CN101528919B

CN101528919B - 突变型dna聚合酶及相关方法

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Publication number: CN101528919B
Application number: CN200780038772.2A
Authority: CN
Inventors: K·A·鲍尔; E·S·史密斯; D·H·盖尔芬德; E·菲斯; S·苏科; T·迈尔斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2007-10-18
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2027-10-18
Also published as: US8962293B2; US20090148891A1; US20170369856A1; US9738876B2; HK1133038A1; EP2079834A1; JP5189101B2; US20090280539A1; WO2008046612B1; CN101528919A; ES2520025T3; EP2079834B1; US9102924B2; US20150218537A1; CA2666758A1; US10035993B2; CA2666758C; WO2008046612A1; DK2079834T3; JP2011502467A

Abstract

公开了相对于相应的未经修饰的聚合酶具有改良的延伸速率的突变型DNA聚合酶。突变型聚合酶能够用于公开的多种引物延伸方法。还公开了相关的组合物，包括能够用于，例如，突变型DNA聚合酶产生的重组核酸、载体以及宿主细胞。

Description

突变型DNA聚合酶及相关方法

发明领域

本发明涉及DNA聚合酶领域及它们的各种应用，包括核酸的引物延伸与扩增。

发明背景

DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂诸如Mg²⁺存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次产生一致的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如Mullis的美国专利号4,683,202)。

在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在DNA复制的每一循环开始时添加(参见上述美国专利号4,683,202)。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见Gelfand的美国专利号4,889,818和Mullis的美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，靶核酸序列可能仅仅是可疑DNA或RNA的一小部分，因此不扩增的话可能难以检测到靶核酸序列的存在。由于DNA聚合酶在生物技术和医学上的重要性，产生具有需要的酶性质例如改善的引物延伸速率、逆转录效率或扩增能力的DNA聚合酶突变体是非常有益的。

聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，包括手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见Beese等，Science 260：352-355，1993)；Patel等，BioChemistry 34：5351-5363，1995)。大小的细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，而催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的。例如，与引入的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序A是重叠的，在哺乳动物polα和原核的pol I家族DNA聚合酶之间的平均偏差大约为(Wang等，Cell 89：1087-1099，1997)。在结构上基序A以主要包括疏水性残基的反向平行β链起始，延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。基序A的例子中，例如，序列DYSQIELR保留在从数百万年进化的生物体包括例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)和大肠杆菌(Escherichia coli)分离的聚合酶中。把这些观察结果联系在一起，它们指出聚合酶通过类似的催化机理行使功能。

除了高度保守之外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够接受特定的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如Patel等的美国专利号6,602,695)。这样的突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。因此，在本领域需要鉴定氨基酸位点，所述氨基酸位点适于突变以产生改良的聚合酶活性，包括例如改良的延伸速率、逆转录效率或扩增能力。本发明，如同在此阐述的，满足这些及其它需要。

发明概述

本发明提供相对于相应的未经修饰的聚合酶有改良酶活性的突变型DNA聚合酶，它可以用于多种核酸合成应用中。在一些实施方式中，聚合酶在聚合酶结构域中包含具有至少一个以下基序的氨基酸序列：

a)X_a1-X_a2-X_a3-X_a4-R-X_a6-X_a7-X_a8-K-L-X_a11-X_a12-T-Y-X_a15-X_a16(SEQID NO：1)；其中X_a1是I或L；X_a2是L或Q；X_a3是Q、H或E；X_a4是Y，H或F；X_a6是E、Q或K；X_a7是I、L或Y；X_a8是除Q、T、M、G或L之外的氨基酸；X_a11是K或Q；X_a12是S或N；X_a15是I或V；X_a16是E或D；

b)T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N(SEQ ID NO：2)；其中X_b7是S或T；X_b8是除D、E或N之外的氨基酸；和

c)X_c1-X_c2-X_c3-X_c4-X_c5-X_c6-X_c7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ ID NO：3)；其中X_c1是G、N或D；X_c2是W或H；X_c3是W、A、L或V；X_c4是除I或L之外的氨基酸；X_c5是V、F或L；X_c6是除S、A、V或G之外的氨基酸；和X_c7是A或L，

