CN101575373B - 一种血红蛋白提取液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血红蛋白提取液的制备方法，依次进行如下操作：将压积红细胞在透析袋中经低渗透压破碎得到红细胞破碎液；用0℃时终饱和度为25%和60%对应量的硫酸铵进行两步沉淀，然后将沉淀蛋白重悬后转入透析袋中透析以去除硫酸铵，最后将透析的蛋白液用缓冲液稀释，并离心去除颗粒物。利用本发明方法制备血红蛋白提取液，血红蛋白回收率大于85%，脂蛋白及磷脂残留量小于2%，易于通过0.45μm滤膜，非常适合于阴离子交换柱层析法大量生产的要求。
Description
技术领域
本发明属于血红蛋白的分离纯化工艺技术领域，具体地说，涉及血红蛋白分离纯化工艺中制备血红蛋白提取液的方法。
背景技术
血红蛋白的分离纯化工艺是携 氧材料研制的重要工艺步骤。已有的以无基质血红蛋白为载体的携氧材料中，除基因工程重组表达的血红蛋白外，大部分血红蛋白都来源于动物，包括牛、猪、人等，要利用这些动物血红蛋白，首先需要一种低成本、易标准化的血红蛋白纯化方法。
现有的血红蛋白纯化方法主要有加热法、超滤法、萃取法、阴离子交换柱层析法等。加热法和萃取法对血红蛋白的空间结构产生的影响不可避免，且萃取法引入的有机溶剂也是一种潜在的危险因素；超滤法虽然便于进行密闭的流水线生产，但超滤膜需要经常更换，成本高昂；阴离子交换柱层析法成本低，对血红蛋白的空间结构没有影响，且不引入有机溶剂，因而是最有前景的血红蛋白纯化方法。
阴离子交换柱层析法对用于上柱的蛋白提取液有以下两个方面的要求：（1）蛋白提取液必须不含大颗粒物，一般要求经0.45μm滤膜过滤；（2）蛋白提取液中的蛋白成分应尽可能少，并尽可能减少与阴离子交换柱层析介质作用强烈的成分的含量。
传统的用于阴离子交换层析的血红蛋白提取液的制备方法，一般包括以下步骤：
（1）将压积红细胞与低渗溶液（通常是水）按照一定体积比混合以制备低渗环境，静置过夜使红细胞破碎；
（2）离心红细胞破碎液，将上清转移到新的离心管；
（3）将上清以0.45μm滤膜过滤，得到血红蛋白提取液；
（4）将血红蛋白提取液置换至阴离子交换层析平衡缓冲液体系。
通过上述传统方法制备血红蛋白提取液，除了红细胞破碎液体积大，不利于后续步骤开展以外，更重要的是存在以下两个方面的问题：
（1）得到的血红蛋白提取液难于通过0.45μm滤膜，因此需要频繁地更换滤膜，更换滤膜的过程提高了提取液中高铁血红蛋白的含量；
（2）得到的血红蛋白提取液中含有较多的磷脂及脂蛋白，以填料能耐受的最大强度的洗脱溶液也不能将其洗脱，必须执行清洁程序。清洁程序需要耗费大量的乙醇或异丙醇，且时间较长，不适宜大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于阴离子交换柱层析法大量生产要求的血红蛋白提取液的制备方法，采用该方法制备的血红蛋白提取液易于通过0.45μm滤膜，脂蛋白及磷脂含量少。
为实现上述目的，本发明所述血红蛋白提取液的制备方法，包括以下步骤，各步骤均在0～10℃的环境温度条件下进行：
（1）将压积红细胞置于透析袋中，用缓冲液经低渗透压破碎，得到红细胞破碎液；
（2）将与0℃时终饱和度为25%对应量的硫酸铵加入红细胞破碎液中，待硫酸铵充分溶解后以4000 G离心；
（3）向步骤（2）离心所得的上清液中加入与0℃时终饱和度为60%对应量的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后以6000G 离心；
（4）将步骤（3）离心所得的蛋白沉淀重悬后转入透析袋中，用缓冲液透析去除硫酸铵；
（5）经过透析的蛋白液用缓冲液按体积比为1:5进行稀释，然后以10000G离心，去除颗粒物。
本发明的步骤（1）中采用透析的方式制造低渗透压环境使红细胞破碎，有效减小了红细胞破碎液的体积，增加了溶液的密度，从而为后续的硫酸铵分级分离创造了条件；并且因为红细胞破碎液体积小，极大的节约了硫酸铵的用量。采用步骤（2）和步骤（3）的两步硫酸铵沉淀操作，制备不同的溶液密度，使得脂蛋白和磷脂在相应密度与离心力条件下与血红蛋白处于离心管中的不同位置，因而使绝大部分的脂蛋白以及部分杂蛋白得以去除。
