CN101534857A - 癌性疾病调节抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用新型筛选模式制备患者癌性疾病调节抗体的方法。该方法利用癌细胞的细胞毒性作为指标来分离抗癌抗体，使制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助癌症分期和诊断，还可以用于治疗原发性肿瘤，例如***癌或乳腺癌，以及***转移。所述抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物和造血细胞偶联。

Description

癌性疾病调节抗体
发明领域
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和制备，以及CDMAB在诊断和治疗过程中的应用，任选地与一种或多种化学治疗剂联合使用。本发明还涉及利用本发明的CDMAB的结合分析。
发明背景
每个患有癌症的个体都是独特的，由于个体的差异，其患有的癌症也不同于其他人所患的癌症。尽管如此，目前的治疗采用相同的方式治疗患有同期同类型肿瘤的所有患者。至少30％的这些患者的一线治疗是失败的，这样就造成更多轮次的治疗，增加了治疗失败、肿瘤转移及最终死亡的可能性。一种优越的治疗方式应该是针对特定个体的个体化治疗。目前唯一采用个体化治疗的方式是外科手术。化疗和放疗不能针对患者量身定做，而在大多数情况下，手术本身并不足以治愈癌症。
随着单克隆抗体的问世，发展个体化治疗方法的可能性变得更为现实，因为每种抗体能针对单一的表位。而且，制备针对多个表位的集群(constellation)的抗体组合成为可能，该表位集群唯一确定了某一特定个体的肿瘤。
认识到癌细胞和正常细胞的显著差异在于癌细胞含有转化细胞特异的抗原，科学界长期认为可以设计出通过特异性地结合这些癌抗原而特异性地靶向转化细胞的单克隆抗体；这样就产生了单克隆抗体能够作为“魔术子弹(Magic Bullets)”消除癌细胞的观点。已经显示，依照本发明公开的教导分离出的单克隆抗体能够以有利于患者的方式调节癌性疾病进程，如通过降低肿瘤负荷；并且本文将这些单克隆抗体称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
目前，癌症患者通常可以选择的治疗方式很少。目前的癌症治疗方法已经改善了总体存活率和发病率。然而，对特定的个体来说，这些改善的统计数据与他们个人情况的改善并无必然关系。
因此，如果提出一种方法学，使医生能够在同组患者中，独立于其他患者治疗每例肿瘤，这就使根据个人进行量身定做的独特治疗成为可能。理论上，这样一种治疗过程可以增加治愈率，产生更好的效果，从而满足盼望已久的需要。
从历史上来看，多克隆抗体的应用在治疗人类癌症的方面取得的成功有限。一直用人类的血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但极少有延长的好转或反应。而且，这种治疗方法重复性差，与化疗相比，没有更多的益处。像乳腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌等实体肿瘤也用人类血液、黑猩猩的血清、人类血浆和马血清来治疗过，但相应的结果是不可预测和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代，就有至少四项针对人类乳腺癌的临床试验，在使用了针对特定抗原或基于组织特异性的抗体的至少47名患者中，只产生了一名应答者。直到1998年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗Her2抗体与顺铂。在这项试验中，对37个患者的反应进行了评估，大约有四分之一的患者有部分反应，另外一半有轻微的或稳定的病情进展。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及针对糖蛋白和糖脂靶标的抗体。对腺癌有某些特异性的诸如17-1A等抗体已经进入了II期临床试验，其中60多例患者中，只有一例患者产生了部分反应。在其他的试验中，17-1A的使用在额外采用环磷酰胺实验方案的52例患者中，只产生了1例完全反应，2例轻微反应。其他涉及17-1A的临床试验得到与此相似的结果。最初被批准用来成像的人源化鼠单克隆抗体也没能使肿瘤消退。到目前为止，还没有对结肠直肠癌有效的抗体。同样地，对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌和胃癌的结果同样不好。用抗CD3单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了一些有限的成功。因此，可以看到，尽管所测试的抗体在作为人类临床试验的先决条件的小动物实验研究中获得成功，但在绝大多数情况下还是无效的。
现有专利
美国专利5,750,102公开了一种方法，其中用可以从患者的细胞或组织中克隆的MHC基因转染来自患者肿瘤的细胞。然后用这些转染的细胞给患者接种。
美国专利4,861,581公开了一种方法，它包括的步骤有：获取对哺乳动物肿瘤细胞和正常细胞的细胞内成分特异、对外部成分没有特异性的单克隆抗体；标记单克隆抗体；将该标记的抗体与已接受杀灭肿瘤细胞疗法的哺乳动物的组织接触；以及通过测量该标记抗体与退化的肿瘤细胞的细胞内成分的结合来确定治疗的效果。在制备针对人类细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认识到肿瘤细胞是这类抗原的便利来源。
美国专利5,171,665提供了一种新型抗体及其制备方法。具体地，该专利叙述了一种单克隆抗体的制备，该抗体有与人类肿瘤(例如肠癌和肺癌)相关的蛋白抗原牢固结合的特性，而与正常细胞的结合程度弱得多。
美国专利5,484,596提供了一种癌症治疗的方法，所述方法包括：手术去除人类癌症患者的肿瘤；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其能成活但不致瘤；用这些细胞来制备抑制原发性肿瘤复发、同时抑制肿瘤转移的患者疫苗。该专利讲述了能够与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发。如在第4栏，第45行等处提到的，专利权所有人在开发单克隆抗体中应用了自体肿瘤细胞，该单克隆抗体对人类肿瘤表现出活性特异的免疫治疗。
美国专利5,693,763讲述了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性，其不依赖于起源的上皮组织。
美国专利5,783,186涉及能诱导表达Her2的细胞发生凋亡的抗-Her2抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞系、用该抗体和包括所述抗体在内的药物组合物治疗癌症的方法。
美国专利5,849,876描述了产生单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系，该抗体针对从肿瘤和非肿瘤组织来源中纯化的粘液素抗原。
美国专利5,869,268涉及一种制备产生特异针对目标抗原的抗体的人类淋巴细胞的方法，制备单克隆抗体的方法及该方法制备的单克隆抗体。该专利特别涉及用于癌症诊断和治疗的抗-HD人类单克隆抗体的制备。
美国专利5,869,045涉及与人类癌细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体发挥功能的机制是双重的，其中该分子可以与人类癌细胞表面的细胞膜抗原反应，而且该抗体能够进一步内化入癌细胞内，随后结合，这使它们对形成抗体-药物，抗体-毒素的偶联物尤其有用。未经修饰的抗体在特定浓度下，也表现出细胞毒特性。
美国专利5,780,033公开了用于肿瘤治疗和预防的自身抗体的用途。不过，这种抗体是来自老年哺乳动物的抗核自身抗体。这里，自身抗体是指一种存在于免疫***的天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，所以就不要求自身抗体真正来自受治患者。此外，该专利公开了来自老年哺乳动物的天然单克隆抗核自身抗体及产生单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
