CN101571548A - 尿视黄醇结合蛋白胶体金快速检测试纸 - Google Patents
尿视黄醇结合蛋白胶体金快速检测试纸 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种尿视黄醇结合蛋白(RBP)胶体金快速检测试纸及其具体应用。本发明的检测试纸,包括测试条和支撑所述测试条的底板,其中所述测试条至少包括:结合释放垫,其中预包被有胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体;和检测垫,其中包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体的测试线。本发明的RBP检测试纸成本低、易保存,用其测试尿视黄醇结合蛋白快速简便、灵敏度高、准确性好,适合临床和家用并具有产业性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药和免疫检测领域。更具体而言,本发明涉及用于检测尿视黄醇结合蛋白(RBP)的胶体金快速检测试纸。
背景技术
视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Proteins,RBPs)是一类在人体内负责从肝脏转运视黄醇至各靶细胞的运载蛋白,对视黄醇生理功能的发挥起着重要作用。目前已发现七种不同的RBP亚型,主要分布于血液循环***(RBP4,简称RBP)、细胞(RBP1、RBP2、RBP5、RBP6、RBP7,简称CRBPs)和视网膜光感受器间(RBP3,简称IRBP)。
RBP与全反式视黄醇结合[郭晓红,储明星,周忠孝,视黄醇结合蛋白及其基因的分子生物学,遗传,26(2),257-262,2004],主要在肝脏中合成。除了肝脏,在肾脏、大脑、胰腺和心脏等器官中也能合成RBP。不论其最终被转化成视黄酸、视黄醛还是维生素A,视黄醇均以全反式视黄醇的形式与RBP结合[Helen M.Naylor和Marcia E.Newcomer,The structure of human retinol-bindingprotein with its carrier protein transthyretin reveals an interaction with the carboxyterminus of RBP,“人视黄醇结合蛋白与其载体蛋白转甲状腺素蛋白的结构揭示了与RBP的C末端的相互作用”Biochemistry,38,2647-2653,1999]。
肝脏分泌的RBP-视黄醇与转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTR)形成稳定的蛋白复合物在血液***中循环。RBP-视黄醇-TTR复合体的形成有助于防止小分子量的RBP在肾脏中的损失,同时还可能降低RBP4在血液循环中对胞间组织的渗入[Marcia E.Newcomer和David E.Ong,Plasma retinol binding protein:structure and fucntion of the prototypic lipocalin,“血浆视黄醇结合蛋白:prototypic lipocalin的结构和功能”,Biochimica et Biophysica Acta,1482,57-64,2000]。RBP-视黄醇-TTR复合体进入血液***之后,随着血流进入身体各组织,与靶细胞细胞膜上的RBP受体结合。此时,该复合体携带的视黄醇被释放,并转运到细胞内与CRBP结合,随后在辅酶II介导的脱氢酶和细胞视黄醛脱氢酶的作用下转变为视黄酸,从而调控多种基因的表达。RBP-视黄醇-TTR复合体在视黄醇释放后解体,RBP以游离的形式存在于血液***中,游离的RBP在肾近曲小管被重新吸收和分解。因此,正常人尿液内几乎不含RBP,其含量很低。研究表明,人体液中RBP的含量与一些疾病关系密切。当肾小管损伤时,尿液中RBP含量会有不同程度的上调。[杨顺江,视黄醇结合蛋白的测定及其临床意义,国外医学临床生物化学与检验学分册,11(5),16-19,1990]。
正常人尿液中RBP4含量甚微,一般小于0.1mg/24小时尿,但肾小管病人尿液中含量一般大于1mg/24小时尿。因此,尿液中RBP的含量可作为诊断肾小管损伤的指标。利用RBP的特异性和在病人体内的一定浓度,可以通过检测尿RBP蛋白含量来对肾小管疾病病人进行诊断。
