CN101619088A - 山楂酸衍生物及其制备和应用 - Google Patents
山楂酸衍生物及其制备和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101619088A CN101619088A CN200910055852A CN200910055852A CN101619088A CN 101619088 A CN101619088 A CN 101619088A CN 200910055852 A CN200910055852 A CN 200910055852A CN 200910055852 A CN200910055852 A CN 200910055852A CN 101619088 A CN101619088 A CN 101619088A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- derivative
- structural formula
- shown below
- formula shown
- dissolved
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
山楂酸衍生物及其制备和应用,属于医药及其制备和应用的技术领域。具有如右的结构通式所示的结构。式中,X是S、CH或CH=N,当X是S时,Y=C,R=NH2,当X是CH时,Y=N,R=见右下,当X是CH=N时,Y=C,R=H、CH3、OH、SH、NH2、SCH3、NHCH3。以天然产物齐墩果酸为原料,先经氧化得到相应的3-羰基衍生物,再在C2-位卤代或甲酰化或成烯胺,最后通过系列缩合反应得到相应的C2-,C3-位并杂环的山楂酸衍生物。可作为胰岛素增敏剂。通过在天然产物山楂酸的C2-,C3-位引入系列并杂环,高效合成了系列新型的山楂酸衍生物,合成方法简便,且通过该部位的结构改造,明显增强了该类化合物的PTP1B抑制活性。
Description
技术领域
本发明涉及山楂酸衍生物及其制备和应用,应用是指作为蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制剂,简称PTP1B抑制剂,属于医药及其制备和应用的技术领域。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症,因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低,引起糖、蛋白、脂肪、水、电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要共同标志,久病可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭等多种并发症,病情严重和应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。糖尿病及其并发症已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。
目前一般将糖尿病分为两类,I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病,IDDM)与II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病,NIDDM)。世界各地的糖尿病患者中90%属II型糖尿病,II型糖尿病,过去称为非胰岛素依赖型糖尿病或成人发病,是人体无法有效利用胰岛素的结果。世界卫生组织(WHO)估计,全世界目前约有1.8亿人患有糖尿病,这一数字很可能到2030年将翻番一倍以上。
I型糖尿病病人由于第6对染色体短臂上的HLA-D基因决定了遗传易感性,对环境因素反应异常,直接或间接通过自身免疫反应,引起胰岛β细胞破坏,以致胰岛素绝对缺乏,临床特点是起病急,多食、多饮、多尿、体重减轻、有发生酮症酸中毒的倾向,患者必须依赖胰岛素治疗维持生命。
II型糖尿病的致病原因则是胰岛素分泌的相对不足和胰岛素抵抗,也有很强的遗传性和环境因素,并呈显著的异质性,发病机制多样而复杂,各病人间存在较大差异。
胰岛素信号通路中一个重要的调控机制是对胰岛素受体(insulinreceptor,IR)、胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)以及其它下游分子的蛋白质酪氨酸磷酸化进行可逆调节(White MF,KahnCR.J.Biol.Chem.1996,269(1),1)。蛋白酪氨酸磷酸化是一种重要的调节信号转导的翻译后修饰方式。在体内酪氨酸的磷酸化是可逆的动态过程,其磷酸化和去磷酸化分别由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosinekinases,PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs)来调节。II型糖尿病的特征是胰岛素敏感组织如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵抗,胰岛素信号在其传导通路中减弱或阻断是其直接因素。胰岛素通过与其IR胞外α亚单位结合而激活受体胞内β亚单位内在的PTKs活性,导致调节结构域中关键的酪氨酸残基自磷酸化,从而激活IRβ亚基的PTKs活性,然后含有SH 2结构域的接头蛋白如IRS被招募到IR的SH2结合位点,随后PI3K被激活,接着下游糖代谢通路中的PKB、GLUT4进一步被激活,体内的糖脂代谢被启动。PTPs作用与该通路的多个环节,如将自身磷酸化活化的IR去磷酸化,从而降低受体激酶的活性,或将胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2、Shc等中的蛋白酪氨酸残基去磷酸化,从而负调控胰岛素信号通路。特定PTPs和胰岛素信号通路中PTKs间酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰岛素抵抗的原因。因此,通过寻找选择性作用于该通路中PTPs的抑制剂抑制其活性,加强和延长胰岛素信号,成为越来越受重视的治疗II型糖尿病的新途径。
蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)是最早被纯化和确定生物学特性的蛋白酪氨酸磷酸酯酶,全长约50kDa,在C术端有一段可被切割的35个氨基酸的疏水片段,该片段负责将PTP1B定位在内质网上,然后与受体型激酶IR、EGFR(epidermal growth factor receptor)和PDGFR(platelet-derived growthfactor receptor)相互作用,使其去磷酸化(Boute N,et al.Science 2002,295(5560),1708)。PTP1B在多种组织中均有表达,特别是在胰岛素的靶组织如肝脏、肌肉、脂肪等。最近人们发现PTP1B可以通过对IR、IRS的脱磷酸化作用而下调胰岛素信号(Kenner KA,et al.J.Biol.Chem.1996,271,19810),通过抑制PTP1B的活性,有助于提高外周组织对胰岛素的敏感性;此外,PTP1B还可使瘦素受体相关激酶JAK2去磷酸化失活,不能对瘦素产生应答,从而引起瘦素抵抗(ZabolotnyJM,et al.Dev.Cell 2002,2,489),因此PTP1B抑制剂在糖尿病和肥胖症的治疗中有着广阔的前景。