发明概述
本发明的发明人之前已经被授予发明名称为“个体化患者特异性抗癌抗体”的美国专利6,180,357，该专利要求保护筛选用于癌性疾病治疗的个体化抗癌个性抗体的方法。
本申请采用了美国专利6,180,357中讲述的生产患者特异性抗癌抗体的方法，用以分离编码癌性疾病调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗体可以针对一种肿瘤被专门制备，从而使癌症治疗的个性化成为可能。在本申请公开的内容中，具有杀灭细胞(细胞毒性的)或抑制细胞生长(细胞生长抑制的)特性的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒性的。这些抗体能够用于辅助癌症的分期和诊断，也可以用于***转移。
个性化抗癌治疗的前景会给患者的治疗方式带来变化。一种可能的临床情境是在肿瘤出现时就取样并入库。通过该样本，能够从预存在的癌性疾病调节抗体组对该肿瘤进行分型。患者将被常规分期，但可用的抗体可以对患者进一步分期。用现有的抗体可以直接对该患者进行治疗，且肿瘤特异性的抗体组可以通过本文中列出的方法来制备或使用噬菌体展示库并结合本发明公开的筛选方法制备。因为存在交叉反应性，即存在其他肿瘤携带一些与接受治疗的肿瘤相同的表位的可能性，所以将制备的所有抗体都加入到抗癌抗体库中。根据本方法制备的抗体可以用于治疗许多患有与这些抗体结合的肿瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐治疗作为多模式治疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对于非癌细胞相对无毒性这一事实允许大剂量抗体组合单独应用，或与传统的治疗联合应用。高治疗指数也允许短期内的重复治疗，从而降低了治疗抗性细胞出现的可能性。
另外，本发明还包括将标准的化学治疗物质，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而使所述的化疗作用集中。
如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肿瘤特异性抗体的制备过程进行再次治疗。而且，该抗癌抗体可以与从该患者体内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肿瘤。目前几乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良结果。然而，转移癌通常血供丰富，通过红细胞来运输抗癌抗体可以使抗体富集在肿瘤部位。即便在转移之前，大多数癌细胞也要依赖于宿主的血供来存活，与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤同样有效。可选择地，所述抗体可以与其他的血细胞，比如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等偶联。
抗体有五类，每类都与其重链所赋予的功能相关。通常认为通过抗体依赖性细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用来介导裸抗体的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过结合补体***的C-1组分来活化人类补体，从而活化导致肿瘤裂解的补体活化的经典途径。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。鼠IgG2a和IgG3同种型抗体可以有效地召集具有Fc受体的细胞毒细胞，其导致单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。人的IgG1和IgG3同种型抗体介导ADCC。
抗体介导的癌症杀伤功能的另一可能机制是使用能够催化细胞膜及其相关糖蛋白或糖脂中不同的化学键水解的抗体，即所谓的催化抗体。
抗体介导癌细胞杀伤的还有另外两种被更广泛接受的机制。第一种是抗体作为疫苗诱导机体产生针对位于肿瘤细胞上的假定癌症抗原的免疫反应。第二是抗体用于靶向生长受体并干扰其功能或者下调该受体以使其功能有效丧失。
因此，本发明的目的是讲述引发抗体诱导的选自人类肿瘤的组织样本中癌性细胞的细胞毒性作用的方法，该方法包括提供来自人类肿瘤的组织样本，提供分离的单克隆抗体或其细胞的细胞毒性诱导抗原结合片段，以及将分离的单克隆抗体或其细胞的细胞毒性诱导抗原结合片段与所述组织样本接触，所述分离的单克隆抗体结合的一个或多个抗原表位与由以保藏号PTA-4890、PTA-4891或PTA-5643保藏于ATCC的杂交瘤产生的单克隆抗体结合的抗原表位相同。
本发明的另一方面讲述了治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞的细胞毒性作用敏感的人类乳腺肿瘤或***肿瘤的方法，其中所述乳腺肿瘤或***肿瘤表达与分离的单克隆抗体或其细胞的细胞毒性作用诱导抗原结合片段特异性结合的抗原，所述分离的单克隆抗体结合的一个或多个抗原表位与由以保藏号PTA-4890、PTA-4891或PTA-5643保藏于ATCC的杂交瘤产生的单克隆抗体结合的抗原表位相同。所述方法包括如下步骤：给予所述哺乳动物有效诱导细胞的细胞毒性作用的量的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，由此降低所述哺乳动物的肿瘤负荷。
本发明的再一目的是采用特定个体来源的细胞制备癌性疾病调节抗体方法，该抗体对癌细胞有细胞毒性，而同时对非癌细胞相对无毒，该方法是为了分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。
本发明的另外目的涉及癌性疾病调节抗体和其抗原结合片段。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过抗体依赖性细胞毒性作用介导。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过补体依赖性细胞毒性作用介导。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其细胞毒性是其催化细胞化学键水解的能力的作用。
本发明的另外目的是制备癌性疾病调节抗体，其用于癌症诊断、预后和监测的结合分析。
本发明其它的目的和优点通过本发明下述的说明、举例和实施方案将变得显而易见。
附图简要说明
图1包括1A245.6抗体、两种抗体的同种型对照抗体以及抗-EGFR抗体针对几种癌细胞系和非癌细胞系的代表性流式细胞术(FACS)直方图。
图2包括7BD-33-11A抗体、1A245.6的同种型对照抗体、抗EGFR抗体以及抗EGFR的同种型对照抗体针对几种癌细胞系和非癌细胞系的代表性FACS直方图。
图3包括11BD-2E11-2抗体、两种抗体的同种型对照抗体以及抗-EGFR抗体针对几种癌细胞和非癌细胞系的代表性FACS直方图。
图4是特定抗体治疗时，肿瘤体积随时间变化的图解分析。
图5是抗体对MB231人类乳腺癌肿瘤体积的影响随时间变化的图解分析。
图6是量化抗体治疗的存活百分比随时间变化的图解分析。
发明的详细描述
一般而言，下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都有其指定的含义。
术语“抗体”使用其最宽泛的涵义，具体来说涵盖，例如单个单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，去免疫的、鼠的、嵌合的或人源化的抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫偶联物和抗体片段(见下文)。