目前,临床上用于肾功能损伤早期诊断的尿小分子蛋白有β2微球蛋白和RBP。β2微球蛋白在pH<5.5时很不稳定,易降解,取尿液标本后应立即调pH至中性。而且,β2微球蛋白在尿液中的半衰期较短:pH4.0,4℃放置4小时后有70%的降解,而RBP在相同条件下仅有降解5%。因此,RBP相对于β2微球蛋白在肾功能损伤诊断中更稳定,更可靠。
然而,常规检测技术通常都只用于检测血中RBP,而不用于检测尿中的RBP。这是因为尿液成分复杂,肾脏疾病病人尿样一般为蛋白尿,尿样中含有大量蛋白质,对检测目的蛋白RBP产生一定干扰。
目前,用于检测尿中RBP的方法为ELISA法,但ELISA试剂盒检测也会因尿中其它成分的影响而出现一定的假阳性结果,并且该试剂盒需保存在低温下,保质期也仅为半年。尿RBP的检测局限于实验室诊断,需要依赖配套仪器读取数据,成本相应较高,检测时间长,取样量大,需要专门的技术人员读取分析数据。
因此,本领域迫切需要一种能够更加快速、简易、灵敏地检测尿视黄醇的检测方法和检测试剂。
发明内容
本发明的目的正是提供一种低成本、快速简便、易保存、易操作的尿视黄醇检测试纸及其应用方法。
在本发明的第一方面提供了一种检测试纸,其包括测试条和支撑所述测试条的底板,其中所述测试条沿样品的流动方向至少包括:
加样区;
结合释放区,其中预包被有胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体;和
检测区,其中包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体或视黄醇结合蛋白的测试线。
在一个优选例中,所述底板是采用PVC、或PS制备的。
在另一优选例中,所述结合释放区是采用玻璃纤维、或无纺布材料制成的。
在另一优选例中,所述检测区是采用纤维素膜,优选硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜与醋酸纤维素膜混合膜制备的。
在一个优选例中,所述加样区包括一层或多层吸水玻璃纤维、滤纸、或纤维素滤膜。
在另一优选例中,所述加样区与结合释放区为同一区域。
在另一优选例中,所述视黄醇结合蛋白是纯化的天然视黄醇结合蛋白。
在一个优选例中,所述检测试纸用于尿样的检测。
在本发明的一个优选实施方式中,所述测试条还包括位于远离加样区的吸水区。
在另一优选例中,所述吸水区一层或多层吸水玻璃纤维、滤纸、或纤维素滤膜制备的。
在本发明的另一个优选实施方式中,所述结合释放区中胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体为5-250μg/cm2,优选10-200μg/cm2,更优选20-100μg/cm2,最优选20-60μg/cm2。
在一个优选例中,所述抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体是鼠抗尿视黄醇结合蛋白单克隆抗体。
在本发明的另一个优选实施方式中,所述测试线中预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体,且在样品中包含超过检测限的视黄醇结合蛋白时显色。
在一个优选例中,所述抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体为原核***表达的RBP蛋白。
在另一优选例中,所述测试线上抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体为5-150μg/cm2,优选7-100μg/cm2,更优选10-50μg/cm2,最优选10-20μg/cm2。
在本发明的另一个优选实施方式中,所述测试线中包含视黄醇结合蛋白,并在样品中不含或含有低于检测限的视黄醇结合蛋白时显色。
在一个优选例中,所述视黄醇结合蛋白为纯化的视黄醇结合蛋白。
在另一优选例中,所述测试线上视黄醇结合蛋白为10-200μg/cm2,优选20-150μg/cm2,更优选30-100μg/cm2,最优选40-80μg/cm2。
在本发明的另一个优选实施方式中,所述检测试纸还包括质控线。
在一个优选例中,所述质控线包含羊抗鼠多克隆抗体,优选羊抗鼠IgG,其包被量为5-150μg/cm2,优选7-100μg/cm2,更优选10-50μg/cm2,最优选10-20μg/cm2。
在一个优选例中,所述质控线比检测线更远离加样区。
在本发明的另一个优选实施方式中,所述的检测试纸包括:
加样区;
结合释放区,其中预包被有胶体金标记的鼠抗尿视黄醇结合蛋白单克隆抗体;
