CN101569748B

CN101569748B - 一种水溶性的紫杉醇的前药制备方法

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Publication number: CN101569748B
Application number: CN2008100613397A
Authority: CN
Inventors: 张剑锋; 陈晓彬; 周慧
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: CN101569748A

Abstract

本发明提供了一种水溶性的紫杉醇的前药及其制备和化学修饰剂，它以聚乙二醇为载体，以柠檬酸为连接臂，制得了含有多个羧基的分枝型聚乙二醇衍生物，该衍生物用于紫杉醇的修饰，可大幅度提高聚乙二醇对紫杉醇的运载能力，明显提高了紫杉醇的溶解性，修饰后紫杉醇的溶解度为0.1～6.0mg/ml，前药中紫杉醇的含量为1％～38％，有利于提高和改善药物的性能。

Description

一种水溶性的紫杉醇的前药制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇修饰的紫杉醇衍生物及其制备方法和化学修饰剂技术领域。

背景技术

紫杉醇(taxol)是由Wall等人于1963年从红豆杉的树皮中提取分离得到的，它是一种具有促进微管聚合的抗癌药物，是目前应用最为广泛的抗肿瘤药物之一，在多***肿瘤的治疗中具有良好的疗效，临床主要应用早治疗乳腺癌和卵巢癌上。但是紫杉醇存在难溶于水及半衰期短等缺点，给静脉注射带来了很大困难。最早的是采用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor)与无水乙醇1∶1的混合液来稳定紫杉醇，该方法虽然可以增加紫杉醇的水溶性，但不良反应严重。为了有效消除不良反应、提高治疗效果，改善紫杉醇的水溶性成了改进疗效的关键，人们也做了许多尝试。

增加紫杉醇水溶性的主要方法分为物理方法和化学方法。物理方法是将紫杉醇制成乳剂、脂质体、微球等制剂，以达到改善其水溶性的效果；而化学方法是利用紫杉醇母核C2’位、C7位的羟基引入水溶性基团，以获得水溶性较大的紫杉醇衍生物。所得产物目前都还没有应用与临床，但是据文献表示，它们大部分都表现出良好的抗肿瘤活性，且性质稳定。紫杉醇的化学修饰剂按照分子量分包括两类：小分子修饰剂和高分子修饰剂。小分子修饰剂包括：丁二酸、丁二酸酐、戊二酸、氨基酸、苹果酸、N-甲基吡啶盐衍生物等；水溶性高分子包括：聚乙二醇衍生物、聚甲基丙烯酸的共聚物、聚谷氨酸、聚天冬氨酸衍生物等。其中修饰剂以小分子居多，这导致修饰后的衍生物极不稳定，存在半衰期较短的问题，而已有的使用高分子修饰的产物又存在对小分子药物修饰时载药量偏小的问题，这些都将阻碍紫杉醇前药的研究和应用。

药物修饰剂的选择是药物修饰的关键，PEG具有良好的物理性能及化学性能，对药物进行PEG修饰可以改善药物的理化和药效性质，特别是对半衰期影响效果明显，以PEG为载体对紫杉醇进行化学修饰已引起了大家的关注。中国专利200510027736.9公开了一种以聚乙二醇为载体，以羟基乙酸、L-乳酸或者它们的齐聚物为连接臂，在紫杉醇或多烯紫杉醇的2’或者7’位羟基上发生键合反应，得到了新型紫杉醇或多烯紫杉醇前药。中国专利00109748.2则公开了一种聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药，利用氨基酸或寡肽把水溶性的聚乙二醇与紫杉醇或者是把聚乙二醇与多烯紫杉醇键接起来构成紫杉醇或多烯紫杉醇的衍生化合物。此外，中国专利97194360.5则将紫杉醇或多烯紫杉醇与水溶性螯合剂、聚乙二醇或者聚(L-谷氨酸)或聚(L-天冬氨酸)之类的聚合物共轭制成的。上述修饰方法中，作为修饰剂的连接臂都是一些易于降解且对生物体无害的小分子，但这些修饰方法都有一个共同的不足之处，PEG载体对药物分子的载药量非常有限，每一条PEG链只能连接一个紫杉醇分子。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是提供一种聚乙二醇修饰的水溶性的紫杉醇的前药，以柠檬酸做连接臂，使聚乙二醇修饰剂连有多个羧基，使其载药量明显增大。该紫杉醇衍生物，具有良好的水溶性。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种聚乙二醇修饰的水溶性的紫杉醇的前药的制备方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种聚乙二醇修饰的水溶性的紫杉醇的前药的化学修饰剂。