其中聚合酶相对于X_a8是选自Q、T、M、G或L的氨基酸；X_b8是选自D、E或N的氨基酸和/或X_c6是选自S、A、V、或G的氨基酸而其它方面相同的聚合酶(即参考聚合酶)具有改良的核酸延伸速率和/或改良的逆转录效率。在参考聚合酶的一些实施方式中(例如Z05或CS5/CS6)，X_a8是Q、T、M、G或L，X_b8是D、E或N，X_c4是I或L，和X_c6是S、A、V、或G(SEQ ID NOS：23和24)。在参考聚合酶的一些实施方式中，X_b8是D、E或N(SEQ ID NOS：25和26)。

对于基序a)X_a1-X_a2-X_a3-X_a4-R-X_a6-X_a7-X_a8-K-L-X_a11-X_a12-T-Y-X_a15-X_a16(SEQ ID NO：1)，在一些实施方式中，X_a8是选自由A、C、D、E、F、H、I、K、N、P、R、S、V、W、Y(SEQ ID NO：27)及其类似物组成的组的D-或L-氨基酸。在一些实施方式中，X_a8选自由R、K和N组成的组的氨基酸(SEQ ID NO：28)。在一些实施方式中，X_a8是精氨酸(R)(SEQ ID NO：29)。

对于基序b)T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N(SEQ ID NO：2)，在一些实施方式中，X_b8是选自由A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y(SEQ ID NO：30)及其类似物组成的组的D-或L-氨基酸。在一些实施方式中，X_b8是选自由G、A、S、T、R、K、Q、L、V和I组成的组的氨基酸(SEQ ID NO：31)。在一些实施方式中，X_b8是选自由G、T、R、K和L组成的组的氨基酸(SEQ ID NO：32)。

对于基序c)X_c1-X_c2-X_c3-X_c4-X_c5-X_c6-X_c7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ IDNO：3)，在一些实施方式中，X_c4是选自由A、C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y(SEQ ID NO：33)及其类似物组成的组的D-或L-氨基酸。在一些实施方式中，X_c4是选自由F和Y组成的组的氨基酸(SEQ ID NO：34)。在一些实施方式中，X_c4是苯丙氨酸(F)(SEQID NO：35)。在一些实施方式中，X_c6是选自由C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W和Y组成的组的氨基酸(SEQ ID NO：36)。在一些实施方式中，X_c6是选自由F和Y组成的组的氨基酸(SEQ IDNO：37)。在一些实施方式中，X_c6是苯丙氨酸(F)(SEQ ID NO：38)。

在一些实施方式中，改良的聚合酶(例如Z05或CS5/CS6)包括X_a8位置的精氨酸(R)，X_b8位置的甘氨酸(G)，X_c4位置的苯丙氨酸(F)和/或X_c6位置的苯丙氨酸(F)中的至少一个(SEQ ID NOS：39-68)。

在一些实施方式中，本发明的DNA聚合酶是未经修饰的聚合酶的修饰形式。在它的未经修饰的形式中，聚合酶在聚合酶结构域中包括具有以下基序的氨基酸序列：

X_a1-X_a2-X_a3-X_a4-R-X_a6-X_a7-X_a8-K-L-X_a11-X_a12-T-Y-X_a15-X_a16(SEQ IDNO：69)；其中X_a1是I或L；X_a2是L或Q；X_a3是Q，H或E；X_a4是Y，H或F；X_a6是E，Q或K；X_a7是I，L或Y；X_a8是Q，T，M，G或L；X_a11是K或Q；X_a12是S或N；X_a15是I或V；和X_a16是E或D；

T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N(SEQ ID NO：70)；其中X_b7是S或T；和X_b8是D，E或N；和

X_c1-X_c2-X_c3-X_c4-X_c5-X_c6-X_c7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ ID NO：71)；其中X_c1是G，N或D；X_c2是W或H；X_c3是W，A，L或V；X_c4是I或L；X_c5是V，F或L；X_c6是S，A，V或G；和X_c7是A或L。