检测区,其中包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体的测试线和预包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线;以及
任选的吸水区。
在本发明的另一个优选实施方式中,所述的检测试纸包括:
加样区;
结合释放区,其中预包被有胶体金标记的鼠抗尿视黄醇结合蛋白单克隆抗体;
检测区,其中包含预包被有视黄醇结合蛋白的测试线和预包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线;以及
任选的吸水区。
在本发明的第二方面提供了一种制备本发明前述检测试纸的方法,所述方法包括:
(a)提供加样区、结合释放区、检测区、以及任选的吸水区,其中所述结合释放区中预包被有胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体,所述检测区包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体或视黄醇结合蛋白的测试线和任选的质控线;
(b)将步骤(a)中所提供的材料组装拼接成测试试纸。
在本发明的第三发明提供了一种试剂盒,其中包含本发明的检测试纸,和任选的容器、包装物、使用说明书、缓冲剂、或免疫助剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1:本发明试纸条的一种实施方式。其中,各图标具有如下含义:
1:纤维素膜(检测区); 2:检测线(T线);
3:结合释放区; 4:加样区;
5:吸水区; 6:质控线(C线);
7:底板; 8:样品。
图2:采用本发明试纸条测试不同尿样的检测结果。
图2A显示正常人尿样(N)和RBP水平升高的肾病患者尿样(P)的检测结果,其中T-line=检测线,C-line=质控线,数字代表不同对象。
图2B为获自两例RBP水平正常的肾病患者的检测结果。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究,利用抗尿RBP的单克隆抗体和兔多抗,结合胶体金快速诊断技术,开发出快速、灵敏、有效的尿RBP快速诊断试纸。经临床样本测试,其检测结果与实际病情的诊断情况完全符合,并出乎意料地发现本发明胶体金快速检测试纸的特异性、灵敏度、稳定性与市场上同类ELISA试剂盒效果相当,而在产品的保存、成本、稳定性和灵敏度上都高于市场上同类商业化ELISA试剂盒。在此基础上,本发明人完成了本发明。
该方法与免疫比浊法,放免法,酶联免疫法相比具有明显优势,成本低,快速,简便,易保存,易操作,成为家庭自检和医院早期快速诊断的优选诊断形式。
抗RBP单克隆抗体
本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体,即,组成该群体的抗体个体都相同,除了可能存在少量可能的自发突变。因此,修饰语“单克隆的”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。
本发明的单克隆抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术制备或可市售获得。对于单克隆抗体,可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞,包括骨髓瘤细胞系,例如鼠类的骨髓瘤细胞系,包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自Salk Institute Cell Distribution Center,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American TypeCulture Collection,洛克维尔,马里兰,美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal AntibodiesProduction Techniques and Applications),51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生,如,通过体外结合分析例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后,可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned),并通过标准方法生长(Goding,单克隆抗体(Monoclonal Antibodies):原则和实践(Principles andPractice),Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括,例如,DMEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