本发明中使用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即构成该群抗体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能自然发生的变异。单克隆抗体高度特异性的针对单一抗原位点。而且，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优势还在于其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆的”指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通过任何特定的方法来生产该抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。还可以使用在例如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al，J.MoI.Biol，222：581-597(1991)中描述过的技术，从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或可变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体、单结构域抗体分子、融合蛋白、重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体指包括抗原结合可变区，以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列的恒定区(例如，人天然序列恒定区)或其氨基酸序列的变体。优选地，所述完整抗体有一个或多个效应器功能。
依据其重链恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可以分为不同的“种类”。有五大类完整的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的几类可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重链恒定区分别被称为α，、δ、
Figure A200680055621D0011105956QIETU
、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的三维空间构型和亚单位结构是公知的。
抗体“效应器功能”指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨基酸序列变异的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的例子包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性作用、Fc受体结合、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体的下调(例如B细胞受体，BCR)等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，在所述反应中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、噬中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后导致靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页的表3总结了造血细胞的FcR表达。为了评估目标分子的ADCC活性，可以进行例如在美国专利5,500,362或5,821,337描述的体外ADCC分析。用于这类分析的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或附加地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中。
“效应器细胞”指表达一种或多种FcRs并执行效应器功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应器细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMCs中分离。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(γ受体)的受体，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，其包括这些受体的等位基因变体和选择性的剪切形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，两者的氨基酸序列相似，区别主要在于其胞浆区。激活性受体FcγRIIA在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见
Figure A200680055621D0012082459QIETU
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述M)。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel etal.，Immunomethods4：25-34(1994)和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中对FcR进行了综述。其他FcR，包括将来要被确认的FcR，都包括在本发明中的术语“FcR”中。该术语也包括负责将母体的IgG转运到胎儿体内的新生受体，FcRn(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，Eur.J.Immunol.24：2429(1994))。
“补体依赖性细胞毒性作用”或“CDC”指分子在补体存在下，裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体***的第一组分(Clq)与和关联抗原形成复合物的分子(比如，抗体)的结合启动。为了评价补体激活，可以进行如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中描述的CDC分析。
术语“可变的”指可变区某些部分的序列在抗体间高度不同，并用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变异并不是均匀分布在抗体的可变区域内。它集中在轻链和重链可变区的三个所谓的高度可变区的片段内。可变区内保守性较高的部分被称为骨架区(FRs)。每个天然的重链和轻链可变区，包含主要采用β-片层构型的四个FR，由三个高度可变区连接在一起，形成环状连接，在一些情况下形成部分>片层结构。每条链的高度可变区通过FRs以密切靠近的方式与另一条链的高度可变区结合在一起，促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp 15-17；48-53(1991))。恒定区并不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应器功能，例如在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中抗体的参与。
本发明中使用的术语“高度可变区”指抗体中负责与抗原结合的氨基酸残基。高度可变区通常包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区的氨基酸残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp 15-17；48-53(1991))和/或“高变环”区的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基2632(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“骨架区”或“FR”残基指除了本发明定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。抗体经木瓜蛋白酶水解产生两个相同的被称为“Fab”片段的抗原结合片段和一个残余的“Fc”片段，每个“Fab”片段都有单一的抗原结合部位，“Fc”片段的名称反映了其易结晶的能力。胃蛋白酶处理抗体产生一个F(ab′)2片段，其有两个抗原结合部位，且仍能够与抗原交联。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。该区域由以紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变区的二聚体构成。每个可变区的三个高变区正是以这种构型相互作用，来决定VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即便单一的可变区(或只含有三个抗原特异性高变区的Fv的一半)仍能够识别和结合抗原，尽管比完整结合位点的亲和性低。Fab片段也含有轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段不同于Fab片段之处在于其重链CH1区的羧基末端多了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本发明中指代Fab′，其中恒定区的半胱氨酸残基至少携带一个游离的巯基。最初的F(ab′)2抗体片段以Fab′片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他的抗体片段的化学偶联也是公知的。