多种DNA聚合酶适于根据本发明的突变。尤其适宜的是热稳定聚合酶，包括来自各种嗜热菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通过氨基酸取代、***或缺失或其它修饰来源于上述野生型或天然存在的酶的热稳定聚合酶。示例性的聚合酶的未经修饰形式包括例如CS5、CS6或Z05DNA聚合酶，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未经修饰的聚合酶包括例如来自于下列任何种类嗜热菌的DNA聚合酶(或与所述聚合酶具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的功能性DNA聚合酶)：海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；水生栖热菌(Thermus aquaticus)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；黄栖热菌(Thermus flavus)；丝状栖热菌(Thermus filiformis)；栖热菌种sps17(Thermus sp.sps17)；栖热菌种Z05(Thermus sp.Z05)；那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)；非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)；Thermus caldophilus或热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax).适宜的聚合酶还包括那些具有逆转录酶(RT)活性和/或能够掺入非常规核苷酸诸如核糖核苷酸或其它2′-修饰的核苷酸的聚合酶。

在一些实施方式中，聚合酶未经修饰的形式包括嵌合聚合酶。在一个实施方式中，例如，嵌合聚合酶未经修饰的形式是CS5 DNA聚合酶(SEQ ID NO：18)，CS6 DNA聚合酶(SEQ ID NO：19)或与CS5 DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶具有至少90％、91％、92％、93％，94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的聚合酶。在一些特定的变种中，嵌合聚合酶未经修饰的形式包括相对于SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的选自G46E、L329A和E678G的一个或更多个氨基酸取代。例如，突变型聚合酶未经修饰的形式可以是G46E CS5；G46E L329A CS5；G46EE678G CS5；或G46E L329A E678G CS5。在示例性的实施方式中，取代未经修饰的形式以提供包括一个或更多个选自S671F、D640G、Q601R和I669F的氨基酸取代的突变型聚合酶。例如，所述突变型DNA聚合酶可以是下列的任何一个：G46E S671F CS5；G46E D640G CS5；G46EQ601R CS5；G46E I669F CS5；G46E D640G S671F CS5；G46E L329AS671F CS5；G46E L329A D640G CS5；G46E L329A Q601R CS5；G46EL329A I669F CS5；G46E L329A D640G S671F CS5；G46E S671F E678GCS5；G46E D640G E678G CS5；G46E Q601R E678G CS5；G46E I669FE678G CS5；G46E L329A S671F E678G CS5；G46E L329A D640GE678G CS5；G46E L329A Q601R E678G CS5；G46E L329A Q601RD640G I669F S671F E678G CS5；G46E L329A I669F E678G CS5等。

在一些实施方式中，聚合酶是CS5聚合酶(SEQ ID NO：15)、CS6聚合酶(SEQ ID NO：16)或Z05聚合酶(SEQ ID NO：6)，其中X_b8是选自由G、T、R、K和L组成的组的氨基酸。例如，CS5或CS6聚合酶可以选自下列：D640G，D640T，D640R，D640K和D640L。Z05聚合酶可以选自由D580G、D580T、D580R、D580K和D580L组成的组。

突变型聚合酶可以包括其它非取代修饰。一种这样的修饰是热可逆的共价修饰，它使酶失活，但是在高温，诸如通常用于引物延伸的温度下孵育相反地使酶激活。在一个实施方式中，包括热可逆的共价修饰的突变型聚合酶由热稳定DNA聚合酶和具有下列式I或II之一的二羧酸酐的混合物在碱性pH和低于约25℃的温度下进行的反应产生：

其中R₁和R₂是氢或有机基团，它们可以连在一起；或

其中R₁和R₂是有机基团，它们可以连在一起，并且氢是顺式的。在上述酶的一个特定变种中，聚合酶未经修饰的形式是G64E CS5。

在一些实施方式中，如同此处描述的，使用单链DNA作为模板(例如M13mp18，HIV)，以适当的引物(例如核酸序列5′-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3′(SEQ ID NO：72)的多核苷酸)引发，通过测量在固定时间间隔(例如每5、10、15、20、30或60秒)荧光基团的掺入来检测双链DNA的形成，以此来确定延伸速率。如同本文描述的，在预定的时间单位期间，本发明的聚合酶的延伸速率可以与参考聚合酶(例如天然存在的或未经修饰的聚合酶)的延伸速率相比。

