CN101563088A

CN101563088A - 可溶性环氧化物水解酶的抑制剂的新用途

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Publication number: CN101563088A
Application number: CNA2007800470058A
Authority: CN
Inventors: P·A·贝克; J·S·塞法鲁; T·常; A·H·科萨卡; P·A·尼恩
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2009-10-21
Also published as: CA2671837A1; WO2008074678A1; US20090082402A1; JP2010513372A; EP2091542A1

Abstract

本发明涉及使用可溶性环氧化物水解酶抑制剂治疗或预防与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的方法。

Description

可溶性环氧化物水解酶的抑制剂的新用途

本发明总体上涉及这样的发现，可溶性环氧化物水解酶的抑制剂可以用于治疗与生殖泌尿疾病相关的疾病状态(disease state)。本发明具体涉及用可溶性环氧化物水解酶的抑制剂治疗或预防与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的方法。

环氧化物水解酶为这样的一组酶，其催化环氧化物与水的加成，得到邻二醇(Hammock等人(1997)，Comprehensive Toxicology：Biotransformation(Elsevier，New York)，283-305页)。几种哺乳动物环氧化物水解酶已得到表征，包括可溶性环氧化物水解酶(sEH)(也称为胞质环氧化物水解酶)、胆固醇环氧化物水解酶、LTA₄水解酶、肝氧蛋白(hepoxilin)环氧化物水解酶和微粒体环氧化物水解酶(Fretland和Omiecinski，Chemico-Biological Interactions，129：4159(2000))。已发现环氧化物水解酶存在于脊椎动物的多种组织中，包括心、肾和肝。

sEH的已知内源底物为花生四烯酸的四种环氧区域异构体(epoxyregioisomer)，称为环氧二十碳三烯酸或EET。它们是5，6-、8，9-、11，12-和14，15-环氧二十碳三烯酸。这些底物水解产生的产物为二羟基二十碳三烯酸或DHETS，分别为5，6-、8，9-、11，12-和14，15-二羟基-二十碳三烯酸。已知为底物的还有亚油酸的环氧化物，称为白细胞毒素或异白细胞毒素(isoleukotoxin)。EET和白细胞毒素均由细胞色素P450单加氧酶家族成员产生(Capdevila等人，J.Lipid Res.，41：163-181(2000))。近期，sEH底物的结构要求得到了描述(Morisseau等人，Biochem.Pharmacol.63：1599-1608(2002))，并确定了其晶体结构及其与抑制剂的共晶结构(Argiriadi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10637-10642(1999))。sEH的许多抑制剂也得到了描述(Mullin和Hammock，Arch.Biochem.Biophys.216：423-439(1982)，Morisseau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8849-8854(1999)，McElroy等人，J.Med.Chem.46：1066-1080(2003))。近期，有文献描述了可溶性环氧化物水解酶对于羟基不饱和脂肪酸的磷酸化形式具有磷酸酶活性，使其成为了双功能酶(Newman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：1558-1563(2003))。此磷酸酶活性的生理学重要性还未得到确认。

最确定的EET生理学作用是其在血管床的血管舒张中的作用。累积的证据表明EET实际上作为内皮源性超极化因子或称EDHF起作用(Campbell等人，Circ.Res.78：415-423(1996))。EET在内皮细胞中形成，通过这样的机制诱导血管平滑肌细胞的血管舒张，所述机制导致大电导钙激活钾通道(“maxi K”)的活化，伴随超极化和松弛(Hu和Kim，Eur.J.Pharmacol.230：215-221))。已证实14，15-EET通过与细胞表面受体结合发挥其生理效应，该受体受胞内的环AMP和涉及蛋白激酶A的信号传导机制调控(Wong等人，J.Lipid Med.Cell Signal.16：155-169(1997))。更近期，证实在冠状平滑肌中这种依赖EET的松弛是通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G_sα发生的，伴随着ADP-核糖基化(Li等人，Circ.Res.85：349-56(1999))。可选地，最近已证实阳离子通道TRPV4由小鼠主动脉血管内皮细胞中的5，6-EET活化(Watanabe等人，Nature 424：434-438(2003))。这引起了人们将EET和可溶性环氧化物水解酶作为抗高血压剂的靶点的兴趣。实际上，与野生型对照相比，sEH敲除的雄性小鼠血压降低(Sinai等人，J.Biol.Chem.275：40504-40510(2000))。此外，在自发性高血压大鼠中，对sEH的抑制导致血压降低(Yu等人，Circ.Res.87：992-998(2000))。

