CN101614712A - 一种依替米星的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对依替米星及其相关物质的检测方法。本发明采用高效液相色谱法，色谱条件为：聚苯乙烯－二乙烯基苯高聚物色谱柱：MKF－RP－ETI，(粒径4～10μm，柱规格(100～300)×(8.0～4.6)mm(I.D.))，流动相组成体积比为0.10～0.50mol/l的醋酸盐缓冲液(pH＝4～7)和乙腈的体积比为90～100∶10～0，流速：0.8～1.2ml/min，检测器：示差折光检测器；进样量：10～20μl；本发明使用常规HPLC仪及示差折光检测器即可完成对依替米星及其相关物质的在线检测，方法简单，快速，准确。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱(HPLC)检测方法，具体涉及一种以聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱介质为分离载体的对依替米星及其有关物质进行含量测定的分析方法。
(二)背景技术
硫酸依替米星(etimicin)为国家一类新药，是我国科技人员研究开发的具有自主知识产权的新一代半合成氨基糖苷类抗生素。作为一种新药，其质量控制和安全评价尤为重要。目前，关于依替米星含量测定的方法主要有微生物法，旋光法，HPLC法。其中微生物法操作繁琐，误差大，在2005版中国药典依替米星含量测定中该法已被淘汰；而旋光法则精确性差，重复性低；相对而言，HPLC法灵敏度高，精确性好，但依替米星只具有紫外末端吸收，难以用紫外检测器直接进行测定，通常要对样品进行柱前衍生化处理，或换用其他通用型检测器，如蒸发光散射检测器(ELSD)等[参见：王明娟，胡昌勤，金少鸿，中华临床医学杂志，2004，5(6)：4～6；国家药典委员会，中华人民共和国药典，2005年版，北京：化学工业出版社，2005，730]。其中柱前衍生化试剂法操作繁琐、费时，影响因素较多，而且反应过程中可能会产生一些副产物，干扰其有关物质检查或纯度分析[参见：张玫，袁耀佐，范青峰，实验与研究，2004，28(7)：314～316]；2005版中国药典采用蒸发光散射法，其专属性好、灵敏度高、满足药品的检测要求，但所用ELSD检测器，对于依替米星的纯化过程中的在线检测而言，成本较高且操作繁琐，及纯度虚高。
因此开发一种操作快速简单、分析成本较低的检测方法用于依替米星前期纯化的在线检测，对纯化工艺的开发具有积极意义。
(三)发明内容
本发明的目的是开发研究一种能对依替米星及其有关物质进行快速、准确检测的分析检测方法。
本发明的技术方案如下，一种依替米星及其有关物质高效液相色谱的快速分析检测方法，其特点在于采用一种多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为固定相的高聚物色谱柱，高效液相色谱操作条件为：
a.高聚物色谱柱：MKF-RP-ETI(南京麦科菲高效分离载体有限公司生产)，4～10μm，(100～300)×(8.0～4.6)mm(I.D.)；
b.流动相：0.10～0.50mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝4～7)和乙腈的体积比为90～100∶10～0；
c.流速：0.8～1.2mL/min，进样量：10～20μL，柱温：室温；
d.采用示差检测器检测。
与现有技术相比，本发明的优点和效果如下：
1、选用高聚物色谱柱(MKF-RP-ETI)及常规的醋酸盐缓冲液(pH＝6.0)，乙腈比例为10～0％的范围内，依替米星以及其有关物质达到了有效的分离，该流动相的pH信以及有机相比例均在所用的MKF-RP-ETI柱的适用范围内。
2、本法与《中国药典》25版所述方法相比，所用色谱柱具有更好的酸碱耐受性，更适合在此流动相中长期使用，因而具有较好的耐用性。
3、本发明操作简单，分析成本低，为国产新药依替米星纯化过程的在线检测提供技术支持。
(四)具体实施方案
实验器材及试剂：
(1)实验仪器：
Summit高效液相色谱仪(戴安公司)，由P680HPLC泵、Shodex示差折光检测器、8125型进样装置组成；工作站(美国戴安Chromeleon***)。
(2)实验试剂：
硫酸依替米星发酵液(厂家提供)；硫酸依替米星纯品(中国药品生物制品检定所)；乙腈(美国Merck公司)；醋酸，醋酸铵(均为国产分析纯)。高效液相去离子水(自制)。
(3)色谱条件：
色谱柱：填料为高度交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS-DVB)微球，粒径4～10μm，(南京麦科菲高效分离载体有限公司，型号：MKF-RP-ETI，(100～300)×(8.0～4.6)mm(I.D.))。流动相：0.10～0.50mol/L的醋酸盐缓冲液-乙腈，流速：0.8～1.2mL/min，进样量：10～20μL，柱温：25℃。
(4)样品配制：
供试品溶液的配制：移液管精密量取硫酸依替米星发酵液2mL，置于10mL容量瓶中以流动相定容至刻度，形成稀释5倍的发酵液。
对照品溶液的配制：精确称量硫酸依替米星纯品0.6g置于10mL容量瓶中以流动相定容至刻度，制得60mg/ml的对照品溶液。
实施例1
色谱条件：检测机器：戴安Summit型高效液相色谱***；色谱柱：MKF-RP-ETI(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.10mol·L-1的醋酸盐缓冲液(pH＝4.0)-乙腈(90∶10)；流速：1mL/min；进样量：20μL；进样物质：供试品溶液与对照品溶液。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例2
色谱条件：检测仪器、色谱柱、进样量、进样物质同实施例1，流动相：0.20mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)-乙腈(95∶5)；流速：0.8mL/min。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例3
