CN101555502B - L-色氨酸酶法转化制备方法 - Google Patents
L-色氨酸酶法转化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及L-色氨酸酶法转化制备方法。该制备方法采用含有L-丝氨酸的混合氨基酸作为原料，将具有高活力L-色氨酸合成酶或L-色氨酸酶的基因工程菌与含有L-丝氨酸的混合氨基酸转化液混合，30～45℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度L-色氨酸。该方法解决了混合氨基酸中L-丝氨酸的分离及综合开发难题，得到了应用更为广泛、附加值较高的L-色氨酸产品，具有原料来源广、价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及L-色氨酸的酶法转化制备方法。
二、背景技术
色氨酸(tryptophan)，又名α-氨基-β-吲哚丙酸，是Hopkins和Cole在1902年发现并分离到的一种氨基酸。它有D-和L-型两种异构体，天然存在的只有L-色氨酸。L-色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，因此被广泛用于医药、食品和饲料等领域。
根据目前文献报导L-色氨酸的制备方法主要有以下三种：
1、发酵法
发酵法生产L-色氨酸大体上可以分为：直接发酵法和前体添加发酵法。
直接发酵法中常用的L-色氨酸产生菌有：谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，枯草杆菌，北京棒杆菌等。如Fukui(JP 1974，20：391)等由枯草杆菌选育的5-氟色氨酸(5-FT)抗性变异株，可积累L-色氨酸9.6g/L。Nakayama等(JP 1982，5：694)进一步改造变异株，使其具有5-FT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)双重抗性，连续流加邻氨基苯甲酸，可积累L-色氨酸15.6g/L。Oikawa等人(JP 2000342294，2000)发明一种以乳酸为起始原料生产L-色氨酸的方法，即先将乳酸氧化为丙酮酸，再与吲哚和铵离子反应得L-色氨酸。Hatakeyama等人(US 5776740，1998)采用一步法生产L-色氨酸，即在含有甘氨酸、甲醛、吲哚和具丝氨酸羟甲基转移酶的微生物细胞水溶液中合成L-色氨酸。目前，体内和体外的遗传操作技术已经用于新型色氨酸产生菌的选育。
2、酶转化法
酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，它是廉价生产L-色氨酸最为有效的方法。国内外研究者构建并筛选了高产L-色氨酸酶和L-色氨酸合成酶基因工程菌，为用酶工程技术生产L-色氨酸奠定了基础。在氨基酸主要生产国日本，几家大公司如三井东压、三菱油化和三乐等均采用酶促转化法生产L-色氨酸。据文献报道(日经生物技术，1987，(1)：8)日本三乐公司克隆了大肠杆菌色氨酸合成酶基因和丝氨酸羟甲基转移酶(SHTase)基因，用甘氨酸为原料合成L-丝氨酸，再加入吲哚生产色氨酸，产量为90g/L。
Ishiwata等采用化学法合成DL-丝氨酸，用恶臭假单孢菌消旋酶将D-丝氨酸转型为L型，加上底物吲哚，用大肠杆菌色氨酸合成酶进行酶促转化，产色氨酸为110g/L。Yukawa等(Process Biotech.，1987，(12)：165)构建了带有色氨酸合成酶基因的大肠杆菌K-12，酶促转化L-丝氨酸和吲哚得L-色氨酸200g/L。Genex公司Hamilton等(Trends in Biotechnology，1985，8(3)：64-68)克隆了色氨酸酶基因，以L-丝氨酸和吲哚为底物酶促转化产L-色氨酸200g/L。
国内韦平和等(中国现代应用药学杂志，1999，16(6)：37-39)利用PCR技术扩增了JM105色氨酸酶基因，构建色氨酸酶基因工程菌WW-4，以L-丝氨酸和吲哚为底物酶促转化产L-色氨酸49g/L，L-丝氨酸转化率为84.2％，吲哚转化率为93.6％。张绪梅等(生物技术通讯，2006，17(1)：12-14)构建色氨酸合成酶基因工程菌BA3，其色氨酸合成酶活性是对照菌的3.7倍。
3、化学合成法
色氨酸的化学合成途径很多，主要有以吲哚为原料及在合成过程中生成吲哚环两大类(氨基酸杂志，1983，4：29-33)。但上述二种方法合成色氨酸或合成路线长、或需采用价格昂贵的特殊原料、或构建吲哚环的路线反应步骤多，涉及原料多，工艺条件较苛刻，操作难度大，而不适合大规模工业化生产。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-色氨酸的方法。
目前，在我国氨基酸生产领域和食品发酵等工业生产过程中，副产品为大量不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸，而该混合氨基酸直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。本发明采用富含L-丝氨酸的混合氨基酸作为酶法制备L-色氨酸的原料，反应条件温和，色氨酸合成酶或色氨酸酶专一性强，转化率高，可以达到转化L-丝氨酸为易于分离的L-色氨酸的目的，实现了工业副产品的综合利用，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。
本发明可以通过以下技术方案来达到：
L-色氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为：
(1)色氨酸合成酶或色氨酸酶的基因工程菌菌株(BA3或WW-4)，在含有异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma公司)或乳糖的培养基中培养，诱导产生高活力的色氨酸合成酶或色氨酸酶；
(2)采用游离细胞法，将含酶细胞和富含L-丝氨酸的混合氨基酸转化液混合后，再加入缓冲液和表面活性剂，在30～45℃条件下进行酶促转化反应。
(3)将反应生成物进行分离，得到高纯度的L-色氨酸。
上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和乳糖，其浓度为1～20g/L，氮源采用有机氮源，如牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液和/或蛋白质水解物，其浓度为1～30g/L，加入IPTG或乳糖诱导，其浓度为0.05～10g/L。