动物试验表明,PTP1B缺失的老鼠由于增加或延长了在肌肉与肝脏组织中IR的磷酸化水平,而使其对胰岛素的敏感性增强,明显降低体内甘油三酯的水平(Elchebly M,et al.Science 1999,283,1544;Klaman LD,et al.Mol.Cell.Biol.2000,20,5479);同时相关的研究表明PTP1B缺失的老鼠由于对瘦素敏感性的增强,能量消耗增加,所以对高脂食物引起的肥胖有着良好的抵抗作用(Zabolotny LD,et al.Dev.Cell 2002,2,489;Cheng A,et al.Dev.Cell 2002,2,497)。随着人类基因组计划的进展,在遗传学方面越来越多的证据表明PTP1B和II型糖尿病及肥胖有关(Echwald SM,et al.Diabetes 2002,51(1),1;Di Paoia R,et al.Am.J.Hum.Genet.2002,70(3),806),因此PTP1B抑制剂是治疗糖尿病和肥胖症潜在的药物。
PTP1B选择性抑制剂的研究取得了一定的进展,但大多局限于一些肽类或类肽化合物,例如基于PTP1B去磷酸化的底物序列设计的抑制剂EEDE(F2PMP)M(Ki=7.2nM)、Glu-F2PMP-F2PMP(IC50=40nM),虽然这些肽类抑制剂具有较强的抑制活性及较高的选择性,但它们是肽类磷酸化合物的事实使其很难成为药物候选化合物。最近,一系列非肽类非磷酸化合物类PTP1B抑制剂被报道,它们具有一定的选择性,更重要的是,其中一些化合物对降低ob/ob小鼠血浆中葡萄糖和胰岛素水平有显著作用。这是第一例药理学的直接证据,证明PTP 1B抑制剂具有抗糖尿病活性(Malamas,MS,et al.J.Med.Chem.2000,43,1293)。这些无疑为我们寻找新的小分子非肽类有机化合物作为高效、高选择性PTP1B抑制剂提供了机遇。
与人工合成的小分子化合物相比,天然产物在成药性方面具有先天的优越性,因此从天然产物、特别是从高安全性天然产物的有效成分入手,寻找新颖的母核结构并进行构效关系研究,是发现成药性好、安全性高的PTP1B抑制剂的重要途径。山楂酸(maslinic acid,MA)是一种五环三萜酸,主要存在于油橄榄、蛇麻草、水杨梅、薄荷、丁香、红枣、山楂、石榴和鼠尾草等天然植物中。近年来的研究表明山楂酸具有诸多药理作用,如抗癌、抗氧化、抗艾滋病、抗菌、抗炎、抗I I型糖尿病等。中国药科大学孙宏斌等报道了山楂酸对KK-Ay小鼠有明确的降血糖效果(Sun H,et al.Biol.Pharm.Bull.2007,30(11),2975)。
发明内容
通过对PTP1B抑制活性筛选,发现五环三萜类化合物山楂酸具有较好的PTP1B抑制活性(IC50=4.28μM)。因此以山楂酸作为先导化合物,在其C2-、C3-位并入各种杂环,可合成了一类具有显著PTP1B抑制活性的山楂酸衍生物。
本发明的目的在于推出一类山楂酸衍生物,其特征在于,具有以下的结构通式所示的结构:
本发明的另一目的在于提供该类衍生物的制备方法。为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案。以天然产物齐墩果酸为原料,先经氧化得到相应的3-羰基衍生物,再在C2-位卤代或甲酰化或成烯胺,最后通过系列缩合反应得到相应的C2-,C3-位并杂环的山楂酸衍生物。
现详细说明本发明的技术方案,一种制备一类山楂酸衍生物的方法,其特征在于,具体操作步骤:
第一步制备3-羰基衍生物
将8.3g的齐墩果酸溶于60mL二氯甲烷中,加入7.9g的PCC,室温下搅拌12小时,反应液用硅藻土过滤,滤饼用二氯甲烷洗涤,母液浓缩后溶于100mL乙酸乙酯,饱和亚硫酸氢钠水溶液洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,浓缩,得1.0g的3-羰基衍生物,产率90%,3-羰基衍生物具有以下所示的结构式:
第二步确定目标产物的结构通式中X、Y和R的确切结构确定目标产物的结构通式中X、Y和R的确切结构时,会遇到以下四种情况:1)X=S,Y=C和R=NH2,2)X=CH,Y=N和 3)X=CH=N,Y=C和R=H、CH3、NH2、NHCH3,4)X=CH=N,Y=C和R=OH、SH、SCH3,如遇到情况1),进入第二-1步,如遇到情况2),进入第二-2步,如遇到情况3),进入第二-3步,如遇到情况4),进入第二-4步;
第二-1步:
0.83g的3-羰基衍生物溶于10mL二氯甲烷和10mL冰醋酸混合溶剂中,冰浴下分批加入0.59g的三溴吡啶嗡盐,2小时加完,冰浴下搅拌30分钟,室温下搅拌1小时,加入50mL水,二氯甲烷萃取,分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得2-溴代衍生物,产率82%,将0.30g的2-溴代衍生物和0.06g的硫脲溶于15mL无水乙醇中,回流反应12小时,反应液浓缩,加入50mL水,乙酸乙酯萃取,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,得WB-511粗产物,二氯甲烷萃取,得产物WB-511,产率63%,2-溴代衍生物具有以下所示的结构式:
WB-511具有以下所示的结构式:
第二-2步:
1.0g的3-羰基衍生物溶解于30mL苯中,氮气保护下加入0.75mL甲酸乙酯、0.47g的甲醇钠,室温下反应5小时,反应液浓缩,加入30mL水,乙酸乙酯萃取,食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得2-甲酰化衍生物,产率94%,将0.2g的2-甲酰化衍生物、0.28g的盐酸羟胺、0.38mL水溶解于10mL乙醇中,氮气保护下回流1小时,加入50mL水,乙酸乙酯萃取,食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并吡唑衍生物,产率85%,将0.1g的C2-,C3-并吡唑衍生物、0.11g的烟酰氯或异烟酰氯、2mL吡啶、20mL DMF室温下搅拌3小时,浓缩,加50mL水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得ZH-583-1或ZH-583-2,产率43%-77%,2-甲酰化衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并吡唑衍生物具有以下所示的结构式:
ZH-583-1具有以下所示的结构式:
ZH-583-2具有以下所示的结构式:
第二-3步:
在装有分水器的三口瓶中加入1.5g的3-羰基衍生物(1)、4.25mL的DMFDMA、30mL甲苯、0.08mL三乙胺,缓慢升温至120℃,从分水器蒸出15mL甲苯,补加15mL甲苯,重复上述操作3-4次,旋蒸除去溶剂,得2-烯胺衍生物(5),将0.15g的乙醇钠、1.10-0.11g的醋酸甲脒或盐酸乙脒或盐酸胍溶于10mL乙醇中,氮气保护和室温下搅拌30分钟,将0.57g的2-烯胺衍生物(5)溶于5mL乙醇中,加入到上述反应体系中,回流3小时,反应液浓缩,加入20ml水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并嘧啶衍生物或C2-,C3-并甲基嘧啶衍生物或C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物,产率72%-74%,
将0.41-0.42g的C2-,C3-并嘧啶衍生物或C2-,C3-并甲基嘧啶衍生物或C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物、2.15g的LiI溶于40mL DMF中,回流48小时,降至室温,加入150mL冰水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得白色固体WB-491-B或WB-505或WB-520,产率72%-80%,
将0.42g的C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物、2.15g的LiI溶于40mLDMF中,加入0.21g正辛胺,回流48小时,降至室温,加入150mL冰水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得白色固体WB-506,产率78%,
C2-,C3-并嘧啶衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并甲基嘧啶衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物具有以下所示的结构式:
WB-491-B具有以下所示的结构式:
WB-505具有以下所示的结构式:
WB-520具有以下所示的结构式:
WB-506具有以下所示的结构式:
进入第三步;
第二-4步:
将20g的3-羰基衍生物、12g的K2CO3、3.33mL CH3I溶于200mLDMF中,室温搅拌3小时。加400mL水稀释,乙酸乙酯萃取,合并有机相,分别用1M的稀盐酸和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,硅胶柱层析纯化,得28-甲酯化衍生物,产率92%。
将4.0g的28-甲酯化衍生物溶于100mL苯中,氮气保护下加入2.9mL甲酸乙酯、1.84g的甲醇钠,室温搅拌6小时。反应液浓缩,加入30ml水,乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,得2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物,产率98%。
将0.3g的2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物、0.07-0.09g的脲或硫脲、0.3g的TsOH溶于10mL甲苯和10mL DMF混合溶剂中,回流反应20小时。体系中加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并羟基取代嘧啶杂环衍生物或C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物,产率55%-72%。
将0.10g的C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物、0.5g无水LiI溶于10mL无水DMF中,回流48小时。加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得WB-537,产率68%。
将0.10g的C2-,C3-并羟基取代嘧啶杂环衍生物或C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物、0.5g无水LiI溶于10mL无水DMF中,加入0.05g正辛胺,回流48小时。加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得WB-507或WB-523,产率76%-78%,
28-甲酯化衍生物具有以下所示的结构式:
2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并羟基取代嘧啶杂环衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物具有以下所示的结构式:
WB-537具有以下所示的结构式:
WB-507具有以下所示的结构式:
WB-523具有以下所示的结构式:
第三步:结束。
本发明的优点在于通过在天然产物山楂酸的C2-、C3-位引入系列并杂环,高效合成了系列新型的山楂酸衍生物,合成方法简便,且通过该部位的结构改造,明显增强了该类化合物的PTP1B抑制活性。
附图说明
图1是测试化合物ZH-583-1对CHO/IR细胞内胰岛素受体IR及其下游蛋白Akt中酪氨酸磷酸化水平的影响。
具体实施方式
实施例一~十均按照发明内容所述制备方法的步骤进行操作,每个实施例仅罗列关键技术。
实施例一:WB-511的制备
第二步中,目标产物WB-511属于情况1);第二-1步中,0.83g 3-羰基衍生物溶于10mL二氯甲烷和10mL冰醋酸混合溶剂中,冰浴冷却下分批加入0.59g三溴吡啶嗡盐,约2小时加完,冰浴下搅拌30分钟,然后室温搅拌1小时。加入50mL水,用二氯甲烷萃取,分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得2-溴代衍生物,产率82%。将0.30g 2-溴代衍生物、0.06g硫脲溶于15mL无水乙醇中,回流反应12小时。反应液浓缩,加入50mL水,用乙酸乙酯萃取,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,得WB-511粗产物,经二氯甲烷处理得产物WB-511,产率63%。WB-511的1H NMR(CD3OD-d4):δ12.02(1H,br s),7.84(2H,br s),5.20(1H,s),2.75(1H,m),1.16(3H,s),1.10(3H,s),1.06(3H,s),0.86(9H,s),0.76(3H,s).
