CN101568543B - 大环肽作为丙型肝炎病毒抑制剂 - Google Patents
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Abstract
公开了具有下列通式的大环肽：
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请序列号60/866,125(2006年11月16日申请)的权益。
本公开通常涉及抗病毒化合物，且更具体涉及可抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(本文还指的是“丝氨酸蛋白酶”)功能的化合物，包含这种化合物的组合物和抑制NS3蛋白酶的功能的方法。
HCV是主要人类病原体，在世界范围内，估计感染1.7亿人，是1型艾滋病毒所感染数目的大致5倍。大部分这些HCV感染的个体形成严重的渐进性肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。
目前，最有效的HCV治疗使用α干扰素和利巴韦林的组合，可在40％的患者中引起持续效果。最新的临床结果表明，作为单疗法，PEG化的α干扰素优于未修饰的α干扰素。然而，对于包括PEG化的α干扰素和利巴韦林的联用药的实验性治疗方案，大部分患者的病毒载量不会持续降低。由此，对于治疗HCV感染的有效疗法，还有明显和未满足的需要。
HCV是正链RNA病毒。基于推断的氨基酸序列和在5′非翻译区的广泛相似性的对比，已经将HCV分类为黄病毒科中的独立种类。黄病毒科的所有成员具有包膜的病毒体，该病毒体含有正链RNA基因组，通过单个连续的开放读框的转译，该基因组编码所有已知的病毒特异性蛋白。
在核苷酸内和整个HCV基因组的编码氨基酸序列中，发现了相当多的异质性。已经表征了六个主要基因型，并且已经描述了50个以上的亚型。HCV的主要基因型在世界范围内的分布是不同的，HCV的遗传异质性的临床意义仍然是难以捉摸的，尽管对于基因型在致病性和治疗方面的可能效果进行了许多研究。
单链HCV RNA基因组的长度大约为9500个核苷酸，并且具有单个开放读框(ORF)，其编码大约3000个氨基酸的单个大的多蛋白。在受感染细胞中，这种多蛋白在许多位点被细胞和病毒蛋白酶裂解，产生结构和非结构(NS)性蛋白。就HCV来说，成熟型非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响。第一个在NS2-NS3接合点裂解；第二个是包含在NS3的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶，并且介导在NS3下游的所有随后的裂解，在NS3-NS4A裂解位点两者是以顺式形式，对于剩余的NS4A-NS4B NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点，是以反式形式。NS4A蛋白似乎可提供许多功能，充当NS3蛋白酶的辅因子，并且可能帮助NS3及其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白与NS4A形成复合物对于有效的多蛋白加工是必不可少的，可以在所有位点提高分解蛋白的裂解。NS3蛋白还显示出核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是依赖于RNA的RNA聚合酶，其涉及在HCV的复制中。
本公开提供了例如在与NS4A蛋白酶的组合中可抑制NS3蛋白酶的功能的肽化合物。进一步的，本公开描述了给予患者组合治疗，使得按照本公开的化合物(其可有效抑制HCV NS3蛋白酶)可以与一或两种具有抗HCV活性的其它化合物一起给予。
在第一个方面，本公开提供了式(I)的化合物：
或其可药用盐，其中
R1选自烷氧基、羟基和-NHSO2R7；
R2a和R2b独立地选自氢和甲基；
R3选自烯基，烷基，芳基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，杂环基和杂环基烷基；
R4是-OR8；
R5选自氢、烷基和环烷基；
R6选自氢，烷基，烷氧羰基，烷胺基羰基，烷基羰基，氨基羰基，芳氧羰基，环烷基氧基羰基，二烷胺基羰基，卤代烷氧基羰基，卤代烷基，卤代烷基羰基，杂环基氧基羰基和(NRaRb)磺酰基；
R7选自烷基，芳基，环烷基，(环烷基)烷基，二烷胺基羰基，二烷胺基羰基烷基，杂环基，杂环基羰基和-NRaRb；其中环烷基和(环烷基)烷基的环烷基部分任选被一个、两个或三个独立选自下列的基团取代：烯基，烷氧基，烷氧基烷基，烷基，芳烷基，芳基羰基，氰基，环烯基，(环烷基)烷基，卤素，卤代烷氧基，卤代烷基和(NReRf)羰基；和其中Ra和Rb独立地选自氢，烷氧基，烷基，芳基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，卤代烷基，杂环基和杂环基烷基；和其中Re和Rf独立地选自氢，烷基，芳基，芳烷基和杂环基；其中芳基、芳烷基的芳基部分和杂环基任选被一或两个独立地选自烷氧基、烷基和卤素的取代基取代；和
R8选自烷氧基烷基，烷基，烷基羰基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，环烷基羰基，卤代烷氧基烷基，卤代烷基，(NRcRd)羰基和-P(O)(OR′)2；其中Rc和Rd独立地选自氢、烷基和芳烷基；或Rc和Rd与它们相连接的氮原子一起形成5或6元单环杂环，该杂环任选含有一个选自O、NRx和S的额外杂原子；其中Rx选自氢和烷基；且其中R′选自氢和烷基；和
Q是C3-9饱和或不饱和链，任选包含一个至三个独立地选自O、S(O)m和NR9的杂原子，其中m是0、1或2，和R9选自氢，烷氧基，烷氧羰基，烷基，烷基羰基，烷基磺酰基，氨基羰基，芳基磺酰基，环烷基，(环烷基)烷基，环烷基氧基，二烷胺基羰基，二烷胺基羰基烷基，卤代烷基和杂环基羰基。
在第一个方面的第一个实施方案中，本公开提供了式(I)的化合物或其可药用盐，其中R1是-NHSO2R7。
在第一个方面的第二个实施方案中，本公开提供了式(I)的化合物或其可药用盐，其中R7是环烷基。
在第一个方面的第三个实施方案中，本公开提供了式(I)的化合物或其可药用盐，其中R2a和R2b是氢。
在第一个方面的第四个实施方案中，本公开提供了式(I)的化合物或其可药用盐，其中Q是包含零个杂原子的C5-7不饱和链。在第五个实施方案中，Q是含有零个杂原子的C6不饱和链。
在第二个方面，本公开提供了式(II)的化合物：
或其可药用盐，其中
R1是-NHSO2R7；
R2a和R2b是氢；
R3选自烯基，烷基，芳基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，杂环基和杂环基烷基；
R4是-OR8；
R5是氢；
R6是烷氧羰基；
R7选自烷基，芳基，环烷基，(环烷基)烷基，二烷胺基羰基，二烷胺基羰基烷基，杂环基，杂环基羰基和-NRaRb；其中Ra和Rb独立地选自氢，烷氧基，烷基，芳基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，卤代烷基，杂环基和杂环基烷基；
R8选自烷氧基烷基，烷基，烷基羰基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，环烷基羰基，卤代烷氧基烷基，卤代烷基，(NRcRd)羰基和-P(O)(OR′)2；其中Rc和Rd独立地选自氢、烷基和芳烷基；或Rc和Rd与它们相连接的氮原子一起形成5或6元单环杂环，该杂环任选含有一个选自O、NRx和S的额外杂原子；其中Rx选自氢和烷基；和其中R′选自氢和烷基；和
Q是C3-9饱和或不饱和链，任选包含一个至三个独立地选自O、S(O)m和NR9的杂原子，其中m是0、1或2，R9选自氢，烷氧基，烷氧羰基，烷基，烷基羰基，烷基磺酰基，氨基羰基，芳基磺酰基，环烷基，(环烷基)烷基，环烷基氧基，二烷胺基羰基，二烷胺基羰基烷基，卤代烷基和杂环基羰基。
在第二个方面的第一个实施方案中，本公开提供了式(II)的化合物或其可药用盐，其中R7是环烷基。
在第二个方面的第二个实施方案中，本公开提供了式(II)的化合物或其可药用盐，其中Q是包含零个杂原子的C6不饱和链。
在第三个方面，本公开提供了下述的化合物：
或其可药用盐。
在第四个方面，本公开提供了组合物，其包含式(I)的化合物或其可药用盐和可药用载体。在第四方面的第一个实施方案中，组合物进一步包含至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。在第四个方面的第二个实施方案中，其它化合物的至少一种是干扰素或利巴韦林。在第四个方面的第三个实施方案中，干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和成淋巴干扰素tau。
在第四个方面的第四个实施方案中，本公开提供了组合物，该组合物包含式(I)的化合物或其可药用盐、可药用载体和至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中至少一种其它化合物选自白细胞间介素2、白细胞间介素6、白细胞间介素12、可增加1型辅助性T细胞响应形成的化合物、干扰性的RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、次黄嘌呤核苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
在第四个方面的第五个实施方案中，本公开提供了组合物，该组合物包含式(I)的化合物或其可药用盐、可药用载体和至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中至少一种其它化合物可有效抑制选自下列的靶向的功能，用于治疗HCV感染：HCV金属蛋白酶，HCV丝氨酸蛋白酶，HCV聚合酶，HCV解螺旋酶，HCV NS4B蛋白，HCV入口，HCV组装，HCV出口，HCV NS5A蛋白和IMPDH。
在第五个方面，本公开提供了治疗患者HCV感染的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐。在第五个方面的第一个实施方案中，该方法进一步包括给予至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其它化合物在给予式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或与其同时给予。在第二个实施方案中，其它化合物中的至少一种是干扰素或利巴韦林。在第三个实施方案中，干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和淋巴样干扰素tau。
在第五个方面的第四个实施方案中，本公开提供了治疗患者HCV感染的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐和至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中至少一种其它化合物在给予式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或与其同时给予，其中至少一种其它化合物选自白细胞间介素2、白细胞间介素6、白细胞间介素12、可增加1型辅助性T细胞响应形成的化合物、干扰性的RNA、反义RNA、咪奎莫特、利巴韦林、次黄嘌呤核苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
在第五个方面的第五个实施方案中，本公开提供了治疗患者HCV感染的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐和至少一种具有抗HCV活性的其它化合物，其中至少一种其它化合物在给予式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或与其同时给予，其中至少一种其它化合物可有效抑制靶向的功能，对于治疗HCV感染，靶向选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV入口、HCV组装、HCV出口、HCV NS5A蛋白和IMPDH。
在第六个方面，本公开提供了组合物，其包含式(I)的化合物或其可药用盐、具有抗HCV活性的一种、两种、三种、四种或五种其它化合物和可药用载体。在第六个方面的第一个实施方案中，该组合物包含三或四种具有抗HCV活性的其它化合物。在第六个方面的第二个实施方案中，该组合物包含一或两种具有抗HCV活性的其它化合物。
在第七个方面，本公开提供了治疗患者HCV感染的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐和具有抗HCV活性的一种、两种、三种、四种或五种其它化合物，其它化合物在给予式(I)化合物或其可药用盐之前、之后或与其同时给予。在第七个方面的第一个实施方案中，该方法包括给予三或四种具有抗HCV活性的其它化合物。在第七个方面的第二个实施方案中，该方法包括给予一或两种具有抗HCV活性的其它化合物。
本公开的其它方面可以包括本文所公开实施方案的合适组合。
其它方面和实施方案可以在本文提供的说明书中得到。
应该将本公开的说明书视为与法律和化学键合原理相一致。在有些情况下，可能需要在任何给定位置除去氢原子，以便容纳取代基。
应该理解，本公开所涵盖的化合物是可合适稳定地用作药物试剂的那些化合物。
说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献在本文中以其整体引入作为参考。在不一致的情况下，以本公开(包括定义)为准。
在本说明书中使用的下列术语具有指明的含义：
本文使用的术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的2至6个碳原子的直链或支链基。
本文使用的术语“烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的烷基。
本文使用的术语“烷氧基烷基”是指被一个、两个或三个烷氧基取代的烷基。
本文使用的术语“烷氧羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的烷氧基。
本文使用的术语“烷基”是指衍生自含有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
本文使用的术语“烷基氨基”是指-NHR，其中R是烷基。
本文使用的术语“烷胺基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的烷基氨基。
本文使用的术语“烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的烷基。
本文使用的术语“烷基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的烷基。
本文使用的术语“氨基”是指-NH2。
本文使用的术语“氨基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的氨基。
本文使用的术语“芳基”是指苯基或其中一个或两个环是苯基的双环稠环***。双环稠环***由与4至6元芳香或非芳香碳环稠合的苯基组成。本公开的芳基可以通过基团中的任何可取代的碳原子与母体分子部分相连接。芳基的代表性例子包括但不局限于茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。本公开的芳基可以任选被一个、两个、三个、四个或五个独立选自下列的取代基取代：烯基，烷氧基，烷氧羰基，烷基，第二个芳基，芳烷基，芳氧基，氰基，氰基烷基，卤素，卤代烷氧基，卤代烷基，杂环基，杂环基烷基，硝基和氧代；其中第二个芳基、芳烷基和芳氧基的芳基部分、杂环基和杂环基烷基的杂环基部分可以进一步任选被一个、两个、三个、四个或五个独立选自下列的取代基取代：烯基，烷氧基，烷基，氰基，卤素，卤代烷氧基，卤代烷基，硝基和氧代。
本文使用的术语“芳烷基”是指被一个、两个或三个芳基取代的烷基。
本文使用的术语“芳基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的芳基。
本文使用的术语“芳氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的芳基。
本文使用的术语“芳氧羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的芳氧基。
本文使用的术语“芳基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的芳基。
本文使用的术语“羰基”是指-C(O)-。
本文使用的术语“氰基”是指-CN。
本文使用的术语“氰基烷基”是指被一个、两个或三个氰基取代的烷基。
本文使用的术语“环烯基”是指具有三个至十四个碳原子和零个杂原子的非芳香化的、部分不饱和单环的、双环的或三环***。环烯基的代表性的例子包括但不局限于环己烯基、八氢萘基和降冰片烯基。
本文使用的术语“环烷基”是指具有三个至十四个碳原子和零个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环***。环烷基的代表性的例子包括但不局限于：环丙基、环戊基、二环[3.1.1]庚基和金刚烷基。
本文使用的术语“(环烷基)烷基”是指被一个、两个或三个环烷基取代的烷基。
本文使用的术语“环烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的环烷基。
本文使用的术语“环烷基氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的环烷基。
本文使用的术语“环烷基氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的环烷基氧基。
本文使用的术语“二烷基氨基”是指-NR2，其中每个R是烷基。两个R基团可以相同或不同。
本文使用的术语“二烷胺基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的二烷基氨基。
本文使用的术语“二烷胺基羰基烷基”是指被一个、两个或三个二烷胺基羰基取代的烷基。
本文使用的术语“卤素”和“卤代”是指F、Cl、Br或I。
本文使用的术语“卤代烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的卤代烷基。
本文使用的术语“卤代烷氧基烷基”是指被一个、两个或三个卤代烷氧基取代的烷基。
本文使用的术语“卤代烷氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的卤代烷氧基。
本文使用的术语“卤代烷基”是指被一个、两个、三个或四个卤素原子取代的烷基。
本文使用的术语“卤代烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的卤代烷基。
本文使用的术语“杂环基”是指含有一个、两个或三个独立地选自氮、氧和硫杂原子的5、6或7元环。五员环具有零至两个双键，六和七元环具有零至三个双键。术语“杂环基”还包括双环基团，其中杂环基环与4至7元(优选4至6元)芳香或非芳香化碳环或另一个单环杂环基稠合。本公开的杂环基可以通过基团中的碳原子或氮原子与母体分子部分相连接。杂环基的例子包括但不局限于：苯并噻吩基，呋喃基，咪唑基，二氢吲哚基，吲哚基，异噻唑基，异噁唑基，吗啉基，噁唑基，哌嗪基，哌啶基，吡唑基，吡啶基，吡咯烷基，吡咯并吡啶基，吡咯基，噻唑基，噻吩基和硫吗啉基。本公开的杂环基可以任选被一个、两个、三个、四个或五个独立选自下列的取代基取代：烯基，烷氧基，烷氧羰基，烷基，芳基，芳烷基，芳氧基，氰基，氰基烷基，卤素，卤代烷氧基，卤代烷基，第二个杂环基，杂环基烷基，硝基和氧代；其中芳基、芳烷基和芳氧基的芳基部分、第二个杂环基和杂环基烷基的杂环基部分可以进一步任选被一个、两个、三个、四个或五个独立选自下列的取代基取代：烯基，烷氧基，烷基，氰基，卤素，卤代烷氧基，卤代烷基，硝基和氧代。
本文使用的术语“杂环基烷基”是指被一个、两个或三个杂环基取代的烷基。
本文使用的术语“杂环基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的杂环基。
本文使用的术语“杂环基氧基”是指通过氧原子与母体分子部分连接的杂环基。
本文使用的术语“杂环基氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的杂环基氧基。
本文使用的术语“羟基”是指-OH。
本文使用的术语“硝基”是指-NO2。
本文使用的术语“-NRaRb”是指通过氮原子与母体分子部分连接的两个基团Ra和Rb。Ra和Rb独立地选自氢，烷氧基，烷基，芳基，芳烷基，环烷基，(环烷基)烷基，卤代烷基，杂环基和杂环基烷基。
本文使用的术语“(NRaRb)磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分连接的-NRaRb。
本文使用的术语“-NReRf”是指通过氮原子与母体分子部分连接的两个基团Re和Rf。Re和Rf独立地选自氢、烷基、芳基、芳烷基和杂环基；其中芳基、芳烷基的芳基部分和杂环基任选被一或两个独立地选自烷氧基、烷基和卤素的取代基取代。
本文使用的术语“(NReRf)羰基”是指通过羰基与母体分子部分连接的-NReRf。
本文使用的术语“氧代”是指＝O。
本文使用的术语“磺酰基”是指SO2。
本公开的化合物可以以前体药物形式存在。本文使用的术语“前体药物”表示可通过在血液中水解而快速体内转化为母体化合物的化合物。本公开的前体药物包括母体分子上的羟基的酯、母体分子上的羧基的酯和母体分子上的胺的酰胺。
本公开的化合物可以以可药用盐形式存在。本文使用的术语“可药用盐”表示本公开化合物的盐或两性离子形式，其要是水或油溶的或可分散的，在可靠的医学判断范围内，其要适合于接触患者的组织，没有过量的毒性、刺激性、***反应或其它问题或并发症，与合理的益处/危险比例相称，并且对于它们的预定用途是有效的。盐可以在化合物的最终分离和纯化期间制备，或通过合适碱性官能团与合适酸的反应来单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐，己二酸盐，海藻酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐；二葡糖酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，甲酸盐，富马酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，均三甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，萘磺酸盐，烟酸盐，2-萘磺酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酯酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐，磷酸盐，谷氨酸盐，碳酸氢盐，对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。可以用于形成可药用加成盐的酸的例子包括无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，和有机酸例如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。
碱加成盐可以在化合物的最终分离和纯化期间制备，通过酸性基团与合适碱例如氢氧化物、金属阳离子的碳酸盐或碳酸氢盐进行反应，或与氨或有机伯、仲或叔胺反应。可药用盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝阳离子，以及非毒性的季胺阳离子，例如铵，四甲铵，四乙铵，甲胺，二甲胺，三甲胺，三乙胺，二乙胺，乙胺，三丁基胺，吡啶，N，N-二甲苯胺，N-甲基哌啶，N-甲基吗啉，二环己基胺，普鲁卡因，二苄胺，N，N-二苄基苯乙胺和N，N′-二苄基乙二胺。可用于形成碱加成盐的其它代表性的有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。
本文使用的术语“抗HCV活性”是指化合物可有效治疗HCV病毒。
术语“本公开的化合物”和等效表达是指式(I)的化合物和其可药用对映体、非对映体和盐。同样，中间体是指上下文中容许的它们的盐。
术语“患者”包括人及其它哺乳动物。
术语“药物组合物”是指一种组合物，其包含本公开的化合物与至少一种其它药物载体的组合，载体即助剂、赋形剂或载体，例如稀释剂，防腐剂，填料，流动调节剂，崩解剂，湿润剂，乳化剂，悬浮剂，甜味剂，调味剂，香料，抗菌剂，抗真菌剂，润滑剂和分配剂，这取决于给药模式和剂型。可以使用例如列于Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1999)中的组分。
本文使用的短语“药学可接受的”指的是那些化合物、物质、组合物和/或剂型，在可靠的医学判断范围内，其适合与患者的组织接触，没有过分的毒性、刺激性、***反应或其它问题或并发症，与合理的危险/益处比例相称。
术语“治疗有效量”是指足以显示有意义的患者益处例如病毒载量持续减少的各个活性组分的总量。当单独给予应用于单一活性组分时，该术语是指单独的组分。当应用于组合中时，该术语是指可引起治疗效果的活性组分的组合数量，不论组合给予、连续给予或同时给予。
术语“治疗”是指：(i)防止疾病、障碍或病症在患者中出现，其可能被预示患该疾病、障碍和/或病症，但还没有确诊；(ii)抑制疾病、障碍或病症，即延滞其发展；和/或(iii)减轻疾病、障碍或病症，即引起疾病、障碍和/或病症的衰退。
在用于命名本公开化合物的情况下，本文使用的符号P1′、P1、P2、P2*、P3和P4标记蛋白酶抑制剂结合的氨基酸残基的相对位置(相对于天然肽裂解基质的结合位置)。裂解存在于P1和P1′之间的天然基质中，其中非主要位置表示从向N-末端延伸的肽固有裂解位点的C末端起始的氨基酸；而主要位置从裂解位点符号的N-末端发出，并向C-末端延伸。例如，P1′是指远离裂解位点的C-末端的右手端的第一个位置(即N-末端第一个位置)；而P1从C-末端裂解位点P2(从C-末端起始的第二个位置，等等)的左侧开始计数。(参见Berger A.& Schechter I.，Transactions of the Royal Society London series(1970)，B257，249-264]。