在本发明的实施方式中,可采用市售的抗RBP单抗,例如购自Genetex。
在本发明的一个实施方式中,采用了鼠抗尿RBP单克隆抗体。在一个优选实施方式中,用于制备单克隆抗体的RBP蛋白是天然的RBP蛋白或重组的RBP蛋白,例如采用中国专利申请200610117198.7中所描述的方法制备的重组RBP蛋白。
在一个优选实施方式中,所述单克隆抗体是采用中国专利申请200610117198.7中所描述的方法制备的,更优选是由其中所公开的杂交瘤细胞系S-18-16产生的单抗。
免疫胶体金技术
免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,其发展十分迅速,在生物医学各研究领域,特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。胶体金已成为继荧光素、放射同位素和酶之后,在免疫标记技术中较为常用的一种非放射性标剂。
胶体金是由氯金酸在还原剂如鞣酸、柠檬酸三钠的作用下聚合形成特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,它具有高电子密度、能与多种生物大分子结合的特点。免疫金标记技术主要利用了金颗粒的这一特征,在金标蛋白结合处于显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或***斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。
在本发明中,胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行,例如李永勤等的综述“以膜为固相载体的免疫胶体金快速试验”(微生物学免疫学进展2003年第31卷第1期);王玉金、杨书豪等的“简单、快速同时检测乙肝表面抗原和甲胎蛋白胶体金免疫层析方法的建立”(中华微生物学和免疫学杂志2003年10月第23卷第10期)。
胶体金快速检测试纸
本发明的尿RBP胶体金快速检测试纸可采用本领域常用的各种搭接构造、材料和常规的检测板制备方法制成,只要其采用本发明的抗RBP单克隆抗体通过免疫胶体金原理产生可直接观察的检测信号即可。在本发明的基础上,本领域技术人员可根据需要对检测试纸的结构和材料进行改变。
本发明检测的免疫检测板,通常包括测试条和支撑测试条的底板。底板可可采用例如(但不限于)PVC聚酯胶板、PS等材料制成,只要其能对测试条起到支撑作用并且不会影响测试。
测试条沿样品流动方向通常依次包括:加样区、结合释放区、检测区和吸水区,在加样区的加样垫中加以样品,通过吸水区的毛细作用使样品通过结合释放区的结合释放垫,然后到达检测区的检测垫,通过免疫胶体金原理实现对样品中是否含有RBP或异常含量的RBP的检测。
加样区可制成加样窗、加样孔等各种形式,其中包括采用例如(但不限于)吸水玻璃纤维、滤纸、纤维素滤膜等一层或多层材料制成的加样垫。
吸水区位于试纸上与加样区相对的另一侧,包括通常由例如滤纸等吸水性材料制成的吸水垫,以驱动试纸上的液体迁移。
结合释放区位于加样区和检测区之间,包括采用例如(但不限于)玻璃纤维或无纺布等材料制成的结合释放垫。在该区域中预包被有胶体金标记的抗RBP单克隆抗体,在制备中所用溶液浓度为0.5-5mg单抗/ml,优选1-1.5mg单抗/ml,更优选1mg单抗/ml,单位面积抗体溶液用量为10-100μl/cm2,优选15-80μl/cm2,更优选20-60μl/cm2。在一个优选实施方式中,检测试纸上的单抗包被量为5-250μg/cm2,优选10-200μg/cm2,更优选20-100μg/cm2,最优选20-60μg/cm2。在本发明的优选实施方式中,所述标记单抗以鼠单抗最佳,工作浓度为1mg/ml最佳。
测试区位于结合释放区与吸水区之间,包括采用纤维素膜,例如(但不限于)醋酸纤维素、硝酸纤维素等材料制成的测试垫。在该测试垫上至少包含检测线,并优选包含作为试纸质量控制的质控线。在采用质控线的情况下,所述质控线通常比检测线更远离加样区。