本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案为：一种水溶性的紫杉醇的前药，其特征在于：它是紫杉醇与以柠檬酸为连接臂的分枝型聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇衍生物作用后的产物，其结构式为：

分枝型PEG修饰剂1：

分枝型PEG修饰剂2：

它就是把聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇与柠檬酸相连，使每一条PEG链连上3个或6个羧基，得到如上结构的分枝型PEG修饰剂，PEG修饰剂再与紫杉醇的2’-羟基通过酯键相连，得到紫杉醇衍生化合物，即紫杉醇的前药：

作为优选，聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇的分子量为2000～20000。

本发明解决上述另一个技术问题所采用的技术方案为：一种水溶性的紫杉醇的前药制备方法，其特征在于：步骤1是PEG或mPEG羧酸酯的制备，将PEG或mPEG先变成醇钠，再与溴乙酸叔丁酯反应后得羧酸酯；步骤2是羧基PEG或mPEG的制备，将羧酸酯水解制成羧基PEG或mPEG；步骤3是羧基PEG或mPEG活化；步骤4是分枝型PEG或mPEG修饰剂的合成，与柠檬酸反应制得含有多个羧基的分枝型PEG或mPEG；步骤5是分枝型PEG或mPEG活泼酯的制备；步骤6是分枝型PEG或mPEG修饰的紫杉醇前药的合成，用分枝型PEG或mPEG与紫杉醇反应，制得白色固体状的紫杉醇前药。

具体地说，步骤1是将经过真空干燥的PEG或mPEG溶于经过金属钠干燥的1，4-二氧六环中，加入金属钠，搅拌至无气泡放出，静置后减压抽滤，将滤液浓缩；以催化剂量的KI作催化剂，在室温搅拌下逐滴地滴加溴乙酸叔丁酯，可以按照化学反应系数比例进行配比，完毕后继续搅拌反应，然后用无水***萃取，再次过滤，真空干燥，得到PEG或mPEG的羧酸酯。

步骤2是将所得羧酸酯溶于0.05～0.2mol/l NaOH溶液，50～60℃水解反应，再用盐酸调节pH值至2.8～3.0，减压蒸馏蒸除水分，所得固体溶于二氯甲烷，过滤除去少量固体杂质，滤液用***沉淀，收集沉淀，固体真空干燥，再乙酸乙酯重结晶，获得羧基PEG或mPEG.。

步骤3是将羧基PEG或者mPEG溶于二氯甲烷，待溶解后，降温至0～5℃，按以下摩尔比投料：羧基∶二环己基碳二亚胺∶N-羟在丁二酰亚胺＝1∶2∶2，先加入DCC室温下搅拌反应后，再加入NHS，然后室温封闭条件下搅拌反应，反应完毕，过滤除去反应生成的二环己基脲，然后用***将活化后的PEG或mPEG产品沉淀析出，用***淋洗，真空干燥。

步骤4是称取经过干燥处理柠檬酸，溶于吡啶中，待溶解后，加入二氯甲烷，再加入DCC，在室温下搅拌反应，然后可以按照化学反应系数比例加入羧基PEG或者mPEG活泼酯，再搅拌反应，所得溶液过滤除去所生成的固体，溶液进行减压蒸馏，取剩下液体，用0.5～1.5mol/l盐酸洗涤来除净剩余的吡啶，用二氯甲烷溶解，然后再用无水***进行萃取，过滤，再真空干燥获得分枝型PEGA修饰剂或者mPEG修饰剂。

步骤5是把分枝型PEG或mPEG溶于二氯甲烷，待溶解后，降温至0～5℃，按照羧基∶DCC∶NHS为1∶2∶2的摩尔比，分别加入DCC和NHS，室温下搅拌后再自然升至室温，继续搅拌反应，然后过滤除去反应生成的二环己基脲，然后用***将活化后的产品沉淀析出，用***淋洗，滤出产物，真空干燥。

步骤6是称取分枝型PEG修饰剂或mPEG修饰剂活泼酯溶于二氯甲烷，降温至0～ 5℃，可以按照化学反应系数比例加入紫杉醇、DMAP和DCC，搅拌反应，自然升温至室温，继续反应，然后加入10％HAc/THF分解过量的DCC，用HCl溶解洗涤，无水Na₂SO₄干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤，真空干燥后得白色固体状产物。

本发明解决上述再一个技术问题所采用的技术方案为：一种水溶性的紫杉醇的化学修饰剂，其特征在于由含有羧基官能团的聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇与柠檬酸作用，从而得到含有多个羧基、以柠檬酸为连接臂的分枝型聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇衍生物，其结构式分别为：