来自任一脊椎动物的抗体的“轻链”基于其恒定区的氨基酸序列，都可以归于两种截然不同的所谓kappa(κ)和lambda(λ)链中的一种。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些区域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽还包含VH和VL区之间的多肽连接子，其使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双体(Diabodies)”指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一多肽链上(VH-VL)包含与轻链可变区(VL)结合的重链可变区(VH)。通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子，使这些区域被迫与另一条链上的互补区域配对，由此产生了两个抗原结合位点。例如在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al，Proc.NatlAcad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中对双体作了更详细的描述。
“分离的”抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体。其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗作用的物质，可以包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶解物。因为缺乏抗体的天然环境中的至少一种组分，分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体。但是，通常分离抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
“结合”目的抗原的抗体是指对该抗原有充分亲和力的抗体，以致该抗体在靶定表达该抗原的细胞时，可以作为治疗或诊断试剂。如果该抗体能结合抗原性部分，它通常会优先结合其抗原性部分，而不是其它受体，这不包括诸如非特异性的Fc接触的偶然结合或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与其他蛋白有明显的交叉反应。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领域中是公知的，可以包括但并不局限于例如FACS、细胞ELISA和Western印迹等分析。
正如本发明中使用的，“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”的表述可以交替使用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。根据有意使用的不同指代的上下文，指代是清楚的。
“治疗”既指治疗性处理，也指预防性或防止性的措施，其目的就是预防或减缓(减轻)目标病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或欲对其病症进行预防的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物已经被诊断为患有该病症或倾向于或易患该病症。
术语“癌症”和“癌性(的)”是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长或死亡不受调控。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌症更多具体的实例包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌在内的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌在内的胃癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，***，卵巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，***癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛癌，***癌，还有头颈部癌。
“化疗剂”是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括：诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、乌瑞替派(uredopa)的氮丙啶类；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine)；诸如瘤可宁(chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard)等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司丁、雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas)；如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类抗生素；甲氨碟呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤类嘌呤类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；
Figure A200680055621D0016082734QIETU
；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2＂-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；***糖苷(＂Ara-C＂)；环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ.)和多西他赛
Figure A200680055621D00162
Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)等紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；去甲长春碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任一种药物在药学上可以接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，诸如抗***药物，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、LY1 17018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素物质，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种药物在药学上可以接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何一种可以归于哺乳类的动物，包括人类、小鼠、免疫缺陷鼠(SCID)或裸鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地，本发明中的哺乳动物指人类。