在其它各方面，本发明提供编码本文所述的突变型DNA聚合酶的重组核酸，包含该重组核酸的载体，以及用所述载体转化的宿主细胞。在特定的实施方式中，所述载体是表达载体。包含上述表达载体的宿主细胞能够用于本发明的通过在适于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞生产突变型聚合酶的方法。本发明的聚合酶可以包含在反应混合物和/或试剂盒中。重组核酸、宿主细胞、载体、表达载体、反应混合物和试剂盒的实施方式如前文和此处所述。

在另一方面，提供了指导引物延伸的方法。该方法大体上包括在适于引物延伸的条件下将本发明的突变型DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板以及游离核苷酸接触，从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。游离核苷酸可以包括非常规核苷酸诸如核糖核苷酸和/或标记的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一个或更多个核苷酸类似物。在一些变种中，引物延伸方法是用于多核苷酸扩增的方法，包括在适于多核苷酸扩增的条件下将突变型DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板以及游离核苷酸接触。

本发明还提供了用于上述引物延伸方法的试剂盒。大体上，所述试剂盒包括至少一个提供本文所述的突变型DNA聚合酶的容器。在特定的实施方式中，该试剂盒进一步包括提供一种或更多种另外的试剂的一个或更多个另外的容器。例如，在特定的变种中，一个或更多个另外的容器提供游离核苷酸，适于引物延伸的缓冲剂，和/或在引物延伸条件下能够与预定的多核苷酸模板杂交的引物。

进一步提供了包含本发明的聚合酶的反应混合物。所述反应混合物也可以包括模板核酸(DNA和/或RNA)，一种或更多种引物或探针多核苷酸，游离核苷酸(包括例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、标记的核苷酸、非常规核苷酸)，缓冲剂，盐，标记物(例如荧光基团)。

定义

除非有另外的定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有如同本发明所属技术领域的普通技术人员通常了解的含义。尽管仅仅描述了示例性的方法和物质，实质上与本文描述相似的任何方法和原料都可被用于本发明的实践或试验。对本发明来说，下列术语定义如下。

术语“一”，和“该”包括复数对象，除非上下文清楚地指出别的含义。

“氨基酸”指代可以合并为肽、多肽或蛋白质的任何单体单位。如本文所述的，术语“氨基酸”包括下列20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。这20种天然氨基酸的结构见例如Stryer等，BioChemistry，5^th ed.，Freeman and Company(2002)。另外的氨基酸诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够遗传编码(Stadtman(1996)“Selenocysteine，”Annu Rev Biochem.65：83-100 and Ibba等(2002)“Genetic code：introducingpyrrolysine，”Curr Biol.12(13)：R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如侧链和/或主链被修饰)和氨基酸类似物。参见例如Zhang等(2004)“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophaninto proteins in mammalian cells，”ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(24)：8882-8887，Anderson等(2004)“An expanded genetic code with afunctional quadruplet codon”ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(20)：7566-7571，Ikeda等(2003)“Synthesis of a novel histidineanalogue and its efficient incorporation into a protein in vivo，”Protein Eng. Des.Sel.16(9)：699-706，Chin等(2003)“An Expanded Eukaryotic GeneticCode，”Science 301(5635)：964-967，James 等(2001)“Kineticcharacterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizablephenylazophenylalanine residues，”Protein Eng.Des.Sel.14(12)：983-991，Kohrer等(2001)“Import of amber and ochre suppressor tRNAs intomammalian cells：A general approach to site-specific insertion of aminoacid analogues into proteins，”ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(25)：14310-14315，Bacher等(2001)“Selection and Characterization ofEscherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise ToxicTryptophan Analogue，”J.Bacteriol.183(18)：5414-5425，Hamano-Takaku等(2000)“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes theUnnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine，”J.Biol. Chem.275(51)：40324-40328和Budisa 等(2001)“Proteins with{beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores andpharmaceutically active amino acids，”Protein Sci.10(7)：1281-1292。

进一步说明，氨基酸典型地为包括取代的或未被取代的氨基、取代的或未被取代的羧基和一种或更多种侧链或基团，或这些基团的任意一个的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸盐、boronate、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任意组合。其它代表性的氨基酸包括但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂的和/或光可裂的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或更多个毒性部分的氨基酸。