分枝型PEG修饰剂1：

分枝型PEG修饰剂2：

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.将聚乙二醇或单氧基聚乙二醇与柠檬酸相连接，制得含有多个羧基的分枝型聚乙二醇衍生物，从而使聚乙二醇对小分子药物的运载能力得到大幅度提高；

2.将紫杉醇与分枝型聚乙二醇衍生物反应制成紫杉醇的前药，提供了一种制备紫杉醇衍生物的方法；

3.明显提高了紫杉醇的溶解性，修饰后紫杉醇的溶解度为0.1～6.0mg/ml，前药中紫杉醇的含量为1％～38％，有利于提高和改善药物的性能；

4.增大了紫杉醇的稳定性，提高了其在生物体内的作用时间，从而达到了缓释的目的。

附图说明

图1为水溶性的紫杉醇的前药合成线路图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明的合成路线为：将PEG或mPEG先变成醇钠，再与溴乙酸叔丁酯反应后得羧基PEG或mPEG，把羧基PEG或mPEG经活化后与柠檬酸反应制得含有多个羧基的分枝型PEG或mPEG，最后用该分枝型PEG或mPEG与紫杉醇反应，即可制得白色固体状的紫杉醇前药。在本发明优先的实施例中，以mPEG与柠檬酸制得的分枝型PEG修饰剂，再对紫杉醇进行修饰的合成路线如图1：

实施例1

1.mPEG5000羧酸酯的制备

将10g经过真空干燥的mPEG5000溶于100ml经过金属钠干燥的1，4-二氧六环中，加入切成丝状的金属钠，磁力搅拌约24h，至无气泡放出。静置24h后用G₄型沙芯漏斗减压抽滤，滤液浓缩到20～30ml。加入0.2g KI作催化剂，在室温搅拌下逐滴滴加6ml溴乙酸叔丁酯，完毕后继续搅拌反应24h，用经过处理的无水***萃取，再次过滤，真空干燥箱干燥，得到微黄色沉淀。

2.羧基mPEG5000的合成

将所得固体干燥产物溶于125ml 0.1mol·L^-1NaOH溶液，55℃水解反应24h，用3mol·L^-1盐酸调节pH值至2.8～3.0，溶液颜色由棕黄的逐渐变浅，减压蒸馏蒸除水分，所得固体溶于少量二氯甲烷，过滤除去少量固体杂质，滤液用200ml***沉淀，收集沉淀，固体真空干燥，乙酸乙酯重结晶，产物为微黄色粉末状固体。

3.羧基mPEG5000的活化

称取5.06g羧基mPEG 5000，溶于20ml二氯甲烷，待固体完全溶解后，降温至0～5℃，按以下摩尔比投料：羧基∶二环己基碳二亚胺(DCC)∶N-羟在丁二酰亚胺(NHS)＝1∶2∶2，先加入DCC室温下搅拌4h后，加入NHS，然后室温条件下密闭搅拌反应24h。停止反应，过滤除去反应生成的二环己基脲，然后用7倍于反应液体积的***将活化后的PEG产品沉淀析出，用***淋洗，真空干燥。

4.分枝型mPEG5000修饰剂的合成

称取经过干燥处理的0.385g柠檬酸，溶于适量吡啶，待固体完全溶解后，加入2倍体积的二氯甲烷，再加入0.83g DCC，室温下磁力搅拌1h。然后加入5.06g羧基mPEG5000活泼酯，磁力搅拌24h。所得溶液过滤除去所生成的固体，溶液进行减压蒸馏直到剩下3～5ml时用1mol·L^-1盐酸洗涤，除净剩余的吡啶，用二氯甲烷溶解，然后再用无水***进行萃取，过滤，萃取提纯三次后真空干燥。

5.分枝型mPEG5000活泼酯的制备

把5.25g分枝型mPEG5000溶于20ml二氯甲烷，待固体完全溶解后，降温至0～5℃，按照羧基∶DCC∶NHS为1∶2∶2的摩尔比，分别加入DCC和NHS。室温下密闭搅拌4h后自然升至室温，再搅拌反应24h。过滤除去反应生成的二环己基脲，然后用7倍于反应液体积的***将活化后的产品沉淀析出，用***淋洗，滤出产物、真空干燥。

6.分枝型mPEG修饰的紫杉醇前药的合成

称取0.5055g分枝型mPEG修饰剂活泼酯溶于30ml二氯甲烷，降温至0～5℃，加入0.3022g紫杉醇、0.006g DMAP和0.012g DCC，搅拌反应，自然升温至室温，继续反应24h，加入5ml 10％HAc/THF分解过量的DCC，用20ml 0.1mol·L^-1 HCl溶解洗涤，无水Na₂SO₄干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤得白色固体，真空干燥后得白色固体状产物。