检测线可包含抗RBP多克隆抗体,其浓度为0.5-5mg/ml,优选1-2mg/ml,更优选1mg/ml,在制备中所用多抗溶液浓度为0.5-5mg多抗/ml,优选1-1.5mg多抗/ml,更优选1mg多抗/ml,单位面积多抗溶液用量为5-100μl/cm2,优选8-80μl/cm2,更优选10-50μl/cm2。在一个优选实施方式中,检测试纸上的多抗包被量为5-150μg/cm2,优选7-100μg/cm2,更优选10-50μg/cm2,最优选10-20μg/cm2。在采用竞争抑制法的实施方式中,可采用RBP蛋白溶液(优选纯化的RBP蛋白)来制备检测线,其浓度为0.5-5mg RBP蛋白/ml,优选1-4mg RBP蛋白/ml,更优选2-3mg RBP蛋白/ml,单位面积RBP蛋白溶液用量为5-100μl/cm2,优选8-80μl/cm2,更优选20-40μl/cm2。在一个优选实施方式中,检测试纸上的多抗包被量为10-200μg/cm2,优选20-150μg/cm2,更优选30-100μg/cm2,最优选40-80μg/cm2。
质控线通常采用羊抗鼠多克隆抗体等制成,如羊抗鼠IgG等,以0.5-5mg/ml,优选1-3mg/ml、更优选1mg/ml的浓度结合在测试区特定位置上,单位面积羊抗鼠多克隆抗体溶液用量为5-100μl/cm2,优选8-80μl/cm2,更优选20-40μl/cm2,最优选10-20μl/cm2。在一个优选实施方式中,检测试纸上的多抗包被量为5-150μg/cm2,优选7-100μg/cm2,更优选10-50μg/cm2,最优选10-20μg/cm2。
上述单抗、多抗或蛋白质溶液所采用的溶剂可以是本领域常用的缓冲液或稀释液,只要其不影响所述蛋白质的活性并适于施加于检测试纸既可。
在本发明的一个优选实施方式中,所述尿RBP胶体金快速检测试纸可采用如图1所示的结构。在底板(7)上从加样端开始依次排列有:样品区(4)、结合释放区(3)、检测区(纤维素膜)(1)、吸水区(5)。
结合释放区(3)可采用例如(但不限于)玻璃纤维或无纺布等材料制成,在其上附有胶体金标记的抗RBP单克隆抗体。
检测区(1)可采用纤维素膜,例如醋酸纤维素、硝酸纤维素等材料制成。应理解的是虽然在此处优选采用纤维素膜,但与纤维素膜具有类似特性的适合材料也可用于本发明,这是本领域技术人员根据需要和材料性质可确定的。
在该纤维素膜的加样侧包被有检测线(2),在本发明中也称为T线(Testline),而在吸水区侧包被有质控线(6),在本发明中也称为C线(Control line)。
质控线上预包被有作为质量控制标记物的羊抗鼠多克隆抗体,例如羊抗鼠IgG。在检测试纸保持其正常使用效果并采用准确测试方式的情况下,不论样品中是否存在RBP,试纸上预包被的胶体金标记的抗RBP单克隆抗体总能与质控线中的羊抗鼠多抗结合形成一条有色质控带。若未出现质控线则表明检测方法错误或检测板变质或失效,应更换试纸重新进行测定。
应理解,虽然本发明附图中的检测线和质控线为直线型,也可根据需要将其预包被为其它图案,例如“+”等。
在本发明的一个优选例中,所述检测线上预包被有RBP多克隆抗体,其浓度为0.5-5mg/ml,优选1-2mg/ml,更优选1mg/ml,浓度为0.5-5mg多抗/ml,优选1-1.5mg多抗/ml,更优选1mg多抗/ml,单位面积多抗溶液用量为5-100μl/cm2,优选8-80μl/cm2,更优选10-50μl/cm2。在一个优选实施方式中,检测试纸上的多抗包被量为5-150μg/cm2,优选7-100μg/cm2,更优选10-50μg/cm2,最优选10-20μg/cm2。
样品中如果含有超过检测限的RBP,则该RBP先与结合释放垫上金标记的抗RBP单克隆抗体结合形成抗原-抗体复合物,然后在通过检测线时显现出红色阳性标记。若样品中不存在RBP或RBP的量未超过检测限,则不会检测线不会形成红色阳性标记。
因此,在该优选例中,如下判断检测结果:不论检测线是否显色,如果质控线不显色,则表明检测方法错误或检测板变质或失效,应更换试纸重新进行测定;检测线和质控线均显色(即在测试区中出现两条显色条带),就表明样品中存在超过检测限的RBP,结果为阳性;反之,如果检测线不显色,仅质控线显色,就表明样品中不存在或仅存在检测限以下的RBP,结果为阴性。