“寡核苷酸”指短长度、单链或双链多聚脱氧核苷酸，其通过已知的方法(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学)，利用例如发表于1988年5月4日的EP 266,032中描述的固相技术，或利用Froehler et al，Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物化学合成。然后将其用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
“嵌合”抗体指免疫球蛋白，其部分重链和/或轻链与来源于特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，同时链上的其余序列与来源于另一种属或属于另一种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，此外还指这些抗体的片段，只要它们能够表现出所需的生物活性(美国专利4,816,567和Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA，81：6851-6855(1984))。
非人类(例如鼠科)抗体的“人源化”形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab′，F(ab)2或抗体的其他抗原结合序列)，其包含来自非人类免疫球蛋白的最小序列。在绝大多数情况下，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，来自受者抗体的互补决定区(CDRs)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔等非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此外，人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常是两个可变区的几乎所有的部分，其中所有或几乎所有的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且所有或几乎所有的FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。最优地，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区序列的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的序列。
“去免疫化”抗体是针对给定的物种没有免疫原性或免疫原性较差的免疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现去免疫化。可以使用任何本领域技术人员公知的去免疫化技术。例如，在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中，描述了一项使抗体去免疫原性的适当的技术。
诱导“细胞凋亡”的抗体是通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，这些方式例如但不限于：结合膜联蛋白V(Annexin V)、半胱天冬酶(caspase)活性、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或膜囊泡(所谓的凋亡小体)的形成。
在本说明书中，杂交瘤细胞系及其产生的分离的单克隆抗体可以选择用内部分类号7BD-33-11A，1A245.6和11BD-2E11-2或其各自的保藏号PTA-4890，PTA-4889和PTA-5643来表示。
本文中使用的“抗体-配体”包括至少对靶抗原的一个抗原表位有结合特异性的部分，所述部分可以是完整的抗体分子、抗体片段和至少有一个抗原结合区或其部分(即抗体分子的可变部分)的任何分子，例如，Fv分子、Fab分子、Fab′分子、F(ab′)2分子、双特异性抗体、融合蛋白或任一基因工程分子，所述分子特异性识别和结合抗原的至少一个抗原表位，所述抗原可被分别以ATCC号PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643命名的杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体结合(ATCC PTA-4890、ATCCPTA-4889或ATCC PTA-5643抗原)。
本文中使用的“癌性疾病调节抗体”(CDMAB)指以有益于患者的方式，例如通过减轻肿瘤负荷或延长肿瘤患者的生存期的方式，调节癌性疾病过程的单克隆抗体，以及其抗体-配体。
本发明中使用的“抗原结合区”指识别靶抗原的分子的部分。
本发明中使用的“竞争性抑制”是指通过常规的抗体相互竞争分析(Belanger L.，Sylvestre C.和Dufour D.(1973)，Enzyme linked immunoassayfor alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竞争和夹心法的甲胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta 48，15)，能够识别和结合由分别以ATCC号PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643命名的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(ATCC号PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643抗体)针对的抗原决定表位。
本发明中使用的“靶抗原”指ATCC号PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643抗原或其部分。
本发明中使用的“免疫偶联剂”指以化学或生物学方式连接到细胞毒素、放射物质、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂的诸如抗体的任一分子或CDMAB。只要能够与其靶标结合，该抗体或CDMAB可以在其分子的任一部位与细胞毒素、放射物质、抗肿瘤药或治疗剂连接。免疫偶联剂的实例包括抗体毒素化学偶联剂和抗体-毒素融合蛋白。
本发明中使用的“融合蛋白”指任何嵌合蛋白，其抗原结合区与例如毒素、酶或蛋白药物的生物活性分子连接。
本发明的CDMAB可以被修饰，即通过分子内的氨基酸修饰，产生出衍生分子。也可能是化学修饰。
衍生分子要保留多肽的功能特性，也就是说，具有这类取代的分子仍能够使该多肽分别与ATCC号PTA-4890、PTA-4889或PTA-5643抗原或其部分结合。
氨基酸取代包括但不必然限于在本领域中公知的“保守”氨基酸取代。
举例来说，被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任一种取代这些疏水氨基酸的任何其它一种；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。其他的取代也可以被认为是保守的，取决于特定氨基酸的环境和其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可以经常互换，丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的蛋氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发生部位氨基酸残基的明显特征是其带电特性，这两种氨基酸的不同pK并不重要。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是“保守的”。
