氧化物涂层的磁性颗粒本身不是新的。在Anal.Chem 2005，77，5912-5919中，描述了氧化铁(III)/二氧化钛芯壳纳米颗粒，并且建议该纳米颗粒用作分析磷酸肽的亲和探针。 
同样地，利用金属氧化物结合核酸不是新的。US6,383,393描述通过色谱法纯化和分离核酸混合物的方法。核酸混合物被吸附在柱上的金属氧化物基底上。US 5,057,426有相似的公开内容，其中金属氧化物基体被用于结合核酸。然而，这些公开内容是在色谱柱的背景中，而与聚合物颗粒完全无关。 
US 6,914,137描述使用含有二氧化钛的聚苯乙烯微滴定板进行DNA分离的方法，所述二氧化钛在板形成时，作为粉末并入塑料。 
涂有二氧化钛的颗粒也是已知的。Guo等在OpticalMaterials 22(2003)，39-44中描述芯壳颗粒，其中密集的聚苯乙烯、氧化铁(III)芯用二氧化钛涂覆。然而，这些颗粒与本发明的磁性多孔颗粒相当不同。在Guo中，聚苯乙烯/铁芯是密集的，无孔材料，因此沥滤问题不是Guo面对的问题。而且，没有给出在分离生物分子中应用这样的颗粒的建议。Guo等的颗粒的红外吸收光谱(他们的图3)表 明它们几乎不包含铁。在他们的图7中，这也被指出，在图7中，作者表明在磁铁上温育15分钟后大约90％的颗粒被回收。 
此外，如他们的图2所示，颗粒具有宽的粒度分布，因此不是单分散性的。因此，利用这样的颗粒分离生物聚合物是不利的，因为大多数靶标与甚至在15分钟的温育时间后也不会吸附到磁铁的较小颗粒结合，导致大多数靶标损失。同样地，如从他们的图1中所见的，颗粒被高度地聚集，这也使它们不适合生物分离。 
因此，从第一方面看，本发明提供包含聚苯乙烯或聚丙烯酸酯的单分散性聚合物微颗粒，其中所述颗粒具有至少一种过渡金属氧化物形成的涂层。 
从另一方面看，本发明提供包含聚苯乙烯或聚丙烯酸酯的多孔聚合物微颗粒，其中所述颗粒具有至少一种过渡金属氧化物形成的涂层。 
从第二方面看，本发明提供制备如上所述的颗粒的方法，其包括将包含聚苯乙烯或聚丙烯酸酯的单分散性和/或多孔聚合物微颗粒，与能转化为氧化物的至少一种过渡金属化合物反应，和例如在应用热和/或水之后形成过渡金属氧化物涂层。 
从进一步的方面看，本发明提供这些颗粒在生物聚合物分离中的应用。 
本发明的聚合物颗粒包括聚合物芯种，其使用公知的Ugelstad类型方法膨胀。在本申请中，单词珠和颗粒可互相交换使用。聚合物芯可以是聚丙烯酸酯，但是优选由聚苯乙烯形成，因此种材料一般是直径0.1到0.5微米量级的聚苯乙烯颗粒。如本领域公知的，此类芯可以通过在聚合开始前使单体(通常地和聚合引发剂)扩散入芯而膨胀。在该膨胀过程期间，可以使用多种单体。优选的单体包括苯乙烯或丙烯酸酯单体，例如甲基丙烯酸酯。 
本发明的颗粒优选是多孔的。优选地，在制造过程期间，通过使用致孔剂使颗粒为多孔的，如本领域已知的。而且，已知在聚合物颗粒制造中使用立体稳定、特定的表面活性剂、无氧的条件 等。 
本发明中应用的颗粒可以通过其中在聚合前将单体预膨胀为芯颗粒的方法产生，或通过其中在短的最初单体膨胀时期后，开始聚合同时进一步加入单体的方法产生。 
在颗粒形成的膨胀阶段期间形成的聚合物可以是聚苯乙烯均聚物或丙烯酸酯聚合物(例如甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯)，但是更优选的是苯乙烯的共聚物。共聚物可以是与能和苯乙烯共聚合的任何共聚单体形成的，例如二乙烯基苯(DVB)、氨基-苯乙烯和硝基-苯乙烯，特别是二乙烯基苯。 
因此优选地，该聚合物是交联的，例如通过掺入交联剂，例如共聚单体。适当的交联剂包括二乙烯基苯(DVB)或二甲基丙烯酸乙二醇酯。DVB是优选的。需要的交联剂(例如共聚单体)的适当量是本领域普通技术人员已知的，但是一般地为30到85％(按相对于单体重量的重量计)，例如大约50wt％。因此，优选地，本发明中使用的聚合物颗粒是交联的苯乙烯的聚合物颗粒(例如苯乙烯-二乙烯基苯聚合物颗粒)。 
在用过渡金属化合物涂覆之前，本发明的聚合颗粒优选进行表面官能化。换句话说，聚合颗粒的表面优选被提供有能够——任选地通过活化——与过渡金属化合物反应或相互作用(例如将化合物共价键合到表面)的基团。优选地，表面是胺官能化的，例如通过用乙二胺直接胺化或通过硝化表面并还原硝基为胺。此类氨基官能化的表面，提供与过渡金属化合物直接反应或在与过渡金属化合物反应前进一步官能化的理想模板。例如，表面可以如WO 05/015216所述，通过与环氧化物或二醇/异氰酸酯反应而官能化。可以产生羟基官能化表面或聚氨酯官能化表面。通过小心地挑选环氧化物单体的性质，也可形成携带乙烯基基团的表面。 
已经发现具有多层涂层的聚合颗粒显示比其单层对应物甚至更少的沥滤。因此，优选地，本发明的聚合颗粒包括一层以上(例如2或3层)涂层。其可以是相同的但优选不同的涂层可以用至 少一种过渡金属化合物形成，如本文所述的。可选地，多层涂层的仅其中一层——优选最外面的涂层——可以用至少一种过渡金属化合物形成。在该后面的情形中，存在的其它涂层可以从任何传统的涂层材料形成，例如使用基于环氧化物的涂层、聚氨酯涂层或由包含例如烷氧基的硅烷制造的涂层。 
优选地，本发明的聚合物颗粒是磁性的。磁性在本文指聚合颗粒能够被磁场吸引。优选地，本发明的聚合颗粒包括顺磁的、非超顺磁的或超顺磁的晶体。顺磁颗粒显示轻微的剩磁性质。非超顺磁晶体在某种意义上是剩磁的：在暴露于磁场后，在不存在磁场情况下，材料必须具有剩余磁化。超顺磁的聚合颗粒是可磁性位移但不可永久磁化的。这指在暴露于磁体后，颗粒可以仍然悬浮或分散在溶液中，而没有聚集或团集。磁性晶体可以是能够被沉积在聚合颗粒内和/或聚合颗粒上的磁性晶形中的任何材料。磁性氧化铁例如磁铁矿或磁赤铁矿是优选的；然而，如果希望，晶体可以是混合的金属氧化物或其它的磁性材料。超顺磁的晶体直径一般为5-15nm，例如大约7nm，而非超顺磁的(热封闭)氧化铁晶体一般稍微更大。 
本发明的磁性聚合颗粒优选是多孔的，因为这允许大量磁性晶体沉积于其中。存在的晶状磁性材料的总量通常为1％以上、优选3％以上、期望地超过或等于5％(按重量计)，例如超过10％。存在的晶状磁性材料的总量可能上至50％wt，优选上至40％wt。基于涂覆的颗粒的总干重，以铁(或者，在非氧化铁的磁性材料情况中的等价金属)的重量为基础，计算百分比。 
根据本发明的聚合颗粒是微颗粒，并且具有通常在0.2到100μm，例如0.2到10μm，优选0.5到5μm，特别是0.8到1.2μm范围内的大小(直径)。 
在将任何类型的涂层置于本发明的颗粒上(金属氧化物涂层或其它涂层例如基于环氧化物的涂层)之前，在本发明中应用的表面官能化的聚合颗粒当修正为2.7μm的平均粒径(即表面积乘以2.7除以MD，其中MD是用微米表示的平均直径)时，一般具有至 少15m2/g(通过BET氮吸收方法测量)和更优选至少30m2/g，例如上至700m2/g的表面积。 
本发明的聚合物颗粒是单分散性的。一般地，聚合颗粒在它们被涂覆之前是球状的并且是单分散性的，并且特别优选地在它们已经涂覆后，保持球状和单分散性。这样的颗粒比非单分散性颗粒在批与批之间显示更少的差别，并且有利地提高使用它们产生的数据的可重复性和可靠性。这样的可重复性在基于颗粒的分析中是特别重要的，并且例如使在诊断技术中应用本发明的聚合颗粒成为可能。 
单分散性指对于多个颗粒(例如至少100个，更优选至少1000个，特别是基本上所有)，颗粒具有小于20％的变异系数(CV)，例如小于15％，优选小于12％，更优选小于11％，仍旧更优选小于10％和最优选不超过大约8％，例如2到5％。CV以百分比被确定为CV＝(100×标准偏差)/平均值其中平均值是平均粒径，并且标准偏差是颗粒大小的标准偏差。优选地，CV在主要模式上计算，即通过将单峰分布曲线拟合到检测的粒度分布。因此，低于或高于模式大小的一些颗粒在计算中可能被减少了，这可能例如基于总颗粒数的大约90％(为可检测的颗粒)。CV的这种测定在Coulter LS 130颗粒大小分析器上进行。 
在本发明中特别有用的是Invitrogen Dynal AS(Oslo，Norway)以商标名DYNABEADS出售的磁性聚合颗粒。 
在WO99/19375(Dyno Industrier ASA)和WO 00/61648(Dyno Specialty Polymers AS)中公开的聚合颗粒——部分从氨基苯乙烯制备，如在WO 01/70825中公开的，它们的内容通过引用并入本文——是特别优选的。聚合颗粒的官能化可在聚合之后发生，通过例如硝化和随后还原如此形成的硝基为侧链胺基；或直接胺化，例如通过用氨基乙醇处理。也可使用通过已知的Ugelstad两步膨胀方法和在WO 00/61647(Dyno Specialty Polymers AS)中公开的改进方法制备的聚合颗粒。本文也使用的是通过WO99/19375和WO00/61648中公开的方法制备的聚合颗粒。根据这些出版物中描述的方法制造的多孔聚 合颗粒可具有通过标准技术置于它们的孔中的磁性颗粒，例如如上所述。 