实施例二:ZH-583-1的制备
第二步中,目标产物ZH583-1属于情况2);第二-2步中,1.0g 3-羰基衍生物溶解于30mL苯中,氮气保护下加入0.75mL甲酸乙酯、0.47g甲醇钠,室温反应5小时,反应液浓缩,加入30mL水,乙酸乙酯萃取,用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得2-甲酰化衍生物,产率94%。将0.2g 2-甲酰化衍生物、0.28g盐酸羟胺、0.38mL水溶解于10mL乙醇中,氮气保护下回流1小时。加入50mL水,用乙酸乙酯萃取,用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化得C2-,C3-并吡唑衍生物,产率85%。将0.1g C2-,C3-并吡唑衍生物、0.11g烟酰氯、2mL吡啶、20mL DMF室温搅拌3小时。浓缩,加50mL水,用乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得ZH-583-1,产率77%。ZH-583-1的1H NMR(CDCl3-d):δ9.38(1H,s),8.78(1H,d),8.49(1H,d,),8.03(1H,s),7.45(1H,dd),5.35(1H,s),2.88(1H,m),2.72(1H,d),2.06(1H,d),1.31(3H,s),1.23(3H,s),1.18(3H,s),0.95(3H,s),0.92(3H,s),0.86(3H,s),0.84(3H,s).
实施例三:ZH-583-2的制备
采用类似实施例二的方法,不同之处在于以异烟酰氯替代烟酰氯,得到化合物ZH-583-2。ZH-583-2的1H NMR(CDCl3-d):δ8.73(2H,d),7.93(3H,m),5.29(1H,s),2.83(1H,m),2.65(1H,d),1.21(3H,s),1.17(3H,s),0.94(3H,s),0.91(3H,s),0.87(3H,s),0.85(3H,s),0.84(3H,s).
实施例四:WB-491-B的制备
第二步中,目标产物WB-491-B属于情况3);第二-3步中,在装有分水器的三口瓶中加入1.5g 3-羰基衍生物、4.25mL的DMFDMA、30mL甲苯、0.08mL三乙胺,缓慢升温至120℃,从分水器蒸出15mL甲苯,然后再补加15mL甲苯,重复上述操作3-4次。反应结束后,旋蒸除去溶剂,得2-烯胺衍生物。将0.15g乙醇钠、0.11g醋酸甲脒溶于10mL乙醇中,氮气保护下室温搅拌30分钟,将0.57g 2-烯胺衍生物溶于5mL乙醇中,加入到上述反应体系中,回流3小时。反应液浓缩,加入20ml水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并嘧啶衍生物,产率78%。
将0.41g C2-,C3-并嘧啶衍生物、2.15g LiI溶于40mL DMF中,回流48小时。降至室温,加入150mL冰水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得白色固体WB-491-B,收率78%。WB-491-B的1H NMR(CDCl3-d):δ9.03(1H,s),8.33(1H,s),5.37(1H,s),2.88(1H,m),2.69(1H,d),2.31(1H,d),1.31(3H,s),1.25(3H,s),1.18(3H,s),0.94(3H,s),0.91(3H,s),0.85(6H,s).
实施例五:WB-505的制备
采用类似于实施例四的方法,不同之处在于以盐酸乙脒替代醋酸甲脒,得衍生物WB-505,收率80%。WB-505的1H NMR(CDCl3-d):δ8.21(1H,s),5.36(1H,s),2.88(1H,m),2.66(3H,s),2.64(1H,d),2.24(1H,d),1.28(3H,s),1.22(3H,s),1.17(3H,s),0.95(3H,s),0.91(3H,s),0.85(3H,s),0.83(3H,s).
实施例六:WB-520的制备
采用类似于实施例四的方法,不同之处在于以盐酸胍替代醋酸甲脒,得衍生物WB-520,收率72%。WB-520的1H NMR(CDCl3-d):δ7.89(1H,s),7.35(1H,s,NH),5.36(1H,s),3.64(3H,s),2.90(1H,m),2.53(1H,d),2.14(1H,d),1.19(3H,s),1.04(3H,s),1.01(3H,s),0.94(3H,s),0.91(3H,s),0.80(3H,s),0.65(3H,s).