不对称中心存在于本公开的化合物中。例如，化合物可以包括下式的P1环丙基单元：
其中C1和C2各自表示环丙基环的1和2位置处的不对称碳原子。
(1R，2S) (1S，2R)
R2与羰基同侧 R2与羰基同侧
(1R，2R) (1S，2S)
R2与酰胺基同侧 R2与酰胺基同侧
应该理解，本公开包括具有抑制HCV蛋白酶能力的所有立体化学形式或其混合物。
本公开的某些化合物还可以存在不同的稳定构造形式，这种形式是可以分离的。扭转不对称性是由于非对称单键周围的阻旋作用，例如由于空间位阻或环张力，可以分离不同的构象异构体。本公开包括这些化合物的每个构象异构体和其混合物。
本公开的某些化合物可以存在两性离子形式，并且本公开包括这些化合物的每种两性离子形式和其混合物。
当用于治疗时，可以以原始化学制剂形式给予治疗有效量的式(I)化合物以及其可药用盐，这可以提供药物组合物的活性组分。相应地，本公开进一步提供了药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)化合物或其可药用盐和一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。式(I)的化合物和其可药用盐如上所述。载体、稀释剂或赋形剂必须是可接受的，与制剂的其它组分不矛盾，并且对其接受者无害。按照本公开的另一个方面，提供了制备药物制剂的方法，该方法包括：将式(I)的化合物或其可药用盐与一或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂混合。
药物制剂可以以单位剂量形式提供，每单位剂量含有预先确定数量的活性组分。对于预防和治疗HCV介导的疾病，典型的单疗法是：每天给予大约0.01和大约250毫克每千克(“mg/kg”)体重的剂量水平的本公开化合物，优选在每天大约0.05和大约100mg/kg体重之间。典型地，本公开的药物组合物每天可以给予大约1至大约5次，或者连续输液。这种给药形式可以用作慢性或急性治疗。可以与载体物质组合来制备单一剂型的活性组分量可以变化，这取决于所治疗病症、病症的严重程度、给药时间、给药途径、所使用化合物的***速度、治疗持续时间和患者的年龄、性别、重量和病症。优选的单位剂量制剂是含有本文上面列举的活性组分的日剂量或亚剂量、或其合适部分的那些制剂。通常，用基本上小于化合物的最佳剂量的小剂量来开始治疗。而后，少量地增加剂量，直到在这种情况下达到最佳效果为止。通常，最优选，以通常得到抗病毒有效结果而不引起任何不良或有害副作用的浓度水平给予化合物。
当本公开的组合物包含本公开化合物与一或多种其它治疗或预防性药剂的组合时，化合物和其它药剂两者通常以单疗法方案中通常剂量的大约10至150％之间的剂量水平存在，且更优选在大约10和80％之间。
药物制剂可以适合于任何合适途径给药，例如口服(包括口腔或舌下)、直肠、鼻部、局部(包括面颊、舌下、或透皮)、***或肠胃外(包括皮下、皮内、肌注、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或皮内注射或输液)途径。这种制剂可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如使活性组分与载体或赋形剂组合。
适合于口服的药物制剂可以以离散单元形式提供，例如胶囊或片剂；粉末或颗粒；在水或非水液体中的溶液或悬浮液；食用泡沫或whips；或水包油型液体乳胶或油包水乳化液。
例如，对于片剂或胶囊形式的口服给药，可以将活性药物组份与口服、无毒的可药用惰性载体例如乙醇、丙三醇、水等等结合。粉末是如下制备的：将化合物磨碎至合适大小的粉末，与类似磨碎的药学载体例如食用碳水化合物例如淀粉或甘露糖醇混合。还可以存在调味剂、防腐剂、分散和着色剂。
胶囊可以如下制备：制备如上所述的粉末混合物，并填充到成形的凝胶壳中。可以将助流剂和润滑剂例如胶态硅石、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加入到粉末混合物中，而后进行填充。当摄取胶囊时，还可以加入崩解或增溶剂例如琼脂、碳酸钙或碳酸钠，以提高药物的利用率。
此外，当要求或需要时，还可以将合适结合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂结合进混合物中。合适的结合剂包括淀粉，凝胶，天然糖例如葡糖或β-乳糖，玉米甜味剂，天然和合成树胶例如***胶、黄芪胶或海藻酸钠，羧甲纤维素，聚乙二醇等等。用于这些剂型中的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。如下配制片剂：例如制备粉末混合物，造粒或制成棒条，加入润滑剂和崩解剂，并挤压成为片剂。如下制备粉末混合物：将合适粉碎的化合物与如上所述的稀释剂或基质混合，任选与下列混合：结合剂例如羧甲纤维素、藻酸、凝胶或聚乙烯吡咯烷酮，溶液阻滞剂例如石蜡烃、再吸收促进剂例如季盐和/或吸收剂例如膨润土、高岭土或磷酸氢钙。可以将粉末混合物如下进行造粒：用结合剂例如糖浆、淀粉糊、acadia胶浆或纤维素或聚合物质的溶液湿润，并迫使其通过筛。作为造粒的替代性方法，可以使粉末混合物流过压片机，结果是，不完全成形的棒条被***成颗粒。借助于加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油，可以将颗粒润滑，以防止粘住片剂胎模。然后将润滑的混合物压缩成片剂。还可以将本公开的化合物与易流动的惰性载体结合，并直接压缩成片剂，不用经历造粒或形成棒条步骤。可以提供清洁的或不透明防护涂层(由密封的片胶层、糖涂层或聚合材料涂层和石蜡的抛光涂层组成)。可以将染料加入到这些涂层中，以区别不同的单位剂量。
可以制备剂量单位形式的口服液体例如溶液、糖浆和酏剂，以使给定数量包含预定数量的化合物。可以通过将化合物溶解在合适调味的水溶液中来制备糖浆，而酏剂是通过使用无毒的赋形剂来制备的。还可以加入增溶剂和乳化剂(例如乙氧基化异十八烷醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(例如薄荷油或天然甜味料或糖精或其它人工甜味料)，等等。
如果合适的话，口服剂量单位制剂可以是微囊密封的。还可以制备延长或持续释放的制剂，例如，通过在聚合物、石蜡等等中涂渍或嵌入颗粒性物质。
还可以以脂质体递送***的形式给予式(I)的化合物和其可药用盐，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多层气泡。脂质体可以由各种磷脂例如胆固醇、十八烷胺硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
式(I)的化合物和其可药用盐也可以利用化合物分子结合的单一载体形式的单克隆抗体来递送。本化合物也可以与作为目标药物载体的可溶性聚合物结合。这种聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺酚，聚羟乙基天冬酰胺酚，或棕榈酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，本化合物可以与可生物降解的聚合物结合，用于实现药物的控制释放，例如聚乳酸、聚ε己内酯(polepsiloncaprolactone)、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚乙缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两亲性的水凝胶的嵌段共聚物。
可以以离散贴片形式(预定保持与接受者的表皮密切接触较长的一段时间)提供适合于透皮给药的药物制剂。例如，利用通常在Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中描述的离子电渗疗法，活性组分可以从贴片中递送。
可以将适合于局部给药的药物制剂配制为油膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、软膏、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。
对于治疗眼睛或其它外部组织，例如口腔和皮肤，优选，以局部油膏或乳膏的形式施用制剂。当配制油膏时，活性组分可以与石蜡或水可互溶的软膏基质一起使用。或者，可以将活性组分与水包油型膏用底物或油包水型基质一起配制为乳膏。
适合于局部给予眼睛的药物制剂包括滴眼剂，其中活性组分溶解或悬浮在合适载体中，尤其是水溶剂。
适合于局部给予口腔的药物制剂包括糖锭、软锭剂和漱口剂。
适合于直肠给予的药物制剂可以以栓剂或灌肠剂形式提供。
适合于鼻部给药的药物制剂(其中载体是固体)包括具有例如20至500微米范围粒径的粗粉，其是采用鼻吸的方式给予，即从接近鼻子的粉末容器中快速吸入通过鼻腔。对于鼻喷入或滴鼻剂形式的合适制剂(其中载体是液体)，包括活性组分的水或油溶液。
适合于吸入给药的药物制剂包括细粒或雾剂，其可以利用各种型式的可计量的、剂量加压的喷雾器、雾化器或吹入器来产生。
适合于***给药的药物制剂可以以***栓、塞、乳膏、凝胶剂、软膏、泡沫或喷雾剂的形式提供。
适于肠胃外给药的药物制剂包括含水和无水无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，使制剂与预定接受者的血液等渗压；和可以包含悬浮剂和增稠剂的含水和非水无菌的悬浮液。制剂还可以提供在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和管瓶，并且可以保存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用之前，只需要加入无菌的液体载体，例如水，用于立刻注射。临时的注射液和悬浮液可以用无菌粉末、颗粒和片剂制备。
应该理解，除了上面特别提及的组分之外，制剂可以包含本领域对于所述制剂类型惯用的其它药剂，例如适合于口服的那些制剂可以包含调味剂。
下面表1列出了可以与本公开化合物一起给予的化合物的一些说明性例子。在组合治疗中，本公开的化合物可以与其它抗HCV活性化合物一起给予，可以联合或单独给予，或通过将化合物组合为组合物来给予。
表1
| 商品名 | 生理学类别 | 抑制剂的类型或靶向 | 来源公司 |
| NIM811 | 亲环素抑制剂 | Novartis | |
| 日达仙(Zadaxin) | 免疫调节剂 | Sciclone | |
| Suvus | 亚甲基蓝 | Bioenvision | |
| Actilon(CPG10101) | TLR9激动剂 | Coley | |
| Batabulin(T67) | 抗癌剂 | β-微管蛋白抑制剂 | Tularik Inc.，SouthSan Francisco，CA |
| 商品名 | 生理学类别 | 抑制剂的类型或靶向 | 来源公司 |
| ISIS 14803 | 抗病毒 | 反义 | ISISPharmaceuticalsInc，Carlsbad，CA/ElanPhamaceuticalsInc.，New York，NY |
| Summetrel | 抗病毒 | 抗病毒 | EndoPharmaceuticalsHoldings Inc.，Chadds Ford，PA |
| GS-9132(ACH-806) | 抗病毒 | HCV抑制剂 | Achillion/Gilead |
| 吡唑并嘧啶化合物和盐源于WO-2005047288，2005年5月26日 | 抗病毒 | HCV抑制剂 | Arrow TherapeuticsLtd. |
| 左旋韦林(Levovirin) | 抗病毒 | IMPDH抑制剂 | Ribapharm Inc.，Costa Mesa，CA |
| Merimepodib(VX-497) | 抗病毒 | IMPDH抑制剂 | VertexPharmaceutical sInc.，Cambridge，MA |
| XTL-6865(XTL-002) | 抗病毒 | 单克隆抗体 | XTLBiopharmaceuticalsLtd.，Rehovot，Isreal |
| 商品名 | 生理学类别 | 抑制剂的类型或靶向 | 来源公司 |
| Telaprevir(VX-950，LY-570310) | 抗病毒 | NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂 | VertexPharmaceuticalsInc.，Cambridge，MA/Eli Lilly andCo.Inc.，Indianapolis，IN |
| HCV-796 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Wyeth/Viropharma |
| NM-283 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Idenix/Novartis |
| GL-59728 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Gene Labs/Novartis |
| GL-60667 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Gene Labs/Novartis |
| 2’C MeA | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Gilead |
| PSI 6130 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Roche |
| R1626 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Roche |
| 2’C甲基腺苷酸 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Merck |
| JTK-003 | 抗病毒 | RdRp抑制剂 | Japan Tobacco Inc.，Tokyo，Japan |
| 左旋韦林(Levovirin) | 抗病毒 | 利巴韦林 | ICNPharmaceuticals，Costa Mesa，CA |
| 利巴韦林 | 抗病毒 | 利巴韦林 | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| 利巴韦林前体(Viramidine) | 抗病毒 | 利巴韦林前体药物 | Ribapharm Inc.，Costa Mesa，CA |
| Heptazyme | 抗病毒 | 核糖酶 | RibozymePharmaceuticalsInc.，Boulder，CO |
| 商品名 | 生理学类别 | 抑制剂的类型或靶向 | 来源公司 |
| BILN-2061 | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | BoehringerIngelheim PharmaKG，Ingelheim，Germany |
| SCH 503034 | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | Schering Plough |
| Zadazim | 免疫调节剂 | 免疫调节剂 | SciClonePharmaceuticalsInc.，San Mateo，CA |
| Ceplene | 免疫调节剂 | 免疫调节剂 | MaximPharmaceuticalsInc.，San Diego，CA |
| CellCept | 免疫抑制剂 | HCV IgG免疫抑制剂 | F..Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| Civacir | 免疫抑制剂 | HCV IgG免疫抑制剂 | NabiBiopharmaceuticalsInc.，Boca Raton，FL |
| Albuferon-α | 干扰素 | 白蛋白IFN-α2b | Human GenomeSciences Inc.，Rockville，MD |
| Infergen A | 干扰素 | IFN alfacon-1 | InterMunePharmaceuticalsInc.，Brisbane，CA |
| Omega IFN | 干扰素 | IFN-ω | IntarciaTherapeutics |
| IFN-β和EMZ701 | 干扰素 | IFN-β和EMZ701 | TransitionTherapeutics Inc.，Ontario，Canada |
| 商品名 | 生理学类别 | 抑制剂的类型或靶向 | 来源公司 |
| Rebif | 干扰素 | IFN-β1a | Serono，Geneva，Switzerland |
| Roferon A | 干扰素 | IFN-α2a | F..Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| Intron A | 干扰素 | IFN-α2b | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| Intron A和日达仙(Zadaxin) | 干扰素 | IFN-α2b/α1-胸腺素 | RegeneRxBiopharmiceuticalsInc.，Bethesda，MD/SciClonePharmaceuticalsInc，San Mateo，CA |
| Rebetron | 干扰素 | IFN-α2b/利巴韦林 | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| Actimmune | 干扰素 | INF-γ | InterMune Inc.，Brisbane，CA |
| 干扰素-β | 干扰素 | 干扰素-β-1a | Serono |
| Multiferon | 干扰素 | 长效IFN | Viragen/Valentis |
| Wellferon | 干扰素 | 类淋巴母细胞IFN-αn1 | GlaxoSmithKlineplc，Uxbridge，UK |
| Omniferon | 干扰素 | 天然IFN-α | Viragen Inc.，Plantation，FL |
| 派罗欣 | 干扰素 | PEG化的IFN-α2a | F..Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| 商品名 | 生理学类别 | 抑制剂的类型或靶向 | 来源公司 |
| 派罗欣和Ceplene | 干扰素 | PEG化的IFN-α2a/免疫调节剂 | MaximPharmaceuticalsInc.，San Diego，CA |
| 派罗欣和利巴韦林 | 干扰素 | PEG化的IFN-α2a/利巴韦林 | F..Hoffmann-LaRoche LTD，Basel，Switzerland |
| PEG-Intron | 干扰素 | PEG化的IFN-α2b | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| PEG-Intron/利巴韦林 | 干扰素 | PEG化的IFN-α2b/利巴韦林 | Schering-PloughCorporation，Kenilworth，NJ |
| IP-501 | 肝保护 | 抗纤维化 | IndevusPharmaceuticalsInc.，Lexington，MA |
| IDN-6556 | 肝保护 | 半胱天冬酶抑制剂 | IdunPharmaceuticalsInc.，San Diego，CA |
| ITMN-191(R-7227) | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | InterMunePharmaceuticalsInc.，Brisbane，CA |
| GL-59728 | 抗病毒 | NS5B复制酶抑制剂 | Genelabs |
| ANA-971 | 抗病毒 | TLR-7激动剂 | Anadys |
| TMC-465350 | 抗病毒 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂 | Medivir/Tibotec |
本公开的化合物还可以用作实验室试剂。对于病毒复制试验的设计、动物试验***的验证和结构生物学研究，该化合物可以有助于提供研究工具，从而增加对HCV疾病机理的认识。进一步的，本公开的化合物可有效用于建立或确定其它抗病毒化合物的结合位点，例如，利用竞争性抑制。
本公开的化合物还可以用于治疗或预防物质的病毒污染，因此可降低接触到这种物质的实验室或医务人员或患者的病毒感染危险，这种物质例如血液、组织、手术器械和服装、实验仪器和服装、和血液收集或输液装置和材料。
当通过合成方法或通过代谢过程(包括存在于人或动物体中的那些(体内)或体外存在的过程)制备时，本公开包括具有式(I)的化合物。
通常用于鉴别本文所公开化合物的化学缩写包括：Bn：苄基；Boc：叔丁氧羰基{Me3COC(O)}；BSA：牛血清白蛋白；CDI：羰二咪唑；DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]-十一-7-烯；CH2Cl2＝DCM：二氯甲烷；TBME：叔丁基甲醚；DEAD：偶氮二羧酸二乙酯；DIAD：二异丙基偶氮基二羧酸酯；DIEA：二异丙基乙胺；DIPEA：二异丙基乙胺；4-DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DCC：1，3-二环己基碳二亚胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DPPA：二苯基膦酰基叠氮化物；Et：乙基；EtOH：乙醇；EtOAc：乙酸乙酯；Et2O：二***；Grubb′s催化剂：双(三环己基膦)亚苄基二氯化钌(IV)；Grubb′s二代催化剂：三环己基膦[1，3-双(2，4，6-三甲基苯基)-4，5-二氢咪唑-2-亚基][亚苄基]二氯化钌(IV)；HATU：[O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；HBTU：[O-(1H-苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐；HOBT，1-羟基苯并***；HOAT：1-羟基-7-氮杂苯并***；HPLC：高效液相色谱；MS：质谱；Me：甲基；MeOH：甲醇；NMM：N-甲基吗啉；NMP：N-甲基吡咯烷；Pr：丙基；PPA：多磷酸；TBAF：四-正丁基铵氟化物；1，2-DCE或DCE：1，2-二氯乙烷；TFA：三氟乙酸；THF：四氢呋喃。
用于合成本公开化合物的起始原料为本领域技术人员所知，并且可以容易地制备或可商购。
下面列出的下列方法为说明性目的而提供，不是用来限制权利要求的范围。应该认识到，在制备这种化合物时，必需使用惯用的保护基来保护官能团，然后除去保护基，提供本公开的化合物。有关按照本公开的使用保护基的细节为本领域技术人员所知。
如反应路线1所示，可以使用本发明的中间体例如二肽(1)，制备式(I)的化合物。在该方法的第一步中，使用酸例如HCl，在溶剂例如醚中，将1的Boc保护的氮脱保护，提供相应的游离胺2。随后使用偶合剂例如HATU，在溶剂例如二氯甲烷中，胺2可以与氨基酸3偶合，提供三肽中间体4。应注意，在某些情况下，中间体例如3是可商购的，或者这种化合物可以容易地通过本领域已知的方法、以外消旋或手性方式制备。在式(I)化合物的结构中，关键转化是大环化过程，其中通用结构4的中间体转变为通用结构5的中间体。在引用的常规实施例中，中间体4转化为5可能受分子内部的烯烃易位(metathesis)反应的影响。这种类别的反应在本领域是非常确实的，因此，已经开发了许多烯烃易位催化剂，并且可商购。例如，二烯4转化为大环5可能受到用足够数量Grubb′s第一代烯烃易位催化剂的处理4的影响(在溶剂例如二氯甲烷或二氯乙烷中)。在4至5的转化的某些例子中，可能需要加热反应混合物，以便实现这种环化过程。然后，通过两步方法，中间体5转变为式(I)的化合物例如7。在这种方法的第一步中，中间体5的酯官能团水解为相应的羧酸6。这种转化可以通过皂化反应实现，其中在THF、甲醇和水的混合物中用碱例如氢氧化锂处理5。通过所示的与磺酰胺衍生物的简单偶合反应，得到的酸6可以转变为式(I)的化合物。例如，本领域沿用已久的是，在溶剂例如二氯甲烷中，用CDI处理羧酸例如6，原位产生活性中间体，当用磺酰胺处理该活性中间体时，提供7，即式(I)的化合物。
反应路线1
如果在上述最后的偶合过程即在6至7的转化中，R8SO2NH2本体是磺酰胺衍生物，例如RaRbNSO2NH2，那么可以使用其它偶合方法。在其中，使用碱例如双六甲基乙硅烷锂(在溶剂例如THF中)，磺酰胺中间体1(反应路线2)首先去质子化。然后将得到的磺酰胺阴离子2的THF溶液加入到含有活化羧酸的上述反应混合物中。然后将该反应混合物搅拌几小时，提供需要的酰基磺酰胺7。
反应路线2
式(I)的化合物还可以转变为其它的式I化合物，如本文所描述。这种方法的例子示于反应路线3中，其中式I的化合物(1)(其在P4位置携带Boc基团)转变为式I的化合物(3)(其中所述化合物在P4位置携带脲基团)。1至3的转化可以用两步方法进行，首先，在溶剂例如二氯甲烷中，用酸例如TFA处理1，1转化为胺2。在一当量碱的存在下，可以用异氰酸酯处理得到的胺TFA盐，提供式I的化合物(3)，其中P3部分用脲封端。如先前所注释，本领域技术人员可以认识到，中间体2可以用作制备式(I)化合物的起始原料，其中P3基团用酰胺或氨基甲酸酯封端。使用由胺形成所述P4官能团的标准条件，可以获得所述式I化合物的结构。
反应路线3
制备P2中间体和式(I)化合物的非限制性方法示于下面反应路线中。在具体实施例中给出的所述中间体、反应条件和方法广泛地适用于其它取代型式的化合物。例如，在反应路线IV的式(I)化合物中看到的P2单元的合成，可以按照所定义的合成路径来制备。在其中，用有机金属试剂例如格氏试剂(或者烷基或芳基锂物种，或者烷基或芳基锌物种)处理可商购的N-Boc-4-氧代-L-脯氨酸，提供中间体(2)，其中脯氨酸的C4位置携带R3取代基和游离的三级羟基。然后可以将中间体2的醇官能团功能化，提供所需要的R8官能团。在这种方法中，中间体2的醇可以参与本领域一系列较好建立的反应。例如，可以将2的醇酰化，提供酯、氨基甲酸酯或碳酸酯；将其烷基化，提供醚，将其膦酸化，提供磷酸酯。对于反应路线IV的中间体2至中间体3的转化，需要首先保护所示的2的羧基。