在所有这些方法中，使用氨基苯乙烯特别是4-氨基苯乙烯作为在制备具有氨基的聚合材料中的共聚单体是优选的。使用该单体或共聚单体排除对聚合后硝化和还原反应的需要。而且，该方法提供的表面的更可预测的性质(均一性)使涂层应用非常可靠。 
用过渡金属化合物涂覆聚合颗粒，因此，氧化物在颗粒表面和任选地聚合物颗粒的孔内产生氧化物层，其用于封闭这些孔，物理上将磁性晶体封装在聚合颗粒内。因此，所产生的“涂覆的”颗粒相对于起始材料具有减少的孔隙率，较不倾向于沥滤磁性材料。 
为了该应用，过渡金属氧化物指周期表的第3族到第10族的金属或Al或Ga的氧化物。因此，适于涂覆本发明的聚合物颗粒的用于随后转化为氧化物涂层的过渡金属化合物是周期表的第3族到第10族的金属、Al或Ga的化合物，特别是第4族到第6族或Al的化合物，特别是第4族(Ti、Zr和Hf)或第5族(V、Nb或Ta)的化合物。高度优选地，过渡金属化合物是Nb、Ta、钛或锆，特别是Zr或Ti的化合物。 
聚合物颗粒上的涂层是氧化物涂层。优选地，这是被讨论的过渡金属的最稳定的氧化物。高度优选地，聚合物颗粒用氧化铝、二氧化钛或二氧化锆，特别是TiO2和ZrO2涂覆。 
过渡金属涂层的形成可以通过任何便利方法例如化学气相沉积而完成，但是优选地，使用溶胶-凝胶技术完成。在涂覆氧化物之前，颗粒表面可以是未官能化的，但是优选地被官能化以携带能将配体转移到过渡金属化合物上的活性基团，和/或通过H键合进一步稳定。这使聚合物颗粒和过渡金属化合物之间的最初相互作用的发生成为可能。方便地，珠表面可携带亲核基团，优选地为含氧或含氮的基团。珠表面也可以携带包含膦酸酯的基团。因此，珠可被胺化、羟基化、氨基羟基化、肟化，或者携带羧酸基团或氨基乙酸基团。 
不希望被理论所限制，认为过渡金属化合物中至少一 个键的不稳定性对本文描述的涂覆技术的成功是关键的。更具体地说，认为在与例如聚合物颗粒表面上的胺基接触后，在胺和过渡金属化合物之间形成键或其它的相互作用。 
当此类过渡金属种类与水(其可能是键形成的副产物)接触时，过渡金属化合物上的键可经历断裂反应形成羟基(例如TiOH)。然后，该化合物转化为氧化物，排出更多的水。因此，当过渡金属化合物和珠初次接触用于将过渡金属化合物粘附到聚合颗粒时，后者引起形成氧化物涂层，其通过相互作用例如离子的和非离子的相互作用保留在珠表面。 
因此，涂层的形成可至少部分地依赖于，在珠和过渡金属之间发生相互作用或反应的程度和过渡金属化合物中能够被断裂的键的数目。用于本发明的优选的过渡金属化合物包括4个在暴露于聚合物颗粒/水后能够被断裂的键。 
因此，优选的过渡金属化合物是与聚合物颗粒表面反应的并且可以容易地转化为氧化物的——例如在应用热或与水反应后——过渡金属化合物。因此，适当的过渡金属化合物是氢化物、卤化物、醇、肟、醇盐(alkoxide)、芳氧盐(aryloxide)(例如酚盐)、酯(例如乙酸酯、丙烯酸酯)、乙酰乙酸盐、硫代氨基甲酸盐、胺、链烷双酸盐(alkanedionate)和磷酸盐或这些的混合物(例如携带烷氧基和卤化物的过渡金属化合物)。这些化合物分别包含至少一个-Tm-H、-Tm-Hal、-TmOH、-TmNOH、-Tm-OR、-TmO(O)CR、-TmSC(S)NR、-Tm-NR、-Tm-O-CR＝CR-C(O)R或-TmOP(O)OR基团，其中R可以是H、芳基、烯烃或烷基，上至18C，更优选上至10C，特别是C1-6。 
卤化物和醇盐是特别优选的，特别是醇盐。最特别地，过渡金属化合物上的所有配体是烷氧基。 
优选地，醇盐是钛(IV)或锆(IV)离子的醇盐。高度优选地，醇盐是C1-6醇盐，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基。特别优选地，存在4个这样的基团，例如四甲氧基、四乙氧基、四丙氧基或四丁氧基。为了清楚起见，注意锆酸四烷基酯、原锆酸四烷基酯 (tetraalkyl or thozirconate)和锆酸四烷氧基酯是相同的化合物。也可以使用过渡金属化合物的混合物形成涂层。 
在根据本发明的优选方法中，聚合颗粒与如以上定义的过渡金属醇盐化合物在有机溶剂中反应。可以使用高和低水溶性的溶剂。溶剂优选是惰性的溶剂。适当的溶剂的代表性实例包括甲苯、二甲苯和醚。高度优选的溶剂是2-甲氧基乙基醚。一般地，1g聚合珠悬浮在2-150ml的溶剂中，更优选地5-15ml。 
形成本发明的涂覆的颗粒的方法可以以单一步骤或以两步步骤进行。在单一步骤方法中，将水加到有机溶剂中的聚合颗粒和过渡金属化合物的悬浮液或分散体中。在优选的两步步骤方法中，可首先将聚合颗粒悬浮或分散在有机溶剂中，加入过渡金属化合物，然后加入水。在两种方法中，一般都加入过量的过渡金属化合物。优选地在-10℃到200℃、更优选地在20℃到100℃的范围内例如大约室温的温度下进行反应。本要求保护的方法的令人惊讶的特征是涂覆反应可以在该低温下实行，并且不需要可破坏聚合物颗粒的过度加热来形成涂层。典型的反应时间是10分钟到240分钟，例如大约90分钟。 
优选地，两步步骤方法的第一步骤在惰性气氛下例如氩气气氛下进行。更优选地，反应基本上不存在水。换句话说，反应是无水的(例如其包含＜5％wt的水，优选＜1％wt的水)。虽然不希望被理论所束缚，但是认为通过在干燥条件下进行第一步骤，仅小部分的过渡金属化合物经历反应，并与聚合颗粒结合。因此，本反应的第一步骤用来在聚合颗粒上形成均匀的过渡金属化合物“底漆(primer)”层。 
在两步步骤方法的第二步骤中，加入水——优选去离子水。虽然不希望被理论所束缚，但是认为这诱导过渡金属化合物快速水解，以提供氧化物，其与颗粒上的水解的底漆层连接。 
一般地，对于加入的每摩尔过渡金属化合物，加入0.01到5摩尔水。在加入水的时候，聚合颗粒悬浮液一般是在室温下。典型的反应时间是1小时到10小时，优选1小时到3小时，例如大约2 小时。 
本发明的方法可能需要加入酸或碱，例如作为催化剂。然而，优选地，反应在没有加入酸例如磷酸或冰醋酸的情况下发生。也优选地，使用搅动、搅拌和/或声处理提高浸渗和加快反应速度。 
在反应完成后，可通过任何本领域已知的常规方法例如过滤分离涂覆的聚合颗粒。通常，涂覆的颗粒将被洗涤，优选上至10次，以除去任何未结合的试剂，例如未反应的起始材料。任何溶剂和/或溶剂的混合物可用于洗涤，例如丙酮、甲醇、水、异丙醇(isopranol)或醚。适当地，用于第一阶段的溶剂也用作洗涤溶剂。然后，可干燥聚合颗粒，优选地在真空中。 
因此，从另一方面看，本发明提供如上所述制备聚合物微颗粒的方法，其包括将包含聚苯乙烯或聚丙烯酸酯的聚合微颗粒与至少一种过渡金属醇盐和水反应。优选地，本方法包括在加入水之前，加入醇盐。 
通过本文描述的方法可获得的颗粒构成本发明的又一方面。应用 
所产生的聚合颗粒可用于多种应用，例如用于纯化(例如分离、分馏、耗尽、脱盐)、提取或俘获(例如浓缩)例如生物分子(例如肽、蛋白质、核酸)、金属离子、有机化合物(例如药物或药物衍生物)、底物和上述任何的混合物。聚合颗粒也可用于从例如分析和固相合成中的复杂混合物分离特定的生物分子(例如核酸、蛋白质、肽)。 
本发明的聚合颗粒在通过吸附/解吸附方法帮助的多种生物分子的分离和分馏中的用途，缘于以上描述的过渡金属氧化物涂覆的颗粒的大的结合能力。本发明的聚合颗粒能使此类分离和分馏在没有柱、没有样品稀释的情况下进行，并且能使此类分离和分馏高通量的自动进行。小体积的颗粒的大表面积是特别有益的，例如与使 用板相比较。 
在高度优选的实施方案中，本发明的颗粒用于结合来自样品的核酸如DNA和RNA。DNA或RNA的分离在许多生物化学方法和诊断方法中是重要步骤。例如，在可以进行其它研究和过程例如检测、克隆、测序、扩增、杂交、cDNA合成、研究核酸结构和成分(例如DNA的甲基化模式)等之前，从其中经常发现核酸的复杂混合物分离核酸通常是必要的。在这样的复杂混合物中，大量细胞或其它污染物例如蛋白质或糖的存在经常阻碍用于分子生物学的许多反应和技术。另外，DNA可以污染RNA制品，反之亦然。因此，从复杂混合物例如细胞、组织等分离核酸的方法是需要的，这不但从制备观点是需要的，而且在现今应用的、依靠识别DNA或RNA的许多方法例如诊断微生物传染、法学、组织类型和血型测定、基因分型、遗传变异的检测等等中是需要的。分离核酸可以使用本发明的颗粒、使用任何适当的核酸分离方法来完成。 