EET，特别是11，12-EET，也已被证实为显示抗炎性质(Node等人，Science，285：1276-1279(1999)；Zeldin和Liao，TIPS，21：127-128(2000))。Node等人已证实11，12-EET降低细胞因子诱导的内皮细胞粘附分子，特别是VCAM-I的表达。他们还证实EET阻止白细胞对血管壁的附着，且其机制包括对NF-κB和iκB激酶的抑制。尽管sEH的抑制剂可用于治疗心血管疾病和炎性疾病，但此前还未发现sEH的抑制剂可以用于治疗生殖泌尿疾病。

自发性高血压大鼠(SHR)为高血压动物模型，通过对魏-凯二氏(Wistar-Kyoto(WKY))大鼠进行高血压选择育种得到。与魏-凯二氏对照大鼠相比，SHR还显示在醒着的时间里泌尿频率增加，且多***约三次(Clemow等人，Neurourol Urodyn.16：293(1997))。对于SHR中的过度***背后的病因学，已提出了多种建议，但这么多建议本身即意味着缺乏有力的证据。一项研究表明F1代SHR X WKY杂种的回交得到频繁***表型和高血压表型的遗传之间的高度相关性(Clemow等人，J.Urol.161：1372-1377(1999))，表明一些遗传决定因子可能为这两种表型所共有。

许多关于SHR的研究对与高血压相关的基因座进行了定位。脂肪酸转运蛋白CD36曾经是极好的备选，其在SHR的驯养群体中基本不存在，将其以转基因方式加回至SHR株时，则逆转该高血压表型(Aitman等人，Nat.Genet.21：76-83(1999))。后来，研究指出，与这些振奋人心的结果相反，尽管高血压表型实际上不包含作为定义突变的CD36，日本的原始SHR群体却正常表达CD36(Gotoda等人，Nat.Genet.22：226-228(1999))。更近期，对高血压和血压正常的大鼠株之间其它回交的F2代的遗传连锁研究表明，染色体2和10上的基因座促成高血压。染色体2基因座显示为Npr1基因，其编码利尿钠肽受体家族成员，而染色体10基因座包含Ace基因。这些基因座对于***的影响还未有报道。

已报道在SHR的一些组织中可溶性环氧化物水解酶增加(但没有在膀胱中增加的指征)，并报道在SHR中sEH的量根据动物来源而有所不同(Okuda等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.296：537-543(2002))。这在SHR中是常见现象，伴随特定基因的表达。SHR中遗传异质性的程度比啮齿动物近交品系中通常情况下的程度高，且根据建立者配对(founderpair)的遗传组成，任何给定群的基因构成可以与其它群不同(Nabika等人，Hypertension 18：12-16(1991))。对将花生四烯酸环氧化为14，15-EET起部分作用的细胞色素P450 2J14，已表明在SHR中其在若干细胞色素P450之中有特异性增加(Yu等人，Mol.Pharmacol.57：1011-1020(2000))。对于sEH增加是CYP2J14增加的结果还是原因并不清楚。或者，两者的增加可能都是由于还未阐明的信号传导途径干扰所导致。

尿失禁可以大致分为4个主要类别：1)与膀胱不稳定相关联的急迫性尿失禁；2)与膀胱颈/尿道功能弱相关联的压力性尿失禁；3)混合型尿失禁，其中急迫和压力机制一起发生；4)充溢性尿失禁，由机械梗阻或功能紊乱导致。急迫性尿失禁是接受医学治疗的最常见形式，该病的发病机制可能包含几种机制，包括肌源性或神经学(MS、中风、帕金森病、脊髓损伤)因素。该疾病特征在于频繁的异常逼尿肌收缩，伴随无意识漏尿和急迫。

对此疾病最广泛应用的疗法是抗毒蕈碱药奥昔布宁(oxybutynin)和托特罗定(tolterodine)，其通过抑制平滑肌收缩和降低基础膀胱紧张度发生作用，但其效用受到该种类的副作用限制，包括口干、便秘和认知损害。

本发明显示了通过干预这些异常逼尿肌收缩治疗失禁的希望，而没有伴随抗毒蕈碱药所产生的副作用。

本发明提供了治疗具有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂。在一个其它实施方案中，生殖泌尿疾病为膀胱过度活动症、出口梗阻、出口功能不全(outlet insufficiency)、间质性膀胱炎、雄性***功能障碍或骨盆过敏。在另一实施方案中，经口施用有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂。可溶性环氧化物水解酶抑制剂优选具有小于1μM的IC50。在一个其它实施方案中，哺乳动物受试者为人。

本发明提供了降低哺乳动物受试者膀胱收缩频率和幅度的方法，其包括向受试者施用有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂。本发明还提供了鉴定降低膀胱收缩频率和幅度的化合物的方法，其包括将该化合物与可溶性环氧化物水解酶接触、测定该化合物是否抑制可溶性环氧化物水解酶、以及用测定该化合物对膀胱收缩频率和幅度的影响的功能测定法测试该化合物。