反应路线IV
醇的功能化的化学由Richard Larock在标准文本的例如下列题目中进行了描述：Comprehensive Organic Transformations：A Guide toFunctional Group Preparations.Second Addition。该文本由Wiley and Sons出版。在其中，标出了具体参考文献和综述，对于反应路线IV的中间体2至中间体3的转化，本领域技术人员可以容易地采用它们。例如，由醇形成醚的条件和相关参考文献可以在Larock′s文本的883页至929页找到。更具体地说，在890-894页引用的条件和参考文献与本发明实践的结构最相关。醇转化为相应酯衍生物的类似条件可以在Laroch′s文本的1952页和1955页找到。此外，描述在Journal of Organic Chemsitry2001，volume 66，8926页中的化学过程和其中引用的相关参考文献可有效用于本发明实践的结构。
应注意，有机金属试剂对脯氨酸衍生物1的酮部分进行加成(反应路线VI)在本领域是沿用已久的。例如，Hruby和同事(J.Org.Chem.2001，66，3593)描述了苯基溴化镁对反应路线IV的通用结构1的中间体进行加成。这些发现提供了下列证据：当使用叔丁基酯基作为C2羧基部分的保护基时，获得所需要的1，2加成物(2，反应路线VI)的最佳产率。此外，在关于加成反应的立体化学结果的X-射线晶体衍射形式中，该工作提供了明显的证据。具体地说，由于上述格氏试剂对酮1加成，获得单一产物，其中C4羟基和C2羧基假定为参照五元环的顺式相对取向。由此结构测定可推断，在反应路线VI的结构1的叙述中，R3M对1的酮进行加成中的表面选择性是α。即，有机金属对1中羰基的反面(底面)选择性地加成，可以提供具有所显示立体化学的相应叔醇(2)。
反应路线VI
Hruby的上述工作描述了具体格氏试剂对1的衍生物的加成(反应路线VI)。然而，各种格氏试剂对脯氨酸1的加成包括在本公开中。在本领域，描述有机金属试剂(包括格氏试剂)对酮进行加成的文献是相当多的，并且概括在综述中，例如：Comprehensive Organic FunctionalGroup Transformations.2卷：Synthesis：Carbon with one heteroatomattached by a single bond.Editor in Chief Alan.R.Katritzky，
等人1995.Chapter 2.02，37页。这种类别的反应还描述在Comprehensive Organic Synthesis中。Editor in Chief Barry M Trost，1卷：Additions to C-X pi-bonds(part 1).1991。
本领域最新的研究提供了进一步优化格氏试剂在对酮的加成反应中的条件，并且这些工作可以在本公开中使用。例如，Ishihara和同事(Org.Lett.2005，7卷，No.4，573)最近描述了镁盐型复合物的形成和应用性。镁盐型复合物R3MgLi源自于格氏试剂和烷基锂。如Ishihara所描述，在对酮的反应中，这些复合物提供了1，2加成物的出色产率。在一个单独研究中，Knochel和同事(Angew.Chem Int.Ed.2006，45，497)描述了在与有机镁试剂的结合中使用可溶性镧系盐例如LnCl3。这些镧系盐的存在可导致对于羰基化合物的1，2加成反应的效率提高。在对羰基化合物的简单加成中，这些工作和在其中引用的参考文献形成了在优化格氏反应方面的现有技术状态，并且在本公开中充当重要的资料来源。
也应注意，大量有机金属化合物可参与对酮的加成反应。包括在该工作中的试剂有例如芳基锂、烷基锂和杂芳基锂试剂，其在对羰基部分进行1，2方式加成是众所周知的。例如，在Dondoni和同事的最近研究(J.Org.Chem.2005，70，9257)中，使用BuLi将苯并噻唑锂化，并且将得到的C2-锂物种以1，2方式对内酯进行加成。利用类似方法，锂化的苯并噻唑可以预料以1，2方式对反应路线VI的酮1进行加成，提供中间体例如2a。
本领域技术人员可以认识到，衍生自杂环例如噁唑和噻唑和咪唑的有机金属试剂也可以参与对酮1的1，2加成反应。有相当多的文献定义了使用于这些杂环***中的每一个的独特条件，并且这种信息本领域技术人员可容易地得到。例如，在对酮的加成反应中，使用衍生自苯并噁唑或噁唑的有机金属试剂，要求使用锂镁盐。Bayh和同事的这些最新研究的具体内容描述在J.Org.Chem.，2005，70，5190中。苯并噁唑对反应路线VI的酮1的加成可以提供中间体例如2b的制备。
有大量文献描述了使用各类衍生自杂环的有机金属试剂对酮进行加成。例如，Behinda和同事的工作(Tet.Lett.42，2001，647)描述了锂化苯并咪唑的形成和其对简单内酯的加成。同样，在对反应路线VI的酮1的加成反应中，使用这种锂化的苯并咪唑可以提供中间体例如2c的制备。此外，Kawasaki和同事的最近研究(Bioorganic and MedicinalChem.Lett.13，2003，87)描述了一系列锂化的芳香杂环化合物的形成和它们对于活化酰胺的加成反应。同样，在对反应路线VI的酮1的加成反应中，使用这些锂化的杂芳环中间体可以提供中间体2d-2k。
在对酮1的1，2加成反应中，使用衍生自联芳基或杂芳基-芳基***的有机金属化合物也与本公开有关。这种类别的有机金属试剂对酮1的加成可以提供中间体例如2l和2m。应注意，在本发明的范例中，可能需要合成联芳基或杂芳基有机金属化合物，用于随后在对反应路线VI的酮1的加成反应中使用。本领域技术人员可以了解描述这种类型的有机金属化合物和其前体物制备的大量文献。例如，Chinchilla和同事的最新综述(Chem.Rev.2004，104，2667)描述了金属化杂环的制备和它们的应用性。制备联芳基或杂芳基-芳基***的基础化学常常使用Suzuki类偶合反应。Gregory Fu发表的一系列文献描述了这种偶合反应的目前工艺水平，提出进一步参考文献如下：JACS 2004，126，1340；JACS，2002，124，13662；Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，No.11，1945；Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，No.20，3910；JACS 2002，122，4020；JACS 2001，123，10099；Org.Lett.2001，Vol.3，No.26，4295；Angew.Chem.Int.Ed.1998，37，No.24，3387。除了这一系列著作之外，该领域的关键性综述是容易获得的，例如Rossi在Synthesis 2004，No.15，2419中的综述。
实施例
现在与一些实施方案结合来描述本公开，这些实施方案不限制本公开的范围。相反，本公开包括可以包含在权利要求书范围内的所有的替换、改进和等效内容。由此，包括具体实施方案的下列实施例可以举例说明本公开的一个实践，当然，这些实施例是为了举例说明某些实施方案的目的，并且提供其过程和概念方面的最有用和容易理解的说明。
溶液百分数表达重量与体积关系，溶液比例表达体积与体积关系，除非另有说明。在Bruker 300、400或500MHz波谱仪上记录核磁共振(NMR)谱；以百万分之一报道化学位移(δ)。按照Still′s快速色谱技术(J.Org.Chem.1978，43，2923)，在硅胶(SiO2)上进行快速色谱。
实施例1
磺酰胺的制备
向氯代磺酰异氰酸酯(1当量)的THF冷(-20℃)搅拌溶液中加入水(1当量)(在THF中)，并将得到的溶液升温至0℃，制备中间体氨磺酰基氯。向此溶液中加入无水Et3N(1当量)，而后加入必要的仲胺(1当量)。将反应混合物加热至室温，然后过滤，旋转蒸发滤液，得到所需要的磺酰胺。然后使所述磺酰胺与羧酸偶合，提供所需要的酰基磺酰胺。
实施例2
制备酰基磺酰胺中间体的具体方法
向(1R，2S)1-叔丁氧羰基氨基-2-乙烯基-环丙烷羧酸(217mg，1.194mmol)的THF(5mL)溶液中加入CDI(290mg，1.791mmol)，并将反应混合物回流加热45分钟。在另一个圆底烧瓶中，将LiHMDS(10M溶液，在己烷中，2.4mL，2.4mmol)加入到N-乙基甲基磺酰胺(330mg，2.388mmol)的THF(5mL)溶液中，在室温下搅拌反应混合物1小时。将两个反应混合物合在一起，在室温下搅拌2小时。加入水，以猝灭反应，用EtOAc提取反应溶液。分离有机相，用MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到粗品，将其用制备HPLC纯化，得到所需要的N-酰基磺酰胺。然后将N-酰基磺酰胺溶于4N HCl的二噁烷(2mL)溶液中，在室温搅拌4小时。蒸发溶液，得到淡褐色的油形式的HCl盐。(112mg，33％产率)。1HNMR(400Mz，CD3OD)δ1.16(t，J＝7.21Hz，3H)，1.68(dd，J＝10.03，7.83Hz，1H)，2.15(m，1H)，2.37(m，1H)，2.89(s，3H)，3.30(m，2H)，5.31(d，J＝10.27Hz，1H)，5.42(d，J＝17.12Hz，3H)，5.68(m，1H)..LC-MS(保留时间：0.883min)，MS m/z 270(M+Na+)。
实施例3：
外消旋(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备(方法A和方法B)
利用下列的方法A和B中的每一个制备外消旋的所命名化合物。
方法A
甘氨酸乙酯的N-苄基亚胺的制备
将甘氨酸乙酯盐酸盐(303.8g，2.16mole)悬浮在叔丁基甲基醚(1.6L)中。加入苯甲醛(231g，2.16mole)和无水硫酸钠(154.6g，1.09mole)，使用冰水浴将混合物冷却至0℃。用30分钟逐滴加入三乙胺(455mL，3.26mole)，在室温搅拌混合物48小时。然后通过加入冰冻水(1L)来猝灭反应，分离有机层。用叔丁基甲基醚(0.5L)提取水相，用饱和NaHCO3水溶液(1L)和盐水(1L)的混合物洗涤合并的有机相。用MgSO4干燥溶液，真空浓缩，得到392.4g N-苄基亚胺产物浓黄色油，其可直接在下一步使用。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.32(t，J＝7.1Hz，3H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，4.41(d，J＝1.1Hz，2H)，7.39-7.47(m，3H)，7.78-7.81(m，2H)，8.31(s，1H)。
外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备
用60分钟向叔丁醇锂(84.06g，1.05mol)的无水甲苯(1.2L)悬浮液中逐滴加入甘氨酸乙酯的N-苄基亚胺(100.4g，0.526mol)和反式-1，4-二溴-2-丁烯(107.0g，0.500mol)的无水甲苯(0.6L)的混合物。加入完毕后，通过加入水(1L)和叔丁基甲基醚(TBME，1L)来猝灭深红混合物。分离水相，再次用TBME(1L)提取。合并有机相，加入1N HCl(1L)，在室温下搅拌混合物2小时。分离有机相，用水(0.8L)提取。然后合并水相，用盐(700g)饱和，加入TBME(1L)，将混合物冷却至0℃。然后通过逐滴加入10N NaOH，将搅拌混合物碱化至pH值14，分离有机层，用TBME(2×500mL)提取水相。将合并的有机提取物干燥(MgSO4)，浓缩至1L体积。向此游离胺溶液中加入BOC2O或二碳酸二叔丁基酯(131.0g，0.6mol)，在室温搅拌混合物4天。将额外的二碳酸二叔丁基酯(50g，0.23mol)加入到反应中，回流混合物3小时，然后冷却至室温过夜。将反应混合物用MgSO4干燥，真空浓缩，得到80g粗品。通过快速色谱(2.5Kg SiO2，用1％至2％MeOH/CH2Cl2洗脱)纯化残余物，得到57g(53％)外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯黄色油，当在冰箱中静置时，其凝固：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.46(s，9H)，1.43-1.49(m，1H)，1.76-1.82(br m，1H)，2.14(q，J＝8.6Hz，1H)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H)，5.12(dd J＝10.3，1.7Hz，1H)，5.25(br s，1H)，5.29(dd，J＝17.6，1.7Hz，1H)，5.77(ddd，J＝17.6，10.3，8.9Hz，1H)；MS m/z254.16(M-1)。
外消旋(1R，2S)/(1S，2R)1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
将N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(9.39g，36.8mmol)溶于4N HCl/二噁烷(90mL，360mmol)中，在室温搅拌2小时。浓缩反应混合物，提供(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐，定量产率(7g，100％)。1H NMR(甲醇-d4)δ1.32(t，J＝7.1，3H)，1.72(dd，J＝10.2，6.6Hz，1H)，1.81(dd，J＝8.3，6.6Hz，1H)，2.38(q，J＝8.3Hz，1H)，4.26-4.34(m，2H)，5.24(dd，10.3，1.3Hz，1H)5.40(d，J＝17.2，1H)，5.69-5.81(m，1H)。
方法B
外消旋N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
在-78℃，向叔丁醇钾(11.55g，102.9mmol)的THF(450mL)溶液中加入商购的甘氨酸乙酯的N，N-二苄基亚胺(25.0g，93.53mmol)的THF(112mL)溶液。将反应混合物加热至0℃，搅拌40分钟，然后冷却到-78℃。向此溶液中加入反式-1，4-二溴-2-丁烯(20.0g，93.50mmol)，在0℃搅拌混合物1小时，冷却到-78℃。加入叔丁醇钾(11.55g，102.9mmol)，将混合物立即加热至0℃，再搅拌一小时，而后真空浓缩。将粗品接纳在Et2O(530mL)中，加入1N HCl水溶液(106mL，106mmol)，在室温将得到的双相混合物搅拌3.5小时。分离各层，用Et2O(2x)洗涤水层，用饱和NaHCO3水溶液碱化。用Et2O(3x)提取所需要的胺，将合并的有机提取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，真空浓缩，获得游离胺。将该物质用4N HCl的二噁烷溶液(100mL，400mmol)处理，浓缩，得到(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐褐色半固体(5.3g，34％产率)，其与方法A获得的物质相同，只不过存在少量未鉴别的芳香杂质(8％)。
实施例4
N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的拆分
外消旋体的1∶1混合物
(1R，2S)和(1S，2R)
拆分A
向磷酸钠缓冲液的水溶液(0.1M，4.25升(“L”)，pH值8)(放在12升夹套反应器中，在39℃保持，以300rpm进行搅拌)中加入511克Alcalase 2.4L(大约425mL)(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度达到39℃时，通过加入50％NaOH/水，将pH值调节至8.0。然后在40分钟期间内加入外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(85g)的850mL DMSO溶液。然后将反应温度在40℃保持24.5小时，在此期间，使用50％NaOH/水，在1.5小时和19.5小时的时点将混合物的pH值调节至8.0。24.5小时之后，测定酯的对映过量是97.2％，将反应冷却至室温(26℃)，搅拌过夜(16小时)，而后测定酯的对映过量是100％。然后用50％NaOH将反应混合物的pH值调节至8.5，并将得到的混合物用MTBE(2×2L)提取。然后将合并的MTBE提取物用5％NaHCO3(3×100mL)、水(3×100mL)洗涤，真空蒸发，得到对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯浅黄色固体(42.55g；纯度：97％210纳摩尔(“nM”)，不包含酸；100％对映体过量(“ee”)。然后用50％H2SO4将得自于提取过程的水层酸化至pH值2，用MTBE(2×2L)提取。用水(3×100mL)洗涤MTBE提取物，蒸发，得到酸浅黄色固体(42.74g；纯度：99％210nM，不包含酯)。
1R，2S-酯 1S，2R-酸
| 酯 | 酸 | |
| 高分辨率质谱 | (+)ESI，C13H22NO4，[M+H]+，理论值256.1549，实测值256.1542 | (-)ESI，C11H16NO4，[M-H]-理论值226.1079，实测值226.1089 |
拆分B
在24孔平皿的孔(容积：10ml/孔)中，向0.5mL 100毫摩尔(“mM”)Heps·Na缓冲液(pH值8.5)中加入0.1mL Savinase 16.0L(蛋白酶，得自于Bacillus clausii)(Novozymes North America Inc.)和外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)的0.1mL DMSO溶液。将平皿密封，在40℃、在250rpm下培养。18小时之后，如下测定酯的对映过量是44.3％：除去0.1mL反应混合物，并与1mL乙醇较好地混合；离心之后，用手性HPLC分析10微升(“μl”)上清液。向剩余的反应混合物中加入0.1mL DMSO，在40℃、在250rpm下额外培养平皿3天，而后将4mL乙醇加入到孔中。离心之后，用手性HPLC分析10μl上清液，测定酯的对映过量是100％。
拆分C
在24孔平皿的孔(容积：10ml/孔)中，向0.5mL 100mM Heps·Na缓冲液(pH值8.5)中加入0.1mL Esperase 8.0L(蛋白酶，得自于Bacillushalodurans(Novozymes North America Inc.)和外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)的0.1mL DMSO溶液。将平皿密封，在40℃、在250rpm下培养。18小时之后，如下测定酯的对映过量是39.6％：除去0.1mL反应混合物，并与1mL乙醇较好地混合；离心之后，用手性HPLC分析10微升上清液。向剩余的反应混合物中加入0.1mL DMSO，在40℃、在250rpm下额外培养平皿3天，而后将4mL乙醇加入到孔中。离心之后，用手性HPLC分析10μl上清液，测定酯的对映过量是100％。
用下面的方式进行样品分析：
1)样品制备：大约0.5mL反应混合物与10体积的EtOH较好地混合。离心之后，将10μl上清液注射到HPLC柱上。
2)转化测定：
柱：YMC ODS A，4.6×50毫米(“mm”)，S-5μm
溶剂：A，1mM HCl/水；B，MeCN
梯度：30％B，1min；30％至45％B，0.5min；45％B，1.5min；45％至30％B，0.5min。
流速：2mL/min
UV检测：210nM
保留时间：酸，1.2min；酯，2.8min。
3)酯的对映过量测定：
柱：CHIRACEL OD-RH，4.6×150mm，S-5μm
流动相：MeCN/50mM HClO4-水(67/33)
流速：0.75mL/min
UV检测：210nM。
保留时间：
(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸，5.2min；
外消旋体(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，18.5min和20.0min；
(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，18.5min。
拆分D
在20升夹套反应器中，将5L 0.3M磷酸钠缓冲液(pH值8)保持在38℃，在130rpm下搅拌。将4升Alcalase 2.4L(Novozymes North AmericaInc.)和1升DI水加入到反应器中。当混合物的温度接近38℃时，用10NNaOH将pH值调节至7.8。在1小时期间内，通过加料漏斗将外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(500克)的5升DMSO溶液加入到反应器中。然后将反应温度调节至48℃。21小时之后，酯的对映过量达到99.3％。在24小时处停止加热，将反应慢慢地冷却至室温(大约25℃)，搅拌过夜。然后用10N NaOH将反应混合物的pH值调节至8.5，并将混合物用MTBE(2×4L)提取。用5％NaHCO3(3×400mL)和水(3×400mL)洗涤合并的MTBE提取物，蒸发，得到对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯浅黄色结晶(259g；纯度：96.9％210nM，不包含酸；100％ee)。
拆分E
在20升夹套反应器中，将10L 0.1M磷酸钠缓冲液(pH值8)保持在40℃，在360rpm下搅拌。将1.5升Alcalase 2.4L(Novozymes NorthAmerica Inc.)加入到反应器中。当混合物的温度接近38℃时，用10NNaOH将pH值调节至8.0。在1小时期间内，通过加入漏斗将外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)的2升DMSO溶液加入到反应器中。然后将反应温度调节至40℃。3小时之后，用10N NaOH将pH值调节至8.0。21小时之后，将反应冷却至25℃。用10N NaOH将反应混合物的pH值调节至8.5，并将混合物用MTBE(2×5L)提取。用5％NaHCO3(3×500mL)和水(3×200mL)洗涤合并的MTBE提取物，蒸发，得到110克黄色油。将油在真空条件下、在室温下放置，得到对映体纯N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯无色长棒结晶(101g；纯度：97.9％210nM，不包含酸；100％ee)。
晶体结构对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯用单晶分析进行表征(X射线NB#：52795-093，编号：634592N1)。没有形成绝对构型，因缺乏已知的手性中心或较重原子。通过酰胺基和羰基氧原子之间的分子间氢键，沿着结晶的a-轴心形成链结构(N...O 3.159
)。
N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的结构：
N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的结构：
结晶数据： 实验性的：
化学式：C13H21N1O4 结晶
晶系：正交晶 结晶来源：MTBE
空间群：P212121 结晶说明：无色棒状
a＝5.2902(1)
α＝90° 晶体大小(mm)：0.12×0.26×
0.30
b＝13.8946(2)
β＝90° 数据收集
c＝19.9768(3)
γ＝90° 温度(K)：293
V＝1468.40(4)
max(°)：65.2(Cu Kα)
Z＝4 dx＝1.155g cm-3 所测定的反射值：7518
晶胞常数的反射值：6817 独立反射的值：
2390(Rint＝0.0776)
晶胞常数的θ范围(°)：2.2-65.2 观测的反射值：(I≥2σ：2284
吸收系数(mm-1)：0.700 吸收修正(Tmin-Tmax)：
0.688-1.000
拆分F
在20升夹套反应器中，将5L 0.2M硼酸钠缓冲液(pH值9)保持在45℃，在400rpm下搅拌。将3升DI水和4升Savinase 16L(EX类型)(Novozymes North America Inc.)加入到反应器中。当混合物的温度接近45℃时，用10N NaOH将pH值调节至8.5。在40分钟期间内，通过加入漏斗将外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)的2升DMSO溶液加入到反应器中。然后将反应温度调节至48℃。2小时之后，用10N NaOH将pH值调节至9.0。在18小时，酯的对映过量达到72％，用10N NaOH将pH值调节至9.0。在24小时，将温度降低至35℃。在42小时，将温度升至48℃，用10N NaOH将pH值调节至9.0。在48小时处停止加热，将反应慢慢地冷却至室温(大约25℃)，搅拌过夜。在66小时，反应混合物的pH值是8.6。用MTBE(2×4L)提取混合物。用5％NaHCO3(3×300mL)和水(3×300mL)洗涤合并的MTBE提取物，蒸发，得到对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯浅黄色结晶(101A g；纯度：95.9％210nM，不包含酸；98.6％ee)。
实施例5
步骤1：1(R)-氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备
在N2氛围中，在室温，将1(R)-叔丁氧羰基氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(8.5g，33.3mmol)与200mL 4N HCl/二噁烷(Aldrich)一起搅拌3小时。减压除去溶剂，保持温度低于40℃。得到6.57g(～100％)1(R)-氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐淡褐色的固体。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，1.69-1.82(m，2H)，2.38(q，J＝8.8Hz，1H)，4.29(q，J＝7.0Hz，2H)，5.22(d，J＝10.3Hz，1H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.69-5.81(m，1H)..MS m/z 156(M++1)。