实施例1
杂交瘤制备-杂交瘤细胞系7BD-33-11A，1A245.6，11BD-2E11-2杂交瘤：
根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系7BD-33-11A和1A245.6于2003年1月8日分别以保藏号PTA-4890和PTA-4889保藏于美国典型培养物保藏中心，该中心位于美国弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯大学路10801(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)。依据37 CFR1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。
根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系11BD-2E11-2于2003年11月11日以保藏号PTA-5643保藏于美国典型培养物保存中心，该中心位于美国弗吉尼亚州20110-2209马纳萨斯大学路10801。依据CFR 1.808的规定，保藏者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限制。
为了制备产生7BD-33-11A抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原，即人类乳腺癌细胞的单细胞悬液。通过以分次剂量皮下和腹腔注射含有20万至250万个细胞的100微升抗原-佐剂和弗氏完全佐剂免疫8到9周龄的BALB/c小鼠。初次免疫三周后，用新鲜制备的含有20万至250万个细胞的抗原-佐剂以同样的方式加强免疫小鼠，并在上次加强后两周再加强一次。在最后一次免疫后的至少两天，取出脾脏用于融合。通过将分离的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤伴侣融合以制备杂交瘤。检测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了制备产生1A245.6抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原，即人类乳腺癌细胞的单细胞悬液。通过以分次剂量皮下和腹腔注射含有250万个细胞的100微升抗原-佐剂和弗氏完全佐剂免疫8到9周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后3周，用新鲜制备的含有250万个细胞的抗原-佐剂以同样的方式加强免疫小鼠，2周后、5周后以及上一次加强三周后再加强免疫小鼠。在最后一次免疫后的至少三天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤伴侣融合以制备杂交瘤。检测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了制备产生11BD-2E11-2抗癌抗体的杂交瘤，在冷PBS中制备抗原，即人类乳腺癌细胞的单细胞悬液。通过以分次剂量皮下和腹腔注射含有20万至250万个细胞的100微升抗原-佐剂和弗氏完全佐剂免疫8到9周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后两周或三周，用新鲜制备的含有20万至250万个细胞的抗原-佐剂以同样的方式加强免疫小鼠，并在上次加强后两周再加强一次。在最后一次免疫后至少两天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤伴侣融合以制备杂交瘤。检测所述杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了检测杂交瘤细胞分泌的抗体是IgG，还是IgM同种型，进行ELISA分析。将4℃包被缓冲液(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.2-9.6)中的浓度为2.4μg/ml的山羊抗小鼠的IgG+IgM(H+L)，按100μl/孔加入ELISA板过夜。该ELISA板用洗涤缓冲液(PBS+0.05％ Tween)洗3次。按100μl/孔加入封闭缓冲液(含5％奶的洗涤缓冲液)，室温1小时，随后用洗涤缓冲液洗3次。按100μl/孔加入杂交瘤上清，将该板室温孵育1小时。所述板用洗涤缓冲液洗3次，按100μl/孔加入山羊抗小鼠的IgG或IgM辣根过氧化物酶偶联物的1/5000稀释液(用含1％牛血清白蛋白的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗3次。按100μl/孔加入TMB溶液，室温孵育1至3分钟。按100μl/孔加入2M H2SO4，终止颜色反应，用Perkin-Elmer HTS7000读板仪在450nm波长处读板。如表1所示，7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
经过1至4轮有限稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶细胞结合的抗体。检测了三种乳腺癌细胞系：MDA-MB-231(也被称为MB-231)、MDA-MB-468(也被称为MB-468)和SKBR-3。板内的细胞在使用前先固定。室温下，该板用含MgCl2和CaCl2的PBS洗三次。每孔加100μl PBS稀释的2％多聚甲醛，室温10分钟，然后弃掉多聚甲醛。再用含MgCl2和CaCl2的PBS在室温下洗涤该板3次。每孔加100μl 5％奶洗涤液(PBS+0.05％ Tween)进行封闭，室温1小时。该板用洗涤液洗3次，按100μl/孔加入杂交瘤上清，室温孵育1小时。用洗涤缓冲液将该板洗3次，按100μl/孔加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠的IgG或IgM的1/5,000稀释液(用含1％牛血清白蛋白的PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗3次，每孔加入100μl TMB底物，室温孵育1-3分钟。每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，用Perkin-ElmerHTS7000读板仪在450nm波长处读板。如图1列表所示，结果表示为与IgG同种型对照(3BD-27)比较高出背景的倍数。7BD-33-11A和1A245.6杂交瘤细胞系产生的抗体与检测的所有三种乳腺癌细胞系都强烈结合，至少比背景高出6倍。两种抗体与MDA-MB-231细胞系的结合最强。杂交瘤细胞系11BD-2E11-2产生的抗体也与MDA-MB-231细胞系结合最强，但是与另外两种细胞系的结合并没显示出比背景强。这些结果表明该抗体识别的表位在MDA-MB-468或SKBR-3细胞上不存在，且与7BD-33-11A和1A245.6识别的表位明显不同。
进行抗体结合试验的同时，在相同的乳腺癌细胞系：MDA-MB-231、MDA-MB-468和SKBR-3上，检测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。活/死细胞毒性分析试剂盒购自Molecular Probes公司(Eu，OR)。根据厂商的说明书并作下述的改动后进行分析。在分析前，将细胞根据预先确定的适当密度进行铺板。2天后，将100μl来自杂交瘤微量滴定板的上清转移到细胞培养板中，在5％ CO2培养箱中孵育5天。将阳性对照孔吸净，加入100μl叠氮钠和/或放线菌酮。因为已知3BD-27单克隆抗体不与检测的三种乳腺癌细胞系结合，所以该抗体也被加入作为同种型对照。出于比较，该分析也用了抗-EGFR抗体(C225)。经过5天的处理后，倒空反应板的液体并吸干。通过多通道挤瓶，将含MgCl2和CaCl2的室温DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50μl用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的荧光活/死(Live/Dead)染料，在37℃含5％ CO2的培养箱内孵育30分钟。将该板置于Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪内读数，用Microsoft Excel分析数据。结果在表1中列出。