本发明还提供了鉴定具有罹患生殖泌尿疾病的风险的哺乳动物受试者的方法，其包括测定样品中的可溶性环氧化物水解酶水平或活性(或底物和产物之间的平衡)，该样品来自受试者，优选为尿样或膀胱组织。

本发明还提供了治疗患有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的14，15-EET受体激动剂，优选该激动剂与14，15-EET受体的亲和性值小于100nM。

除非另有说明，在本申请(包括说明书和权利要求书)中使用的下列术语具有下文给定的定义。必须注意，在说明书和随附的权利要求书中使用时，除非另有明确说明，单数形式“一个/种”和“该”包括复数形式。

术语“14，15-EET受体激动剂”指这样的分子，其结合14，15-EET受体或处于14，15-EET受体附近时，会通过增加受体的效果或延长其持续时间来调节这种受体的活性。激动剂可以包括14，15-EET和其它环氧二十碳三烯酸，以及核苷酸、蛋白质、核酸、碳水化合物、有机化合物、无机化合物、或任何调节14，15-EET受体效果的其它分子。

术语“疾病状态”指任何疾病、病症、症状、失调或迹象。

术语“与生殖泌尿疾病相关的疾病状态”与“与生殖泌尿疾病相关的症状”可以互换使用，其指与泌尿道相关的疾病状态，包括但不限于膀胱过度活动症、出口梗阻、出口功能不全、良性***增生症、间质性膀胱炎、雄性***功能障碍和骨盆过敏。特别地，本发明的化合物可以用于治疗与以上疾病状态相关的症状，例如急迫、频繁、膀胱容量改变、失禁、排尿阈值、膀胱收缩不稳定、***痉挛、逼尿肌反射亢进(神经原性膀胱)、逼尿肌不稳定、良性***增生症(BPH)、尿道狭窄、肿瘤、流速低、开始排尿困难、急迫、耻骨痛、尿道过度移动、内因性***缺损、混合型尿失禁、压力性尿失禁、骨盆痛、间质(细胞)膀胱炎、***痛、***炎、外阴痛、尿道炎、睾丸痛、及其它与膀胱过度活动症相关的症状。

术语“有效量”或“治疗有效量”指无毒但足以提供期望的生物学结果的药剂的量。该结果可以是减少和/或减轻疾病的体征、症状或原因，或生物***的其它任何期望的改变。本领域普通技术人员可以用常规试验确定任何个体情况下适当的“有效”量。

术语“间质性膀胱炎”指由未知原因导致的膀胱壁的慢性炎症，表现症状为尿急和尿频、排尿困难、排尿量小、及通过***能暂时缓解的膀胱和/或尿道疼痛。在一些情况下，疼痛可能发散到生殖器、直肠区域和大腿。在90％的患者中，对膀胱的膀胱镜检查显示瘀点性出血或肾丝球状出血(glomeraulation)。

术语“雄性***功能障碍”指特征在于不能达到和/或保持******以完成令人满意的性行为的疾病。

术语“出口梗阻”指包括但不限于良性***增生症(BPH)、尿道狭窄、肿瘤等的疾病状态。出口梗阻可进一步定义为梗阻(例如流速低、开始排尿困难等)或刺激(例如急迫、耻骨痛等)。

术语“出口功能不全”指尿道过度移动或内因性***缺损，其症状表现为压力性尿失禁。

术语“膀胱过度活动症”或“逼尿肌过度活动”指表现为急迫、频繁和/或失禁发作的症状。这些症状可以由膀胱容量改变、排尿阈值、膀胱收缩不稳定和/或***痉挛导致。反射亢进、出口梗阻、出口功能不全和骨盆过敏也可能是对于此疾病状态自发的。

术语“骨盆过敏”指骨盆痛、失禁、***痛、***炎、外阴痛、尿道炎、睾丸痛等。骨盆过敏可能表现为骨盆区域的疼痛或不适，还常常包括上文定义的膀胱过度活动症的症状。

术语“可溶性环氧化物水解酶抑制剂”指这样的化合物，其抑制可溶性环氧化物水解酶的IC50小于1μM，优选小于100nM。可以用标准方法测定IC50。一种具体方法为实施例3中所述的比色测定法。

术语“受试者”指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于哺乳类的任何成员：人，非人灵长类如黑猩猩、及其它猿和猴类；家畜如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物如兔、狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的例子包括但不限于鸟、鱼等。该术语不代表特定年龄或性别。

术语疾病状态的“治疗”或“疗法”包括：1)预防疾病状态，即对于可能暴露于疾病状态或易受疾病状态感染，但还未体验或显示疾病状态症状的受试者，令其疾病状态的临床症状不发生；2)抑制疾病状态，即阻止疾病状态或其临床症状的发展；3)或减轻疾病状态，即使疾病状态或其临床症状临时或永久消退。