步骤2：1(R)-[1-叔丁氧羰基-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备
将Boc-L-4-羟脯氨酸(N-Boc(2S，4R)-羟脯氨酸)(10g，43.3mmol)的400mL二氯甲烷搅拌浆液用N-甲基吗啉(9.3mL，84.7mmol)、HATU(19.5g，51.3mmol)和1(R)-氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(9.1g，47.5mmol)顺序处理。将该金黄色均匀溶液在室温、在N2氛围中搅拌18小时，而后真空浓缩，得到棕色油。将其在乙酸乙酯和饱和NaHCO3水溶液之间分配。用盐水洗涤有机相，干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到15g(94％)1(R)-[1-叔丁氧羰基-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯类白色固体：LC-MS(Xterra HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：3min。停持时间(Hold time)：1min。流速：5mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：2.09min)，MS m/z369(M++1).。
步骤3：1(R)-[4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备。
将1(R)-[1-叔丁氧羰基-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(5.0g，13.6mmol)的搅拌浆液用4N HCl/二噁烷(20mL)处理3小时。真空浓缩反应混合物，得到4.5g(97％)1(R)-[4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐白色固体：1HNMR(300MHz，CD3OD)δ1.26(t，J＝7.14Hz，3H)，1.46(dd，J＝9.70，5.31Hz，1H)，1.80(dd，J＝8.23，5.31Hz，1H)，2.00-2.15(m，1H)，2.18-2.30(m，1H)，2.45(dd，J＝13.36，7.50Hz，1H)，3.36-3.48(m，1H)，4.11-4.24(m，2H)，4.44(dd，J＝10.25，7.68Hz，1H)，4.58-4.65(m，1H)，4.84-4.94(m，1H)，5.17(d，J＝1.83Hz，1H)，5.27-5.42(m，1H)，5.67-5.89(m，1H)。
实施例6
环丙基磺酰胺的制备，方法A和B
方法A：
向100mL冷却至0℃的THF溶液中鼓入气态氨，直到达到饱和为止。向此溶液中加入5g(28.45mmol)环丙基磺酰基氯(从Array Biopharma购买)的50mL THF溶液，将溶液加热至室温过夜，额外搅拌一天。浓缩混合物，直到溶剂剩余1-2mL为止，施加到30g SiO2塞上(用30％至60％EtOAc/己烷洗脱)，得到3.45g(100％)环丙基磺酰胺白色固体。1HNMR(甲醇-d4)δ0.94-1.07(m，4H)，2.52-2.60(m，1H)；13C NMR(甲醇-d4)δ5.92，33.01。
方法B：
步骤1：N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺的制备
将叔丁胺(3.0mol，315.3mL)溶于THF(2.5L)中。将溶液冷却至-20℃。慢慢地加入3-氯丙烷磺酰氯(1.5mol，182.4mL)。将反应混合物升温至室温，搅拌24小时。过滤混合物，真空浓缩滤液。将残余物溶于CH2Cl2(2.0L)中。将得到的溶液用1N HCl(1.0L)、水(1.0L)、盐水(1.0L)洗涤，用Na2SO4干燥。过滤，真空浓缩，得到淡黄色固体，将其用己烷结晶，得到产物白色固体(316.0g，99％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，2.30-2.27(m，2H)，3.22(t，J＝7.35Hz，2H)，3.68(t，J＝6.2Hz，2H)，4.35(b，1H)。
步骤2：环丙烷磺酸叔丁基酰胺的制备
在-78℃，向N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺(2.14g，10.0mmol)的THF(100mL)溶液中加入n-BuLi(2.5M，在己烷中，8.0mL，20.0mmol)。用1小时使反应混合物温热至室温。真空除去挥发物。将残余物在EtOAC和水(200mL，200mL)之间分配。分离有机相，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。用己烷将残余物重结晶，得到所需要的产物白色固体(1.0g，56％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.98-1.00(m，2H)，1.18-1.19(m，2H)，1.39(s，9H)，2.48-2.51(m，1H)，4.19(b，1H)。
步骤3：环丙基磺酰胺的制备
将环丙烷磺酸叔丁基酰胺(110.0g，0.62mol)的TFA(500mL)溶液在室温下搅拌16小时。真空除去挥发物。用EtOAC/己烷(60mL/240mL)将残余物重结晶，得到所需要的产物白色固体(68.5g，91％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.84-0.88(m，2H)，0.95-0.98(m，2H)，2.41-2.58(m，1H)，6.56(b，2H)。
实施例7
N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的制备。
步骤1a：N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺的制备。
如上所述。
步骤1b：N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的制备。
将N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺(4.3g，20mmol)溶于无水THF(100mL)中，并冷却至-78℃。向此溶液中慢慢地加入n-BuLi(17.6mL，44mmol，2.5M，在己烷中)。除去干冰浴，在1.5小时期间内将反应混合物升温至室温。然后将混合物冷却至-78℃，加入n-BuLi溶液(20mmol，8mL，2.5M，在己烷中)。将反应混合物加热至室温，在2小时期间内再冷却至-78℃，加入纯的甲基碘溶液(5.68g，40mmol)。使反应混合物升温至室温过夜，在室温用饱和NH4Cl(100mL)淬灭。用EtOAc(100mL)提取。用盐水(100mL)洗涤有机相，干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到黄色油，将其用己烷结晶，得到产物淡黄色固体(3.1g，81％)：1HNMR(CDCl3)δ0.79(m，2H)，1.36(s，9H)，1.52(m，2H)，1.62(s，3H)，4.10(bs，1H)。
步骤1c：1-甲基环丙基磺酰胺的制备
将N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺(1.91g，10mmol)溶液溶于TFA(30mL)中，在室温搅拌反应混合物16小时。真空除去溶剂，得到黄色油，将其用EtOAc/己烷(1∶4，40mL)结晶，得到实施例3，1-甲基环丙基磺酰胺白色固体(1.25g，96％)：1H NMR(CDCl3)δ0.84(m，2H)，1.41(m，2H)，1.58(s，3H)，4.65(bs，2H).C4H9NO2S的分析计算值：C，35.54；H，6.71；N，10.36.实测值：C，35.67；H，6.80；N，10.40。
实施例9
1-丙基环丙基磺酰胺的制备
步骤1b：N-叔丁基-(1-苄基)环丙基-磺酰胺的制备。
使用制备1-甲基环丙基磺酰胺所描述的方法，只是在该方法的第二步中使用丙基卤来代替甲基碘，制备该化合物。
实施例10
N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺的制备。
按照合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺中所描述的方法，只是用1.25当量的烯丙基溴作亲电试剂，以97％产率获得该化合物N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺。该化合物不用纯化就可以直接在下一个反应中采用：1H NMR(CDCl3)δ0.83(m，2H)，1.34(s，9H)，1.37(m，2H)，2.64(d，J＝7.3Hz，2H)，4.25(bs，1H)，5.07-5.10(m，2H)，6.70-6.85(m，1H)。
1-烯丙基环丙基磺酰胺的制备。
按照1-甲基环丙基磺酰胺的合成中所描述的方法，由N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺获得该化合物1-烯丙基环丙基磺酰胺，产率40％。用SiO2柱色谱纯化化合物，使用2％MeOH/CH2Cl2作为洗脱液：1HNMR(CDCl3)δ0.88(m，2H)，1.37(m，2H)，2.66(d，J＝7.0Hz，2H)，4.80(s，2H)，5.16(m，2H)，5.82(m，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.2，35.6，40.7，119.0，133.6。
实施例15
环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯(制备C1-取代的环丙基磺酰胺中的关键中间体)的制备
步骤1：3-氯丙基磺酰胺的制备
将3-氯丙烷磺酰氯(55g，310.7mmol)溶液溶于THF(200mL)中，用30分钟逐滴加入到冷却至0℃的NH4OH溶液(200mL)中。将反应混合物加热到室温，搅拌1小时，用二氯甲烷(4×500mL)多次分配水层。用1N HCl(150mL)、水(150mL)洗涤合并的二氯甲烷层，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。用最低量的二氯甲烷/己烷重结晶粗品固体，得到3-氯丙基磺酰胺白色固体(45.3g，93％)。1H NMR(CDCl3)δ2.34(m，2H)，3.32(t，J＝7.3Hz，2H)，3.70(t，J＝6.2Hz，2H)，4.83(s，2H)；13CNMR(CDCl3)δ27.10，42.63，52.57。
步骤2：3-氯丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯的制备
用30分钟向冷却到0℃的3-氯丙基磺酰胺(30.2g，191.5mmol)、三乙胺(30.2mL，217.0mmol)和4-DMAP(2.40g，19.6mmol)的二氯甲烷(350mL)溶液中慢慢地逐滴加入二碳酸二叔丁基酯(47.2g，216.9mmol)的二氯甲烷(250mL)溶液。使反应混合物升温至室温，额外搅拌3小时，用1N HCl(300mL)、水(300mL)、盐水(300mL)分配，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到粗品。用70mL 5％二氯甲烷/己烷研磨该物质，得到3-氯丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯灰白色固体(47.2g，96％)：1HNMR(CDCl3)δ1.51(s，9H)，2.33(m，2H)，3.60(t，J＝7.3Hz，2H)，3.68(t，J＝6.21Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)δ26.50，27.95，42.37，50.40，84.76，149.53。
步骤3：环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯的制备
在氩气氛中，将正丁基锂(74.7mL，119.5mmol，1.6M，在己烷中)溶液溶于无水THF(105mL)中，并冷却至-78℃。用20-30分钟，向此溶液中逐滴加入3-氯丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯(14g，54.3mmol)的无水THF溶液(105mL)。除去干冰浴，在2小时期间内将反应混合物升温至室温。用冰醋酸(3.4mL)淬灭反应混合物，真空浓缩，在二氯甲烷(100mL)和水(100mL)之间分配。用盐水(100mL)洗涤有机相，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯蜡状的类白色固体(12.08g，100％)：1H NMR(CDCl3)δ1.10(m，2H)，1.34(m，2H)，1.50(s，9H)，2.88(m，1H)，7.43(s，1H)..13C NMR(CDCl3)δ6.21，28.00，31.13，84.07，149.82。
实施例16
1-甲氧基-甲基环丙基磺酰胺的制备
步骤1：1-甲氧基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯的制备
向冷却至-78℃、溶于THF(30mL)的环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯(1.0g，4.5mmol)溶液中加入正丁基锂(6.4mL，10.2mmol，1.6M，在己烷中)，搅拌反应混合物1小时。向此溶液中加入氯甲基甲醚的纯溶液(0.40mL，5.24mmol)，慢慢地使混合物升温至室温过夜。使用1N HCl水溶液将溶液pH值调节至3，然后用乙酸乙酯(4×50mL份额)提取。将合并的提取物干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到1-甲氧基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯蜡状的固体(1.20g，100％)，其不用进一步纯化就可以在下一个反应中直接采用：1H NMR(CDCl3)δ1.03(m，2H)，1.52(s，9H)，1.66(m，2H)，3.38(s，3H)，3.68(s，2H)，7.54(s，1H)；13CNMR(CDCl3)δ11.37，28.29，40.38，58.94，73.43，83.61，149.57。
步骤2：1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的制备
将1-甲氧基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯(114g，4.30mmol)溶液溶于50％TFA/二氯甲烷(30mL)溶液中，在室温下搅拌16小时。真空除去溶剂，将残余物用80g SiO2色谱分离(用0％至60％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺白色固体(0.55g，77％，两步)：1H NMR(CDCl3)δ0.95(m，2H)，1.44(m，2H)，3.36(s，3H)，3.65(s，2H)，4.85(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ11.17，40.87，59.23，74.80；LRMS m/z183(M++NH4)。
实施例17
1-环丙基甲基环丙基磺酰胺的制备
步骤1：1-环丙基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯的制备
按照合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯中所描述的方法，只是1.10当量的环丙基甲基溴用作亲电试剂，以92％产率获得1-环丙基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯。该化合物不用纯化就可以直接在下一个反应中采用：1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：1-环丙基甲基环丙基磺酰胺的制备
按照1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的合成中所描述的方法，由1-环丙基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯获得该化合物，产率65％。用SiO2柱色谱纯化化合物，使用0％至60％乙酸乙酯/己烷作为洗脱液：1HNMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193(M++NH4)。
实施例19
1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
步骤1：1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙烷磺酰基氨基甲酸叔丁基酯的制备
按照合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰基氨基甲酸叔丁基酯中所描述的方法，只是1.20当量的3，5-二甲基异噁唑-4-异氰酸酯用作亲电试剂，以粗品100％产率获得该化合物。该化合物不用纯化就可以直接在下一个反应中采用。
步骤2：1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙烷磺酰胺的制备
由1.62g(4.52mmol)1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙烷磺酰基氨基甲酸叔丁基酯，使用30mL(120mmol)4N HCl/二噁烷，搅拌过夜，浓缩，在Biotage 40M柱上色层分离(用0％至5％甲醇/二氯甲烷洗脱)，以50％产率获得该化合物(580mg)：1H NMR(甲醇-d4)δ1.57(m，2H)，1.61(m 2H)，2.15(s，3H)，2.30(s，3H)，4.84(s，3H)；13C NMR(甲醇-d4)δ9.65，10.94，15.01，46.11，114.82，159.45，165.55，168.15；LRMS m/z260(M++H)。
实施例20
由环丁基溴制备环丁基磺酰胺
向冷却至-78℃的5.0g(37.0mmol)环丁基溴的30mL无水二***(Et2O)溶液中加入44mL(74.8mmol)1.7M叔丁基锂的戊烷溶液，将该溶液用1.5小时慢慢地热至-35℃。将该混合慢慢地用导管导入冷却至-40℃的5.0g(37.0mmol)新蒸馏的磺酰氯的100mL己烷溶液中，用1小时将该混合物加热至0℃，然后小心地真空浓缩。将该混合物再溶解在Et2O中，用一些冰冻水洗涤一次，干燥(MgSO4)，小心地浓缩。将该混合物再溶解在20mL THF中，逐滴加入到500mL饱和NH3/THF中，搅拌过夜。真空浓缩混合物，得到粗品黄色固体，用最低量的CH2Cl2/己烷(含有1-2滴MeOH)重结晶，得到1.90g(38％)环丁基磺酰胺白色固体。1HNMR(CDCl3)δ1.95-2.06(m，2H)，2.30-2.54(m，4H)，3.86(p，J＝8Hz，1H)，4.75(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ16.43，23.93，56.29..HRMSm/z(M-H)-C4H8NSO2的计算值：134.0276，实测值134.0282。
实施例21
环戊基磺酰胺的制备
将18.5mL(37.0mmol)2M环戊基-氯化镁的醚溶液逐滴加入到3.0mL(37.0mmol)冷却至-78℃的新蒸馏磺酰氯(从Aldrich获得)的100mL己烷溶液中。用1小时将该混合物加热至0℃，然后小心地真空浓缩。将该混合物再溶解在Et2O(200mL)中，用一些冰冻水(200mL)洗涤一次，干燥(MgSO4)，小心地浓缩。将该混合物再溶解在35mL THF中，逐滴加入到500mL饱和NH3/THF中，搅拌过夜。真空浓缩混合物，得到粗品黄色固体，通过50g硅胶过滤残余物，使用70％EtOAc-己烷作为洗脱液，然后浓缩溶液。用最低量的CH2Cl2/己烷(含有1-2滴MeOH)将残余物重结晶，得到2.49g(41％)环戊基磺酰胺白色固体。1H NMR(CDCl3)δ1.58-1.72(m，2H)，1.74-1.88(m，2H)，1.94-2.14(m，4H)，3.48-3.59(m，1H)，4.80(bs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.90，28.33，63.54；MS m/e148(M-H)-。
实施例22
环己基磺酰胺的制备
将18.5mL(37.0mmol)2M环己基氯化镁(TCI Americas)的醚溶液逐滴加入到3.0mL(37.0mmol)冷却至-78℃的新蒸馏磺酰氯的100mL己烷溶液中。用1小时将该混合物加热至0℃，然后小心地真空浓缩。将该混合物再溶解在Et2O(200mL)中，用一些冰冻水(200mL)洗涤一次，干燥(MgSO4)，小心地浓缩。将该混合物再溶解在35mL THF中，逐滴加入到500mL饱和NH3/THF中，搅拌过夜。真空浓缩混合物，得到粗品黄色固体，通过50g硅胶过滤残余物，使用70％EtOAc-己烷作为洗脱液，浓缩。用最低量的CH2Cl2/己烷(含有1-2滴MeOH)将残余物重结晶，得到1.66g(30％)环己基磺酰胺白色固体。1H NMR(CDCl3)δ1.11-1.37(m，3H)，1.43-1.56(m，2H)，1.67-1.76(m，1H)，1.86-1.96(m，2H)，2.18-2.28(m，2H)，2.91(tt，J＝12，3.5Hz，1H)，4.70(bs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.04，25.04，26.56，62.74；MS m/e 162(M-1)-。
实施例23
新戊基磺酰胺的制备
按照制备环己基磺酰胺的方法，49mL(37mmol)0.75M新戊基氯化镁(Alfa)在二***中转变为1.52g(27％)新戊基磺酰胺白色固体。1HNMR(CDCl3)δ1.17(s，9H)，3.12(s，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ29.46，31.51，67.38；MS m/e 150(M-1)-。
实施例24
环丁基甲磺酰胺的制备
将12.3g(83mmol)环丁基甲基溴(Aldrich)和13.7g(91mmol)碘化钠的150mL丙酮溶液回流过夜，而后冷却至室温。滤出无机固体，分别在环境温度和150torr在80℃蒸馏出丙酮和环丙基甲基碘(8.41g，46％)。
将冷却至-78℃的4.0g(21.98mmol)环丁基甲基碘的30mL无水二***(二***)溶液通过导管加入到17mL(21.98mmol)1.3M仲丁基锂的环己烷溶液中，搅拌该溶液5分钟。向该混合物中通过导管加入冷却至-78℃的3.0g(21.98mmol)新蒸馏的磺酰氯的110mL己烷溶液，用1小时将该混合物加热至室温，然后小心地真空浓缩。将该混合物再溶解在二***中，用一些冰冻水洗涤一次，干燥(MgSO4)，过滤，小心地浓缩。将该混合物再溶解在30mL THF中，逐滴加入到500mL饱和NH3/THF中，搅拌过夜。真空浓缩混合物，得到粗品黄色固体，用最低量的二氯甲烷/己烷(含有1-2滴甲醇)重结晶，得到1.39g(42％)环丁基甲基磺酰胺白色固体。1H NMR(CDCl3)δ1.81-2.03(m，4H)，2.14-2.28(m，2H)，2.81-2.92(m，1H)，3.22(d，J＝7Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ19.10，28.21，30.64，60.93；MS m/e 148(M-1)-。
实施例25
环丙基甲基磺酰胺的制备
使用制备环丁基甲基磺酰胺的方法，由环丙基代甲基溴(Aldrich)制备环丙基甲基磺酰胺(参见JACS 1981，p.442-445)。1H NMR(CDCl3)δ0.39-0.44(m，2H)，0.67-0.76(m，2H)，1.13-1.27(m，1H)，3.03(d，J＝7.3Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.33，5.61，59.93；MS m/e134(M-1)。
实施例26
2-噻吩基磺酰胺的制备
使用Justus Liebigs Ann.Chem.，501，1933，p.174-182的方法，由2-噻吩基磺酰氯(从Aldrich购买)制备。
实施例27
4-溴苯磺酰胺的制备
用饱和氨/THF处理商购的4-溴磺酰氯，制备4-溴苯基磺酰胺。
实施例28
环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺HCl盐的制备
步骤1：1(R)-叔丁氧羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸的制备