实施例2

1.PEG6000羧酸酯的制备

同实施例1，用12g PEG6000取代其中的mPEG5000。

2.羧基PEG6000的合成

在实施例1的基础上，利用与实施例1相同的实验方法，制得羧基PEG6000。

3.羧基PEG6000的活化

在实施例1的基础上，利用与实施例1相同的实验方法，制得羧基PEG6000活泼酯。

4.分枝型PEG6000修饰剂的合成

在实施例1的基础上，利用与实施例1相同的实验方法，制得分枝型PEG6000修饰剂，其中除柠檬酸增加1倍用量外，其余试剂用量均同实施例1。

5.分枝型PEG6000活泼酯的制备

在实施例1的基础上，利用与实施例1相同的实验方法，制得分枝型PEG6000活泼酯。

6.分枝型PEG修饰的紫杉醇前药的合成

在实施例1的基础上，利用与实施例1相同的实验方法，制得分枝型PEG修饰的紫杉醇前药，除紫杉醇的用量增加1倍以外，其余反应剂量均按实施例1进行配比。

Claims

1.一种水溶性的紫杉醇的前药制备方法，其特征在于：步骤1是PEG或mPEG羧酸酯的制备，将PEG或mPEG先变成醇钠，再与溴乙酸叔丁酯反应后得羧酸酯；步骤2是羧基PEG或mPEG的制备，将羧酸酯水解制成羧基PEG或mPEG；步骤3是羧基PEG或mPEG活化；步骤4是分枝型PEG或mPEG修饰剂的合成，与柠檬酸反应制得含有多个羧基的分枝型PEG或mPEG；步骤5是分枝型PEG或mPEG活泼酯的制备；步骤6是分枝型PEG或mPEG修饰的紫杉醇前药的合成，用分枝型PEG或mPEG与紫杉醇反应，制得白色固体状的紫杉醇前药；

步骤1是将经过真空干燥的PEG或mPEG溶于经过金属钠干燥的1，4-二氧六环中，加入金属钠，搅拌至无气泡放出，静置后减压抽滤，将滤液浓缩；以KI作催化剂，在室温搅拌下滴加溴乙酸叔丁酯，完毕后继续搅拌反应，然后用无水***萃取，再次过滤，真空干燥，得到PEG或mPEG的羧酸酯；

步骤2是将所得羧酸酯溶于NaOH溶液，水解反应后，再用盐酸调节pH值至2.8～3.0，减压蒸馏蒸除水分，所得固体溶于二氯甲烷，过滤除去少量固体杂质，滤液用***沉淀，收集沉淀，固体真空干燥，再乙酸乙酯重结晶，获得羧基PEG或mPEG；

步骤3是将羧基PEG或者mPEG溶于二氯甲烷，待溶解后，降温至0～5℃，按以下摩尔比投料：羧基∶二环己基碳二亚胺∶N-羟基丁二酰亚胺＝1∶2∶2，先加入DCC室温下搅拌反应后，再加入NHS，然后室温条件下搅拌反应，反应完毕，过滤除去反应生成的二环己基脲，然后用***将活化后的PEG或mPEG产品沉淀析出，用***淋洗，真空干燥；

步骤4是称取经过干燥处理柠檬酸，溶于吡啶中，待溶解后，加入二氯甲烷，再加入DCC，密闭条件下搅拌反应，然后加入分枝型PEG或者mPEG活泼酯，再搅拌反应，所得溶液过滤除去所生成的固体，溶液进行减压蒸馏，取剩下液体，用盐酸洗涤来除净剩余的吡啶，用二氯甲烷溶解，然后再用无水***进行萃取，过滤，再真空干燥获得分枝型PEG修饰剂或者mPEG修饰剂；

步骤5是把分枝型PEG或mPEG溶于二氯甲烷，待溶解后，降温至0～5℃，按照羧基∶DCC∶NHS为1∶2∶2的摩尔比，分别加入DCC和NHS，室温下搅拌后再自然升至室温，继续搅拌反应，然后过滤除去反应生成的二环己基脲，然后用***将活化后的产品沉淀析出，用***淋洗，滤出产物，真空干燥；

步骤6是称取分枝型PEG修饰剂或mPEG修饰剂溶于二氯甲烷，降温至0～5℃，加入紫杉醇、DMAP和DCC，搅拌反应，自然升温至室温，继续反应，然后加入10％HAc/THF分解过量的DCC，用HCl溶解洗涤，无水Na₂SO₄干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤，真空干燥后得白色固体状产物。