实践表明，经过本发明方法制备的血红蛋白提取液，与传统的用于阴离子交换层析的血红蛋白提取液制备方法相比，其脂蛋白与磷脂含量残留率小于2%，易于通过0.45μm滤膜；且硫酸铵用量少，纯化成本低，血红蛋白回收率较高，具有很好的应用前景。
附图说明
附图是本发明与传统的用于阴离子交换层析的血红蛋白提取液制备方法相比，制备的血红蛋白提取液的SDS-PAGE分析结果对照图；
图中：M表示蛋白分子量标准；
C表示传统方法制备的血红蛋白提取液；
D表示本发明方法制备的血红蛋白提取液。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
在0～10 ℃的环境温度条件下依次进行以下操作：
（1）将压积红细胞在平均截留分子量为60 kDa的透析袋中经低渗透压破碎得到红细胞破碎液，透析所用缓冲液为经过脱氧处理的Tris-HCl缓冲液，缓冲液的Tris base浓度为 100 mM，pH值为8.0；
（2）将与0℃时终饱和度为25%对应量的硫酸铵加入红细胞破碎液中，待硫酸铵充分溶解后以4000 G离心；
（3）向步骤(2)中离心所得的上清液中加入与0℃时终饱和度为60%对应量的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后以6000G离心；
（4）将步骤（3）所得的沉淀蛋白重悬后转入平均截留分子量为60 kDa的透析袋中透析以除去硫酸铵，透析所用缓冲液为经过脱氧处理的Tris-HCl, NaCl缓冲液，缓冲液的Tris base浓度为55 mM，NaCl浓度为30 mM，缓冲液的pH值为8.5；
（5）经过透析的蛋白液用缓冲液按体积比为1:5的比例进行稀释，然后以10000 G离心去除颗粒物，所用缓冲液是经过脱氧处理的Tris-HCl, NaCl缓冲液，缓冲液的Tris base浓度为55 mM，NaCl浓度为30 mM，缓冲液的pH值为8.5。
本实施例，利用本发明方法制备血红蛋白提取液，血红蛋白回收率为87%，脂蛋白及磷脂残留量为1.5%，易于通过0.45μm滤膜，非常适合于阴离子交换柱层析法大量生产的要求。
说明书附图是本发明方法与传统方法制备的血红蛋白提取液的SDS-PAGE对照分析图。从图中可以看出，采用本发明方法制备的血红蛋白提取液中蛋白成分得到有效的减少，且血红蛋白含量提高。
Claims (4)
1.一种血红蛋白提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，各步骤均在0～10℃的环境温度条件下进行：
（1）将压积红细胞置于透析袋中，用缓冲液经低渗透压破碎，得到红细胞破碎液；
（2）将与0℃时终饱和度为25%对应量的硫酸铵加入红细胞破碎液中，待硫酸铵充分溶解后以4000 G离心；
（3）向步骤（2）离心所得的上清液中加入与0℃时终饱和度为60%对应量的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后以6000G 离心；
（4）将步骤（3）离心所得的蛋白沉淀重悬后转入透析袋中，用缓冲液透析去除硫酸铵；
（5）经过透析的蛋白液用缓冲液按体积比为1:5进行稀释，然后以10000G离心，去除颗粒物。
2.如权利要求1所述的一种血红蛋白提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（4）中所用透析袋的平均截留分子量为60 kDa。
3.如权利要求1所述的一种血红蛋白提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中所用缓冲液为经过脱氧处理的Tris-HCl缓冲液，缓冲液的Tris base浓度为 100 mM，pH值为8.0。
4.如权利要求1所述的一种血红蛋白提取液的制备方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）中所用的缓冲液为经过脱氧处理的Tris-HCl，NaCl缓冲液, 缓冲液中的Tris base浓度为55 mM，NaCl浓度为30 mM，缓冲液的pH值为8.5。
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