向1(R)-叔丁氧羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(3.28g，13.2mmol)的THF(7mL)和甲醇(7mL)溶液中加入LiOH(1.27g，53.0mmol)的水(14mL)悬浮液。在室温下搅拌混合物过夜，用1N NaOH(15mL)和水(20mL)淬灭。用乙酸乙酯(20mL)洗涤得到的混合物，用20mL 0.5NNaOH提取有机相。用1N HCl酸化合并的水溶液相，直到pH值4为止，用乙酸乙酯(3×40mL)提取。用盐水洗涤合并的有机提取物，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到标题化合物白色固体(2.62g，87％)。1HNMR：(DMSO-d6)δ1.22-1.26(m，1H)，1.37(s，9H)，1.50-1.52(m，1H)，2.05(q，J＝9Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，5.22(d，J＝17Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，7.18，7.53(s，NH(旋转异构体)，12.4(br s，1H))；MS m/z228(M++H)。
步骤2：环丙烷磺酸(1-(R)-叔丁氧羰基氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷羰基)-酰胺的制备
在氮气氛围中，将步骤1产物(2.62g，11.5mmol)和CDI(2.43g，15.0mmol)的THF(40mL)溶液回流加热50分钟。将该溶液冷却至室温，通过套管转移到环丙基磺酰胺(1.82g，15.0mmol)的THF(10mL)溶液中。向得到的溶液中加入DBU(2.40mL，16.1mmol)，继续搅拌20小时。用1N HCl淬灭混合物，至pH值1，真空浓缩THF。用乙酸乙酯(2×50mL)提取悬浮液，干燥(Na2SO4)合并的有机提取物，过滤，浓缩。通过用己烷-乙酸乙酯(1∶1)再结晶来进行纯化，得到标题化合物(2.4g)白色固体。通过Biotage 40S柱纯化母液(9％丙酮/二氯甲烷洗脱)，得到第二批标题化合物(1.1g)。合并两个批料(总收率92％)。1H NMR(DMSO-d6)δ0.96-1.10(m，4H)，1.22(dd，J＝5.5，9.5Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.70(t，J＝5.5Hz，1H)，2.19-2.24(m，1H)，2.90(m，1H)，5.08(d，J＝10Hz，1H)，5.23(d，J＝17Hz，1H)，5.45(m，1H)，6.85，7.22(s，NH(旋转异构体)；MS m/z331(M++H)。
步骤3：环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基-环丙烷羰基)酰胺HCl盐的制备
将步骤2产物(3.5g，10.6mmol)的二氯甲烷(35mL)和TFA(32mL)溶液在室温下搅拌1.5小时。真空除去挥发物，将残余物悬浮在1N HCl/二***(20mL)中，真空浓缩。这种方法重复一次。用戊烷研磨得到的混合物，过滤，得到标题化合物吸湿性的类白色固体(2.60g，92％)。1HNMR：(DMSO-d6)δ1.01-1.15(m，4H)，1.69-1.73(m，1H)，1.99-2.02(m，1H)，2.38(q，J＝9Hz，1H)，2.92-2.97(m，1H)，5.20(d，J＝11Hz，1H)，5.33(d，J＝17Hz，1H)，5.52-5.59(m，1H)，9.17(br s，3H)；MS m/z 231(M++H)。
实施例29
(1S，4R，6S 14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸的制备，实施例29
实施例29
步骤1：1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲基酯的制备
将2(S)-叔丁氧羰基氨基-8-壬烯酸(从RSP Amino Acids购买)(3.5g，12.9mmol)的200mL DCM溶液用4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸甲基酯盐酸盐(2.15g，11.8mmol)、N-甲基吗啉(4.25mL，38.6mmol)和HATU(5.37g，14.1mmol)顺序处理。在室温、在N2氛围中搅拌反应混合物3天，而后真空浓缩。将残余物在乙酸乙酯和pH值4的缓冲液(苯二甲酸氢盐)之间分配。用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机相，干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到粗品。进行快速色谱(50％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)，得到4.7g(～100％)的1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲基酯无色油：1H NMR(500MHz，CD3OD)δ1.33-1.50(m，8H)，1.46(s，9H)，1.57(m，1H)，1.72(m，1H)2.08(m，2H)，2.28(m，1H)，3.72(s，3H，)3.75-3.87(m，2H)，4.36(m，1H)，4.51(bs，1H)，4.57(t，J＝8.2Hz，1H)，4.95(d，J＝10.4Hz，1H)，5.01(m，1H)，5.83(m，1H)；MS m/z399(M++1)。
步骤2：1-[[1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯的制备
将1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸甲基酯(4.7g，11.8mmol)溶于THF(80mL)、甲醇(20mL)和水(40mL)中。加入粉末氢氧化锂(5.6g，233mmol)。在室温、在N2氛围中搅拌浅黄色浆液16小时，而后真空浓缩。将残余物在醚和水之间分配。除去***相，用1N HCl处理水相，直到pH值4为止。用EtOAc提取该酸性溶液(三次)。将合并的EtOAc提取物干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到4.36g(96％)的1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-8-壬烯酰基)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)-羧酸白色固体。然后将该酸溶于150mL的DMF中，加入(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(2.61g，13.6mmol)、N-甲基吗啉(2.5mL，22.6mmol)和HATU(5.2g，13.7mmol)。在室温、在N2氛围中搅拌反应混合物16小时，而后真空浓缩。将残余物在乙酸乙酯和pH值4的缓冲液(苯二甲酸氢盐)之间分配。用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机相，干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到粗品。进行快速色谱(60％-80％乙酸乙酯/己烷)，得到6.0g(98％)1-{[1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯白色固体：1H NMR(500MHz，CD3OD)δ1.25(t，J＝7.2Hz，3H)，1.33-1.80(m，10H)，1.46(s，9H)，2.09(m，3H)，2.25(m，2H)，3.76(m，2H)，4.14(m，2H)，4.27(dd，J＝8.5，5.2Hz，1H)，4.50(m，2H)，4.94(d，J＝10.1Hz，1H)，5.01(dd，J＝17.1，1.8Hz，1H)，5.11(dd，J＝10.4，1.8Hz，1H)，5.30(d，J＝15.6Hz，1H)，5.80(m，2H)，8.57(s，1H)；MS m/z 522(M++1)。
步骤3：(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.4，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯的制备
将1-{[-(2(S)-叔丁氧羰基-氨基-壬-8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基环丙烷-羧酸乙酯(800mg，1.53mmol)的2L二氯甲烷溶液用N2吹扫0.5小时。然后加入三环己基膦[1，3-双(2，4，6-三甲基-苯基)-4，5-二氢咪唑-2-亚基][亚苄基]-二氯化钌(IV)(Strem)(64mg，0.075mmol)，用N2再吹扫混合物10分钟。将该淡橙色均匀溶液回流2小时，得到暗橙色溶液。将反应混合物冷却至室温，真空浓缩，得到橙色油。进行快速色谱(乙酸乙酯)，得到460mg(61％)(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸乙酯灰色固体。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ1.19(t，J＝7.2Hz，3H)，1.42(s，9H)，1.22-1.8(m，8H)，1.87(m，2H)，2.03-2.22(m，4H)，2.63(m，1H)，3.65(m，1H)，4.09(m，3H)，4.45(m，1H)，4.56(s，1H)，4.82(m，1H)，5.23(m，1H)，5.51(s，1H)，7.16(s，1H)；MS m/z 494(M++1)。
步骤4：(1S，4R，6S,14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸
向(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸乙酯(493mg，1.0mmol)的THF(4mL)、甲醇(1mL)和水(2mL)溶液中加入粉末氢氧化锂(480mg，20mmol)，并在室温、在N2氛围中搅拌该浅黄色浆液16小时。然后真空浓缩混合物，并将残余物在醚和水之间分配。除去***相，用1N HCl处理水相，直到pH值4为止。用EtOAc提取该酸性溶液三次。将合并的EtOAc提取物干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到460mg(98％)实施例18，(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂三环[14.3.0.04，6]-十九-7-烯-4-羧酸灰色固体。1HNMR(500MHz，CD3OD)δppm 1.26(t，J＝7.2Hz，3H)，1.35-1.52(m，15H)，1.57-1.68(m，3H)，1.79(m，1H)，2.04(m，1H)，2.16-2.41(m，3H)，3.80(dd，J＝10.7，4.3Hz，1H)，3.88(m，1H)，4.38(dd，J＝8.9，3.1Hz，1H)，4.55(m，2H)，5.39(t，J＝9.8Hz，1H)，5.58(m，1H)；MSm/z466(M++1)。
实施例30
(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基)-氨基甲酸叔丁基酯的制备
步骤1：1-{[1-(2-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备
向1-{[1-(2(S)-叔丁氧羰基氨基-非8-烯酰)-4(R)-羟基-吡咯烷-2(S)羰基]-(1R)-氨基}-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(1.5g，2.87mmol)的10mLDMF混合物中加入咪唑(0.25g，3.67mmol)和叔丁基-二甲基甲硅烷基氯(516mg，3.44mmol)。将混合物在室温搅拌两天。然后真空浓缩反应混合物，将残余物溶于乙酸乙酯中。用水洗涤此溶液，用硫酸镁干燥，真空浓缩，获得粗品固体。用快速色谱纯化(用20％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到1.43g(78％)1-{[1-(2-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯白色固体。
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ0.10(s，6H)，0.89(s，9H)，1.22(m，3H)，1.31-1.48(m，16H)，1.50-1.75(m，3H)，2.06(m，3H)，2.11-2.33(m，2H)，3.70(m，2H)，4.03-4.19(m，2H)，4.21(m，1H)，4.45(t，J＝7.87Hz，1H)，4.59(m，1H)，4.91(d，J＝9.15Hz，1H)，4.98(d，J＝17.20Hz，1H)，5.08(dd，J＝10.25，1.83Hz，1H)，5.27(dd，J＝17.38，1.65Hz，1H)，5.65-5.87(m，2H)；MS m/z 636(M++1)。
步骤2：14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯的制备
向1-{[1-(2-叔丁氧羰基氨基-壬-8-烯酰)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-2-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(1.63g，2.56mmol)的640mL二氯甲烷溶液中加入215mg(0.26mmol)三环己基膦[1，3-二(2，4，6-三[亚苄基]二氯化钌(IV)。将混合物回流加热15分钟。真空浓缩残余物，而后用快速色谱纯化，用30％乙酸乙酯/己烷洗脱。为了将样品进一步脱色，再次将粗品色谱分离，用50％醚/己烷洗脱，得到1.5g(96％)14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯白色固体。1HNMR(500MHz，CD3Cl)δ0.06(s，3H)，0.07(s，3H)，0.86(s，9H)，1.18-1.24(m，6H)，1.34-1.64(m，14H)，1.86-1.96(m，3H)，2.02-2.09(m，1H)，2.11-2.17(m，1H)，2.19-2.28(m，1H)，2.57-2.63(m，1H)，3.50-3.54(m，1H)，3.71(dd，J＝10.22，6.26Hz，1H)，4.06-4.17(m，2H)，4.52-4.58(m，2H)，4.75(d，J＝8.55Hz，1H)，5.21(t，J＝9.92Hz，1H)，5.35(d，J＝7.63Hz，1H)，5.45-5.50(m，1H)，6.94(s，1H)；MS m/z608(M++1)。
步骤3：14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸的制备
向14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯(1.5g，2.47mmol)的THF(4mL)、甲醇(1mL)和水(2mL)混合溶剂***的溶液中加入粉末氢氧化锂一水合物(1.0g，50mmol)。在室温、在N2氛围中搅拌浅黄色浆液4小时。然后真空浓缩混合物，并将残余物在醚和水之间分配。除去***相，用1N HCl处理水相，直到pH值4为止。用EtOAc提取该酸性溶液(三次)。将合并的EtOAc提取物干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到1.2g(84％)14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸类白色固体。1H NMR(300MHz，CD3OD)0.12(s，6H)，0.89(s，9H)，1.23-1.64(m，17H)，1.70-1.87(m，1H)，1.90-2.49(m，6H)，3.70-3.80(m，1H)，3.83-3.90(m，1H)，4.28-4.36(m，1H)，4.47-4.55(m，1H)，4.65(s，1H)，5.30-5.39(m，1H)，5.53-5.62(m，1H)；MS m/z 580(M++1)。
步骤4：[18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]-氨基甲酸叔丁基酯的制备
将14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(500mg，0.86mmol)溶于25mL THF中，并用CDI(180mg，1.12mmol)处理。(必须小心，使用烘干的玻璃器皿，保持干燥N2氛围，避免湿润)。将反应混合物回流2小时之后，将其冷却至室温，用环丙基磺酰胺(135mg，1.12mmol)和DBU(170mg，1.12mmol)顺序处理。将反应混合物在室温搅拌4小时，通过旋转蒸发除去THF。将残余物在乙酸乙酯和pH值4的缓冲液之间分配。干燥(MgSO4)有机相，真空浓缩，得到粗品。然后用快速色谱纯化(用33％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到300mg(51％)[18-(叔丁基-二甲基-硅烷基氧基)-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]-氨基甲酸叔丁基酯白色固体。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1H 0.07(s，3H)，0.08(s，3H)，0.85(s，9H)，0.87-1.49(m，21H)，1.73-1.95(m，3H)，2.08-2.16(m，1H)，2.25-2.36(m，2H)，2.42-2.56(m，1H)，2.85-2.93(m，1H)，3.65-3.74(dd，J＝10.61，3.66Hz，1H)，3.89(d，J＝10.25Hz，1H)，4.34(m，J＝9.70，9.70Hz，1H)，4.43(t，J＝7.87Hz，1H)，4.57(s，1H)，4.94-5.01(m，1H)，5.10(d，J＝8.78Hz，1H)，5.66-5.75(m，1H)，6.55(s，1H)，10.13(s，1H)；MS m/z 683(M++1)。
步骤5：实施例19，(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基)-氨基甲酸叔丁基酯的制备
向[18-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]-氨基甲酸叔丁基酯(330mg，0.48mmol)的25mL THF混合物中加入氟化四丁铵(150mg，0.54mmol)。将反应混合物在室温搅拌18小时，而后通过旋转蒸发除去THF。将残余物在乙酸乙酯和水之间分配。干燥(MgSO4)有机相，真空浓缩，得到粗品。然后通过用己烷研磨来纯化，得到200mg(73％)(4-环丙烷磺酰基氨基羰基-18-羟基-2，15-二氧代-3，16-二氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基)-氨基甲酸叔丁基酯，实施例19，白色固体。1H NMR(500MHz，CD3Cl)δ1.87-1.64(m，21H)，1.70-1.98(m，3H)，2.15-2.56(m，5H)，2.85-2.94(m，1H)，3.71(d，J＝13.91Hz，1H)，4.10-4.26(m，2H)，4.51(t，J＝7.87Hz，1H)，4.62(s，1H)，4.98(m，1H)，5.06(d，J＝8.78Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，6.72(s，1H)，10.24(s，1H)；MS m/z 569(M++1)。
使用实施例29和30中所描述的方法，制备下列大环的醇中间体：
使用实施例29和30中所描述的方法，可以制备下列大环的醇中间体：
实施例31
实施例31，2(S)-叔丁氧羰基氨基-3-戊-4-烯基硫基丙酸的制备
步骤1：在室温，向N-Boc-半胱氨酸甲基酯(3.36g，0.014mol)的甲醇(166mL)溶液中加入三乙胺(10.8mL)和1-溴戊-4-烯(3.19g，21mmol，1.5当量)，在室温下将得到的溶液搅拌过夜。然后真空浓缩混合物，将得到的残余混合物用快速色谱纯化(己烷、乙酸乙酯梯度)，提供1.76g(41％)所需要的硫醚。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1.43(s，9H)，1.64(m，2H)，2.11(m，2H)，2.51(m，2H)，2.95(m，2H)，3.75(s，3H)，4.51(m，1H)，4.95-5.03(m，2H)，5.34(m，1H)，5.80(1H，m)；MS m/z 304(M++1)。
步骤2：将步骤1的硫醚产物(9.51g，31.4mmol)加入到1M LiOH/水(200mL)和THF(200mL)的混合物中，在室温下将得到的混合物搅拌过夜。然后使用1N盐酸将反应混合物酸化，用乙酸乙酯将得到的混合物提取若干次。合并提取物，用硫酸镁干燥，真空浓缩，提供所需要的酸，实施例20，其可以在下一个反应中原态使用。
实施例32
实施例32，N-叔丁氧羰基-3-(4-戊烯基硫基)-L-缬氨酸的制备
步骤1：N-叔丁氧羰基-3-(4-戊烯基硫基)-L-缬氨酸甲基酯的制备
在室温下，向7.12g(48mmol，1.0eq)L-3-巯基缬氨酸的100mL 1，4-二噁烷和25mL水的溶液中加入9.60ml(96mmol，2.0eq)10N氢氧化钠水溶液，而后用几分钟逐滴加入12.00mL(101mmol，2.1eq)5-溴-1-戊烯。在室温下将得到的混合物搅拌68小时。此时，加入12.50g(57mmol，1.2eq)二碳酸二叔丁基酯，在室温下另外搅拌混合物6小时。真空浓缩混合物，将残余物溶于水中。用二***洗涤含水混合物，使用1N盐酸调节至pH值3，而后用乙酸乙酯提取。用盐水洗涤合并的提取物，用无水硫酸镁干燥，过滤，真空浓缩。
将粗品(12.20g)溶于120mL无水二甲亚砜中。向此溶液中加入10.50g(76mmol)碳酸钾和4.70mL(76mmol)碘甲烷，在室温下将得到的混合物搅拌24小时。用水稀释反应混合物，用乙酸乙酯提取。用水(2X)和盐水洗涤合并的提取物，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。进行硅胶柱色谱(洗脱：2-10％乙酸乙酯/己烷)，提供8.54g N-叔丁氧羰基-3-(4-戊烯基硫基)-L-缬氨酸甲基酯无色油。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.76(d of d of t，1H，J＝17.2，10.3，6.6Hz)，5.35(br d，1H，J＝9.0Hz)，5.05-4.94(m，2H)，4.27(br d，1H，J＝9.0Hz)，3.73(s，3H)，2.52(m，2H)，2.13(四重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.61(五重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.43(s，9H)，1.35(s，3H)，1.33(s，3H)。
步骤2：实施例32，N-叔丁氧羰基-3-(4-戊烯基硫基)-L-缬氨酸的制备
在室温下，向8.52g(25.7mmol)N-叔丁氧羰基-3-(4-戊烯基硫基)-L-缬氨酸甲基酯的200mL四氢呋喃溶液中加入1.10g(26.2mmol)氢氧化锂一水合物的50mL水溶液。在室温下将得到的混合物搅拌65小时。然后向反应混合物中加入28mL 1.00N盐酸。用二***稀释混合物，用水(3X)和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到8.10gN-叔丁氧羰基-3-(4-戊烯基硫基)-L-缬氨酸无色油。..NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.75(d of d of t，1H，J＝17.2，10.3，6.6Hz)，5.40(br s，1H)，5.05-4.94(m，2H)，4.28(br s，1H)，2.56(m，2H)，2.13(四重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.63(五重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.44(s，9H)，1.39(s，3H)，1.37(s，3H)。
实施例33
实施例33，5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)戊酸的制备
步骤1：吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙基酯的制备
使用改变的迪安-斯达克榻分水器(通过充满分子筛的索氏抽提器进行冷凝物回流)，在氮气氛围中，将L-焦谷氨酸(Aldrich，25.0g，195mmol)和对甲苯磺酸单水合物(3.71g，19.5mmol)的溶液在异丙醇(40mL)中回流6小时。冷却至室温后，用醚稀释反应，用饱和碳酸氢钠水溶液、而后饱和NaCl水溶液洗涤，干燥(MgSO4)，蒸发，得到无色浆液。放置后结晶。在己烷中研磨晶体残余物，提供31.9g(96％)吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙基酯白色棱晶：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ6.35(br s，1H)，5.04(sept..1H，J＝6.2Hz)，4.18(dd，1H，J＝8.4，5.3Hz)，2.51-2.28(m，3H)，2.27-2.12(m，1H)，1.24(d，6H，J＝6.2Hz)..LCMS m/z 172(M+H)+。
步骤2：1-(叔丁氧羰基)-吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙基酯的制备