本文显示的化学结构使用

的2.2版本制成。本文的结构中碳、氧或氮原子上出现的任何空化合价均表示存在氢。

本发明基于这样的发现，即可溶性环氧化物水解酶对调节膀胱逼尿肌的平滑肌收缩起重要作用。用Affymetrix基因芯片(实施例1)和定量逆转录酶(qRT)-PCR(实施例2)进行差别基因表达研究，其中比较了SHR和WKY大鼠之间膀胱的信使RNA(mRNA)水平。相对于WKY膀胱，在SHR膀胱中可溶性环氧化物水解酶被鉴定为上调最多的基因，说明sEH水平或活性的增加对在SHR中观察到的膀胱活动过度的症状起作用，所述症状为诸如排尿频率高和膀胱体积小。因此，抑制sEH治疗泌尿道疾病状态如膀胱过度活动症具有有益效果。此外，受试者尿样或膀胱组织中sEH水平或活性的增加说明受试者可能具有罹患生殖泌尿疾病的风险。

已有许多种sEH抑制剂得到鉴定。在此通过引用并入本文的WO00/23060公开了1-(4-氨基苯基)吡唑类化合物，其以亚微摩尔(submicromolar)的IC50抑制sEH，并显示抗炎活性。这些化合物具有式I表示的结构。

其中R¹为3-吡啶基、MeOCH₂、i-Pr、Et、CF₃或Me；R²为Et、CF₃、i-Pr、2-噁唑烷基或Me；R³为3-吡啶基、3，5-二甲基噁唑-4-基或2-氯吡啶-4-基。在下文描述的实验中使用此系列的代表成员化合物1，为(N-[4-(5-乙基-3-吡啶-3-基-吡唑-1-基)-苯基]-烟酰胺)。

其它种类的sEH抑制剂包括查耳酮氧化物衍生物(Mullin和Hammock，Arch.Biochem.Biophys.，216：423-429(1982)；Miyamoto等人，Arch.Biochem.Biophys.，254：203-213(1987))和多种反式3-phenyglycidol(Dietze等人，Biochem Pharm.42：1163-1175(1991)；Dietze等人，Comp.Biochem.Physiol.B，104：309-314(1993))。更近期，Hammock等人公开了一系列具有纳摩尔的IC50值的1，3-二取代的脲、氨基甲酸酯和酰胺(US 6,531,506；Morisseau等人，Biochem.Pharmacology 63：1599-1608(2002)，均通过引用并入本文)。已公开了348个这些化合物的QSAR模型分析(McElroy等人，J.Med.Chem.46：1066-1080(2003))。这些化合物的结构以式II表示。

其中X为NH、O或CH₂，R¹和R²为烷基或芳基。来自此系列化合物的代表化合物包括N-环己基-N-4-氯苯基脲、N，N’-二(3，4-二氯苯基)脲和N-环戊基-N’-十二烷基脲。

用麻醉的自发性高血压大鼠测试sEH抑制剂化合物1对排尿的影响(实施例4)。静脉输注抑制剂导致膀胱逼尿肌肌肉不随意收缩的频率和幅度均有剂量依赖性减少，证实了sEH抑制剂治疗膀胱过度活动症症状的用途。由于sEH抑制应导致其底物堆积，检测了14，15-EET对于分离的膀胱组织的影响(实施例5)。这些研究表明14，15-EET松弛膀胱平滑肌，该膀胱平滑肌已由与嘌呤能(purinergic)机制相关的低频电场刺激。此松弛效果是14，15-EET特异性的，而8，9-EET、11，12-EET和14，15-DHET均显示无效。

本文描述的方法使用的药物组合物包含上述分子和一种或多种可药用赋形剂或载体，及任选的其它治疗和/或预防成份。此类赋形剂包括液体如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。适合用于非流体制剂的赋形剂也为本领域技术人员所知。可用于本发明组合物的可药用盐包括例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。Remington’s PharmaceuticalSciences，18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)中有对可药用赋形剂和盐的全面讨论。

此外，这样的载体中可以存在辅助物质如湿润剂或乳化剂、生物学缓冲液物质、表面活性剂等。生物学缓冲液实质上可以是药理学可接受的并为制剂提供期望pH的任何溶液，期望pH即为在生理学可接受范围内的pH。缓冲溶液的例子包括盐水、磷酸缓冲盐溶液、Tris缓冲盐溶液、Hank’s缓冲盐溶液等。

根据预期的施用方式，药物组合物的形式可为固体、半固体或液体剂型，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、液体剂、悬浮剂、乳膏剂、软膏剂、洗液等，优选为适合单次施用准确剂量的单位剂型。组合物将包括有效量的选定药物，其与可药用载体组合，另外还可包括其它药物、佐剂、稀释剂、缓冲剂等。