实施例七:WB-506的制备
采用实施例六的方法,不同之处在于最后C-28酯水解反应中加入正辛胺,得白色固体WB-506,产率78%。WB-506的1H NMR(CDCl3-d):δ7.90(1H,s),5.35(1H,s),2.89(1H,m),2.54(1H,d),2.14(1H,d),1.25(3H,s),1.21(3H,s),1.17(3H,s),0.98(3H,s),0.95(3H,s),0.84(3H,s),0.82(3H,s).
实施例八:WB-537的制备
第二步中,目标产物WB-537属于情况4);第二-4步中,将20g 3-羰基衍生物、12g K2CO3、3.33mL CH3I溶于200mL DMF中,室温搅拌3小时。加400mL水稀释,乙酸乙酯萃取,合并有机相,分别用1M的稀盐酸和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,硅胶柱层析纯化,得28-甲酯化衍生物,产率92%。
将4.0g 28-甲酯化衍生物溶于100mL苯中,氮气保护下加入2.9mL甲酸乙酯、1.84g甲醇钠,室温搅拌6小时。反应液浓缩,加入30ml水,乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,得2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物,产率98%。
将0.3g 2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物、0.09g硫脲、0.3g TsOH溶于10mL甲苯和10mL DMF混合溶剂中,回流反应20小时。体系中加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物,产率55%。
将0.10g C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物、0.5g LiI(3.85mmol)溶于10mL DMF中,回流48小时。加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得白色固体WB-537,产率68%。
实施例九:WB-523的制备
采用实施例八的方法,不同之处在于最后C-28酯水解反应中加入正辛胺,得衍生物WB-523,收率76%。
实施例十:WB-507的制备
采用类似于用实施例八和九的方法,不同之处在于以脲替代硫脲,得衍生物WB-507,收率78%。WB-507的1H NMR(CDCl3-d):δ7.23(1H,d),6.10(1H s,OH),5.33(1H,s),2.86(1H,m),1.16(3H,s),1.10(3H,s),1.03(3H,s),0.97(3H,s),0.94(3H,s),0.84(3H,s),0.81(3H,s).
实施例十一:五环三萜类衍生物的PTP1B抑制活性测试
1.测试原理:利用分子生物学手段在大肠杆菌***表达hPTP 1B催化结构域,经纯化后的hPTP1B重组蛋白能水解底物pNPP的磷脂键,得到的产物在410nm处有很强的光吸收,因此可以通过直接检测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。标准的测活体系如下:50mM Mops,PH 7.0,1mM EDTA,2mM DTT,2mM PNPP,2%DMSO,40nM hPTP1B。
2.观察指标:动态测定波长为410nm处的光吸收,时间为3min,其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。
3.样品测试:1、将1mg样品溶于200μL DMSO中。取20μL加入到96孔聚丙烯板的A2-H11样品孔中,然后加80μL DMSO,作为母板。2、用Biomek 2000自动加样***取2μL样品加入到96孔聚苯乙烯板的对应样品孔中,作为筛选用的子板。3、A1-D1、E12-H12中加入2μL DMSO作为百分之百酶活性对照。4、A12-D12、E1-H1中加入2μL不同浓度的阳性对照物(由10μL/m L两倍稀释的四个浓度)。5、A1-H12分别加入88μL Assay mix。6、A1-H12分别加入10μL hPTP1B。7、在SpectraMAX 340上测量410nm处光吸收,时间为3min。8、将数据输出为文本文件,然后以Excel方式打开,以A1-D1、E12-H12的Vmax值平均作为100%酶活力。化合物对PTP1B的抑制率通过以下公式求得:
抑制率(%)=(1-各筛选孔Vmax值/空白对照Vmax平均值)×100%
4.测试结果:筛选结果是当化合物的浓度为20μg/mL时对酶活性的百分抑制率,抑制活性高于50%时,按常规筛选得出IC50,阳性对照4-[4-(4-草酰基-苯氧甲基)-苯甲氧基]-苯乙酮酸(4-[4-(4-oxalyl-phenoxymethyl)-benzyloxy]-phenyl-oxo-acetic acid)的IC50为5.4μM[Christopher T.Seto,et al.J.Med.Chem.2002,45,3946.]。
4-[4-(4-草酰基-苯氧甲基)-苯甲氧基]-苯乙酮酸
各测试化合物抑制PTP1B的IC50值见下表:
表一山楂酸衍生物抑制PTP1B的活性数据
实施例12:化合物ZH-583-1对CHO/IR细胞内IR磷酸化水平的影响试验
1.试验原理:胰岛素敏感细胞内胰岛素受体IR的磷酸化水平受到PTK和PTPase的严密调控,PTP1B在这个过程中起着负调控因子的作用。通过检测CHO/IR细胞内IR磷酸化水平变化,可以判断PTP1B抑制剂是否进入细胞以及在细胞内的作用效果。
2.试验方法:1、细胞接种:生长状态良好的细胞以3-4×105细胞/孔的密度接入6孔板,每孔2mL含10%FB S的F12培养基。2、饥饿:培养24h后,2mL无血清F12培养基过夜培养12h。3、给药:去除旧培养基,加入含化合物的无血清F12培养基0.9mL,孵育2-4小时。其中分别以1mM的Na3VO4和0.1%的DMSO做阳性和阴性对照。4、胰岛素刺激:每孔中加入100nM胰岛素100μL,使得终浓度为10nM,作用10分钟。5、收样:弃去培养基,每孔加150μL×1上样缓冲液,裂解细胞,收样。
3.试验结果:本实验检验ZH-583-1对CHO/IR细胞内胰岛素受体磷酸化水平影响,对于被检验化合物ZH-583-1,设有终浓度为0.37、1.1、3.3、10μM四个浓度,溶剂DMSO作为阴性对照(以0代表),钒酸钠作为阳性化合物(以V代表)。如图1所示:IRβ是胰岛素受体β亚基,代表胰岛素受体的本底表达水平;β激动蛋白作为内参,代表总上样量。使用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体PY20检测IR的磷酸化水平,Akt的Ser473可以被PDK 1磷酸化(Akt-p),Akt-p是IR下游蛋白,Akt磷酸化水平高,说明IR磷酸化水平高,胰岛素信号增强,也表明PTP1B抑制剂在细胞水平是有效的。对化合物ZH-583-1的研究表明随着抑制剂浓度的升高,IR及Akt的磷酸化水平呈现明显的升高趋势。由此可见,ZH-583-1在细胞内IR的去磷酸化过程中起抑制作用,可以增强细胞对胰岛素的敏感性,预示着该类化合物具有增强胰岛素的作用,能够在一定程度上缓解胰岛素抵抗。
结论:山楂酸衍生物可以作为胰岛素增敏剂,在预防、延缓或治疗由PTP1B介导的疾病,特别是II型糖尿病和肥胖症及由此引起的并发症的药物中的用途。
Claims (5)
2、权利要求1所述的山楂酸衍生物的制备方法,其特征在于,具体操作步骤:
第一步制备3-羰基衍生物
将8.3g的齐墩果酸溶于60mL二氯甲烷中,加入7.9g的PCC,室温下搅拌12小时,反应液用硅藻上过滤,滤饼用二氯甲烷洗涤,母液浓缩后溶于100mL乙酸乙酯,饱和亚硫酸氢钠水溶液洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,浓缩,得1.0g的3-羰基衍生物,产率90%,3-羰基衍生物具有以下所示的结构式:
第二步确定目标产物的结构通式中X、Y和R的确切结构确定目标产物的结构通式中X、Y和R的确切结构时,会遇到以下四种情况:1)X=S,Y=C和R=NH2,2)X=CH,Y=N和 3)X=CH=N,Y=C和R=H、CH3、NH2、NHCH3,4)X=CH=N,Y=C和R=OH、SH、SCH3,如遇到情况1),进入第二-1步,如遇到情况2),进入第二-2步,如遇到情况3),进入第二-3步,如遇到情况4),进入第二-4步;
第二-1步:
0.83g的3-羰基衍生物溶于10mL二氯甲烷和10mL冰醋酸混合溶剂中,冰浴下分批加入0.59g的三溴吡啶嗡盐,2小时加完,冰浴下搅拌30分钟,室温下搅拌1小时,加入50mL水,二氯甲烷萃取,分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得2-溴代衍生物,产率82%,将0.30g的2-溴代衍生物和0.06g的硫脲溶于15mL无水乙醇中,回流反应12小时,反应液浓缩,加入50mL水,乙酸乙酯萃取,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,得WB-511粗产物,二氯甲烷萃取,得产物WB-511,产率63%,2-溴代衍生物具有以下所示的结构式:
WB-511具有以下所示的结构式:
第二-2步:
1.0g的3-羰基衍生物溶解于30mL苯中,氮气保护下加入0.75mL甲酸乙酯、0.47g的甲醇钠,室温下反应5小时,反应液浓缩,加入30mL水,乙酸乙酯萃取,食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得2-甲酰化衍生物,产率94%,将0.2g的2-甲酰化衍生物、0.28g的盐酸羟胺、0.38mL水溶解于10mL乙醇中,氮气保护下回流1小时,加入50mL水,乙酸乙酯萃取,食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并吡唑衍生物,产率85%,将0.1份重量的C2-,C3-并吡唑衍生物、0.11g的烟酰氯或异烟酰氯、2mL吡啶、20mL DMF室温下搅拌3小时,浓缩,加50mL水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩得ZH-583-1或ZH-583-2,产率43%-77%,2-甲酰化衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并吡唑衍生物具有以下所示的结构式:
ZH-583-1具有以下所示的结构式:
ZH-583-2具有以下所示的结构式:
第二-3步:
在装有分水器的三口瓶中加入1.5g的3-羰基衍生物(1)、4.25mL的DMFDMA、30mL甲苯、0.08mL三乙胺,缓慢升温至120℃,从分水器蒸出15mL甲苯,补加15m L甲苯,重复上述操作3-4次,旋蒸除去溶剂,得2-烯胺衍生物(5),将0.15g的乙醇钠、1.10-0.11g的醋酸甲脒或盐酸乙脒或盐酸胍溶于10mL乙醇中,氮气保护和室温下搅拌30分钟,将0.57g的2-烯胺衍生物(5)溶于5mL乙醇中,加入到上述反应体系中,回流3小时,反应液浓缩,加入20ml水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并嘧啶衍生物或C2-,C3-并甲基嘧啶衍生物或C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物,产率72%-74%,
将0.41-0.42g的C2-,C3-并嘧啶衍生物或C2-,C3-并甲基嘧啶衍生物或C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物、2.15g的LiI溶于40mL DMF中,回流48小时,降至室温,加入150mL冰水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得白色固体WB-491-B或WB-505或WB-520,产率72%-80%,
将0.42g的C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物、2.15g的LiI溶于40mLDMF中,加入0.21g正辛胺,回流48小时,降至室温,加入150mL冰水,乙酸乙酯萃取,有机相用食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得白色固体WB-506,产率78%,
C2-,C3-并嘧啶衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并甲基嘧啶衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并氨基嘧啶衍生物具有以下所示的结构式:
WB-491-B具有以下所示的结构式:
WB-505具有以下所示的结构式:
WB-520具有以下所示的结构式:
WB-506具有以下所示的结构式:
进入第三步;
第二-4步:
将20g的3-羰基衍生物、12g的K2CO3、3.33mL CH3I溶于200mLDMF中,室温搅拌3小时。加400mL水稀释,乙酸乙酯萃取,合并有机相,分别用1M的稀盐酸和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,硅胶柱层析纯化,得28-甲酯化衍生物,产率92%。
将4.0g的28-甲酯化衍生物溶于100mL苯中,氮气保护下加入2.9mL甲酸乙酯、1.84g的甲醇钠,室温搅拌6小时。反应液浓缩,加入30ml水,乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,得2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物,产率98%。
将0.3g的2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物、0.07-0.09g的脲或硫脲、0.3g的TsOH溶于10mL甲苯和10mL DMF混合溶剂中,回流反应20小时。体系中加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得C2-,C3-并羟基取代嘧啶杂环衍生物或C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物,产率55%-72%。
将0.10g的C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物、0.5g无水LiI溶于10mL无水DMF中,回流48小时。加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得WB-537,产率68%。
将0.10g的C2-,C3-并羟基取代嘧啶杂环衍生物或C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物、0.5g无水LiI溶于10mL无水DMF中,加入0.05g正辛胺,回流48小时。加入50mL冰水,用乙酸乙酯萃取,合并有机相,饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,浓缩,硅胶柱层析纯化,得WB-507或WB-523,产率76%-78%,