在室温下，在N2氛围中，将吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙基酯(步骤26A的产物，31.9g，188mmol)、二碳酸二叔丁基酯(48.6g，225mmol)和DMAP(2.30g，8.8mmol)的乙腈(300mL)溶液搅拌30分钟。将反应蒸发至大约100mL，用醚稀释，用1N HCl、然后饱和NaCl水溶液洗涤，干燥(MgSO4)，蒸发，得到1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-5-酮-2(S)羧酸异丙基酯浅黄色油，50.1g(99％)：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.06(sept.1H，J＝6.2Hz)，4.53(dd，1H，J＝9.5，2.9Hz)，2.66-2.40(m，2H)，2.36-2.22(m，1H)，2.03-1.93(m，1H)，1.47(s，9H)，1.26(d，3H，J＝6.2Hz)，1.24(d，3H，J＝6.2Hz)..LCMS m/z 272(M+H)+。
步骤3：2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-5-羟基戊酸异丙基酯的制备
用1.5小时向1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-5-酮-2(S)-羧酸异丙基酯(步骤26B的产物，49.5g，183mmol)的甲醇(300mL)溶液中加入～1g份额的硼氢化钠(10.0g，263mmol)。在氮气氛围中另外搅拌反应10分钟。用水稀释，用醚提取，用饱和NaCl水溶液洗涤合并的有机馏份，干燥(MgSO4)，蒸发，得到浅黄色油。进行快速色谱(硅胶，20-30％乙酸乙酯/己烷)，得到31.8g(64％)2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-5-羟基戊酸异丙基酯无色浆液：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.16(br d，1H，J＝7.3Hz)，5.03(sept.，1H，J＝6.2Hz)，4.28(br d，1H，J＝6.2Hz)，3.67(br dd，J＝10.2，5.5Hz)，1.94-1.79(m，2H)，1.76-1.67(m，1H)，1.66-1.56(m，2H)，1.43(s，9H)，1.25(d，3H，J＝6.2Hz)，1.23(d，3H，J＝6.2Hz).LCMS m/z 276(M+H)+。
步骤4：异丙基-5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)戊酸酯的制备
在氮气氛围中，将2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-5-羟基戊酸异丙基酯(步骤26C的产物，17.6g，63.9mmol)、烯丙基甲基碳酸酯(24.0mL，213mmol)、Pd2(dba)3(1.62g，1.78mmol)和BINAP(4.42g，7.10mmol)的THF(150mL)脱气混合物回流3小时。冷却至室温后，用醚稀释反应，通过硅藻土过滤，蒸发，得到暗褐色浆液。对残余物进行快速色谱(硅胶，30％醚/己烷)，得到5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)戊酸异丙基酯粘稠的无色油，16.3g(81％)：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.88(ddt，1H，17.4，10.4，5.5)，5.28(m，1H)，5.22-5.11(m，1H)，5.02(sept.，1H，J＝6.2Hz)，4.21(br t，1H，J＝6.7Hz)，3.94(dt，2H，J＝5.9，1.5Hz)，3.42(t，2H，J＝5.9Hz)，1.90-1.82(m，1H)，1.75-1.57(m，3H)，1.42(s，9H)，1.21(d，3H，J＝6.2Hz)，1.19(d，3H，J＝6.2Hz)..LCMS m/z 316(M+H)+。
步骤5：实施例33，5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)戊酸的制备
在室温下，在氮气氛围中，将5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)戊酸异丙基酯(步骤26D的产物，16.1g，51.1mmol)和氢氧化锂水合物(4.19g，102mmol)在THF/水(100mL/20mL)中的混合物搅拌16小时。用水稀释反应，用醚洗涤，将水溶液馏份的pH值调节至～4，用醚提取，用饱和NaCl洗涤合并的有机馏份，干燥(MgSO4)，蒸发，得到5-烯丙氧基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)戊酸浅黄色浆液：1H NMR(300MHz，氯仿-D)δ5.89(ddt，1H，J＝17.4，10.4，5.5)，5.25(dd，1H，J＝17.4，1.6Hz)，5.17(dd，1H，J＝10.4，1.6Hz)，4.30(br d，1H，J＝6.2)，3.96(dt，2H，J＝5.9，1.5Hz)，3.46(t，2H，J＝5.9Hz)，1.96-1.86(m，1H)，1.85-1.77(m，1H)，1.75-1.64(m，2H)，1.43(s，9H)..LCMS m/z 274(M+H)+。
实施例34
制备实施例34的一般方法
如下制备实施例23：将N-三苯甲基保护的苏氨酸的DMF溶液加入到氢化钠的DMF溶液(冷却至-15℃)中。在-15℃搅拌反应混合物30分钟，而后加入5-溴-1-戊烯，将得到的混合物加热至-5℃。在-5℃保持反应混合物3天，而后通过加入1N HCl水溶液来猝灭反应，使用如上所述的标准提取方法进行后处理。利用标准色谱方法，获得纯式的实施例23。
实施例35：
实施例35，N-叔丁氧羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸的制备
步骤1：N-叔丁氧羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸甲基酯的制备
在室温下，向10.26g(50mmol，1.0eq)N-叔丁氧羰基-L-丝氨酸的500mL无水二甲亚砜溶液中加入2.00g(50mmol，1.0eq)60％氢化钠/矿物油。在室温下搅拌该混合物0.5小时，直到停止放出气体为止。向得到的溶液中加入6.00mL(50mmol，1.0eq)5-溴-1-戊烯，接着立即加入2.00g(50mmol，1.0eq)60％氢化钠/矿物油。然后将反应混合物在室温下搅拌16小时。用2000mL水稀释混合物，通过加入50mL 1.00N盐酸将pH值调节至3-4，用乙酸乙酯提取。用水(2X)和盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。除去残余矿物油，将得到的物质溶于稀氢氧化钠水溶液中。用己烷洗涤水溶液，而后使用盐酸调节至pH值4，用乙酸乙酯提取。用水(2X)和盐水洗涤提取物，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。
将粗品(7.70g)溶于100mL无水二甲亚砜中。向此溶液中加入7.80g(56mmol)碳酸钾和3.50mL(56mmol)碘甲烷，在室温下将得到的混合物搅拌24小时。用水稀释反应混合物，用乙酸乙酯提取。用水(2X)和盐水洗涤合并的提取物，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩。进行硅胶柱色谱(洗脱：2-10％乙酸乙酯/己烷)，提供6.70g N-叔丁氧羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸甲基酯无色油。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.78(双重双峰t，1H，J＝17.2，10.2，6.6Hz)，5.34(br d，1H，J＝8.0Hz)，5.03-4.92(m，2H)，4.40(m，1H)，3.81(d of d，1H，J＝9.5，2.9Hz)，3.74(s，3H)，3.61(d ofd，1H，J＝9.5，3.5Hz)，3.42(m，2H)，2.06(四重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.61(五重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.44(s，9H)。
步骤2：实施例35，N-叔丁氧羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸的制备
在室温下，向6.65g(23mmol)N-叔丁氧羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸甲基酯的500mL四氢呋喃溶液中加入1.95g(46mmol)氢氧化锂一水合物的100mL水溶液。在室温下将得到的混合物搅拌40小时。然后向反应混合物中加入46mL 1.00N盐酸。用乙酸乙酯稀释混合物，用水(3X)和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到6.30g N-叔丁氧羰基-O-(4-戊烯基)-L-丝氨酸无色油。NMR(300MHz，CDCl3)：δ5.77(双重双峰t，1H，J＝17.2，10.2，6.6Hz)，5.37(br d，1H，J＝8.0Hz)，5.03-4.92(m，2H)，4.42(m，1H)，3.87(d of d，1H，J＝9.5，2.6Hz)，3.63(d of d，1H，J＝9.5，4.0Hz)，3.45(t，2H，J＝6.6Hz)，2.07(四重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.64(五重峰，2H，J＝7.3Hz)，1.44(s，9H)。
实施例36
实施例36，(S)-4-烯丙氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丁酸的制备
在0℃，向氢化钠(913mg，22.8mmol)的DMF混合物中加入N-t-Boc-L-高丝氨酸(2g，9.13mmol)。在0℃搅拌该反应混合物15分钟，而后加入烯丙基溴(1.38g，11.4mmol)。将混合物升温至室温，搅拌2小时。然后将其真空浓缩。用水稀释残余物，用己烷和醚顺序洗涤。除去有机层，用1N HCl将水层小心地调节至pH值3。用乙酸乙酯提取该酸性水溶液。干燥(MgSO4)有机相，真空浓缩，得到2.2g(93％)(S)-4-烯丙氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丁酸无色油。1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.42(s，9H)，1.80-1.90(m，1H)，2.04-2.16(m，1H)，3.50-3.54(m，2H)，3.97(d，J＝4.39Hz，2H)，4.23(dd，J＝8.78，4.39Hz，1H)，5.15(d，J＝10.25Hz，1H)，5.26(dd，J＝17.38，1.65Hz，1H)，5.84-5.97(m，1H)。
实施例37
实施例37，(S)-2-(叔丁氧羰基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酸的制备
步骤1：3-氨基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)丙酸甲酯的制备
向i(Boc-DAP-OH)(3.0g 14.7mmol)的50mL二氯甲烷混合物中加入5mL甲醇。向此溶液中慢慢地加入(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2M，在醚中，7.9mL，15.8mmol)。在室温搅拌混合物2小时，直到所有固体溶解为止，该溶液变成浅黄色。然后将其浓缩，得到3.2g(99％)3-氨基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)丙酸甲酯ii无色油。1H NMR(CD3OD，300MHz)δ1.46(s，9H)，2.82-3.00(m，2H)，3.71(s，3H)，4.14(brs，1H)。
2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基苯基磺酰氨基)丙酸甲酯iii的制备：
向3-氨基-2(S)-(叔丁氧羰基氨基)丙酸甲酯ii(1.6g，7.3mmol)的DCM(50mL)混合物中加入DIPEA(1.64mL，9.4mmol)和2-硝基苯磺酰氯(1.62g，7.3mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。然后将其浓缩，溶于乙酸乙酯中，然后将其用饱和碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸镁干燥。然后将其过滤，浓缩，得到2.9g(98％)2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基苯基磺酰氨基)丙酸甲酯iii黄色泡沫。1H NMR(CD3OD，300MHz)δ1.41(s，9H)，3.36-3.51(m，2H)，3.71(s，3H)，4.22(m，1H)，7.80-7.90(m，3H)，8.07-8.10(m，1H)。
2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酸甲酯iv的制备：
向2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基苯基磺酰氨基)丙酸甲酯iii(150mg，0.37mmol)的3mL DMF的混合物中加入碳酸钾(102mg，0.74mmol)。在室温搅拌该混合物20分钟，而后加入5-溴-1-戊烯(65μL，0.55mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2天。然后过滤，浓缩，通过硅胶色谱纯化(用25％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到75mg(43％)2(S)-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酸甲酯iv黄色固体。1H NMR(CD3OD，300MHz)δ1.42(s，9H)，1.54-1.64(m，2H)，1.97(q，J＝7.20Hz，2H)，3.37(m，2H)，3.57-3.80(m，2H)，3.72(s，3H)，4.42(dd，J＝8.60，5.31Hz，1H)，4.91-5.01(m，2H)，5.69-5.79(m，1H)，7.75-7.85(m，3H)，8.04(m，1H)；MS m/z 372(M++1-Boc)。
实施例37，2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酸v的制备：
将(S)-甲基2-(叔丁氧羰基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)-丙酸酯iv(500mg，1.06mmol)溶于下列混合溶剂***中：THF(4ml)、甲醇(1mL)和水(2mL)。加入粉末氢氧化锂(250mg，10.4mmol)。在室温搅拌该浅黄色浆液15小时，而后真空浓缩。将残余物在醚和水之间分配。除去***相，用1N HCl处理水相，直到pH值4为止。用乙酸乙酯提取该酸性溶液四次。将合并的乙酸乙酯提取物干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到430mg(89％)2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酸(实施例26)黄色油。1H NMR(CD3OD，300MHz)δ1.38(s，9H)，1.51-1.60(m，2H)，1.89-1.98(m，2H)，3.28-3.32(m，2H)，3.59-3.64(dd，J＝14.95，9.46Hz，1H)，3.71-3.74(m，1H)，4.33(dd，J＝9.61，4.43Hz，1H)，4.87-4.94(m，2H)，5.63-5.72(m，1H)，7.71-7.77(m，3H)，8.01(dd，J＝7.48，1.37Hz，1H)；MS m/z 358(M++1-Boc)。
实施例86
(1S，4R，6S，14S，18R)-[7-顺式-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-12-环丙基-18-羟基-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]氨基甲酸叔丁基酯(实施例86)的制备
步骤1：N-(戊-4-烯基)环丙胺的合成。
使用加入漏斗，用5分钟的时间，将5-溴戊烯(15.75g，106mmol)的50mL甲醇溶液加入到环丙胺(20.6g，361mmol)的200mL甲醇溶液中。在室温搅拌此溶液72小时，此时回流1小时。蒸馏除去甲醇和过量环丙胺。将残余物(产物的氢溴酸盐)在醚和4N NaOH之间分配。用醚(2x)洗涤水相。将合并的***提取物干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到8g(60％)N-(戊-4-烯基)环丙胺黄色油：1H NMR(500MHz，CDCl3)δ0.31-0.36(m，2H)0.40-0.46(m，2H)1.53-1.63(m，2H)1.87(brs，1H)2.05-2.10(m，2H)2.10-2.14(m，1H)2.69(t，J＝7.32Hz，2H)4.91-5.07(m，2H)5.72-5.88(m，1H)。
步骤2：2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酸的合成
将N-(戊-4-烯基)环丙胺(668mg，5.30mmol)的20mL乙腈溶液加入到N-叔丁氧羰基-L-丝氨酸β-内酯(1.0g，5.30mmol)的40mL乙腈浆液中。在N2氛围中、在室温搅拌该混合物5天，而后真空浓缩，得到粗品2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酸。该物质不用纯化就可以在步骤3中使用。LC-MS(Phenomenex 10微摩尔(“μm”)C18HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：3min。停留时间：1min。流速：4mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA。(保留时间：2.50min)，MS m/z 313(M++1)。
步骤3：1(R)-[1-[2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酰基]-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的合成。
将2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酸(1.47g，4.71mmol)的20mL DCM溶液用1(R)-[4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(在实施例5中制备)(1.44g，4.71mmol)、N-甲基吗啉(1.80mL，16.34mmol)和HATU(2.14g，5.53mmol)顺序处理。在室温、在N2氛围中搅拌反应混合物3小时，而后真空浓缩。将残余物溶于水中，加入1N HCl，直到pH值＝5为止。用EtOAc提取该水溶液(三次)。用饱和NaHCO3水溶液洗涤有机相，干燥(MgSO4)，真空浓缩，得到粗品。进行快速色谱(50％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)，得到1.55g(58％)1(R)-[1-[2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酰基]-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯白色泡沫：
LC-MS(Phenomenex-Luna S10 HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：2min。停留时间：1min。流速：4mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：1.38min)，MS m/z 564(M++1).。
步骤4：1(R)-[1-[2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酰基]-4(R)-(叔丁基二甲基硅基氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的合成。
向1(R)-[1-[2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酰基]-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(155g，2.75mmol)的10mL DMF的混合物中加入咪唑(0.47g，6.88mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(826mg，5.50mmol)。在室温搅拌该混合物18小时，真空浓缩，并在乙酸乙酯和水之间分配。用硫酸镁干燥有机相，真空浓缩，获得类白色固体。进行快速色谱(用二氯甲烷而后乙酸乙酯洗脱)，得到1(R)-[1-[2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酰基]-4(R)-(叔丁基二甲基硅基氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯白色固体(1.75g，94％)：
LC-MS(Phenomenex 10(m C18HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：2min。停留时间：1min。流速：5mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：2.51min)，MS m/z 677(M++1)。
步骤5：(1S，4R，6S，14S,18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯的合成。
向1(R)-[1-[2(S)-(叔丁氧羰基氨基)-3-[N-环丙基-N-(戊-4-烯基)氨基]丙酰基]-4(R)-(叔丁基二甲基硅基氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺基]-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(1.45g，2.14mmol)的1L二氯甲烷溶液中加入181mg(0.21mmol)Grubb′s第二代催化剂[(1，3-二-(2，4，6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基)二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌]。将混合物回流加热1小时。加入第二部分的催化剂(50mg，0.058mmol)，在室温搅拌混合物过夜。真空浓缩残余物，而后通过快速色谱纯化，用50％醚/己烷洗脱，得到0.84g(62％)(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯白色固体：LC-MS(Phenomenex 10μm C18HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：2min。停留时间：1min。流速：5mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：2.43min)，MS m/z 649(M++1).。
步骤6：(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂三环[143.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸的合成。
向(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸乙酯(0.84g，1.30mmol)的THF(30mL)、甲醇(15mL)和水(4mL)溶液中加入粉末氢氧化锂水合物(0.31g，12.90mmol)。在室温、在N2氛围中将得到的浅黄色浆液搅拌过夜。然后真空浓缩混合物，并在己烷/醚(1∶1)和水之间分配。除去有机相，用1N HCl处理水相，直到pH值5为止。用EtOAc提取该酸性溶液(三次)。干燥(MgSO4)合并的EtOAc提取物，真空浓缩，得到0.495g(61％)(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸类白色固体：LC-MS(Phenomenex 10μmC18HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：2min。停留时间：1min。流速：5mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：2.36min)，MS m/z621(M++1).。
步骤7：(1S，4R，6S，14S，18R)-[7-顺式-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-12-环丙基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]氨基甲酸叔丁基酯的合成。