上述步骤(2)的转化液缓冲体系为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液和碳酸缓冲液，使转化液pH7.5～9.5，最适转化液pH8～9；在转化液中加入表面活性剂，如吐温-80，十六烷三甲基溴化铵(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0.005～5g/L。
上述步骤(3)中分离反应体系中L-色氨酸的方法是采用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明采用色氨酸合成酶或色氨酸酶的基因工程菌(BA3或WW-4)在优选的培养基中培养可以高产率的生成色氨酸合成酶或色氨酸酶，使反应有非常高的转化率和反应速率，L-丝氨酸摩尔转化率达到82％以上。
(2)本发明采用富含L-丝氨酸的混合氨基酸作为制备原料，反应条件温和，色氨酸合成酶或色氨酸酶专一性强，转化率高，充分利用了工业副产物，解决了L-丝氨酸高效分离的难题，具有良好的经济效益和环境效益。
(3)L-色氨酸和混合氨基酸中的其它氨基酸理化性质差异很大，用简单的等电点方法就可以分离制备，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。
(4)具有原料来源丰富，价格低廉，转化时间短，操作简便，生产成本低等优点。
四、具体实施方式
实施例一
角蛋白来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸合成酶基因工程菌株培养在如下1000ml培养基(g/ml)中：玉米浆0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.16％，MgSO4.7H2O 0.04％，FeSO4.7H2O0.01％，牛肉膏2％，麦芽糖0.5％，葡萄糖0.5％，IPTG 0.005％，pH7.2。37℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞25g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.5)配制的600ml转化液中，转化液为含3.8％L-丝氨酸(g/ml)的羽毛酸水解液(氨基酸总含量15％)、22.8g吲哚和0.05％OP溶液(g/ml)6mL，37℃酶促反应36h。反应液中L-色氨酸浓度为6.3％，对L-丝氨酸摩尔转化率为87％。
3.将反应液4000rpm离心10min，收集湿细胞和固体L-色氨酸混合物68g，用300mL纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L NaOH调pH12～13，搅拌升温到60～80℃将固体L-色氨酸溶解完全，加活性炭脱色除菌体，滤液用6mol/L HCl调pH至5.9，酸化液冷却至室温，析出的结晶真空过滤，用少量纯水洗涤，烘干得21.2g L-色氨酸。
4.将550ml离心上清液与350ml L-色氨酸结晶母液合并，混合液用6mol/LHCl调pH至3.5，加纯水稀释到1600ml上JK008阳离子树脂柱吸附L-色氨酸，吸附饱和后，先用400ml水洗树脂柱，然后用800ml 4％氨水洗脱，收集含有L-色氨酸洗脱液，升温到70～80℃脱色，减压浓缩到200ml，加三倍体积95％酒精，搅拌均匀，放冰箱静置过夜，析出的结晶过滤后用少量纯水洗涤、干燥得L-色氨酸10.3g，结晶母液循环使用。
实施例二
角蛋白来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸酶基因工程菌培养在如下1000ml培养基(g/ml)中：玉米浆0.5％，牛肉膏2％，蛋白质水解物0.5％，麦芽糖0.5％，乳糖0.5％，IPTG 0.007％，K2HPO4 0.5％，MgSO4.7H2O 0.03％，NaCl 0.5％，pH7.2。37℃摇瓶振荡培养14h，4000rpm离心15min得湿细胞23.8g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.5)配制的600ml转化液中，转化液为含有4.2％L-丝氨酸(g/ml)的毛发酸水解液(氨基酸总含量16％)、25.2g吲哚和0.5％吐温-80(g/ml)溶液6mL，39℃酶促反应32h。反应液中L-色氨酸浓度为7.1％，对L-丝氨酸摩尔转化率为90％。
3.L-色氨酸分离纯化方法同实施例一，得L-色氨酸33.7g。
实施例三
植物来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸合成酶基因工程菌株培养在如下1000ml培养基(g/ml)中：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，麦芽糖0.5％，蔗糖0.3％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.14％，K2HPO4 0.5％，MgSO4.7H2O 0.05％，IPTG 0.005％，pH7.0。37℃摇瓶振荡培养13h，4000rpm离心15min得湿细胞25.3g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L硼酸缓冲液(pH9.0)配制的600ml转化液中，转化液为含2％L-丝氨酸(g/ml)的糖蜜提取液(氨基酸总含量14％)、12g吲哚和0.05％CTAB(g/ml)溶液6mL，39℃酶促反应32h。反应液中L-色氨酸浓度为3.3％，对L-丝氨酸摩尔转化率为87％。
3.L-色氨酸分离纯化方法同实施例一，得L-色氨酸14.8g。
实施例四
植物来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸酶基因工程菌培养在如下1000ml培养基(g/ml)中：蛋白胨1％，酵母膏0.3％，牛肉膏0.4％，乳糖1.5％，葡萄糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.15％，K2HPO4 0.45％，MgSO4.7H2O 0.03％，pH7.2。37℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞23.9g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH8.8)配制的600ml转化液中，转化液为含3.1％L-丝氨酸(g/ml)的玉米浸泡液(氨基酸总含量15％)、18.6g吲哚和0.5％吐温-80(g/ml)溶液6mL，37℃酶促反应36h。反应液中L-色氨酸浓度为5.1％，对L-丝氨酸摩尔转化率为88％。