对于固体组合物，常规的无毒固体载体包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。药学上可施用的液体组合物可以通过例如将本文描述的活性化合物和任选的药物佐剂在赋形剂中溶解、分散等制备，从而形成溶液或悬液，所述赋形剂例如水、盐水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等。如果期望的话，待施用的药物组合物还可包含少量无毒的辅助物质如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。制备这样的剂型的实际方法为本领域技术人员所知或显见；例如参见上文提到的Remington’s Pharmaceutical Sciences。

对于经口施用，组合物通常采用的形式为片剂、胶囊剂、软胶囊剂(softgel capsule)、或可以是水性或非水性溶液、悬浮剂或糖浆剂。片剂和胶囊剂为优选的经口施用形式。用于经口施用的片剂和胶囊剂通常包括一种或多种常用的载体，如乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。当使用液体悬浮剂时，活性剂可以与乳化剂和悬浮剂相结合。如果期望的话，还可以加入调味剂、着色剂和/或甜味剂。可以掺入此处的经口施用制剂的其它任选成份包括但不限于防腐剂、悬浮剂、增稠剂等。

肠胃外制剂可以用常规形式制备，可为液体溶液或悬液、适合在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式、或乳剂。优选地，根据本领域已知技术使用适当载体、分散剂或湿润剂和悬浮剂配制可注射的无菌悬液。可注射无菌制剂还可以是处于无毒的可肠胃外使用的稀释剂或溶剂中的可注射无菌溶液或悬液。可使用的可接受载体和溶剂有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，常规上使用无菌的固定油、脂肪酯或多元醇作为溶剂或悬浮介质。此外，肠胃外施用可包括使用缓释或持续释放***，以保持恒定的剂量水平。

可选的，本发明的药物组合物可以以栓剂形式通过直肠施用。可以通过将药剂与适当的不引起不适的赋形剂混合制备这样的组合物，所述赋形剂在室温下为固体，而在直肠温度下为液体，从而会在直肠中溶解以释放药物。这样的材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。还可以配制本发明的药物组合物用于***施用。除活性成份之外还包含这些载体的子宫托、塞子、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂为本领域已知是适当的。

本发明的药物组合物还可以通过鼻子以气溶胶或吸入剂形式施用。根据药物制剂领域熟知的技术制备这样组合物，可以制成盐水中的溶液，用苯甲醇或其它适当的防腐剂、吸收促进剂提高生物可利用率，并使用推进剂如氟碳化合物或氮、和/或其它常规增溶剂或分散剂。

用于局部药物递送的优选制剂为软膏剂和乳膏剂。软膏剂为半固体制剂，通常基于矿脂或其它矿脂衍生物。如本领域所已知的，包含选定活性物质的乳膏剂为粘稠液或半固体乳剂(水包油或油包水)。乳膏基质可水洗，并包含油相、乳化剂和水相。油相有时也称为“内”相，通常包含矿脂和脂肪醇，如鲸蜡醇或硬脂醇；尽管不是必须的，水相经常在体积上超过油相，并通常包含致湿物。乳膏剂中的乳化剂通常为非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。如会被本领域技术人员所认可的，待使用的特定软膏基质或乳膏基质会提供最优化的药物递送。与其它载体或赋形剂相同，软膏基质应为惰性、稳定、不引起不适且不引起敏感的。

颊部施用的制剂包括片剂、锭剂、凝胶剂等。可选的，颊部施用可以用本领域技术人员已知的跨粘膜递送***完成。本发明的化合物还可以用常规透皮给药***经皮肤或粘膜组织递送，所述透皮给药***即经皮“贴剂”，其中药剂通常包含在充当给药递送装置附着于身体表面的层状结构中。在这样的结构中，药物组合物通常包含在衬层下面的层或“贮器”中。该层状装置可以包含单个贮器或可包含多个贮器。在一个实施方案中，贮器包含可药用接触粘合材料的聚合基体，用以在药物递送过程中将该***附着于皮肤上。适合的皮肤接触粘合材料的例子包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸乙酯等。可选的，含药物的贮器和皮肤接触粘合剂作为单独和不同的层存在，粘合剂在贮器下面，在这种情况下，贮器可以是上文所述的聚合基体，或可以是液体或凝胶贮器，或可采取一些其它形式。这些层状结构的衬层作为该装置的上表面，作为层状结构的主要结构元件发挥作用，并为装置提供了不少灵活性。为衬层所选择的材料应对于活性物质和存在的任何其它材料实质上不通透。

药学有效量的或治疗有效量的组合物会被递送给受试者。准确的有效量会在受试者与受试者之间有所不同，并取决于物种、年龄、受试者体型大小和健康情况、所治疗的疾病的性质和程度、治疗医生的建议、选择施用的疗法或疗法组合。因此，对于给定情况，可以通过例行试验来确定有效量。为本发明的目的，通常在至少一次的剂量中治疗量的范围为约0.05mg/kg到约40mg/kg体重，更优选约0.5mg/kg到约20mg/kg。在较大的哺乳动物中，所指示的每日剂量可为约1mg至100mg，每日一次或多次，更优选范围为约10mg到50mg。可以按需要给受试者施用多次剂量以减轻和/或缓和所述疾病的体征、症状或原因，或带来生物***的任何其它期望的改变。