28-甲酯化衍生物具有以下所示的结构式:
2-甲酰基-28羧酸甲酯衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并羟基取代嘧啶杂环衍生物具有以下所示的结构式:
C2-,C3-并巯基取代嘧啶杂环衍生物具有以下所示的结构式:
WB-537具有以下所示的结构式:
WB-507具有以下所示的结构式:
WB-523具有以下所示的结构式:
第三步:结束。
3、权利要求1所述的山楂酸衍生物的用途,其特征在于,作为胰岛素增敏剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910055852XA CN101619088B (zh) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | 山楂酸衍生物及其制备和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910055852XA CN101619088B (zh) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | 山楂酸衍生物及其制备和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101619088A true CN101619088A (zh) | 2010-01-06 |
CN101619088B CN101619088B (zh) | 2012-07-04 |
Family
ID=41512507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200910055852XA Expired - Fee Related CN101619088B (zh) | 2009-08-04 | 2009-08-04 | 山楂酸衍生物及其制备和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101619088B (zh) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101974064A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-02-16 | 南京师范大学 | 一种合成山楂酸的方法 |
CN102161690A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-08-24 | 华东师范大学 | 用于制备抗骨质疏松药的桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102167720A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-08-31 | 华东师范大学 | 抑制破骨细胞分化的桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102180941A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-09-14 | 华东师范大学 | 桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102286057A (zh) * | 2011-07-07 | 2011-12-21 | 北华大学 | 齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医疗用途 |
EP2712863A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-02 | Sequoia Sciences, Inc. | Novel inhibitors of bacterial biofilms and related methods |
CN103880854A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 中国科学院上海药物研究所 | 木果楝碱甲素、其制备方法和其用途 |
CN103923155A (zh) * | 2013-01-16 | 2014-07-16 | 上海永颐生物科技有限公司 | 一种山楂酸的制备方法 |
CN104086616A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-10-08 | 上海永颐生物科技有限公司 | 一种科罗索酸的制备方法 |
CN108794564A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-11-13 | 烟台大学 | 常春藤皂苷元a环并吡嗪衍生物及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050267055A1 (en) * | 2003-12-26 | 2005-12-01 | Use-Techno Corporation | Agent for improvement of glucose tolerance |
WO2006054370A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Use-Techno Corporation | Gluconeogenesis inhibiting agent |
CN1682740A (zh) * | 2005-03-11 | 2005-10-19 | 中国药科大学 | 五环三萜类化合物在制备糖原磷酸化酶抑制剂中的应用 |
ES2282027B1 (es) * | 2005-09-20 | 2008-10-01 | Universidad De Granada | Utilizacion de acido maslinico como antiparasitario frente a protozoos del phyllum apicomplexa. |
-
2009
- 2009-08-04 CN CN200910055852XA patent/CN101619088B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101974064A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-02-16 | 南京师范大学 | 一种合成山楂酸的方法 |
CN101974064B (zh) * | 2010-11-19 | 2013-06-19 | 南京师范大学 | 一种合成山楂酸的方法 |