3.L-色氨酸分离纯化方法同实施例一，得L-色氨酸23.6g。
实施例五
发酵来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸合成酶基因工程菌培养在如下1000ml培养基(g/ml)中：豆饼水解液3％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.3％，乳糖1％，蔗糖0.5％，麦芽糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.06％，MgSO4.7H2O 0.05％，FeSO4.7H2O 0.01％，pH7.2。37℃摇瓶振荡培养14h，4000rpm离心15min得湿细胞25.8g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L醋酸缓冲液(pH9.0)配制的600ml转化液中，转化液为含2.5％L-丝氨酸(g/ml)的柠檬酸发酵提取液(氨基酸总含量14％)、15g吲哚和0.5％吐温-80(g/ml)溶液6mL，35℃酶促反应38h。反应液中L-色氨酸浓度为4.1％，对L-丝氨酸摩尔转化率为85％。
3.L-色氨酸分离纯化方法同实施例一，得L-色氨酸18.2g。
实施例六
发酵来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸酶基因工程菌培养在如下1000ml培养基(g/mi)中：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，玉米浆0.3％，蔗糖0.5％，果糖0.5％，IPTG 0.01％，NaCl 0.5％，MgSO4.7H2O 0.04％，K2HPO4 0.55％，pH7.0。37℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞23.7g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L硼酸钠缓冲液(pH9.0)配制的600ml转化液中，转化液为含3％L-丝氨酸(g/ml)的L-谷氨酸发酵提取液(氨基酸总含量16％)、18g吲哚和0.05％CTAB(g/ml)溶液6mL，42℃酶促反应30h。反应液中L-色氨酸浓度为4.9％，对L-丝氨酸摩尔转化率为85％。
3.L-色氨酸分离纯化方法同实施例一，得L-色氨酸22.7g。
实施例七
发酵来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下：
1.将色氨酸酶基因工程菌培养在如下1000ml培养基(g/ml)中：蛋白胨1％，玉米浆0.4％，牛肉膏0.3％，果糖0.5％，麦芽糖0.5％，IPTG 0.01％，NaCl0.7％，K2HPO4 0.65％，pH7.0。37℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞22.5g。
2.将湿细胞加入到0.1mol/L硼酸钠缓冲液(pH9.0)配制的600ml转化液中，转化液为含2.9％L-丝氨酸(g/ml)的L-赖氨酸发酵提取液(氨基酸总含量15％)、18g吲哚和0.05％CTAB(g/ml)溶液6mL，40℃酶促反应32h。反应液中L-色氨酸浓度为4.8％，对L-丝氨酸摩尔转化率为86％。
3.L-色氨酸分离纯化方法同实施例一，得L-色氨酸21.5g。
Claims (5)
1.一种L-色氨酸的酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)具有L-色氨酸合成酶或L-色氨酸酶的基因工程菌，在含有IPTG或乳糖的培养基中培养，产生L-色氨酸合成酶或L-色氨酸酶；
(2)用游离细胞法，将含酶细胞和含L-丝氨酸的混合氨基酸转化液混合，其中转化液中L-丝氨酸占总氨基酸重量比含量为20％～50％，再加入缓冲液、适量的磷酸吡哆醛、表面活性剂和吲哚，在35～42℃条件下进行酶促反应，将反应生成物进行分离，得到L-色氨酸；所述的含L-丝氨酸的混合氨基酸转化液来源于经过分离提取的羽毛和/或毛发酸水解液，L-谷氨酸、L-赖氨酸和/或柠檬酸提取后废液，或玉米浸泡液和/或糖蜜。
2.根据权利要求1所述的L-色氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(1)所用的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和果糖，其质量浓度为1～20g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、豆饼水解液或蛋白质水解物，其质量浓度为1～30g/L，加入IPTG或乳糖诱导，IPTG质量浓度为0.05～0.1g/L，乳糖质量浓度为5～10g/L。
3.根据权利要求1所述的L-色氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的缓冲液为磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸缓冲液，使转化液pH 7.5～9.5。
4.根据权利要求1所述的L-色氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的表面活性剂为吐温-80、十六烷基三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚。
5.根据权利要求1所述的L-色氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)分离L-色氨酸的方法为等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。
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