多核苷酸的递送，例如用于递送可溶性环氧化物水解酶的反义寡核苷酸，可以用上述任何制剂或用重组表达载体完成，具有或不具有载体病毒或颗粒。这样的方法为本领域熟知。见例如US 6,214,804；US 6,147,055；US 5,703,055；US 5,589,466；US 5,580,859；Slater等人，(1998)J.AllergyClin.Immunol.102：469-475。例如，多核苷酸序列的递送可以用不同的病毒载体完成，包括反转录病毒和腺相关病毒载体。见例如Miller(1990)Blood 76：271；和Uckert和Walther(1994)Pharmacol.Ther.63：323-347。可用于反义基因疗法的载体包括但不限于腺病毒、疱疹病毒、牛痘、或优选地RNA病毒如反转录病毒。可用于将多核苷酸序列递送到靶细胞中的其它基因递送机制包括胶态分散***和脂质体衍生***、人造病毒包膜、和对于本领域技术人员可得的其它***。见例如Rossi(1995)Br.Med.Bull.51：217-225；Morris等人，(1997)Nucl.Acids Res.25：2730-2736；及Boado等人，(1998)J.Pharm.Sci.87：1308-1315。例如，递送***可以使用大分子复合物、纳米囊、微球体、珠、和基于脂的***，其包括水包油型乳剂、微团、混合微团和脂质体。

因此，本发明提供了

-治疗具有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者(例如人)的方法，所述疾病状态例如膀胱过度活动症、出口梗阻、出口功能不全、间质性膀胱炎或骨盆过敏，例如膀胱过度活动症，该方法包括对受试者施用(例如经口施用)有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂，例如IC50小于1μM的可溶性环氧化物水解酶抑制剂；

-降低哺乳动物受试者(例如人)膀胱收缩频率和幅度的方法，该方法包括对受试者施用(例如经口施用)有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂，例如IC50小于1μM的可溶性环氧化物水解酶抑制剂；

-治疗具有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者的方法，或降低哺乳动物受试者膀胱收缩频率和幅度的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的式I的可溶性环氧化物水解酶抑制剂

其中R¹为3-吡啶基、MeOCH₂、i-Pr、Et、CF₃或Me；R²为Et、CF₃、i-Pr、2-噁唑烷基或Me；R³为3-吡啶基、3，5-二甲基噁唑-4-基或2-氯吡啶-4-基；或其可药用盐；

或

N-[4-(5-乙基-3-吡啶-3-基-吡唑-1-基)-苯基]-烟酰胺或其可药用盐；

或

式II的可溶性环氧化物水解酶抑制剂

其中X为NH、O或CH₂，R¹和R²为烷基或芳基；或其可药用盐；

-鉴定降低哺乳动物受试者膀胱收缩频率和幅度的化合物的方法，该方法包括：a)将化合物与可溶性环氧化物水解酶接触，测定该化合物是否抑制可溶性环氧化物水解酶；和b)在测定该化合物对膀胱收缩频率和幅度的影响的功能测定法中测试该化合物；

-鉴定具有罹患生殖泌尿疾病风险的哺乳动物受试者的方法，该方法包括测定来自受试者的样品(例如膀胱组织或尿样)中的可溶性环氧化物水解酶的水平或活性；

-治疗具有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者(例如人)的方法，所述疾病状态例如膀胱过度活动症、出口梗阻、出口功能不全、间质性膀胱炎或骨盆过敏，例如膀胱过度活动症，该方法包括对受试者施用(例如经口施用)有效量的14，15-EET受体激动剂，例如对于14，15-EET受体的亲和性值小于1nM的激动剂；

-可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备用于治疗与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的药物中的用途，所述疾病状态例如膀胱过度活动症、出口梗阻、出口功能不全、间质性膀胱炎或骨盆过敏；

-可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备用于治疗与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的药物中的用途，其中可溶性环氧化物水解酶抑制剂为如上的式I化合物或其可药用盐；N-[4-(5-乙基-3-吡啶-3-基-吡唑-1-基)-苯基]-烟酰胺或其可药用盐；或如上的式II化合物或其可药用盐；

-可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备用于降低膀胱收缩频率和幅度的药物中的用途；及

-14，15-EET受体激动剂在制备用于治疗与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的药物中的用途。

本文提到的所有专利、专利申请、和出版物，无论在上文或在下文，其全部内容均通过引用并入本文。通过参照下列实施例，本发明的宽范围能够得到最好的理解，实施例并非意在将本发明限制为下文描述的特定实施方案。