在本发明的DNA聚合酶上下文中的术语“突变体”表示相对于相应的功能性DNA聚合酶包含一个或更多个氨基酸取代的多肽，典型为重组的。

在突变型聚合酶上下文中的术语“未经修饰的形式”在本文中是用来定义本发明的突变型DNA聚合酶的术语：术语“未经修饰的形式”指具有除特定的作为表征突变型聚合酶的一个或更多个氨基酸位点外的突变型聚合酶氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，用(a)其未经修饰的形式和(b)一个或更多个特定氨基酸取代提及的突变型DNA聚合酶表示除特定的氨基酸取代之外，突变型聚合酶在特定的基序中具有与未经修饰的形式相同的另外的氨基酸序列。聚合酶可以包含另外的突变以提供想要的功能性，例如改良的双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的掺入，调整的5′-核酸酶活性，调整的3′-核酸酶(或校正)活性等。据此，在实施本文所述的本发明时，DNA聚合酶未经修饰的形式是预先确定的。DNA聚合酶未经修饰的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已经有意识地修饰过的DNA聚合酶。聚合酶未经修饰的形式优选热稳定DNA聚合酶，例如来自各种嗜热菌的DNA聚合酶及与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本上的序列同一性的功能性变体。上述变体可以包括，例如嵌合DNA聚合酶，诸如美国专利号6,228,628和美国申请公开号2004/0005599描述的嵌合DNA聚合酶。在特定的实施方式中，所述聚合酶未经修饰的形式具有逆转录酶(RT)活性。

术语“热稳定聚合酶”指对热稳定的酶，它是耐热的，当在高温下经过双链核酸变性所需要的时间后，其能保留足够的活性以进行随后的引物延伸反应，并且没有不可逆变性(失活)。核酸变性所需的加热条件是本领域熟知的并在例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中举例说明。如本文所述，热稳定聚合酶适于在温度周期变化的反应诸如聚合酶链式反应(“PCR”)中使用。此处的不可逆变性指永久的和完全的酶活性损失。对于热稳定聚合酶，酶活性指以适当的方式组合核苷酸以形成与模板核酸链互补的引物延伸产品的催化作用。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌，水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，丝状栖热菌，栖热菌种sps17，栖热菌种Z05，Thermuscaldophilus，热坚芽孢杆菌，那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。

如本文使用的，“嵌合”蛋白质指氨基酸序列代表来自至少两个不同的蛋白质氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白质。嵌合蛋白典型不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是从编码该嵌合氨基酸序列的″嵌合″基因表达出来。在特定的实施方式中，例如，本发明突变型DNA聚合酶的未经修饰形式是由来源于栖热菌属菌种DNA聚合酶的氨基端(N-末端)区域和来源于Tma DNA聚合酶的羧基端(C-末端)区域组成的嵌合蛋白。N-末端区域指从N-末端(氨基酸位置1)延伸到内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域指从内部氨基酸延伸到C-末端的区域。

在突变型DNA聚合酶的上下文中，与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“相应”是基于根据核苷酸或氨基酸的位置数的编号惯例并以最大化序列同一性百分比的方式比对序列。因为不是给定的“相应区域”内部的所有位点都需要相同，相应区域内部的非匹配位点可能被认为是“相应位点”。据此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的“与氨基酸位点[X]相应的氨基酸位点”表示其它经过验证的DNA聚合酶和结构同系物和家族中的等效位点的集合。在本发明的典型的实施方式中，氨基酸位点的“相应”根据包含一个或更多个本文中进一步探讨的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的基序的聚合酶区域来确定。

本文中使用的“重组体”指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”表示通常经由内切核酸酶的核酸操作，最初在体外产生的不同于自然中的常规形式的核酸。因此线性形式的分离的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外产生的表达载体都被认为是本发明的重组体。很清楚的是，一旦重组核酸被制造以及重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞体内的细胞机制而不是体外操作；然而，上述核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是本发明的重组体。“重组蛋白质”是使用重组技术，即通过上述的重组核酸的表达制造的蛋白质。重组蛋白质典型依据至少一个或更多个特征而不同于天然存在的蛋白质。

当与另一个核酸序列具有功能性关系时核酸是“可操纵连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它是与编码序列可操纵连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，那么它是与编码序列可操纵连接的。