样品可以是包含核酸的任何材料，其包括例如食品和混合产品、临床和环境样品。样品可以是生物样品，其可以包含任何病毒或细胞物质，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。因此，这样的生物样品可以包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物的动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻在内的藻类、真菌、细菌、原生动物等等。因此，代表性样品包括全血和血液来源的产品(例如血浆、血清和棕黄层)、尿、粪便、脑脊液或任何其它的体液、组织、细胞培养物、细胞悬液等等。 
对于分离核酸，大量方法是已知的，但是一般而言，这些方法依靠复杂的一系列提取和洗涤步骤，并且实施起来是耗费时间和耗费劳力的。 
例如，US-A-5,234,809描述这样的方法，其中在存在离液剂例如胍盐的情况下，核酸结合到硅石颗粒形式的固相，从而与剩余样品分离。WO91/12079描述如此方法，凭借该方法核酸通过沉淀被捕获在固相表面上。一般而言，醇和盐用作沉淀剂。 
US 5,705,628和US 5,898,071描述使用浓度为7到13％的大分子量的聚二醇(例如聚乙二醇)与0.5到5M范围内的盐的组合，分离核酸片段，以实现结合到固体支持物上的官能团的方法，所述固体支持物上的官能团作为DNA的生物亲和吸收剂。 
利用本发明的颗粒分离核酸已经被发现是特别优选的。因此，从另一方面看，本发明提供从包含核酸的样品分离核酸的方法，其包括将所述样品与本发明的颗粒相接触。更具体地说，本发明提供从样品分离核酸的方法，其包括：(I)提供包含一种或多种核酸的样品；(II)将样品与如上所述的过渡金属氧化物涂覆的微颗粒混合；(III)温育样品和颗粒；(IV)收集颗粒，任选地在磁场中进行，并除去上清液；和(V)任选地洗脱一种或多种分离的核酸。 
洗涤步骤可以包括在该方法中，如本领域公知的，例如在步骤(IV)之后。 
在这点上，也已经发现在存在离液缓冲液的情况下，核酸容易吸附到过渡金属表面。因此，在特别优选的实施方案中，通过利用该作用，即在存在离液缓冲液的情况下，本发明的聚合颗粒可用于例如从生物标本分离核酸。核酸吸附到过渡金属表面作为离液缓冲液断裂围绕核酸的水的氢键合的网络，从而使溶液中大分子结构不稳定的结果发生。因此，通过随后经由不同的洗涤步骤重构周围环境的氢键合，可以从表面洗脱结合的核酸，例如通过加入希望的缓冲液。 
而且，本发明人意外地发现使用金属氧化物涂覆的颗粒分离核酸高度地依赖于使用的颗粒表面和缓冲液组合物的组合。 
缓冲液特别是离液缓冲液和任选加入的其它试剂例如盐的正确组合/浓度，促进将核酸结合到本发明的聚合颗粒。温度和pH的控制也可以帮助分离。在一些情况中，可以获得不同类型的核酸(例如mRNA、rRNA、tRNA、dsDNA等等)之间的区分。 
特别重要的是使用的缓冲液。适当的离液缓冲液包括 胍盐，例如硫氰酸盐或氯化物、脲、高氯酸盐或碘化物。其它感兴趣的缓冲液包括TRIS HCl、N，N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)、Tricine和磷酸盐缓冲液，并且可以使用离液和非离液缓冲液的混合物。缓冲液可与洗涤缓冲液例如醇(例如异丙醇)和/或非离子型表面活性剂例如Triton(典型地低离子强度的)组合，如本领域公知的。 
分离也可以应用标准洗涤和洗脱缓冲液，例如随后的实施例中描述的那些。 
因此，从又一方面看，本发明提供分离核酸的试剂盒，其包含如上所定义的聚合微颗粒和离液缓冲液。试剂盒的其它任选的组分包括洗涤液和/或洗脱缓冲液。 
温育条件是通常用于本领域的那些，例如从10到50℃的温度，例如室温。温育可以进行任何方便的时间段，例如1分钟到1星期，优选1到5小时。 
样品可以是包含磷蛋白的任何样品。此类样品的制备是本领域公知的。样品可以是细胞碎片，其已被裂解并优选经过至少一个分离过程：例如用包含至少一种盐、洗涤剂或表面活性剂、酸或碱的一种或多种溶液提取；离心；增溶；沉淀；亲和捕获；介电电泳或色谱法。 
在另一高度优选的实施方案中，本发明的颗粒用于分离磷蛋白(该术语包括磷酸肽)。本发明的微颗粒可用于识别细胞蛋白质的非蛋白质修饰或翻译后修饰，特别是磷酸化等。磷酸化和脱磷酸调节许多细胞事件，例如细胞周期控制、细胞分化、转化、细胞凋亡、信号转导等等，并且本发明的微颗粒通过识别其磷酸化状态可以通过化学、生物学或甚至物理微扰——例如，药物处理、毒性损伤、物理暴露(例如辐射或紫外线处理)或用生长或分化因子刺激等等——改变的蛋白质提供对于研究磷酸化级联的支持。 
存在多种现有的方法用于磷蛋白检测和分离。Pro-QDiamond技术(Molecular probes Inc.，OR，USA)使用识别蛋白质上的磷酸基团的荧光团，而不使用抗体或放射性，因此允许简单地检 测甚至非常少量的磷蛋白。捕获磷酸肽可以通过将荧光团负载到磁珠上来实现。 
也可以使用固定化金属离子色谱法(IMAC)技术分离磷蛋白，在该技术中，填充有携带例如羧甲基化天冬氨酸螯合剂与固定化金属例如Fe3+的树脂的柱被用于靶向磷蛋白。固定化金属亲和柱(IMAC)色谱法被用于从靶蛋白样品中修饰的和未修饰的肽的混合物中选择出磷酸肽。标准方案需要利用氯化铁，以结合到IMAC柱的金属螯合密封材料。磷酸化肽当加载到柱上时与固定的铁原子结合，并且可以在酸性条件下洗脱。 
因为酸性氨基酸残基也与IMAC柱上的Fe3+结合，与柱的非特异性结合可能是个阻碍。为了防止这个阻碍，通常在将样品加载到IMAC柱上之前，用2M甲醇盐酸盐处理样品。该方法将所有的酸性氨基酸残基以及肽的C末端从羧酸基团转化为甲酯。磷酸基团保持未修饰，这使其选择性结合到IMAC柱上。 
其它的生物化学家已经在柱中使用二氧化钛颗粒以与2，5-二羟基苯甲酸组合结合磷蛋白，以防止非磷蛋白结合。 
本发明的微颗粒提供进一步的途径以进行磷蛋白分离。因此，从又一方面看，本发明提供本发明的微颗粒在磷蛋白分离中的用途。因此，从另一方面看，本发明提供从包含磷蛋白的样品分离磷蛋白的方法，其包括将所述样品与本发明的颗粒相接触。 
因此，从另一方面看，本发明提供从样品分离磷蛋白的方法，其包括：(I)提供包含一种或多种磷蛋白的样品；(II)将样品与如上所述的过渡金属氧化物涂覆的微颗粒混合；(III)温育样品和颗粒；(IV)收集颗粒，任选地在磁场中进行，并除去上清液；和(V)任选地洗脱一种或多种分离的磷蛋白。 
洗涤步骤可以包括在该方法中，如本领域公知的，例如在步骤(IV)之后。 
样品可以是包含磷蛋白的任何样品。此类样品的制备是本领域公知的。样品可以是细胞碎片，其已被裂解并优选经过至少一个分离过程：例如用包含至少一种盐、洗涤剂或表面活性剂、酸或碱的一种或多种溶液提取；离心；增溶；沉淀；亲和捕获；介电电泳或色谱法。在一些实施方案中，磷蛋白首先通过使用特异性结合试剂的亲和捕获进行富集，所述特异性结合试剂结合磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸的一个或多个。蛋白质也可以通过例如电泳或色谱法的方法从细胞碎片分离。在一些优选的实施方案中，用一种或多种蛋白酶消化蛋白质，以提供样品。优选地，样品包含蛋白酶消化的蛋白质。 
例如，磷酸肽可以通过在此类磁珠的衍生表面上进行选择性富集而从更多普通肽序列的复杂混合物中进行分离。 
温育条件是通常型用于本领域的那些，例如从10到50℃的温度，例如室温。温育可以进行任何方便的时间段，例如1分钟到1星期，优选1到5小时。 
在混合和温育步骤期间，缓冲液(一种或多种)特别是离液缓冲液和任选加入的其它试剂例如盐的正确组合/浓度，促进将磷蛋白结合到本发明的聚合颗粒。温度和pH的控制也可以帮助分离。 
在这点上，使用传统的TiO2颗粒，通常在加载和/或洗涤缓冲液中以相对高的浓度使用2，5-二羟基苯甲酸(DHB)，以确保磷蛋白选择性是高的。在不存在DHB的情况下，选择性是差的，并且许多污染肽被保留。 
然而，本发明的颗粒在负载或洗涤缓冲液中不需要存在DHB，因为在DHB不存在时，选择性是优秀的。因此，在进一步实施方案中，上述步骤(II)在不存在DHB的情况下进行。 
免除DHB的优点是众多的，因为该材料在高度水性的缓冲液中倾向于结晶。随后，晶体可阻塞反相树脂，导致反压并损失样品。因此，在富集磷蛋白中应用本发明的颗粒是高度优选的。 
对于分离方法特别重要的是使用的缓冲液。离液缓冲 液或洗涤剂是可用的缓冲液，特别是结合缓冲液。适当的离液缓冲液包括胍盐，例如硫氰酸盐或氯化物、脲、高氯酸盐或碘化物。其它感兴趣的缓冲液包括TRIS HCl、N，N-二(羟乙基)甘氨酸、Tricine和磷酸盐缓冲液，并且可以使用离液和非离液缓冲液的混合物。缓冲液可与洗涤缓冲液例如醇(例如异丙醇)和/或非离子型表面活性剂例如Triton(典型地低离子强度的)组合，如本领域公知的。 
也可使用洗涤剂，例如在WO96/18731中描述的那些。优选的洗涤剂包括离子型(其包括阴离子型和阳离子型)、非离子型或两性离子型洗涤剂。如在本文使用的术语“离子型洗涤剂”包括当溶于水时部分或全部为离子形式的任何洗涤剂。阴离子洗涤剂已经示出表现特别好，并且是优选的。适当的阴离子洗涤剂包括例如十二烷基硫酸钠(SDS)或其它的碱金属烷基硫酸盐或相似的洗涤剂、sarkosyl或其组合。 