在本发明的另一实施方式中,也可采用竞争抑制法来制备检测试纸。在本发明的另一优选例中,所述检测线上预包被有纯化的RBP蛋白,其浓度为1-5mg/ml,优选2-4mg/ml,更优选2-3mg/ml,其浓度为0.5-5mg RBP蛋白/ml,优选1-4mg RBP蛋白/ml,更优选2-3mg RBP蛋白/ml,单位面积RBP蛋白溶液用量为5-100μl/cm2,优选8-80μl/cm2,更优选20-40μl/cm2。在一个优选实施方式中,检测试纸上的多抗包被量为10-200μg/cm2,优选20-150μg/cm2,更优选30-100μg/cm2,最优选40-80μg/cm2。
样品中的RBP(游离抗原)与固定于检测线的RBP蛋白(固相抗原)竞争结合胶体金标记的抗RBP单抗(标记抗体)。当样品中含有超过检测限的RBP时,该游离抗原将抑制标记抗体与固定抗原的结合,从而抑制在硝酸纤维素膜的检测线形成色带。样品中不存在RBP或存在不超过检测限的RBP时,标记抗体与固定抗原结合,在检测线形成色带。
因此,在该优选例中,如下判断检测结果:不论检测线是否显色,如果质控线不显色,则表明检测方法错误或检测板变质或失效,应更换试纸重新进行测定;检测线和质控线均显色(即在测试区中出现两条显色条带),就表明样品中不存在超过检测限的RBP,结果为阴性;反之,如果检测线不显色,仅质控线显色,就表明样品中存在超过检测限的RBP,结果为阳性。
根据本发明的实施方式,本发明检测试纸对RBP的检测限可达20-200ng/ml,优选50-150ng/ml,更优选100ng/ml。
本发明的试剂盒
可进一步制备包含本发明胶体金快速检测试纸的试剂盒。所述的试剂盒可根据需要包括容器、包装物、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等。
本发明检测试纸和试剂盒的用途
本发明的视黄醇结合蛋白检测试纸和试剂盒可对样品中RBP进行简便、迅速、高灵敏度、高准确率的检测,并且结果直接明了,不需要依靠复杂的仪器和专门技术人员分析数据,成本低,可以实现快速定性,半定量诊断和个人家庭自检,其特异性和灵敏度与酶联免疫法相当。试纸条上设有质控线,可以在检测样品的同时检测试纸条本身是否失效,避免了假阳性和假阴性的产生,因此适用于临床、实验室、或家庭。
本发明的检测试纸或试剂盒可用于判断与RBP(尤其适合尿RBP)水平的异常或变化,并由此获得与之相关的疾病、健康状况或试验结果信息。特别是对检测尿液等方便获取的体液样本,更适合用胶体金快速诊断实现个人家庭自检,能有效的应用于慢性肾病,糖尿病肾病,营养缺乏症,肾损伤病人的自我监控。
本发明的优点
由于尿液成分复杂,肾脏疾病病人尿样一般为蛋白尿,尿样中含有大量蛋白质,对检测目的蛋白RBP产生一定干扰,现有技术中对于RBP的检测通常都是采用血样。即便是采用ELISA方法对尿样进行检测也会出现一定的假阳性结果。
本发明将胶体金技术应用于尿RBP检测,操作简单,检测尿RBP比检测血RBP结果更为可信,并且其对尿样本的检测,假阳性率少,检测结果中的阴性结果本底低,对尿样中的其他蛋白没有交叉反应,特异性高,灵敏度高。采用本发明的胶体金试纸检测尿RBP对多种疾病的诊断和疾病发展进程均有很好的提示作用,将该检测产品推广到家庭自检是大势所趋,具有潜在市场价值和很大的市场容量。
具体而言,本发明尿视黄醇结合蛋白胶体金快速检测试纸具有以下优点:
(1)检测快速:5-10分钟出结果;
(2)特异性高:仅检测RBP异常升高的肾脏疾病样本会出现阳性,而对其他RBP未升高的肾脏疾病样本或其他疾病样本以及正常人尿液样本呈阴性结果;
(3)敏感性高:对尿液RBP蛋白可以达到100ng左右的检出水平;
(4)准确率高:经过30-40例临床样本检测,与酶联免疫法相比较,总符合率为100%;
(5)保存和运输方便:在室温下可以保存3个月至半年以上;
(6)取样方便,样品量少:可用于尿样的测定,每人每次测定只需要50-100μl尿液;
(7)使用便利,生产方便:临床及家居使用极为便利,且具有产业性。
实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.金标抗体层(结合释放垫)的制备
胶体金的制备
采用柠檬酸三钠法,用1%的柠檬酸三钠将0.1%氯化金还原成胶体金溶液。对还原后的胶体金溶液运用电镜观察和400-700nm波长分光光度计扫描法进行质量检测,得到大小为40nm左右、大小均一且分散均匀的胶体金溶液。将该胶体金溶液调整到工作浓度(1mg/ml),并调整pH=7.5-8.5。
胶体金标记抗尿RBP抗体的制备
取1毫升胶体金溶液,用0.2M碳酸钾溶液调pH到8.2,分别加入25μg市售尿RBP抗体(鼠抗尿RBP单克隆抗体,购自Genetex)或由申请人自行制备的鼠抗尿RBP单克隆抗体(制备方法可参见200610117198.7实施例),搅拌,再加入终浓度为3%的BSA,继续搅拌5分钟,4℃静置2小时以上。