色谱条件：检测仪器、色谱柱、进样量、进样物质同实施例1，流动相：0.22mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝6.5)-乙腈(100∶0)；流速：0.9mL/min。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例4
色谱条件：检测仪器、流速、进样物质同实施例1，色谱柱：MKF-RP-ETI(200mm×7.8mm，5μm)，进样量：10μL；流动相：0.10mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝4.0)-乙腈(90∶10)。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例5
色谱条件：检测仪器、进样量、进样物质同实施例1，色谱柱：MKF-RP-ETI(200mm×7.8mm，10μm)，流动相：0.30mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)-乙腈(95∶5)，流速：0.9ml/min。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例6
色谱条件：检测仪器、流速、进样量、进样物质同实施例1，色谱柱：MKF-RP-ETI(250mm×4.6mm，6μm)，流动相：0.50mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝5.5)-乙腈(90∶10)。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例7
色谱条件：检测仪器、流速、进样量、进样物质同实施例1，色谱柱：MKF-RP-ETI(300mm×7.8mm，8μm)，流动相：0.32mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝6.5)-乙腈(90∶10)。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例8
色谱条件：检测仪器、进样量、进样物质同实施例1，色谱柱：MKF-RP-ETI(250mm×4.6mm，4μm)，流动相：0.10mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝4)-乙腈(95∶5)，流速：1.1ml/min。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
实施例9
色谱条件：检测仪器、进样量、进样物质同实施例1，色谱柱：MKF-RP-ETI(100mm×7.8mm，6μm)，流动相：0.40mol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)-乙腈(90∶10)，流速：1.2ml/min。结果：依替米星及其有关物质均达到了基线分离。
Claims (8)
1、一种高效液相色谱法测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于选用聚苯乙烯型-高聚物色谱柱，以醋酸盐缓冲液与乙腈为流动相，分离分析依替米星及其有关物质。
2、根据权利要求1所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，所述高聚物色谱柱为以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质。
3、根据权利要求1和2所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，所述高聚物色谱柱为MKF-RP型色谱柱。
4、根据权利要求1、2和3所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，所述高聚物色谱柱规格为(100～300)×(8.0～4.6)mm(I.D.)或250×4.6mm(I.D.)，粒径4～10μm，。
5、根据权利要求1所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，流动相中醋酸盐缓冲液的含量为0.10～0.50mol·L-1，pH为4～7。
6、根据权利要求1所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，流动相中醋酸盐缓冲液与乙腈的体积比为90～100∶10～0。
7、根据权利要求1所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，选用流速为：0.8～1.2mL/min；
8、根据权利要求1所述的测定依替米星及其有关物质的方法，其特征在于，采用示差折光检测器。
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Application publication date: 20091230 Assignee: Hainan Aike Pharmaceutical Co.,Ltd. Assignor: Nanjing Tech University Contract record no.: 2012320000994 Denomination of invention: Method for analyzing etimicin Granted publication date: 20120523 License type: Exclusive License Record date: 20121108 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
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