也可使用洗涤剂和离液缓冲液的组合。 
分离也可以应用标准洗涤缓冲液，例如随后的实施例中描述的那些。 
本发明人已经意外地发现许多缓冲液，其已经证明在使用本发明的微颗粒分离磷蛋白中特别有用。虽然这些缓冲液在本要求保护的方法中得到极大的应用，但是应该理解它们也在通常使用的多种不同的技术和颗粒中用于分离磷蛋白。缓冲液也可用于分离其它的生物分子。因此，这些缓冲液构成本发明的又一方面。 
对于将磷蛋白结合到本发明的微颗粒，和对于洗涤颗粒，本发明人已经发现50mM乙酸钠，pH4，20％乙醇缓冲液是理想的。这样的缓冲液可以通过将1.66g无水乙酸钠溶于50ml去离子H2O而制备。在用0.45或0.22mm过滤器过滤后，可以加入5.27ml的冰醋酸，用dH2O使总体积达到1.75L。该材料的pH是4.0±0.1。然后，可加入450ml乙醇，并通过加入去离子水使终体积达到2.25L。使用的所有试剂应该是分析级的。 
因此，包含水、乙醇和乙酸钠并且具有3.9至4.1之 间的pH的缓冲液是理想的。优选地，乙醇构成缓冲液的10至30wt％。为了达到希望的pH，对于乙酸钠，缓冲液可以是45到55mM。 
因此，在高度优选的实施方案中，磷蛋白和本发明的微颗粒的温育在存在该缓冲液的情况下进行。 
在分离后，可以使用传统方法洗脱磷蛋白。洗脱可以在包含哌啶(piperadine)、咪唑、正磷酸盐的一种或多种的溶液中进行，或者可以在碱性(例如pH8到11)的溶液中进行。优选的洗脱缓冲液包括碳酸铵、氢氧化铵、柠檬酸二铵、乙酸铵、磷酸二氢铵或碳酸氢铵。 
一种优选的洗脱缓冲液基于磷酸苯酯和氢氧化铵。优选地，其为50mM磷酸苯酯于0.3N NH4OH中。这样的缓冲液可以通过将5ml氢氧化铵(14.8M)加入到500ml去离子水中以产生0.3N NH4OH溶液而制备。然后可以加入6.35g的磷酸苯酯。使用的所有试剂应该是分析级的。 
因此，包含磷酸苯酯(例如其钠盐)和氢氧化铵的洗脱缓冲液用于本发明是理想的，并且这构成本发明的又一方面。 
优选地，用于制造缓冲液的氢氧化铵为0.1到1N。使用的磷酸苯酯可以以10到100mM溶液供应，例如40到60mM溶液，例如50mM。 
本发明人意外地发现与本发明的涂覆的颗粒最佳工作的洗脱缓冲液应该在氢氧化铵(例如0.3N氢氧化铵)中包含磷酸苯酯(例如50mM苯基磷酸钠)，以帮助与紧密结合表面竞争磷酸化残基。 
因此，在高度优选的实施方案中，在上面步骤(V)中磷蛋白的洗脱使用该缓冲液进行。 
在洗脱后，可以使用传统方法例如质谱法分析磷蛋白，以鉴定特定的蛋白质。当与其中使用SILAC(在细胞培养物中稳定同位素标记氨基酸)或使用iTRAQ(用于相对绝对量化的同位素标记试剂)的样品结合使用时，上述方法是特别有用的。 
本发明现在将参考以下实施例和图进一步描述。这些 不意欲限定本发明，而仅仅是示例本发明。附图简述 
图1示出从血清分离的dsDNA(5μg输入)，其使用：泳道1-3：具有钛的磁珠泳道4-6：具有锆的磁珠泳道7：5μg HindIII切割的λdsDNA梯度 
图2示出从血清分离的RNA(5μg输入)，其使用：泳道1-3：具有钛的磁珠泳道4-6：具有锆的磁珠泳道7：5μg 0.24-9.5Kb RNA梯度 
图3示出从血清分离的核酸(5μg输入)，其使用具有锆的磁珠，其中：泳道1-3：RNA泳道4：5μg 0.24-9.5Kb RNA梯度泳道5：空泳道6-8：dsDNA泳道9：5μg HindIII切割的λdsDNA梯度 
图4示出从血清分离的核酸(5μg输入)，其使用具有锆的磁珠：泳道1和2：dsDNA泳道3：5μg HindIII切割的λdsDNA梯度 
图5示出从血清分离的dsDNA，其使用具有钛的磁珠泳道1-2：来自2.5μg输入的分离的dsDNA泳道3-4：来自5μg输入的分离的dsDNA泳道5-6：来自15μg输入的分离的dsDNA泳道7-8：来自20μg输入的分离的dsDNA泳道9：5μg HindIII切割的λdsDNA梯度 
图6示出从血液分离的基因组DNA，其使用具有锆和钛 的磁珠。泳道1-2：用锆实施例1分离的gDNA泳道3-4：用锆实施例2分离的gDNA泳道5-6：用钛实施例9分离的gDNA泳道7-8：用钛实施例10分离的gDNA泳道9-10：用 
Figure G200780051278XD00191
DNA DIRECTTM试剂盒(Invitrogen DynalAS，Oslo，Norway)分离的gDNA。 
图7示出从血液分离的基因组DNA，其使用具有锆和钛的磁珠：泳道1-2：用锆实施例1分离的gDNA泳道3-4：用锆实施例2分离的gDNA(泳道4中明显低的收率的原因是gDNA没有从珠洗脱)泳道5-6：用钛实施例9分离的gDNA泳道7-8：用钛实施例10分离的gDNA泳道9-10：用 
Figure G200780051278XD00192
DNA DIRECTTM试剂盒(Invitrogen DynalAS，Oslo，Norway)分离的gDNA。 
图8示出从血液分离的基因组DNA，其使用具有钛的磁珠：泳道1-2：用钛实施例11分离的gDNA泳道3-4：用钛实施例16分离的gDNA 
图9示出使用不同专用缓冲液的DNA分离的％。 
图10A-D示出与使用二氧化钛珠相比，使用本发明的珠分离磷蛋白之后获得的质谱。 
图11A和B示出在与本发明的颗粒温育之前或之后通过胰蛋白酶消化获得的未知磷蛋白的质谱。实施例一般程序： 
起始材料珠(在随后的实施例中称为珠)是多孔的、1 μm单一大小的、在孔中具有氧化铁晶体的交联的聚苯乙烯/二乙烯基苯珠。这些包含300-500mg铁/g干固体(DS)的磁性聚合颗粒，也用WO 05/015216中描述的方法用环氧化物涂覆。 
洗涤步骤之间的每次分离在磁体上进行，并且在每个洗涤步骤之间摇动悬浮液大约5分钟。锆涂覆的颗粒实施例1 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1.5g的珠(洗涤5次，每次10-30mL的液体)。调节最终的悬浮液至重11.63g。 
加入13.71g的锆酸四丁酯(在丁醇中80％)，并且在室温下以250r pm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入330μL的水。搅拌悬浮液另外18小时。 
在18小时之后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒(5次，每次30-50mL液体)，然后用异丙醇洗涤(5次，每次30-50mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例2 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2g的珠(洗涤5次，每次25-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重15.95g。 
加入17.84g的锆酸四丙酯(在丙醇中70％)，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入450μL的水。搅拌悬浮液另外18小时。 
在18小时之后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒(6次，每次30-50mL液体)，然后用异丙醇洗涤(7次，每次30-50mL液体)，然后用水洗涤4次(每次30-50mL液体)，最后用异丙醇洗涤4次(每次30-50mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例3 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2g的珠(洗涤5次，每次25-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重15.95g。 
加入17.84g的锆酸四丙酯(在丙醇中70％)和450μL的水。在室温下以250rpm搅拌悬浮液18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒(5次，每次30-50mL的液体)，然后用水洗涤(5次，每次30-50mL的液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例4 
用乙醇洗涤2g的珠(洗涤5次，每次25-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重15.95g。 