CN102180941B (zh) * | 2011-03-11 | 2012-11-14 | 华东师范大学 | 桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102180941A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-09-14 | 华东师范大学 | 桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102167720B (zh) * | 2011-03-11 | 2012-11-14 | 华东师范大学 | 抑制破骨细胞分化的桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102167720A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-08-31 | 华东师范大学 | 抑制破骨细胞分化的桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102161690A (zh) * | 2011-03-11 | 2011-08-24 | 华东师范大学 | 用于制备抗骨质疏松药的桦木酮酸衍生物及其制备和应用 |
CN102286057A (zh) * | 2011-07-07 | 2011-12-21 | 北华大学 | 齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医疗用途 |
EP2712863A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-02 | Sequoia Sciences, Inc. | Novel inhibitors of bacterial biofilms and related methods |
CN103880854A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 中国科学院上海药物研究所 | 木果楝碱甲素、其制备方法和其用途 |
CN103923155A (zh) * | 2013-01-16 | 2014-07-16 | 上海永颐生物科技有限公司 | 一种山楂酸的制备方法 |
CN103923155B (zh) * | 2013-01-16 | 2015-11-18 | 上海永颐生物科技有限公司 | 一种山楂酸的制备方法 |
CN104086616A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-10-08 | 上海永颐生物科技有限公司 | 一种科罗索酸的制备方法 |
CN108794564A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-11-13 | 烟台大学 | 常春藤皂苷元a环并吡嗪衍生物及其制备方法和用途 |
CN108794564B (zh) * | 2018-08-03 | 2021-01-19 | 烟台大学 | 常春藤皂苷元a环并吡嗪衍生物及其制备方法和用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101619088B (zh) | 2012-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101619088B (zh) | 山楂酸衍生物及其制备和应用 | |
Chen et al. | Anti-hyperuricemic and nephroprotective effects of Smilax china L. | |
Tang et al. | Anti-diabetic effect of three new norditerpenoid alkaloids in vitro and potential mechanism via PI3K/Akt signaling pathway | |
Lee et al. | Dehydrodiconiferyl alcohol isolated from Cucurbita moschata shows anti-adipogenic and anti-lipogenic effects in 3T3-L1 cells and primary mouse embryonic fibroblasts | |
Deshpande et al. | CD38 in the pathogenesis of allergic airway disease: Potential therapeutic targets | |
CN101260086A (zh) | 蛋白酪氨酸磷酸酯酶1b抑制剂及其制备方法和用途 | |
JP2008531604A (ja) | 選択的なグリコシダーゼインヒビター、インヒビターを作製する方法、およびインヒビターの使用 | |
CN102648284B (zh) | 多酚衍生物及其制造方法 | |
CN108218852A (zh) | 一种螺环化合物、其制备方法、组合物及用途 | |
Kumar et al. | Tandem mass spectrometry-based multiplex assays for α-mannosidosis and fucosidosis | |
CN105982881A (zh) | 一种补骨脂查尔酮及其类似物的用途 | |
CN107531745B (zh) | 一种新的18α-甘草次酸衍生物及其医药用途 | |
Fan et al. | Ameliorative effects of mangiferin derivative TPX on insulin resistance via PI3K/AKT and AMPK signaling pathways in human HepG2 and HL-7702 hepatocytes | |
CN105311011A (zh) | 苯并吡喃衍生物在制备治疗高尿酸血症药物中的新用途 | |
CN1315865C (zh) | 一种枇杷叶总三萜酸及其制备方法和用途 | |
EP1645557A1 (en) | Novel substance having alpha-glucosidase inhibiting activity and food containing the same | |
CN102219822B (zh) | 灵芝酸t酰胺衍生物tlto-a及其合成及应用 | |
CN101792440B (zh) | 喹唑啉酮衍生物及其制备和应用 | |
Mojbafan et al. | Liver alpha-amylase gene expression as an early obesity biomarker | |
EP4190776A1 (en) | Salt and crystal form of ketohexokinase inhibitor and use thereof | |
CN102686233A (zh) | 一种使用麦麸提取物或由其分离得到的活性成分治疗过敏性疾病的组合物 | |
Tian et al. | “Domain Directional Optimization” strategy for the development of UGT1A1-activated fluorescent probe and the application in living systems | |
JP2021508319A (ja) | Akt阻害剤としての塩形態及びその結晶形態 | |
CN104592986B (zh) | 一种葡萄糖醛酸转移酶ugt1a1的特异性荧光探针及其应用 | |
Li et al. | Baicalin− 2-ethoxyethyl ester alleviates renal fibrosis by inhibiting PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120704 Termination date: 20130804 |