观察到三种抗体的细胞毒性有所差异。11BD-2E11-2显示出39-73％的杀伤作用，在SKBR-3细胞上观察到的细胞毒性最高。1A245.6和7BD-33-11A在MDA-MB-231细胞中呈现相似的细胞毒性，但1A245.6对于MDA-MB-468细胞也具有细胞毒性，而7BD-33-11A则没有。
这表明来源于杂交瘤细胞的抗体能在癌细胞中产生细胞毒性。在抗体的结合程度与杂交瘤上清产生的细胞毒性之间也存在普遍的联系。这种趋向有一些例外，比如尽管11BD-2E11-2对MB-468和SKBR-3癌细胞结合微弱，但11BD-2E11-2在MB-468和SKBR-3癌细胞中仍有细胞毒性。这提示该抗体具有在这种细胞类型上无法被细胞ELISA结合分析检测到的调节作用，或者由于分析本身的限制(例如细胞的固定)而检测不到其结合。最后，另一个可能性是所述分析在该特定情况下对检测足以介导细胞毒性的结合不是足够的敏感。另一个例外是尽管7BD-33-11A对MB-468细胞的结合与同种型对照相比高出背景6倍，但该抗体对MB-468细胞的细胞毒性作用相对较弱。这提出了一种可能性，即结合不一定必然预测抗体与其相关抗原连接的结果。已知的非特异性细胞毒性物质放线菌酮产生了预期的细胞毒性。
实施例2
抗体制备
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养杂交瘤7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2来制备单克隆抗体，每星期进行两次收集和再接种。然后用蛋白G琼脂糖4快流(Protein G Sepharose 4 FastFlow)(Amersham Biosciences，Baie d′Urfé，QC)进行标准的抗体纯化操作。本发明的范围包括利用人源化的、嵌合的或鼠单克隆抗体。在细胞毒性分析中，将7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2与许多阳性对照(抗Fas(EOS9.1，IgM，κ，20微克/毫升，eBioscience，San Diego，CA)，抗-Her2/neu(IgGl，κ，10微克/毫升，Inter Medico，Markham，ON)，抗-EGFR(C225，IgGl，κ，5微克/毫升，Cedarlane，Hornby，ON)，放线菌酮(100微摩尔，Sigma，Oakville，ON)，NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))以及阴性对照(107.3(抗-TNP，IgGl，κ，20微克/毫升，BD Biosciences，Oakville，ON)，G155-178(抗-TNP，IgG2a，κ，20微克/毫升，BD Biosciences，Oakville，ON)，MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b，κ，20微克/毫升)，J606(抗-果聚糖，IgG3，κ，20微克/毫升)，IgG缓冲液(2％))进行比较(表2)。检测了乳腺癌(MB-231，MB-468，MCF-7)、结肠癌(HT-29，SW1116，SW620)、肺癌(NCI H460)、卵巢癌(OVCAR)、***癌(PC-3)以及非-癌(CCD 27sk，Hs888 Lu)细胞系(所有这些细胞系都来自ATCC，Manassas，VA)。活/死细胞毒性检测试剂盒购自Molecular Probes公司(Eugene，OR)。根据厂商的说明书并作下述的改动后进行分析。在检测前将细胞以预确定的合适密度铺板。2天后，将100微升纯化抗体稀释到培养基中，然后转移入细胞板中，在含8％ CO2的培养箱中孵育5天。然后倒空培养板并吸干。通过多通道挤瓶，将含MgCl2和CaCl2的室温DPBS分到每孔中，叩打三次，倒出液体并吸干。每孔加入50μl用含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的荧光活/死染料，在37℃含5％ CO2的培养箱内孵育30分钟。该板置于Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪内读数，数据用Microsoft Excel进行分析，结果在表2中列出。数据表示为四次试验的平均值，每次三个重复，并以如下方式定性：4次试验中4次高于阈细胞毒性(threshold cytotoxicity)记为(+++)，4次试验中3次高于阈细胞毒性记为(++)，4次试验中2次高于阈细胞毒性记为(+)。表2中未标记的细胞表示几次结果不一致或低于阈细胞毒性的作用。抗体7BD-33-11A和1A245.6在乳腺以及***肿瘤细胞系中显示出选择性的细胞毒性，而对非转化的正常细胞没有影响。两种抗体都显示出比阳性对照抗-Fas抗体高25至50％的杀伤作用。11BD-2E11-2在乳腺和卵巢癌细胞中具有特异的细胞毒性，并且对正常细胞没有影响。考虑到生物的细胞分析的局限性，化学细胞毒性试剂诱导了预期的细胞毒性，同时用于对比的许多其他的抗体的表现也与预期相同。总之，三种抗体均显示出对许多类型的癌细胞都有细胞毒性活性。由于并不是所有的癌细胞类型都是敏感的，抗体在其活性上有选择性。此外，所述抗体显示出功能性特异性，因为其在非-癌细胞类型中并没产生细胞毒性，这在治疗情况下是一个很重要的因素。
Figure A200680055621D00251
用于FACS的细胞的制备如下：首先用DPBS(无钙离子和镁离子)冲洗单层细胞，然后在37℃用细胞解离缓冲液(INVITROGEN)使细胞脱离培养板。离心并收集细胞之后，在4℃用含MgCl2、CaCl2以及25％胎牛血清的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(洗涤培养基)重悬细胞并计数，分至适当的细胞密度，离心以沉淀细胞并将其重悬于含20微克/毫升7BD-33-11A、1A245.6、11BD-2E11-2或对照抗体(同种型对照或抗-EGFR)染色培养基(含MgCl2和CaCl2的DPBS)中，冰上放置30分钟。加入Alexa Fluor 488-偶联的二抗之前，用洗涤培养基洗细胞一次。然后加入溶于染色培养基的Alexa Fluor 488-偶联的抗体，放置20分钟。接着，最后洗一次细胞并将其重悬在含1μg/mL碘化丙啶(propidium iodide)的染色培养基中。通过在使用CellQuest软件的FACScan(BD Biosciences)上运行样本来评估流式细胞计数的细胞获取结果。细胞的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)通过调整FSC和SSC检测器的电压和振幅设定。三个荧光通道(FL1、FL2和FL3)的检测器通过运行用纯化的同种型对照抗体染色，继而用AlexaFluor 488-偶联二抗染色的细胞来调整，以使细胞有中位荧光强度为大约1-5个单位的统一的波峰。通过FSC设门和碘化丙啶排除来获取活细胞。对于每一份样本，获取大约10,000个活细胞进行分析，结果列于表3中。表3列出高于同种型对照的平均荧光强度的倍增，并如下定性：小于5为(-)；5至50为(+)；50至100为(++)；高于100为(+++)，括号中为染色细胞的百分比。
Figure A200680055621D00261
7BD-33-11A抗体的代表性直方图汇编至图1，1A245.6抗体的代表性直方图汇编至图2，11BD-2E11-2抗体的代表性直方图汇编至图3并显示结合特征，在某些情况下包含示例的双峰。11BD-2E11-2呈现出对于乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231的特异性肿瘤结合。7BD-33-11A和1A245.6均显示出对于乳腺(MDA-MB-231和MCF-7)、结肠、肺、卵巢和***来源的癌细胞系类似的结合，但对一种乳腺癌细胞系(MDA-MB-468)的结合有所不同。这三种抗体全部都与非-癌细胞结合，但所述结合并不产生细胞毒性作用。这是结合并不必然地预示着抗体与其相关抗原连接的结果的进一步证据，并且是非显而易见的发现。这表明在不同细胞中细胞毒性作用取决于抗体连接的情形，而并不仅仅取决于抗体结合。