加入17.84g的锆酸四丙酯(在丙醇中70％)，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入450μL的水。搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用乙醇洗涤颗粒5次(每次30-50mL的液体)，然后用水洗涤5次(每次30-50mL的液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例5 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2g的珠(洗涤5次，每次25-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重15.95g。 
加入17.84g的锆酸四丙酯(在丙醇中70％)，并且以250rpm搅拌悬浮液并加热到130℃。在130℃下，搅拌90分钟后，加入450μL的水。在130℃下，搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒5次(每次30-50mL的液体)，然后用水洗涤5次(每次30-50mL的液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例6 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1g环氧化物涂覆的并且用羧酸官能化的珠(洗涤5次，每次25-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重15.95g。 
加入8.92g的锆酸四丙酯(在丙醇中70％)，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌60分钟后，加入220μL的水。在室温下搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒5次(每次30-50mL的液体)，然后用水洗涤25次(每次30-50mL的液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例7 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2.5g的 RPCProtein(Invitrogen Dynal AS，Oslo，Norway)(洗涤5次，每次30mL的液体)。将颗粒的干物质调节到11.7wt％。加入锆酸四丙酯(在1-丙醇中70％)(22.3g)，然后加入二(2-甲氧基乙基醚)(5.0g)。在环境温度下，以250rpm搅拌混合物1小时后，加入水(0.56g)。在环境温度下进一步搅拌混合物18小时。用50ml二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒10次，并用50ml水洗涤20次。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。实施例8 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤4.0g的环氧化物涂覆的珠(洗涤5次，每次50mL的液体)。将颗粒的干物质调节到11.7wt％。加入锆酸四丙酯(在1-丙醇中70％)(35.7g)，然后加入二(2-甲氧基乙基醚)(8.0g)。在环境温度下，以250rpm搅拌混合物1小时后，加入水(0.89g)。在环境温度下进一步搅拌混合物18小时。用80ml二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒10次，并用80m l水洗涤20次。通过FT-IR(漫反射)可观察锆涂层。 钛涂层实施例9 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2g珠(洗涤5次，每次25-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重14.29g。 
加入8.70g的原钛酸四乙酯，并且在室温下以250r pm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入210μL的水。搅拌悬浮液另外2小时。 
2小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒10次(每次30-50mL液体)，然后用丙酮洗涤4次(每次30-50mL液体)，最后用水洗涤4次(每次30-50mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例10 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1.8g珠(洗涤5次，每次35-60mL的液体)。调节最终的悬浮液至重37.64g。 
加入13.05g的原钛酸四乙酯，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入670μL的水。搅拌悬浮液另外2小时。 
2小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒9次(每次大约100mL液体)，然后用异丙醇洗涤4次(每次大约100mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例11 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1.8g珠(洗涤5次，每次35-60mL的液体)。调节最终的悬浮液至重37.64g。 
加入19.46g的原钛酸四丁酯，并且在室温下以250r pm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入670μL的水。搅拌悬浮液另外2小时。 
2小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒9次(每次 大约100mL液体)，然后用异丙醇洗涤4次(每次大约100mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例12 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2.0g的珠(洗涤5次，每次25mL的液体)。将颗粒的干物质调节到9.5wt％，并加入原钛酸四丁酯(13.0g)。在环境温度下，搅拌混合物1小时后，加入水(0.45g)。在环境温度下进一步搅拌混合物18小时。用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒6次，并用水洗涤5次。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例13 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1.5g珠(洗涤5次，每次20-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重18.82g。 
加入6.52g的原钛酸四丁酯，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入330μL的HNO3溶液(pH＝1)。搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒9次(每次大约50mL液体)，然后用异丙醇洗涤4次(每次大约1050mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例14 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1.5g珠(洗涤5次，每次20-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重18.82g。 
加入6.52g的原钛酸四丁酯，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌90分钟后，加入330μL的NH4OH溶液(pH＝11)。搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒9次(每次大约50mL液体)，然后用异丙醇洗涤4次(每次大约50mL液体)。 通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例15 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤1g环氧化物涂覆的并且用羧酸官能化的珠(洗涤5次，每次20-40mL的液体)。调节最终的悬浮液至重10.55克。 