取上述含有单克隆抗体的胶体金溶液,以6000转/分钟离心15分钟,去上清,沉淀用0.02M pH=7.6的Tris-HCl缓冲液悬浮,得到胶体金溶液,所述缓冲溶液中还含0.25%的BSA和0.02%叠氮钠。
将该胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺纱布至液体开始渗出为止或用点样仪点样包被:点样量设置:2μl/cm,在37℃下干燥2小时,形成金标抗体层(即结合释放垫)。
实施例2.带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备
取抗尿RBP多克隆抗体(由本实验室根据200610117198.7所述方法制备),将其浓度调整为1mg/ml(调整浓度所用试剂为PBS),加入2%甲醛,用喷膜机(Biodot公司,XYZ3050型号)在硝酸纤维素膜中段喷检测线(t-line,T线),喷膜量设置为1μl/cm。
取羊抗鼠IgG(购自SIGMA),调整浓度为2mg/ml(调整浓度所用试剂为PBS),加入2%甲醛,用喷膜机在硝酸纤维素膜中段,距检测线0.5cm处,喷控制线(C-line,C线),喷膜量设置为1μl/cm。
使喷膜在37℃下干燥2小时,再用0.01M pH=7.0含0.5%BSA的PBS,在37℃下封闭0.5-1小时。然后用0.01M pH=7.0的PBS(不含BSA)漂洗,37℃下干燥,即得带有检测线和质控线的纤维素膜。
实施例3.尿RBP胶体金快速检测试纸的组装
通过以下步骤组装尿RBP胶体金快速检测试纸:
(1)将实施例2中制得的带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜粘贴于PVC底板上;
(2)在靠近测试线一端的PVC板上粘贴实施例1中所制备的结合释放垫,使得结合释放垫与测试线下端部分硝酸纤维素膜交叉重叠2mm;
(3)在结合释放垫另一侧粘贴吸水玻璃纤维(样品垫),使得样品垫与结合释放垫部分交叉重叠2mm;
(4)在靠近质控线一端的PVC板上粘贴吸水纸,使得吸水纸与质控线上端部分硝酸纤维素膜交叉重叠2mm;
(5)按宽4mm、长8cm的规格切条,包装。
所得检测试纸的结构如图1所示。
实施例4.样品测试
样品
样品共32例,20例来自上海瑞金医院检验科,12例来自上海市第六人民医院。其中RBP阳性样本28例,阴性样本4例(其中两例为RBP水平正常的肾病患者,另两例为正常人尿样)。
测试及结果读取方法
采用实施例3制得的尿RBP胶体金快速检测试纸,按照以下步骤对样品进行检测并读取结果:
①取尿液样本20μl左右置于小管中;
②将试纸条样品垫一端浸入待测样品中,5-10分钟,室温;
③当质控线出现红色后读取结果,如果质控线未呈现红色,则试纸条本身失效或测试方法不当,丢弃试纸条,更换试纸条再检测;
如果质控线变红,则读取结果;
④如果测试线和质控线均呈红色,表明待测样本中RBP水平异常高,为肾小管,肾损伤,糖尿病肾病等肾脏疾病病人;
如果测试线未呈现红色,表明为RBP水平正常,为正常人尿液;
如果测试线呈现较弱红色,则为RBP水平轻度升高,需参照其它诊断结果判断。
对比测试
采用ELISA方法对同一批尿样进行检测。ELISA试剂盒:购自上海德波生物科技有限公司
采用双抗体夹心法的实验流程:
(1)将样本用稀释液稀释20倍,加入96孔板(内已经包被了抗体),37℃30分钟;
(2)洗板,加酶标抗体30分钟;
(3)洗板,加底物(OPD),20分钟;
(4)450nm比色读数。
结果分析
经检测32例样品中,有28例为阳性,4例为阴性,其中两例为RBP水平正常的肾病患者,另两例为正常人尿样。图2显示了采用本发明试纸检测部分样品后的部分结果。
该结果与ELISA方法测得的结果总符合率达到100%。该结果证明本发明的尿RBP胶体金快速检测试纸具有高度的特异性和准确率。
实施例5.检测试纸性质测定
检测限的确定
用ELISA试剂盒检测样本,以确定了样本中RBP的浓度。对样本进行一定的稀释,使得样本中RBP的浓度分别为:1μg/ml、500ng/ml、200ng/ml、和100ng/ml,再用胶体金试纸条如上所述进行检测。
根据检测结果确定100ng/ml为调试的最终检测灵敏度。
灵敏度检测
将尿液稀释20倍、40倍、50倍或80倍,如实施例4所述采用实施例3所制得检测试纸剂进行检测,以ELISA试剂盒检测相同的样品作比较。