实施例

为使本领域技术人员能够更清楚的理解并实施本发明，给出了下列制备和实施例。这些不应视为对本发明范围的限制，而只是其例示性说明和代表。

实施例1：自发性高血压大鼠膀胱的基因表达谱

对6只自发性高血压大鼠(SHR)和6只魏-凯二氏大鼠(WKY)的整个膀胱进行Affymetrix基因芯片分析。分析SHR和WKY大鼠膀胱之间的差别基因表达，意在鉴定膀胱过度活动症(OAB)的潜在目的基因。

用Trizol法从整个膀胱中分离总RNA。用分光光度计测量的O.D.260读数定量分离的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳和Agilent BioAnalyzer RNA6000测定法定性。

用AMV逆转录酶和Roche Applied Science的“cDNA合成***”试剂盒成份(cat#1117831)从10μg总RNA中生成cDNA第一链和第二链。为生成cDNA，用oligo dT(24mer)-T7引物引导mRNA进行第一链合成。在cDNA第二链的合成步骤之后，样品用苯酚/氯仿提取，用醋酸铵和乙醇进行盐沉淀。沉淀用DEPC处理的水重悬。

然后用ENZO Diagnostics“BioArray高产量RNA转录物标记试剂盒(T7 RNA聚合酶)”(cat#42655-10)进行体外转录步骤，使用前述合成的cDNA的一半。在此T7 RNA聚合酶驱动的体外转录步骤过程中，掺入生物素标记的核糖核苷酸。反应在40μL体积中于37℃进行6小时。然后将样品通过Qiagen RNeasy迷你柱，以纯化样品，除去未掺入的核苷酸。

用上述方法量化体外转录的生物素标记的RNA样品并检查其性质。然后将12μg样品在醋酸盐缓冲液中片段化，置于杂交混合物中。

将10μg样品杂交到大鼠Affymetrix U34A芯片上16小时。芯片用非严格缓冲液和严格缓冲液洗涤并染色。染色过程包括用藻红蛋白标记的链霉抗生物素(SAPE)进行一级染色，接着用二级抗体放大染色，而后再进行三级SAPE染色。染色过程之后，扫描单个芯片。与魏-凯二氏膀胱相比，就SHR/WKY表达倍数而言，发现在SHR膀胱的U34A基因表达排列中，NCBI蛋白质登记号P80299的可溶性环氧化物水解酶是最高度上调的基因。

实施例2：TaqMan实时定量逆转录酶(qRT)-PCR

如实施例1所述由大鼠膀胱制备RNA，储存在-80℃直到进行实验。用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析(Heid等人，Genome Res.6：986-994(1996))测定总RNA中大鼠和人可溶性环氧化物水解酶的相对水平。在扩增之前，总RNA样品用DNAse I处理，并用Qiagen的“Rneasy迷你试剂盒”根据厂家说明进行纯化(cat.#74104，Qiagen Inc.，Valencia，U.S.A.)。逆转录和PCR反应用“单一步骤RT-PCR预混合试剂”(“One-StepRT-PCR Master Mix Reagents”)根据厂家说明进行(cat.#4309169，Applied Biosystems，Foster City，U.S.A.)。在扩增循环过程中，通过FAM报道染料的荧光信号增加检测到大鼠和人可溶性环氧化物水解酶的序列特异的扩增。各个序列特异的扩增以一式两份进行。随后将不同mRNA的水平对于18S rRNA对照归一化(cat.#4308329，Applied Biosystems)。用引物表达软件(Primer Express software)(Applied Biosystems)设计寡核苷酸引物和TaqMan探针，并用Applied Biosystems合成。

正向引物：5’-GGAGAAAGTCACAGGGACACAGTTT-3’(SEQ IDNO：1)

反向引物：5’-GGAAACCCATGACAGAGGCATATA-3’(SEQ IDNO：2)

探针：5’-6FAM-CCAAATGATGTCAGCCATGGGTATGTGA-TAMRA(SEQ ID NO：3)

实施例3：化合物1的合成和IC50测定

化合物1，(N-[4-(5-乙基-3-吡啶-3-基-吡唑-1-基)-苯基]-烟酰胺)，

如(WO 00/23060，化合物1)所述合成。用比色底物4-硝基苯基-(2S，3S)-2，3-环氧-3苯丙基碳酸盐作为底物如Dietze等人，Anal.Biochem.216：176-187(1994))所述测定IC50。在40μM的底物浓度和30℃，发现IC50为0.084+/-0.002微摩尔，测定时用100nM人可溶性环氧化物水解酶，其依(Beetham等人，Arch.Biochem.Biophys.305：197-201(1993))所述表达，依Wixtrom等人(Anal.Biochem.169：71-80(1994))所述纯化。