加入6.52g的原钛酸四丁酯，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌60分钟后，加入220μL的水。搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒5次(每次大约50mL液体)，然后用水洗涤20次(每次大约50mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例16 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤4g含有大约335mg Fe/gDS的环氧化物涂覆的珠(洗涤5次，每次50-80mL液体)。调节最终的悬浮液至重42.22g。 
加入25.95g的原钛酸四丁酯，并且在室温下以250rpm搅拌悬浮液。搅拌60分钟后，加入890μL的水。搅拌悬浮液另外18小时。 
18小时后，用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒5次(每次大约80mL液体)，然后用水洗涤5次(每次大约80mL液体)。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例17 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2.0g含有大约435mg Fe/g DS的环氧化物涂覆的珠(洗涤5次，每次25mL的液体)。将颗粒的干物质调节到9.5wt％，并加入原钛酸四丁酯(13.0g)。在环境温度下，搅拌混合物1小时后，加入水(0.45g)。在环境温度下进 一步搅拌混合物18小时。用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒6次，并用水洗涤7次。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例18 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2.0g的 
Figure G200780051278XD00261
RPC18(Invitrogen Dynal AS，Oslo Norway)(洗涤5次，每次25mL的液体)。将颗粒的干物质调节到11.7wt％。加入原钛酸四丁酯(13.0g)，然后加入二(2-甲氧基乙基醚)(4.0g)。在环境温度下，以250rpm搅拌混合物1小时后，加入水(0.45g)。在环境温度下进一步搅拌混合物18小时。用50ml二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒6次，并用50ml水洗涤70次。通过FT-IR(漫反射)可观察钛涂层。实施例19 
用二(2-甲氧基乙基醚)洗涤2.5g的 
Figure G200780051278XD00262
RPCProtein(Invitrogen Dynal AS，Oslo Norway)(洗涤5次，每次30mL的液体)。将颗粒的干物质调节到11.7wt％。加入原钛酸四丁酯(16.2g)，然后加入二(2-甲氧基乙基醚)(5.0g)。在环境温度下，以250r pm搅拌混合物1小时后，加入水(0.56g)。在环境温度下进一步搅拌混合物18小时。用50ml二(2-甲氧基乙基醚)洗涤颗粒10次，并用50ml水洗涤20次。通过FT-I R(漫反射)可观察钛涂层。本发明的颗粒在生物分离中的应用核酸分离：通用方案和使用的材料： 
核酸来源：ds DNA  HindIII-DNA梯度，其从Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA商业可获得RNA    0.24-9.5Kb RNA梯度，其从I nv i t r ogen Cor p，Carlsbad，CA，USA商业可获得 
使用的商业可获得的缓冲液和溶液：(*)得自Ambion(TX，USA)的MagMAXTM Viral RNA分离试剂盒中(**)得自Invitrogen Dynal AS(Oslo，Norway)的DNA DIRECTTMBlood试剂盒中(***)得自Invitrogen Dynal AS(Oslo，Norway)的DNA DIRECTTMUniversal试剂盒中(****)得自Qiagen(CA，USA)的 Virus Mini M48试剂盒中(*****)得自Roche Diagnostic GmbH(Mannheim，Germany)的MagNA Pure Total Nucleic Acid试剂盒中(******)得自Invitrogen Dynal AS(Oslo，Norway)的 
Figure G200780051278XD00272
gDNA Silane试剂盒中 
RNA和dsDNA的收率通过分光光度分析和溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳来测定。实施例20使用二氧化钛(实施例10)和二氧化锆(实施例2)磁珠从血清纯化双链DNA 
在证明二氧化钛和二氧化锆磁珠在自动***中结合和洗脱dsDNA的能力的研究中，将总量5μg的dsDNA加入到含有100l血清、100μl蛋白酶K、150μl 100％异丙醇和300μl包含硫氰酸胍的裂解/结合溶液(*)的管中的2mg实施例2或10的珠。在室温下，温育该溶液10分钟，并伴随持续的混合。在磁场中收集珠之后，除去上清液。然后用850μl的包含硫氰酸胍和异丙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠之后，从珠除去上清液。然后用450μl包含乙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。在100μl洗脱缓冲液(*)中，通过将珠溶液加热到80℃持续10分钟并伴随持续的混合，洗脱dsDNA。在磁场中收集珠，并且将包含洗脱的dsDNA 的上清液从珠移出，并转移到新的管中。dsDNA收率在图1和表1中示出。 
Figure G200780051278XD00281
表1使用具有钛和锆的磁珠从血清分离的5μg输入dsDNA的收率实施例21使用二氧化钛(实施例10)和二氧化锆(实施例2)磁珠从血清纯化RNA 
在显示二氧化钛和二氧化锆磁珠在自动***中结合和洗脱RNA的能力的研究中，将总量5μg的RNA加入到含有100μl血清、100μl蛋白酶K、150μl 100％异丙醇和300μl包含硫氰酸胍的裂解/结合溶液(*)的管中的2mg实施例2或10的珠。在室温下，温育该溶液10分钟，并伴随持续的混合。在磁场中收集珠之后，除去上清液。然后用850μl的包含硫氰酸胍和异丙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠之后，从珠除去上清液。然后用450μl包含乙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。在100μl洗脱缓冲液(*)中，通过将珠溶液加热到80℃持续10分钟并伴随持续的混合，洗脱RNA。在磁场中收集珠，并且将包含洗脱的RNA的上清液从珠移出，并转移到新的管中。RNA收率在图2和表2中示出。 
Figure G200780051278XD00291
表2使用具有钛和锆的磁珠从血清分离的5μg输入RNA的收率实施例22使用二氧化锆磁珠(实施例2)从血清纯化核酸 
在显示二氧化锆磁珠在自动***中结合和洗脱RNA和DNA的能力的研究中，将总量5μg的RNA和5μg的dsDNA加入到含有100μl血清、100μl蛋白酶K、150μl 100％异丙醇和300μl包含4-6M硫氰酸胍、10-20％Triton X-100、50mM Tris-HCl，pH 6-8的裂解/结合溶液的管中的2mg的珠。在室温下，温育该溶液10分钟，并伴随持续的混合。在磁场中收集珠之后，除去上清液。然后用850μl的包含硫氰酸胍和异丙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠之后，从珠除去上清液。然后用450μl包含乙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。在100μl洗脱缓冲液(*)中，通过将珠溶液加热到80℃持续10分钟并伴随恒定搅拌，洗脱RNA。在磁场中收集珠，并且将包含洗脱的核酸的上清液从珠移出，并转移到新的管中。核酸收率在图3和表3中示出。 表3使用具有锆的磁珠从血清分离的5μg输入核酸的收率实施例23使用二氧化锆磁珠(实施例1)从血清纯化双链DNA 