结果显示胶体金法检测阴、阳性尿样区别明显,信号强度基本稳定不变。而ELISA试剂盒在稀释50倍后,阳性样本信号明显降低,20倍时阳性样本为阴性样本值的10倍,80倍时明显降低到4倍左右。
结果表明本发明的胶体金检测试纸的灵敏度高于采用ELISA法的试剂盒。
稳定性检测
将该胶体金免疫层析试纸条在37℃烘箱内存放3天(相当于在4℃存放3个月),或在室温下存放5个月,采用如上所述方法检测尿样。
结果显示,经存放后的试纸条检测信号依然稳定,结果准确率为100%。
而现有技术中的ELISA试剂盒需4℃存放,96孔板则需-20℃存放,产品存放时间为半年至一年。
因此,本发明的胶体金试纸的稳定性优于现有技术中的ELISA试剂盒,且更易于贮存。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种检测试纸,其包括测试条和支撑所述测试条的底板,其中所述测试条沿样品的流动方向至少包括:
加样区;
结合释放区,其中预包被有胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体;和
检测区,其中包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体或视黄醇结合蛋白的测试线。
2.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,所述测试条还包括位于远离加样区的吸水区。
3.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,所述结合释放区中胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体为5-250μg/cm2,优选10-200μg/cm2,更优选20-100μg/cm2,最优选20-60μg/cm2。
4.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,所述测试线中预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体,且在样品中包含超过检测限的视黄醇结合蛋白时显色。
5.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,所述测试线中包含视黄醇结合蛋白,并在样品中不含或含有低于检测限的视黄醇结合蛋白时显色。
6.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,所述检测试纸还包括质控线。
7.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,其包括:
加样区;
结合释放区,其中预包被有胶体金标记的鼠抗尿视黄醇结合蛋白单克隆抗体;
检测区,其中包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体的测试线和预包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线;以及
任选的吸水区。
8.如权利要求1所述的检测试纸,其特征在于,其包括:
加样区;
结合释放区,其中预包被有胶体金标记的鼠抗尿视黄醇结合蛋白单克隆抗体;
检测区,其中包含预包被有视黄醇结合蛋白的测试线和预包被有羊抗鼠多克隆抗体的质控线;以及
任选的吸水区。
9.一种制备权利要求1所述检测试纸的方法,所述方法包括:
(a)提供加样区、结合释放区、检测区、以及任选的吸水区,其中所述结合释放区中预包被有胶体金标记的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体,所述检测区包含预包被有抗视黄醇结合蛋白多克隆抗体或视黄醇结合蛋白的测试线和任选的质控线;
(b)将步骤(a)中所提供的材料组装拼接成测试试纸。
10.一种试剂盒,其中包含权利要求1所述的检测试纸,和任选的容器、包装物、使用说明书、缓冲剂、或免疫助剂。
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- 2008-04-28 CN CNA2008100367316A patent/CN101571548A/zh active Pending
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