实施例4：麻醉的大鼠中的可溶性环氧化物水解酶活性的抑制

用对Yoshiyama等人，Brain Research(1994)639(2)：300-8所述方法的修改方法，测定大鼠中体内抑制本发明的可溶性环氧化物水解酶的酶活性对于排尿的影响。

用乌拉坦(1.5g/kg，sc)麻醉雌性自发性高血压大鼠(SHR)。暴露气管，用聚乙烯(PE)-240管插管(Becton-Dickinson)。右颈动脉和左股静脉用PE-50管插管，以分别测量血压和药物施用。沿白线切开下腹腔，暴露出输尿管和膀胱。将两边的输尿管结扎并切断，使来自肾的尿排入腹部。通过(膀胱)穹窿(dome)用PE-50管对膀胱插管，将插管用结扎线(3-0丝线)固定在合适的位置。膀胱插管通过“Y形连接器”与传感器和注射器输液泵(Harvard Apparatus)相连。在整个实验过程中，用Gould压力传感器(P23XL)记录平均血压和排尿收缩，该压力传感器与Gould记录器(Gould3800)和Power Lab数据采集***相连。一个小时的稳定期后，将盐水以0.1ml/分钟注入膀胱中，时间为1小时。在1小时的盐水输注结束时，以累积剂量反应或单次团注静脉内施用化合物或载体。测量膀胱收缩幅度和频率，比较试验化合物和其载体时间对照。研究结束时静脉注射致死剂量的戊巴比妥钠(Ro100-5534/033)将动物安乐死。按照在麻醉的SHR中的影响的膀胱内压测量，化合物1是有效的。

实施例5：收缩研究

将来自(雄性/雌性)Sprague-Dawley(Charles River)大鼠膀胱的膀胱肌条浸没在保持37℃的10ml组织浴中，其包含10ml盐溶液，包括：NaCl(118.5mM)、KCl(4.8mM)、NaHCO₃(25mM)、KH₂PO₄(1.2mM)、MgSO₄(1.2mM)、CaCl₂(2.5mM)和葡萄糖(11.0mM)。膀胱肌条用95％O₂和5％CO₂的混合气体充气。组织先用1g静止重量平衡1小时。然后测定对67mM KCl的对照反应。通过表面积1.14cm²的铂电极提供电场刺激(EFS)，电极置于组织任一面，其间距离1cm。对铂电极的刺激由GRASS MedicalInstruments(Quincy，Mass.)的S88矩形脉冲刺激器提供，其设定为以1、2、4或8Hz在10秒的脉冲串中递送脉冲持续时间为0.5ms的10V脉冲。

序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>可溶性环氧化物水解酶的抑制剂的新用途

<130>24078

<160>3

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>引物序列

<400>1

ggagaaagtc acagggacac agttt 25

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>引物序列

<400>2

ggaaacccat gacagaggca tata 24

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>探针序列

<400>3

ccaaatgatg tcagccatgg gtatgtga 28

Claims

1.可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备用于治疗与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的药物中的用途。

2.权利要求1所述的用途，其中所述生殖泌尿疾病为膀胱过度活动症、出口梗阻、出口功能不全、间质性膀胱炎或骨盆过敏。

3.权利要求1所述的用途，其中所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂为式I的化合物

其中R¹为3-吡啶基、MeOCH₂、i-Pr、Et、CF₃或Me；

R²为Et、CF₃、i-Pr、2-噁唑烷基或Me；和

R³为3-吡啶基、3，5-二甲基噁唑-4-基或2-氯吡啶-4-基；

或其可药用盐；

或式II的化合物

其中X为NH、O或CH₂，R¹和R²为烷基或芳基，或其可药用盐。

4.可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备用于降低膀胱收缩频率和幅度的药物中的用途。

5.14，15-EET受体激动剂在制备用于治疗与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的药物中的用途。

6.鉴定降低哺乳动物受试者膀胱收缩频率和幅度的化合物的方法，该方法包括：a)将化合物与可溶性环氧化物水解酶接触，测定该化合物是否抑制可溶性环氧化物水解酶；和b)在测定该化合物对膀胱收缩频率和幅度的影响的功能测定法中测试该化合物。

7.鉴定具有罹患生殖泌尿疾病风险的哺乳动物受试者的方法，该方法包括测定来自受试者的样品中的可溶性环氧化物水解酶的水平或活性。

8.权利要求7所述的方法，其中所述样品为膀胱组织或尿样品。

9.治疗具有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂。

10.降低哺乳动物受试者膀胱收缩频率和幅度的方法，其包括向受试者施用有效量的可溶性环氧化物水解酶抑制剂。

11.治疗具有与生殖泌尿疾病相关的疾病状态的哺乳动物受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的14，15-EET受体激动剂。

12.如上文所述的发明。