实施例3
体内试验
参见图5和图6显示的数据，将颈背部皮下注射的100微升中的五百万个MDA-MB-231人乳腺癌细胞植入到4至8周龄的雌性SCID小鼠。小鼠被随机分成四个处理组，每组10只。植入前一天，将20mg/kg的11BD2E-11-2、7BD-33-11A、1A245.6测试抗体或3BD-27同种型对照抗体(已知不与MDA-MB-231细胞结合)以300微升的体积经腹腔给药，所述体积由含2.7mM KCl，1mM KH2PO4，137mM NaCl和20mMNa2HPO4的稀释液将储存液稀释后得到。所述抗体以同样方式每周给药一次，一共7周。
大约每7天用测径器测量肿瘤生长，测量长达10周，或直至动物个体达到加拿大动物保护协会(CCAC)的终点。在研究期间记录动物的体重。研究结束时所有动物都根据CCAC的指导原则施以安乐死。
整个研究中没有出现临床毒性症状。每周一次测量的体重可以作为健康或发育停滞的替代指标。在用同种型对照、3BD-27以及7BD-33-11A、1A245.6或11BD-2E11-2治疗的各组之间，在体重上有最小的差异。在第60天(停止治疗后11天)，1A245.6治疗组的肿瘤体积是对照组的5.2％(p＝0.0002)，表明抗体治疗在降低肿瘤负荷方面的有效性。那些用7BD-33-11A抗体治疗的携带癌细胞的小鼠没有得病，并且没有肿瘤负荷。11BD-2E11-2治疗组在第67天时肿瘤体积缩小(对照的45％)(p＝0.08)。这也表明，细胞毒性抗体治疗与对照抗体相比，能减小肿瘤负荷。用7BD-33-11A、1A245.6和11BD-2E11-2细胞毒性抗体治疗还有相应的存活益处(图6)。用3BD-27抗体治疗的对照组在移植后第74天达到100％的死亡率。相反，7BD-33-11A治疗组没有得病并且1A245.6治疗的动物呈现100％的存活率，11BD-2E11-2治疗组存活率为24％。
总之，相比对照抗体，细胞毒性抗体治疗在公认的人类癌症模型中使肿瘤负荷降低并增加了存活率，这表明这些抗体(7BD-33-11A、1A245.6和11BD-2E11-2)在用于包括人类在内的其他哺乳动物的治疗中具有药理学和药物学益处。
实施例4
体内建立的肿瘤试验
将颈背部皮下注射的100微升中的五百万个MDA-MB-231乳腺癌细胞植入到5至6周龄的雌性SCID小鼠。每周用测径器测量肿瘤生长。植入后第34天，当该群小鼠的大多数的肿瘤体积达到100mm3(范围从50至200mm3)时，三个处理组的每组被随机分入8-10只小鼠。将15mg/kg的7BD-33-11 A、1 A245.6测试抗体或3BD-27同种型对照抗体(已知不结合MDA-MB-231细胞)以150微升的体积经腹腔给药，所述体积由含2.7mM KCl，1mMKH2PO4，137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释液将储存液稀释后得到。然后所述抗体以同样方式给药，每周三次，总共10次，直至植入后第56天。每7天用测径器测量肿瘤生长，直至植入后第59天或直到动物个体达到加拿大动物保护协会(CCAC)的终点。在研究期间记录动物的体重。研究结束时所有动物都根据CCAC的指导原则施以安乐死。
整个研究中没有出现临床毒性症状。每周测量一次体重。同种型对照和7BD-33-11A或1A245.6抗体治疗组之间在体重上没有显著差异。由图4可以看出，植入后第59天(治疗结束后两天)，7BD-33-11A治疗组的肿瘤体积是对照组的29.5％(p＝0.0003)。在该组，第59天的数值与第52天比较时，平均肿瘤体积还有衰退的趋势(p＝0.25)。同样，1A245.6抗体治疗也显著地抑制肿瘤生长，并降低肿瘤负荷。用这种抗体处理的携带建立的肿瘤的动物的肿瘤体积是用同种型处理对照组的56.3％(p＝0.017)。
总之，相比对照抗体，7BD-33-11A或1A245.6抗体治疗在公认的人类癌症模型中显著降低了建立的肿瘤的肿瘤负荷，表明了这些抗体在用于包括人类在内的其他哺乳动物的治疗中具有药理学和药物学益处。
本说明书中提及的所有专利和公开出版物代表了本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。
应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可以做出各种变化，且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员很容易看出本发明较好地适合实现所描述的目的并获得最终结果和益处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核苷酸、肽、多肽、生物相关化合物、方法、程序和技术都是优选实施方案中有代表性的，其目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所要求保护的本发明并不仅仅局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而易见的，均在所附权利要求书的范围内。

Claims (15)

1.引发抗体诱导的选自人类乳腺肿瘤或***肿瘤的组织样本中癌性细胞的细胞毒性的方法，所述方法包括：
提供所述人类乳腺肿瘤或***肿瘤的组织样本；
提供分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与以保藏号PTA-4890保藏于ATCC的杂交瘤产生的单克隆抗体结合相同的表位；以及
将所述分离的单克隆抗体或其细胞毒性诱导抗原结合片段与所述组织样本接触。
2.治疗哺乳动物中人类乳腺肿瘤或***肿瘤的方法，其包括给予所述哺乳动物分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与以保藏号PTA-4890保藏于ATCC的杂交瘤产生的单克隆抗体结合相同的表位，其中所述给予是采用有效诱导细胞毒性的量并由此降低所述哺乳动物的肿瘤负荷。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与细胞毒性部分偶联。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体活化补体。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是人源化抗体。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是嵌合抗体。
9.可给药形式的化合物治疗哺乳动物中人类乳腺肿瘤或***肿瘤的用途，其中所述化合物包含与以保藏号PTA-4890保藏于ATCC的杂交瘤产生的单克隆抗体结合相同表位的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述可给药形式是采用有效诱导细胞毒性的量并由此降低所述哺乳动物的肿瘤。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与细胞毒性部分偶联。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
12.如权利要求9所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体活化补体。
13.如权利要求9所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体介导抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
14.如权利要求9所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体是人源化抗体。
15.如权利要求9所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体是嵌合抗体。
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