在显示二氧化锆磁珠结合和洗脱dsDNA的能力的研究中，将总量5μg的dsDNA加入到含有100μl血清、800μl包含硫氰酸胍的裂解/结合溶液(*)的管中的2mg的珠。小心涡旋溶液4分钟。在磁场中收集珠之后，除去上清液。然后用400μl的包含硫氰酸胍和异丙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠之后，从珠除去上清液。然后用400μl包含乙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。将珠沉淀风干2分钟，然后在100μl洗脱缓冲液(*)中，通过将珠溶液加热到70℃持续3分钟，洗脱dsDNA。在磁场中收集珠，并且将包含洗脱的dsDNA的上清液从珠移出，并转移到新的管中。dsDNA收率在图4和表4中示出。 表4使用具有锆的磁珠从血清分离的5μg输入dsDNA的收率 实施例24使用二氧化钛磁珠(实施例9)从血清纯化双链DNA 
在显示二氧化钛磁珠结合和洗脱dsDNA的能力的研究中，将增加量(2.5、5、15和20μg)的ds DNA加入到含有100μl血清、800μl包含硫氰酸胍的裂解/结合溶液(*)的管中的2mg的珠。小心涡旋溶液4分钟。在磁场中收集珠之后，除去上清液。然后用400μl的包含硫氰酸胍和异丙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠之后，从珠除去上清液。然后用400μl包含乙醇的溶液(*)洗涤珠沉淀两次。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。将珠沉淀风干2分钟，然后在100μl洗脱缓冲液(*)中，通过将珠溶液加热到70℃持续3分钟，洗脱dsDNA。在磁场中收集珠，并且将包含洗脱的dsDNA的上清液从珠移出，并转移到新的管中。dsDNA收率在图5和表5中示出。 
Figure G200780051278XD00311
表5使用具有钛的磁珠从血清分离的增加量的输入dsDNA的收率实施例25使用二氧化钛(实施例9和实施例10)和二氧化锆(实施例1和 实施例2)磁珠从血液纯化基因组DNA。 
在研究中，显示二氧化钛和二氧化锆磁珠结合和洗脱基因组DNA的能力。将100μl EDTA血液加入到1ml红细胞裂解缓冲液(**)中。在室温下，在辊上温育溶液5分钟。通过在14000rpm下离心沉淀白细胞，并除去上清液。加入0.5mg珠，和200μl来自试剂盒的没有珠的裂解/结合缓冲液(**)。不进一步混合珠悬浮液，而是在室温下静置5分钟。然后，用1ml 1×洗涤缓冲液(**)小心洗涤珠沉淀，而不重悬该沉淀。在磁场中收集珠后，除去上清液。重复洗涤步骤两次。向珠沉淀加入100μl重悬缓冲液(**)，并且通过吹吸重悬该珠。在65℃下，加热珠悬浮液5分钟。通过吹吸混合珠悬浮液，然后在磁场中收集珠。将上清液转移到新的管中。在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分析分离的基因组DNA，结果在图6示出。实施例26使用二氧化钛(实施例9和实施例10)和二氧化锆(实施例1和实施例2)磁珠从血液纯化基因组DNA。 
在研究中，显示二氧化钛和二氧化锆磁珠结合和洗脱基因组DNA的能力。向10μl EDTA血液加入0.5mg珠连同200μl来自试剂盒的没有珠的裂解/结合缓冲液(***)。不进一步混合珠悬浮液，而是在室温下静置5分钟。然后，用200μl 1×洗涤缓冲液(***)小心洗涤珠沉淀，而不重悬该沉淀。在磁场中收集珠后，除去上清液。重复洗涤步骤一次。向珠沉淀加入20μl重悬缓冲液(***)，并且通过吹吸重悬该珠。在65℃下，加热珠悬浮液5分钟。通过吹吸混合珠悬浮液，然后在磁场中收集珠。将上清液转移到新的管中。在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分析分离的基因组DNA，结果在图7示出。实施例27使用二氧化钛(实施例12和实施例17)从血液纯化基因组DNA 
将50μl蛋白酶K(20mg/ml)加入到350μl血液中， 在室温下混合并温育2分钟。加入350μl裂解缓冲液(******)并混合。在55℃下温育10分钟后，加入2.0mg珠，并与样品混合。加入400μl的异丙醇，并与珠和样品混合，在辊上温育3分钟。在磁场中收集珠，并除去上清液。此后，用1ml洗涤缓冲液1(******)洗涤珠两次。将珠沉淀重悬在1ml洗涤缓冲液2(******)中，并转移到新的管中。在磁场中收集珠，并且除去上清液，然后用1ml洗涤缓冲液2(******)最后洗涤珠。沉淀珠，并且在除去上清液后，风干5-10分钟。加入100μl洗脱缓冲液(******)，并且通过吹吸混合珠悬浮液，然后在磁场中收集珠。将具有洗脱的DNA的上清液转移到新的管中。在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分析分离的基因组DNA，其在图8示出。实施例28使用二氧化钛(实施例9)磁珠和不同的缓冲液组合物从血清纯化双链DNA 
在显示二氧化钛需要特定缓冲液组合物以结合并洗脱dsDNA的研究中，使用两种不同的含有基于磁性硅石(magnetic silica)的珠的商业试剂盒。通过更换试剂盒中的磁珠为实施例9的二氧化钛磁珠，进行本方案。通过将总量5μg的ds DNA加入到100μl血清、130μl裂解AL缓冲液(****)和20μl蛋白酶(****)中进行第一方案。将其在56℃下温育15分钟。将2mg实施例9的珠和130μl 100％异丙醇加入到混合物中，并且将其在室温下温育10分钟，并伴随持续的混合。在磁场中收集珠后，除去上清液。然后，用400l AW1(****)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。然后，用400μl AW2(****)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。然后，用400μl 96％乙醇洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。将dsDNA在100μl洗脱缓冲液(****)中洗脱。在磁场中收集珠，并且从珠移出含有洗脱的dsDNA的上清液，并转移到新的管中。 
通过将总量5μg的dsDNA加入到含有100μl血清、 100μl蛋白酶K(*****)、150μl 100％异丙醇和300μl裂解结合溶液(*****)的管中的2mg实施例9的珠，进行第二方案。在室温下，温育该溶液10分钟，并伴随持续的混合。在磁场中收集珠之后，除去上清液。然后用850μl洗涤缓冲液I(*****)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠之后，从珠除去上清液。然后，用450μl洗涤缓冲液II(*****)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。然后，用450μl洗涤缓冲液III(*****)洗涤珠沉淀。在磁场中收集珠后，从珠除去上清液。将dsDNA在100μl洗脱缓冲液(*****)中洗脱。在磁场中收集珠，并且从珠移出含有洗脱的ds DNA的上清液，并转移到新的管中。 
结果在图9中表示。磷蛋白分离实施例29 
从Invitrogen Corp.，CA，USA获得磷酸肽标准混合物[血管紧张肽(Angiotensin)II(DRVYIHPF，1046.54)，血管紧张肽I(DRVYIHPFHL，1296.88)、髓磷脂碱性蛋白片段104-118(GKGRGLSLSRFSWGA，1578.85)、pTpY肽(MAP激酶片段177-189，DHTGFLpTEpYVATR，1669.67)、pY肽(胰岛素受体片段1142-1153(TRDIpYETDYYRK，1702.75)、pT肽(VPIPGRFDRRVpTVE，1720.89)、pS肽(RII磷酸肽片段81-99，DLDVPIPGRFDRRVpSVAAE，2192.08)]。 
根据制造商的说明书，用iTRAQ(Invitrogen Corp.，CA，USA)114、115、116或117同位素标记磷酸肽标准混合物。 
iTRAQ标记的肽的等分试样(5μl的2pmol/μl原液)用2μl的50％乙酸酸化，用36μl结合缓冲液(0.1％TFA或300mg/ml DHB/80％乙腈/0.1％TFA)稀释，然后与8μl的50mg/ml的实施例9的珠温育10分钟，或者将它们通过用 
Figure G200780051278XD00341