将(1S，4R，6S，14S，18R)-7-顺式-14-叔丁氧羰基氨基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-4-羧酸(490mg，0.79mmol)溶于15mL THF中，并用CDI(179mg，1.10mmol)处理。(必须小心，使用烘干的玻璃器皿，保持干燥N2氛围，避免湿润)。将反应混合物回流两小时之后，将其冷却至室温，用环丙基磺酰胺(134mg，1.10mmol)和DBU(168mg，1.10mmol)顺序处理。在室温搅拌过夜之后，通过旋转蒸发除去THF。将残余物溶于水中，加入1N HCl，直到pH值＝5为止。用EtOAc提取该水溶液(三次)。干燥(MgSO4)合并的EtOAc提取物，真空浓缩，得到粗品。通过快速柱纯化，用3％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到300mg(53％)(1S，4R，6S，14S，18R)-[7-顺式-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-12-环丙基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]氨基甲酸叔丁基酯白色固体：LC-MS(Phenomenex 10μm C18HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：2min。停留时间：1min。流速：5mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：2.40min)，MS m/z 724(M++1).。
步骤8：(1S，4R，6S，14S，18R)-[7-顺式-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-12-环丙基-18-羟基-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]氨基甲酸叔丁基酯的合成(实施例86)。
向化合物(1S，4R，6S，14S，18R)-[7-顺式-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-12-环丙基-18-(叔丁基二甲基硅基氧基)-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]氨基甲酸叔丁基酯(250mg，0.35mmol)的15mL THF的混合物中加入四丁基氟化铵(129mg，0.46mmol)。将混合物在室温下搅拌18小时。旋转蒸发除去THF，在乙酸乙酯和水之间分配残余物。干燥(MgSO4)有机相，真空浓缩，得到粗品。用己烷研磨进行纯化，提供200mg(94％)(1S，4R，6S，14S，18R)-[7-顺式-4-环丙烷磺酰基氨基羰基-12-环丙基-18-羟基-2，15-二氧代-3，12，16-三氮杂-三环[14.3.0.04，6]十九-7-烯-14-基]氨基甲酸叔丁基酯白色固体：LC-MS(保留时间：2.32min)，MS m/z 610(M++1)。
(Phenomenex 10μm C18HPLC柱：3.0×50mm长度。梯度：100％溶剂A/0％溶剂B至0％溶剂A/100％溶剂B。梯度时间：3min。停留时间：1min。流速：4mL/min。检测器波长：220nM。溶剂A：10％MeOH/90％H2O/0.1％TFA。溶剂B：10％H2O/90％MeOH/0.1％TFA)。(保留时间：2.32min)，MS m/z 610(M++1).。
实施例87
(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-14a-(环丙基磺酰基氨基甲酰
基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六
氢化环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-6-基氨基甲酸叔丁
基酯，化合物1的制备
化合物1
步骤1。
在-78℃，向甲基亚砜(23.90mL，337mmol)的DCM(100mL)溶液中逐滴加入草酰氯(2M，在DCM中，84mL，168mmol)。在此温度下将形成的溶液搅拌30分钟。在-78℃，逐滴加入(2S，4R)-1-苄基2-甲基4-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸酯(21.38g，77mmol)的DCM(100mL)溶液。在-78℃将形成的浆液搅拌2小时，而后逐滴加入N，N-二异丙基乙胺(66.7mL，383mmol)。在室温下将最终溶液搅拌3小时。用冰冻的1M HCl、5％枸橼酸、而后盐水洗涤混合物，用MgSO4干燥，过滤，蒸发。用硅胶柱色层纯化剩余的浅棕色油，用4∶1、3∶1、然后2∶1己烷-EtOAc洗脱，得到(S)-1-苄基2-甲基4-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸酯(14.8g，70％产率)浅棕色粘性油。
1H NMR(CDCl3)δ2.58-2.63(m，1H)，2.90-2.99(m，1H)，3.62，3.77(s，3H，旋转异构体)，3.95-4.02(m，2H)，4.82-4.89(m，1H)，5.11-5.24(m，2H)，7.32-7.39(m，5H)。
步骤2。
在0℃，向(S)-1-苄基2-甲基4-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸酯(14.0g，50.5mmol)的甲苯(500mL)溶液中逐滴加入联苯-4-基溴化镁(152mL，0.5M，在THF中，75.75mmol)。在此温度下将形成的浅黄色溶液搅拌1小时。用NH4Cl淬灭，分离有机层。用EtOAc提取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，蒸发。使残余物通过硅胶塞进行纯化，用4∶1、3∶1、然后2∶1和最后3∶2己烷-EtOAc洗脱，提供11.70g白色固体，将其用EtOAc-己烷(50ml-150ml)重结晶，得到7.8g的(2S，4R)-1-苄基2-甲基4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸酯小的针晶。浓缩母液，用快速柱纯化，用4∶1、3∶1、然后2∶1和最后3∶2己烷-EtOAc洗脱，得到额外的2.41g所需要的产物。
1H NMR(CDCl3)δ2.39-2.45(m，1H)，2.70-2.75(m，1H)，3.66，3.86(s，3H，旋转异构体)，3.80-3.90(m，1H)，4.00-4.07(m，1H)，4.62(dd，J1，2＝9.5，28Hz，1H)，5.09-5.15(m，1H)，5.21-5.25(m，1H)，7.31-7.38(m，6H)，7.42-7.45(m，2H)，7.54-7.59(m，6H)；
LC-MS(保留时间：2.77min，方法B)，MS m/z 414(M+-H2O)，370(M+-H2O-CO2)。
步骤3。
在0℃，向(2S，4R)-1-苄基2-甲基4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸酯(8.08g，18.73mmol)的DMF(150mL)溶液中加入氢化钠(0.520g，20.60mmol)。在此温度下将形成的浅棕色溶液搅拌30分钟。在0℃，逐滴加入硫酸二甲酯(1.949mL，20.60mmol)。在室温下将最终溶液搅拌2小时。用5％枸橼酸淬灭，用EtOAc提取。用盐水洗涤有机物，用MgSO4干燥，过滤，蒸发。用硅胶快速柱色层纯化残余物，用4∶1、3∶1、然后2∶1己烷-EtOAc洗脱，得到1.45g所需要的产物，将其在MeOH(10ml)中重结晶，得到1.20g(14.38％产率)白色固体。在快速柱纯化期间，还可以回收4.50g起始原料。
1H NMR(CDCl3)δ2.51-2.56(m，1H)，2.85-2.89(m，1H)，2.95，2.97(s，3H，旋转异构体)，3.67，3.80(s，3H，旋转异构体)，3.69-3.86(m，1H)，4.02-4.08(m，1H)，4.62(dd，J1，2＝9.5，28Hz，1H)，5.09-5.17(m，1H)，5.20-5.29(m，1H)，7.29-7.46(m，10H)，7.57-7.60(m，4H)；
LC-MS(保留时间：2.92min，方法B)，MS m/z 446(M++H)，414(M+-MeOH)，370(M+-MeOH-CO2)。
步骤4：
向含有(2S，4R)-1-苄基2-甲基4-(联苯-4-基)-4-甲氧基吡咯烷-1，2-二羧酸酯(1.29g，2.90mmol)的MeOH(30mL)溶液的冰冷Parr振荡容器中加入钯(0.308g，0.290mmol)/碳(10％，湿润)。在25psi压力的氢气条件下，将容器放置在Parr振动设备上5小时。用硅藻土淬灭。过滤，蒸发，得到0.811g(91％)所需要的产物类白色粉末。该物质不用进一步纯化就可以在下一步偶合反应中使用。
LC-MS(保留时间：1.92min，方法B)，MS m/z 312(M++H)，280(M+-MeOH)。
反应路线2
步骤1：(2S，4R)-甲基4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-
烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸酯的制备
在0℃，向(2S，4R)-甲基4-(联苯-4-基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸酯(150mg，0.482mmol)、(S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酸(144mg，0.530mmol)和HATU(260mg，0.723mmol)的DCM(5mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.252mL，1.445mmol)。将反应混合物升温至室温，搅拌18小时。然后用DCM稀释，用5％枸橼酸和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩。用制备HPLC纯化残余物，得到(2S，4R)-甲基4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸酯(140mg，51.5％产率)白色泡沫。
1H NMR(CD3OD)δ1.31-1.57(m，15H)，1.62-1.65(m，1H)，1.78-1.82(m，1H)，2.11-2.13(m，2H)，2.66-2.69(m，1H)，2.84-2.89(m，1H)，3.00(s，3H)，3.76(s，3H)，4.16(s，2H)，4.30-4.35(m，1H)，4.79-4.81(m，1H)，4.95(d，J＝12Hz，1H)，5.03(d，J＝18.5Hz，1H)，5.83-5.87(m，1H)，7.32-7.39(m，1H)，7.45-7.56(m，4H)，7.64-7.71(m，4H)；LC-MS(保留时间：3.20min，方法B)，MS m/z 565(M++H)。
步骤2：(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯
酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸的制备
向(2S，4R)-甲基4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸酯(166mg，0.294mmol)的THF(2mL)和MeOH(2mL)溶液中加入预先配制的氢氧化锂一水合物(37mg，0.882mmol)水溶液(2mL)。在室温搅拌该浑浊的溶液18小时，而后真空浓缩。将残余物溶于水中，用1N HCl酸化至pH值2。用EtOAc提取该水溶液。用5％枸橼酸和盐水洗涤有机相，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到148mg(91％)(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸白色固体。不用进一步纯化。
LC-MS(保留时间：3.14min，方法B)，MS m/z 551(M++H)。
步骤3：(1R，2S)-1-((2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)
壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙基酯的
制备
将(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸(68.2mg，0.124mmol)、1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯、HCl(26.1mg，0.136mmol)、HATU(56.5mg，0.149mmol)和Hunig′s碱(0.076mL，0.433mmol)在DCM(3mL)中的混合物、在室温搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩。将残余物溶于EtOAc中，用稀HCl、然后饱和NaHCO3水溶液和水洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到120mg粗品黄色油。用Biotage纯化，用40％EtOAc/己烷洗脱，得到67mg(79％)(1R，2S)-1-((2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酰胺)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙基酯白色固体。LC-MS：MS m/z 688(M+1)。
步骤4：(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨
基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六
氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮环十五烯-14a-羧酸乙基酯的制备
将(1R，2S)-1-((2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)壬-8-烯酰)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙基酯(60mg，0.087mmol)和GrubbsII(14.81mg，0.017mmol)在DCM(100mL)中的混合物回流4小时。在这时候，再加入0.2eq的Grubbs II(14.81mg，0.017mmol)，并将该混合物再回流4小时。真空浓缩反应混合物，用Biotage纯化粗品，用40％EtOAc/己烷洗脱，得到56mg(97％)(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-14a-羧酸乙基酯浅棕色固体。LC-MS：MS m/z 628(M+1-MeOH)。
1H NMR(300MHz，d4-MeOH)δppm 1.19-1.57(m，19H)，1.75(d，J＝8.78Hz，3H)，1.81-1.96(m，1H)，2.15-2.34(m，3H)，2.60-2.82(m，2H)，3.09(s，3H)，4.07-4.24(m，3H)，4.39-4.54(m，2H)，4.78-4.86(m，1H)，5.25-5.38(m，1H)，5.54-5.69(m，1H)，7.36(t，J＝7.32Hz，1H)，7.46(t，J＝7.50Hz，1H)，7.58-7.72(m，6H)。
步骤5：(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨
基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六
氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-14a-羧酸的制备
将(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-14a-羧酸乙基酯(56mg，0.085mmol)、LiOH一水合物(40.7mg，1.70mmol)的混合物在四氢呋喃(2mL)/水(0.5mL)/MeOH(1mL)中、在室温搅拌18小时。然后将其真空浓缩，用醚洗涤。使用1N HCl将水相调节至pH值＝4，用EtOAc提取。用MgSO4干燥EtOAc 提取物，过滤并真空浓缩，得到52mg(97％)(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-14a-羧酸类白色固体。
LC-MS：MS m/z 654(M+1+Na)。
1H NMR(500MHz，d4-MeOH)δppm 1.25-1.64(m，15H)，1.66-1.84(m，3H)，1.88-2.03(m，1H)，2.10-2.43(m，3H)，2.58-2.86(m，2H)，3.09(s，3H)，4.06-4.27(m，1H)，4.33-4.57(m，2H)，4.77-4.86(m，1H)，5.29-5.45(m，1H)，5.52-5.72(m，1H)，7.37(t，J＝7.48Hz，1H)，7.47(t，J＝7.63Hz，2H)，7.53-7.84(m，6H).。
步骤6：(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-14a-(环丙基磺酰
基氨基甲酰基)-2-甲氧基-5，16-二氧代
-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[e]吡咯并
[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-6-基氨基甲酸叔丁基酯的制备
将(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-14a-羧酸(50mg，0.079mmol)和CDI(755mg，4.66mmol)的混合物在四氢呋喃(5mL)中回流加热1小时。然后将其冷却至室温，而后加入环丙烷磺酰胺(11.51mg，0.095mmol)，而后加入DBU(0.042mL，0.277mmol)。将反应混合物在室温搅拌18小时，而后真空浓缩，得到粗品淡色的油。用制备HPLC纯化，得到15mg(26％)(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-14a-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-甲氧基-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五烯-6-基氨基甲酸叔丁基酯白色固体。
LC-MS：MS m/z757(M+1+Na)。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.86-0.97(m，1H)，0.99-1.09(m，1H)，1.08-1.74(m，19H)，1.80(dd，J＝7.78，5.95Hz，1H)，1.87-2.00(m，1H)，2.01-2.17(m，1H)，2.34-2.44(m，J＝8.24Hz，2H)，2.63-2.77(m，2H)，2.90-3.01(m，1H)，3.14(s，3H)，4.05(d，J＝10.38Hz，1H)，4.35(t，J＝7.32Hz，1H)，4.40-4.51(m，1H)，4.76(d，J＝9.77Hz，1H)，5.14(t，J＝9.46Hz，1H)，5.61-5.77(m，1H)，7.37(t，J＝7.32Hz，1H)，7.46(t，J＝7.63Hz，2H)，7.55-7.66(m，6H).。
实施例88：化合物2的制备
(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-14a-(环丙基磺酰基氨基甲
酰基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代
-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并
[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-6-基氨基甲酸叔丁基酯，化合物2的制备。
化合物2
反应路线3
步骤1：(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基
-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸甲基酯的
制备
将(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸甲基酯(100mg，0.287mmol)、(S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酸(145mg，0.316mmol)、Hunig′s碱(0.176mL，1.01mmol)和HATU(131mg，0.345mmol)的混合物在DCM(3mL)中、在室温搅拌18小时。然后将其真空浓缩。将残余物溶于EtOAc中，用稀HCl、而后饱和NaHCO3水溶液和水洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到250mg粗品棕色油。用Biotage纯化，用60％EtOAc/己烷洗脱，得到188mg(87％)(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸甲基酯类白色泡沫。
LC-MS：MS m/z 751(M+1)。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.28-1.52(m，9H)，1.51-1.74(m，2H)，1.90-2.07(m，2H)，2.58-2.71(m，1H)，2.78-2.91(m，1H)，2.95，3.01(s，3H，旋转异构体)，3.39-3.54(m，2H)，3.56-3.68(m，2H)，3.77-3.80(m，4H)，4.00-4.17(m，1H)，4.34(d，J＝11.29Hz，1H)，4.74-4.81(m，1H)，4.91-5.06(m，2H)，5.66-5.85(m，1H)，7.37(t，J＝7.32Hz，1H)，7.44-7.54(m，4H)，7.61-7.73(m，4H)，7.75-7.90(m，3H)，8.06-8.17(m，1H)。
步骤2：(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基
-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸的制备
将(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸甲基酯(185mg，0.246mmol)和LiOH一水合物(118mg，4.93mmol)的混合物在四氢呋喃(2mL)/MeOH(0.5mL)/水(1mL)中、在室温搅拌18小时。然后真空浓缩反应混合物，用5mL水稀释。然后将其用醚洗涤。使用1N HCl将水相调节至pH值＝4。然后将其用EtOAc提取，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到160mg(87％)(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸白色固体。
LC-MS：MSm/z737(M+1)。
1H NMR(500MHz，d4-MeOH)δppm 1.29-1.73(m，11H)，1.90-2.12(m，2H)，2.67(dd，J＝13.12，9.46Hz，1H)，2.88(d，J＝13.43Hz，1H)，3.04(s，3H)，3.40-3.55(m，2H)，3.56-3.71(m，2H)，3.80(dd，J＝15.41，3.81Hz，1H)，4.06(d，J＝10.99Hz，1H)，4.26-4.38(m，1H)，4.70-4.81(m，1H)，4.95-5.06(m，2H)，5.59-5.90(m，1H)，7.37(t，J＝7.48Hz，1H)，7.42-7.58(m，4H)，7.62-7.75(m，4H)，7.76-7.92(m，3H)，8.01-8.21(m，1H).。
步骤3：(1R，2S)-1-((2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨
基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧
酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙基酯的制备
将(2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酸(160mg，0.217mmol)、1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯HCl盐(49.9mg，0.261mmol)、HATU(99mg，0.261mmol)和Hunig′s碱(0.133mL，0.760mmol)的混合物在DCM(3mL)中、在室温搅拌18小时。然后将其真空浓缩。将残余物溶于EtOAc中，用稀HCl、然后饱和NaHCO3水溶液和水洗涤。然后用MgSO4干燥有机相，过滤，真空浓缩，得到180mg粗品黄色油。用Biotage 纯化，用40％EtOAc/己烷洗脱，得到100mg(53％)(1R，2S)-1-((2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙基酯白色固体。
LC-MS：MSm/z874(M+1)。