20MC(Applied Biosystems，CA，USA)(大约3mm填充长度)或购自GLSciences Inc(Torrance，CA)的二氧化钛球体预填充的 
Figure G200780051278XD00342
Figure G200780051278XD00343
(Eppendorf A.G.，Hamburg，Germany)，以比较磷酸 肽富集的相对功效。 
在大量洗涤(0.1％TFA中的80％乙腈)后，用10μl的洗脱缓冲液(0.3N氢氧化铵中的50mM苯基磷酸钠)洗脱磷酸肽。 
为了定量比较捕获效率，通过两种不同的亲和化学技术和两种不同的支持物分离磷酸肽，将洗脱的物质混合，并用4μl的50％乙酸酸化，然后用自填充的 
Figure G200780051278XD00351
R2 tip column(AppliedBiosystems，CA，USA)脱盐。将磷酸肽直接洗脱至MALDI板上，并与CHCA(α-氰基-4-羟基苯丙烯酸)基质以1∶1比率混合，然后使用4700蛋白质组学分析器(Proteomics Analyzer)(Applied Biosystems，CA.，USA)进行分析。 
在样品分析之前，清洗CID气室(gas cell)，以便在报道离子内获得稳定的同位素比值。使用总共14,000激光脉冲(laser shot)来平均碎片离子的信号。通过在MS/MS(串联MS)谱中检测报道离子的强度比，人工进行量化。 
所获得的结果在图10A到D中表示。圆圈标记的峰是污染物峰。显然的是，DHB的存在对使用二氧化钛球体特异性富集磷酸肽的最优化是必须的。相反，DHB的存在对使用实施例9的磁性二氧化钛涂覆的“Dynabead-TiO2”颗粒的富集的特异性几乎没有影响。而且，本发明的颗粒的分离性能比使用二氧化钛颗粒的任一相当的分离更好。实施例30 
将HeLa细胞(ATCC)维持在包含10％FBS(InvitrogenCorp.，CA.，USA)的DMEM培养基(Invitrogen Corp.，CA.，USA)中。对于SILAC标记，在含有10％透析的FBS并补充有轻L-赖氨酸和轻L-精氨酸(轻培养基)或重[U-13C6]L-赖氨酸和重[U-13C6，15N4]L-精氨酸(重培养基)的SILAC DMEM培养基中，将HeLa细胞的等分试样传代至少6个倍增(大约10天)。在用相应的不含血清的轻或重培养基饥饿过夜后，用150ng/ml的EGF刺激用重培养基标记的HeLa细胞 (50×106个细胞)5分钟，而用轻培养基标记的HeLa细胞(50×106个细胞)保持未处理。刺激后，在含有50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1％NP-40、0.1％脱氧胆酸钠、1mM Na3VO4、10mM NaF和蛋白酶抑制剂混合物的NP-40裂解缓冲液中，立刻裂解重标记的细胞和轻标记的细胞。 
通过在100,000×g下离心15分钟澄清细胞裂解产物，并且用大约50μg的缀合到Dynabeads的磷酸酪氨酸抗体(PY-Plus)或缀合到琼脂糖珠的4G10磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀混合的细胞裂解产物。在通过在4℃下温和转动2h而混合之后，用磁体捕获Dyna beads，而通过离心收获琼脂糖珠。用裂解缓冲液洗涤珠五次，然后用50μl的100mM甘氨酸(pH 2.5)洗脱。洗脱物用1M的Tris中和，用10mM的DTT还原，并用30nM的1×SDS样品缓冲液中的碘乙酰胺烷基化，然后在SDS-PAGE上分离。从凝胶切下蛋白质带，并进行凝胶内胰蛋白酶消化。使用Speed Vac干燥肽提取物。 
在24μl的结合缓冲液中，将提取物与250μg的实施例9的颗粒一起温育10分钟，以分离磷酸肽。用洗涤缓冲液洗涤颗粒五次，然后用10μl的洗脱缓冲液洗脱。洗脱的磷酸肽用2μl的50％乙酸酸化，然后用自填充的PorosR2 tip column脱盐，然后使用MALDI-TOF-TOF分析。 
图11a示出与本发明的颗粒温育之前的提取物的典型MS。图11b示出在温育之后同一提取物的MS。极大地简化了质谱，以使易于鉴定捕获的磷酸肽。在2322.1的峰被确定为重13C6-Lys-标记的源自EGFR的磷酸肽GSHQISLDNPDpYQQDFFPK。 
结果表明特定残基的磷酸化水平的量化是可实现的。 

Claims (28)

1.包含苯乙烯的均聚物或共聚物或聚丙烯酸酯的具有小于20％的变异系数的单分散性聚合物微颗粒，其中所述颗粒具有由至少一种第4族或第5族金属的过渡金属氧化物或至少一种Al的氧化物或其混合物形成的涂层。
2.权利要求1所述的微颗粒，其是磁性的。
3.权利要求2所述的微颗粒，其中磁性材料在涂覆所述至少一种氧化物之前，吸附到所述颗粒的表面上。
4.权利要求2所述的微颗粒，其是多孔的。
5.权利要求4所述的微颗粒，其中磁性材料在涂覆所述至少一种氧化物之前，沉积到所述颗粒的孔中。
6.权利要求1-5任一项所述的微颗粒，在涂覆所述至少一种氧化物之前，其被另外的聚合涂层所覆盖。
7.权利要求1-5任一项所述的微颗粒，其具有0.2到10μm的直径。
8.权利要求1-5任一项所述的微颗粒，其中所述过渡金属氧化物是氧化钛、氧化钽、氧化铌或氧化锆。
9.权利要求1-5任一项所述的微颗粒，其中所述颗粒包含苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物。
10.制备权利要求1-9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒的方法，其包括将包含苯乙烯的均聚物或共聚物或聚丙烯酸酯的聚合物微颗粒与能转化为氧化物的至少一种第4族或第5族过渡金属的化合物或至少一种Al的化合物或其混合物反应，和形成氧化物涂层。
11.权利要求10所述的方法，其中在应用热和/或水后形成所述氧化物涂层。
12.权利要求10所述的方法，其中所述微颗粒的起始材料被预先表面官能化。
13.权利要求12所述的方法，其中所述微颗粒被表面官能化，以携带氨基、羟基、环氧化物基团、羧基或硅氧基。
14.权利要求10-13任一项所述的方法，其中所述化合物是醇盐。
15.权利要求14所述的方法，其中所述醇盐是四C1-6烷氧基锆或四C1-6烷氧基钛。
16.权利要求10-13任一项所述的方法，其以至少两步步骤进行，第一步骤包括将所述微颗粒与所述化合物在无水环境中接触，第二步骤包括将水加入到所述第一步骤的产物中。
17.从包含磷蛋白的样品分离磷蛋白的方法，其包括将所述样品与权利要求1到9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒接触。
18.权利要求17所述的方法，其包括：
(I)提供包含一种或多种磷蛋白的样品；
(II)将所述样品与单分散性聚合物微颗粒混合；
(III)温育所述样品和所述颗粒；
(IV)收集所述颗粒，任选地在磁场中进行，并除去上清液；和任选地
(V)洗脱一种或多种分离的磷蛋白。
19.权利要求18所述的方法，其中步骤(V)在包含磷酸苯酯和氢氧化铵的缓冲液的存在下进行。
20.权利要求18所述的方法，其中步骤(II)在包含水、乙醇和乙酸钠且具有3.9到4.1之间的pH的缓冲液的存在下进行。
21.权利要求18所述的方法，其中步骤(II)在不存在二羟基苯甲酸的情况下进行。
22.权利要求1到9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒在磷蛋白分离中的应用。
23.包含权利要求1到9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒的缓冲液，其中所述缓冲液包含磷酸苯酯和氢氧化铵。
24.从包含核酸的样品分离核酸的方法，其包括将所述样品与权利要求1到9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒接触。
25.权利要求24所述的方法，其中所述核酸和微颗粒之间的接触在离液缓冲液的存在下进行。
26.权利要求24或25所述的从样品分离核酸的方法，其包括：
(I)提供包含一种或多种核酸的样品；
(II)将所述样品与如上所述的氧化物涂覆的微颗粒混合；
(III)温育所述样品和所述颗粒；
(IV)收集所述颗粒，任选地在磁场中进行，并除去上清液；和
(V)任选地洗脱一种或多种分离的核酸。
27.权利要求1到9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒在分离核酸中的应用。
28.用于分离核酸的试剂盒，其包含权利要求1到9任一项所述的单分散性聚合物微颗粒和离液缓冲液。
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