1H NMR(300MHz，DMSO-D6)δppm 1.14(t，J＝7.14Hz，3H)，1.18-1.42(m，12H)，1.60-1.69(m，2H)，1.83-1.96(m，2H)，2.11(q，J＝8.17Hz，1H)，2.51-2.61(m，2H)，2.96(s，3H)，3.33-3.41(m，2H)，3.43-3.65(m，J＝9.51Hz，2H)，3.81-3.91(m，1H)，3.98-4.10(m，J＝6.83，6.83，6.83Hz，3H)，4.58-4.72(m，J＝9.33，4.21Hz，1H)，4.86-5.01(m，2H)，5.09(d，J＝13.17Hz，1H)，5.22(d，J＝17.20Hz，1H)，5.50-5.81(m，2H)，7.07(d，J＝9.15Hz，1H)，7.34-7.41(m，1H)，7.47(t，J＝7.32Hz，4H)，7.61-7.74(m，4H)，7.77-7.93(m，2H)，7.94-8.08(m，2H)，8.43(s，1H)。
步骤4：(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨
基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代
-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并
[2，1-c][[1，4，8]三氮杂环十五烯-14a-羧酸乙基酯的制备
将(1R，2S)-1-((2S，4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-(2-硝基-N-(戊-4-烯基)苯基磺酰氨基)丙酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-羧酰胺基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙基酯(95mg，0.109mmol)和GrubbsII(18.46mg，0.022mmol)的混合物在DCM(200mL)中回流4小时。然后将反应混合物真空浓缩。用Biotage纯化残余物，用60％EtOAc/己烷洗脱，分离65mg(71％)(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-14a-羧酸乙基酯类白色固体。
LC-MS：MSm/z868(M+1+Na)。
1H NMR(500MHz，d4-MeOH)δppm 1.37-1.53(m，13H)，1.57-1.71(m，1H)，1.74(dd，J＝9.77，5.19Hz，1H)，1.76-1.87(m，1H)，1.98-2.05(m，1H)，2.09-2.22(m，J＝10.99Hz，1H)，2.38(q，J＝9.46Hz，1H)，2.53-2.73(m，2H)，3.07-3.14(m，3H)，3.35-3.46(m，2H)，3.50-3.59(m，1H)，3.62-3.74(m，1H)，3.99(d，J＝10.99Hz，1H)，4.14-4.21(m，2H)，4.26(t，J＝7.63Hz，1H)，4.46(d，J＝10.38Hz，1H)，4.82-4.86(m，1H)，5.59(t，J＝10.38Hz，1H)，5.63-5.72(m，1H)，7.37(t，J＝7.32Hz，1H)，7.47(t，J＝7.63Hz，2H)，7.53-7.58(m，2H)，7.59-7.72(m，4H)，7.78-7.92(m，3H)，8.08-8.10(m，1H)。
步骤5：(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨
基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代
-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并
[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-14a-羧酸的制备
将(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-14a-羧酸乙基酯(60mg，0.071mmol)和LiOH一水合物(34.0mg，1.419mmol)的混合物在四氢呋喃(2mL)/水(0.5mL)/MeOH(1mL)中、在室温搅拌18小时。然后将其真空浓缩，并在水和醚之间分配。使用1N HCl将水相调节至pH值＝4，用EtOAc提取。然后用MgSO4干燥有机相，过滤，浓缩，分离52mg粗品类白色固体。用制备HPLC纯化，得到15mg(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-14a-羧酸白色固体。
LC-MS：MS m/z 818(M+1+Na)..1H NMR(500MHz，d4-MeOH)δppm
1.29-1.71(m，11H)，1.72-1.96(m，2H)，2.09-2.27(m，2H)，2.30-2.46(m，1H)，2.80-2.90(m，1H)，3.03(s，3H)，3.06-3.13(m，1H)，3.45-3.62(m，2H)，3.72(dd，J＝14.95，3.66Hz，1H)，3.78(d，J＝12.21Hz，1H)，4.04(d，J＝12.51Hz，1H)，4.08-4.18(m，1H)，4.53(dd，J＝11.44，3.51Hz，1H)，4.98-5.03(m，1H)，5.60-5.80(m，2H)，7.37(t，J＝7.32Hz，1H)，7.43-7.58(m，4H)，7.62-7.73(m，4H)，7.76-7.90(m，3H)，8.07-8.16(m，1H)。
步骤6：化合物2：(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-14a-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-6-基氨基甲酸叔丁基酯的制备
将(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-6-(叔丁氧羰基氨基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-14a-羧酸(13mg，0.016mmol)和CDI(3.61mg，0.022mmol)的混合物在四氢呋喃(2mL)中回流1小时。然后将其冷却至室温，加入环丙烷磺酰胺(2.70mg，0.022mmol)，而后加入DBU(8.39μL，0.056mmol)。将反应混合物在室温搅拌18小时，而后真空浓缩，得到浅黄色油。向该油中加入5mL水，使用1N HCl调节至pH值＝4。过滤收集白色沉淀，用水洗涤，得到15mg粗品白色固体。用快速色谱纯化，用2％MeOH/CH2Cl2洗脱，得到8mg(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-2-(联苯-4-基)-14a-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-甲氧基-8-(2-硝基苯基磺酰基)-5，16-二氧代-1，2，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢环丙基并[n]吡咯并[2，1-c][1，4，8]三氮杂环十五烯-6-基氨基甲酸叔丁基酯白色固体。LC-MS：MS m/z 889(M+1-MeOH)。(该产物被相等部分的P1甲基酯副产物污染)。
生物学研究
在本公开中，使用HCV NS3/4A蛋白酶复合酶试验和基于细胞的HCV复制子试验，并且如下进行制备、操作和验证：
重组体HCV NS3/4A蛋白酶复合物的产生
如下所述，形成衍生自BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3蛋白酶复合物。形成这些纯化的重组体蛋白，用于同源试验(见下文)，从而提供本公开的有效化合物如何抑制HCV NS3蛋白质分解活性的指示。
从Dr.T.Wright，San Francisco Hospital获得HCV感染患者的血清。由DNA片段(由血清RNA(核糖核酸)的逆转录-PCR(RT-PCR)获得)创立经过设计的HCV基因组(BMS株)的全长cDNA(补体脱氧核糖核酸)模板，使用基于其它基因型1a株之间的同源性所选择的引物。由整个基因组序列的测定，按照Simmonds等人的分类，将基因型1a分配给HCV独立型(参见P Simmonds，KA Rose，S Graham，SW Chan，F McOmish，BCDow，EA Follett，PL Yap and H Marsden，J.Clin.Microbiol.，31(6)，1493-1503(1993))。非结构区域的氨基酸序列，NS2-5B，显示了与HCV基因型1a(H77)＞97％的相同性，和与基因型1b(J4L6S)87％的相同性。由R.Purcell(NIH)获得感染性的克隆体H77(1a基因型)和J4L6S(1b基因型)，并且序列公开在Genbank中(AAB67036，参见Yanagi，M.，Purcell，R.H.，Emerson，S.U.and Bukh，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)，8738-8743(1997)；AF054247，参见Yanagi，M.，St Claire，M.，Shapiro，M.，Emerson，S.U.，Purcell，R.H.and Bukh，J，Virology 244(1)，161-172.(1998))。
H77和J4L6S株用于重组体NS3/4A蛋白酶复合物的制备。将这些株的重组体HCV NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027至1711)进行DNA编码，是按照P.Gallinari等人所描述的方法进行的(参见Gallinari P，Paolini C，Brennan D，Nardi C，Steinkuhler C，De FrancescoR.Biochemistry.38(17)：5620-32，(1999))。简要地说，在NS4A编码区的3′端添加三个赖氨酸增溶尾部。将NS4A-NS4B裂解位点(氨基酸1711)的P1位置上的半胱氨酸转换为甘氨酸，以避免赖氨酸标记物的解朊裂解。此外，在氨基酸位置1454，利用PCR引起半胱氨酸至丝氨酸的突变，以防止在NS3解螺旋酶区域中的自溶裂解。在pET21b细菌表达载体(Novagen)中克隆变体DNA片段，并且按照P.Gallinari等人所描述方案(参见Gallinari P，Brennan D，Nardi C，Brunetti M，Tomei L，Steinkuhler C，De Francesco R.，J Virol.72(8)：6758-69(1998))的改型，用大肠杆菌株BL21(DE3)(Invitrogen)表达NS3/4A复合物。简要地说，在20℃，用0.5毫克分子的(mM)异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)将NS3/4A蛋白酶复合物表达诱导22小时。典型的发酵(1升(L))得到大约10克(g)湿润细胞软膏。将细胞再悬浮在溶解缓冲液(10mL/g)中(溶解缓冲液由下列组成：25mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH值7.5，20％丙三醇，500mM氯化钠(NaCl)，0.5％Triton X-100，1微克/毫升(“μg/mLL”)溶菌酶，5mM氯化镁(MgCl2)，1μg/ml DnaseI，5mM β-巯基乙醇(βME)，蛋白酶抑制剂-不含乙二胺四乙酸(EDTA)(Roche))，在4℃均化并培养20分钟。在4℃，将匀浆超声处理，并通过在235000g下超离心1小时来进行澄清。将咪唑加入到上清液中，至15mM的最后浓度，将pH值调节至8.0。将粗蛋白提取物装填到氮川三乙酸镍(Ni-NTA)柱上，该柱用缓冲液B(25mM HEPES，pH 8.0，20％丙三醇，500mM NaCl，0.5％Triton X-100，15mM咪唑，5mM βME)预平衡。以1mL/min的流速装填样品。用15柱体积的缓冲液C(与缓冲液B相同，只是含有0.2％TritonX-100)洗涤该柱。用5柱体积的缓冲液D(与缓冲液C相同，只是含有200mM咪唑)洗脱蛋白。
收集含有NS3/4A蛋白酶复合物的部分，并装填到脱盐柱Superdex-S200上，该柱用缓冲液D(25mM HEPES，pH 7.5，20％丙三醇，300mM NaCl，0.2％Triton X-100，10mM βME)预平衡。以1mL/min的流速装填样品。收集含有NS3/4A蛋白酶复合物的馏分，并浓缩至大约0.5mg/ml。通过SDS-PAGE和质谱分析断定，NS3/4A蛋白酶复合物(衍生自BMS、H77和J4L6S株)的纯度大于90％。将酶在-80℃存储，在冰上解冻，在试验缓冲液中使用之前进行稀释。
监控HCV NS3/4A蛋白质分解活性的FRET肽试验
该体外试验的目的是测定本公开化合物对HCV NS3蛋白酶复合物(衍生自BMS株、H77株或J4L6S株，如上所述)的抑制。该试验提供了本公开的有效化合物如何抑制HCV NS3蛋白质分解活性的指标。
为了监控HCV NS3/4A蛋白酶活性，使用NS3/4A肽基质。该基质是RET S1(共振能量转移缩酚酸肽基质(Resonance Energy TransferDepsipeptide Substrate)；AnaSpec，Inc.cat#22991)(FRET肽)，由Taliani等人在Anal.Biochem.240(2)：60-67(1996)中进行了描述。对于HCV NS3蛋白酶，该肽的序列泛泛地基于NS4A/NS4B天然裂解位点，只是在裂解位点有酯键而不是酰胺键。该肽还含有接近肽的一端的荧光供体EDANS，和接近另一个端部的受体DABCYL。通过在供体和受体之间的分子间共振能量转移(RET)，可以猝灭肽的荧光，但当NS3蛋白酶裂解肽时，产物从RET猝灭阶段释放，并且供体的荧光变得清晰可见。
在不存在或存在本公开化合物的条件下，用三个重组体NS3/4A蛋白酶复合物中的一个来培养肽基质。通过使用Cytofluor Series 4000来实时监控荧光反应产物的形成，测定化合物的抑制效果。
试剂如下：从GIBCO-BRL获得HEPES和丙三醇(超纯)。从Sigma获得二甲亚砜(DMSO)。从Bio Rad获得β-巯基乙醇。
试验缓冲液：50mM HEPES，pH值7.5；0.15M NaCl；0.1％Triton；15％丙三醇；10mMβME。基质：2μM最后浓度(得自于2mM储备溶液，在DMSO中，在-20℃存储)。HCV NS3/4A蛋白酶类型1a(1b)，2-3nM最后浓度(得自于5μM储备溶液，在25mM HEPES(pH值7.5)、20％丙三醇、300mM NaCl、0.2％Triton-X100、10mMβME中)。对于具有接近试验极限的潜力的化合物，通过向试验缓冲液中添加50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma)，并且将最终蛋白酶浓度降低至300pM，可以使试验更灵敏。
在96孔聚苯乙烯黑色平皿(得自于Falcon)中进行试验。每个孔含有25μl NS3/4A蛋白酶复合物(在试验缓冲液中)、50μl本公开的化合物(在10％DMSO/试验缓冲液中)和25μl基质(在试验缓冲液中)。在相同试验平皿上制备对照物(不含化合物)。将酶复合物与化合物或对照物溶液混合1分钟，而后通过加入基质来引发酶促反应。使用CytofluorSeries 4000(Perspective Biosystems)立即将试验平皿读数。设置仪器，从而在25℃读出340nm的发射和490nm的激发。反应通常进行大约15分钟。
用下列方程式计算百分比抑制：
100-[(δFinh/δFcon)×100]
其中δF是在曲线的线性范围内的荧光变化。将非线性的曲线拟合用于抑制-浓度数据，通过利用Excel XLfit软件，使用方程式y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))来计算50％有效浓度(IC50值)。
特异性试验
进行特异性试验，以说明本公开化合物在抑制HCV NS3/4A蛋白酶(与其它丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶类相比)时的体外选择性。
相对于各种丝氨酸蛋白酶类，测定本公开化合物的特异性：人类嗜中性白细胞弹性酶(HNE)、猪胰腺弹性酶(PPE)和人类胰腺糜蛋白酶，和一种巯基蛋白酶：人类肝组织蛋白酶B。在所有情况下，使用先前描述的96孔平皿格式方案(使用对于每种酶具有荧光的氨基-甲基-香豆素(AMC)特定基质)(PCT专利申请No.WO 00/09543)，对于丝氨酸蛋白酶试验进行一些改进。所有的酶是从Sigma，EMDbiosciences购买的，而基质得自于Bachem，Sigma和EMDbiosciences。
根据化合物的效能，化合物浓度在100至0.4μM之间变化。通过将基质加入到酶抑制剂(在室温下预先培养10分钟，并且在cytofluor上测定，水解至15％转化率)中来引发每个酶试验。
每个试验的最终条件如下：
50mM三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH值8，0.5M硫酸钠(Na2SO4)，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％DMSO，0.01％Tween-20(含有5μM LLVY-AMC)和1nM糜蛋白酶。
50mM Tris-HCl(pH值8.0)，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％DMSO，0.02％Tween-20，5μM succ-AAPV-AMC和20nM HNE或8nM PPE；
100mM NaOAC(乙酸钠)pH值5.5，3％DMSO，1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，5nM组织蛋白酶B(在使用之前，在含有20mM TCEP的缓冲液中活化的酶原料)和2μM Z-FR-AMC(在水中稀释)。
使用下式计算抑制的百分比：
[1-((UVinh-UVblank)/(UVctl-UVblank))]×100
非线性的曲线拟合用于抑制-浓度数据，通过利用Excel XLfit软件计算50％有效浓度(IC50值)。
HCV复制子的产生
利用下列中所描述的方法建立HCV复制子完整的细胞***：Lohmann V，Korner F，Koch J，Herian U，Theilmann L，Bartenschlager R.，Science 285(5424)：110-3(1999)。该***能够使我们评价HCV蛋白酶化合物对HCV RNA复制的效果。简要地说，使用Lohmann文章(登录号：AJ238799)中所描述的HCV株1b序列，通过Operon Technologies，Inc.(Alameda，CA)合成HCV cDNA，然后使用标准分子生物学技术，在质粒pGem9zf(+)(Promega，Madison，WI)中组装全长复制子。复制子由下列组成：(i)HCV 5′UTR，其与衣壳蛋白的头12个氨基酸稠合，(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)，(iii)得自于脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES，和(iv)HCV NS3至NS5B基因和HCV 3′UTR。用ScaI将质粒DNAs线性化，按照制造商的说明，使用T7MegaScript转录试剂盒(Ambion，Austin，TX)体外合成RNA转录产物。将cDNA的体外转录产物转染到人类肝癌细胞系HUH-7中。在选择性标记物新霉素(G418)的存在下，获得对可结构性表达HCV复制子的细胞的选择。随着时间推移所得到细胞系被赋予正和负链RNA产物和蛋白产物的特性。
HCV复制子FRET试验
进行HCV复制子FRET试验，以监控本公开所描述化合物对HCV病毒复制的抑制效果。使结构性表达HCV复制子的HUH-7细胞生长在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(Gibco-BRL)中，该培养基含有10％胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/ml G418(Gibco-BRL)。在96孔组织培养无菌平皿中，天黑以前将细胞播种(15×104个细胞/孔)。在稀释平皿(在试验中，0.5％DMSO最后浓度)中，在含有4％FCS、1∶100青霉素/链霉素(Gibco-BRL)、1∶100L-谷酰胺和5％DMSO的DMEM中制备化合物和没有化合物的对照物。将化合物/DMSO混合物加入到细胞中，在37℃培养4天。4天之后，首先使用阿尔玛蓝(Trek Diagnotstic Systems)评价细胞的细胞毒性，以CC50示数。通过向培养细胞的介质中加入1/10th体积的阿尔玛蓝，测定化合物的毒性(CC50)。4小时之后，读出每个孔的荧光信号，用530nm的激发波长和580nm的发射波长，使用CytofluorSeries 4000(Perspective Biosystems)。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)(3次，150μl)彻底冲洗平皿。将细胞用25μl的溶解试验试剂溶解，该试剂含有HCV蛋白酶基质(5X细胞荧光素酶细胞培养物溶解试剂(Promega#E153A))，用蒸馏水稀释至1X，NaCl加入到150mM最终浓度，FRET肽基质(上面酶试验所描述)稀释至10μM最终浓度(用2mM原料，在100％DMSO中)。然后将平皿放入Cytofluor 4000仪器中，将该仪器定到340nm激发/490nm发射，21个循环的自动化模式，以动力学模式进行平皿读数。按照IC50值测定所描述的方法，进行EC50值测定。
HCV复制子荧光素酶指示试验
作为其次的试验，在复制子荧光素酶指示试验中，证明了由复制子FRET试验得到的EC50值测定数据。复制子荧光素酶指示试验的使用，首先由Krieger等人进行了描述(Krieger N，Lohmann V，andBartenschlager R，J.Virol.75(10)：4614-4624(2001))。利用嵌入cDNA编码Renilla荧光素酶基因的人源化形式和直接与荧光素酶基因的3′端稠合的连接序列，改进了FRET试验所描述的复制子结构。使用位于核中的Asc1限制位点(新霉素标志基因的直接上游)，将这种嵌入引入复制子结构中。还可在位置1179(丝氨酸至异亮氨酸)引起适应性突变(Blight KJ，Kolykhalov，AA，Rice，CM，Science 290(5498)：1972-1974)。形成结构性表达这种HCV复制子结构的稳定细胞系，如上所述。按照具有下列改进的HCV复制子FRET试验所描述的方法，建立荧光素酶指示试验。在37℃/5％CO2培养箱中4天之后，使用Promega Dual-Glo荧光素酶试验***，分析细胞的Renilla荧光素酶活性。从含有细胞的每个孔中除去介质(100μl)。向剩余的50μl介质中加入50μl Dual-Glo荧光素酶试剂，在室温下将平皿rocked 10分钟至2小时。然后将Dual-Glo Stop&Glo试剂(50μl)加入到每个孔中，在室温下再次摇动平皿10分钟至2小时。使用荧光程序，在Packard TopCount NXT上将平皿读数。
使用下式计算抑制的百分比：
将该值制成图形，使用XLfit进行分析，获得EC50值。
注意，通过使用示于表2中的专利实施例编号和专利化合物编号，可以在本文中找到化合物的结构。
表2
| 化合物编号 | IC50值范围 | EC50(nM) |
| 1 | 2 | 5 |
对于本领域技术人员其是明显的，本公开不局限于前述的说明例证性的实施例，在不背离本公开的必要特性的条件下，其可以用其它特定形式来加以涵盖。因此期望，实施例在各个方面被认为是说明例证性的，而不是限制性的，应参考附加的权利要求、而不是前述实施例，因此意欲包括落入权利要求的等效内容的含义和范围内的所有变化。
Claims (11)
1.式(I)的化合物：
或其可药用盐，其中
R1是-NHSO2R7；
R2a和R2b独立地选自氢和甲基；
R3选自芳基，芳基是指苯基或其中一个或两个环是苯基的双环稠环***，双环稠环***由与4至6元芳香或非芳香碳环稠合的苯基组成；
R4是-OR8；
R5为氢；
R6选自碳原子数1-6的烷氧羰基；
R7选自碳原子数3-14的环烷基；和
R8选自碳原子数1-6的烷基；和
Q是含有零个杂原子的C6不饱和链。
2.式(II)的化合物：
或其可药用盐，其中
R1是-NHSO2R7；
R2a和R2b是氢；
R3选自芳基，芳基是指苯基或其中一个或两个环是苯基的双环稠环***，双环稠环***由与4至6元芳香或非芳香碳环稠合的苯基组成；
R4是-OR8；
R5是氢；
R6是碳原子数1-6的烷氧羰基；
R7选自碳原子数3-14的环烷基；
R8选自碳原子数1-6的烷基；和
Q是含有零个杂原子的C6不饱和链。
3.一种化合物，其是
或其可药用盐。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1的化合物或其可药用盐，和可药用载体。
5.权利要求4的组合物，进一步包含至少一种具有抗HCV活性的其它化合物。
6.权利要求5的组合物，其中至少一种其它化合物是干扰素或利巴韦林。
7.权利要求5的组合物，其中至少一种其它化合物选自白细胞间介素2、白细胞间介素6、可增加1型辅助性T细胞响应形成的化合物、干扰性的RNA、反义RNA、咪奎莫特、次黄嘌呤核苷5′-一磷酸脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
8.权利要求5的组合物，其中至少一种其它化合物选自利巴韦林和白细胞间介素12。
9.权利要求1的化合物或其可药用盐在制备用于治疗患者HCV感染的药物中的用途。
10.权利要求1的化合物或其可药用盐与至少一种具有抗HCV活性的其它化合物在制备用于治疗患者HCV感染的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中至少一种其它化合物是干扰素或利巴韦林。
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