术语“宿主细胞”指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及细胞培养物中生长的来自高等植物或者动物的单个的细胞。

术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是已经***了一条外源DNA的。所述载体可以是例如来源于质粒的。载体包含在宿主细胞中促进自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其不是在该宿主细胞中天然发现的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外来的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，可以产生载体及其***的DNA的若干拷贝。另外，载体还可以包含容许***的DNA转录为mRNA分子或相反使***的DNA复制为多拷贝RNA的必要元件。某些表达载体还包括***的DNA附近的序列元件，其能增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译成蛋白分子。因此***的DNA编码的许多mRNA和多肽分子能迅速地合成。

术语“核苷酸”除指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体之外，本文中还应当理解为涉及其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其对于使用该核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等效的，除非上下文明确指出不同。

术语“核酸”或“多核苷酸”指聚合体，其可以相应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合体或其类似物。其包括核苷酸诸如RNA和DNA的聚合体，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰)形式，和混合聚合体(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰诸如不带电的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的键(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其它键(例如，Nielsen等(((Science254：1497-1500，1991)描述的肽核酸)，典型地核苷酸单体通过磷酸二酯键连接。核酸可以是或包括，例如，染色体或染色体片段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合体、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不局限于任何特定的长度。除非另外指出，除任何明确指出的序列之外，特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列。

术语“寡核苷酸”指包括至少2个核酸单体单位(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型地包括大约6到大约175个核酸单体单位，更典型地大约8到大约100个核酸单体单位，更典型地大约10到大约50个核酸单体单位(例如大约15，大约20，大约25，大约30，大约35，或更多的核酸单体单位)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，包括该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任意地通过任何合适的方法制备，包括但不限于现有或天然序列的分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或通过例如，Narang等的磷酸三酯法(Meth.Enzymol.68：90-99，1979)，Brown等的磷酸二酯法(Meth.Enzymol.68：109-151，1979)，Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法(Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981)，Matteucci等的三酯法(J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191，1981)，自动合成法，或1984年7月3日授予Caruthers等的名为“PROCESS FORPREPARING POLYNUCLEOTIDES”的美国专利号4,458,066的固相支持法，或本领域技术人员所知的其它方法的方法直接化学合成。

本文中使用的术语“引物”指在起始引物延伸的条件下(例如，在包括在适当的缓冲液中和适当的温度或温度周期(例如在聚合酶链式反应中)下存在所需的三磷酸核苷(在要复制的模板支配下)和聚合酶的条件下)能够作为起始模板指导的核酸合成的位点的多核苷酸。为进一步说明，引物还可以用于其它多种寡核苷酸介导的合成过程，包括作为RNA从头合成和体外转录相关的过程(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物典型是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适宜长度取决于该引物预定的用途，但是典型地从6到40个核苷酸，更典型地从15到35个核苷酸。短的引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须是足够互补的以与模板杂交来发生引物延伸。在特定的实施方式中，术语“引物对”表示一组引物，其包括与扩增的核酸序列的5′末端的互补序列杂交的5′有义引物(有时称为″正向″)以及与扩增的序列的3′末端杂交的3′反义引物(有时称为″反向″)(例如，如果靶序列作为RNA表达或者是RNA)。如果需要，引物可以通过与用光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的标记相结合来标记。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于酶联免疫吸附(ELISA)测定试验)、生物素、或者半抗原和蛋白质，对于其可利用抗血清或单克隆抗体。

当涉及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时，术语“常规的”或“天然的”指描述的多核苷酸中天然存在的(即，对于DNA是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外，在体外DNA合成反应诸如测序中，dITP和7-脱氮-dGTP经常被用来代替dGTP，而7-脱氮-dATP可以用来代替dATP。共同地，这些称为dNTPs。

当涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时，术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。与常规的dNTPs相比，特定的非常规核苷酸在核糖的2′位置修饰。因此，尽管对于RNA天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP，共称rNTPs)，因为这些核苷酸具有在糖2′位的羟基，与之相比dNTPs没有，如本文使用的，作为DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸是非常规的核苷酸。如本文使用的，非常规的核苷酸包括但不限于在核酸测序中用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括但不限于具有2′，3′双脱氧结构的称为双脱氧核苷三磷酸的化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地称为ddNTPs。终止剂化合物的其他例子包括核糖核苷酸的2′-PO₄类似物(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398)。其它非常规的核苷酸包括硫代磷酸dNTPs([[α]-S]dNTPs)、5′-[α]-硼烷(borano)-dNTPs、[α]-膦酸甲酯dNTPs和核糖核苷三磷酸(rNTPs)。非常规的碱基可以用放射性同位素诸如³²P、³³P或³⁵S，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，半抗原标记诸如生物素，或者酶标记诸如链霉亲和素或抗生物素蛋白来标记。荧光标记可以包括带负电荷的染料，例如荧光素家族的染料，或者电中性的染料，例如罗丹明家族的染料，或者带正电荷的染料，例如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。Perkin-Elmer(Boston，MA)、AppliedBiosystems(Foster City，CA)或Invitrogen/Molecular Probes(Eugene，OR)销售各种染料或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、德克萨斯红和TAMRA标记的核苷酸。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，其在GE Healthcare UK Limited(Amersham Place，LittleChalfont，Buckinghamshire，England)有售。

如本文使用的，“序列同一性百分比”通过在比较窗口比较两条最佳比对的序列来确定，其中对于两条序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分与参考序列(不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。百分比是通过确定存在于两条序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位点的数目以得到匹配位点的数目，用比较窗口中的位点总数除匹配位点的数目并用100乘该结果以得到序列同一性百分比来计算。

在两个或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比指的是当在比较窗口或者指定的区域使用下列序列比较算法中的一种或用手工比对并目检测量为最大相应而比较和比对时，相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如在特定区域内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)的两条或更多条序列或子序列。如果序列至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，或者至少55％相同的，那么它们是″基本上相同的″。这些定义也指测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于至少约50核苷酸长度的区域中，或更典型地在100到500或1000或更多核苷酸长度的区域中。

在两个或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“相似性百分比”指的是当在比较窗口或者指定的区域使用下列序列比较算法中的一种或用手工比对并目检测量为最大相应而比较和比对时，具有特定百分比相同的或定义为保守氨基酸取代的相似的氨基酸残基(例如在特定区域内60％相似性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相似的)的两条或多条序列或子序列。如果序列至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，或者至少55％彼此相似的，那么它们彼此是“基本上相似的”。任选地，相似性存在于至少约50氨基酸长度的区域中，或更典型地在至少大约100到500或1000或更多氨基酸长度的区域中。

对于序列比较，通常以一条序列作为参考序列，用测试序列与它比较。当使用序列比较算法时，将试验和参考序列输入电脑，指定子序列坐标(coordinate)，如有必要，还需指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定替换参数。然后以程序参数为基础，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性或相似性百分比。

如本文使用的，“比较窗口”包括涉及选自由20到600组成的组的任一数目连续位点的片段，通常大约50到大约200，更通常大约100到大约150，其中在两条序列最佳比对后序列可以与同样数目连续位点的参考序列比较。用来比较的序列比对方法是本领域熟知的。用来比较的最佳序列比对可以，例如，采用Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482，1970)，用Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)，用Pearson和Lipman的搜索相似性法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)，用这些算法的计算机化执行(例如，theWisconsin Genetics Software Package中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或者用手工比对及目检(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(1995 supplement))。

一个有用的算法的例子是PILEUP。PILEUP使用累进的、成对的比对从一组相关序列建立多重序列比对以显示关联和序列同一性百分比。其同样绘制树或树形图来显示用于比对的簇相互关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的简单化累进比对方法(J.Mol.Evol.35：351-360，1987)。使用的方法与Higgins和Sharp描述的方法(CABIOS 5：151-153，1989)相似。该程序可以比对最多达300条序列，其中每一条的最大长度是5,000个核苷酸或氨基酸。该多重比对程序从成对比对两条最相似的序列开始，产生两条比对序列的簇。然后将该簇与次最相关的序列或比对的序列的簇比对。通过两条单独序列成对比对的简单延伸来比对两簇序列。最终比对是通过一系列累进的、成对的比对来实现的。程序通过指定特定的序列及其序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标和通过指定程序参数来运行。使用PILEUP，使用下列参数将参考序列与其它测试序列相比以确定序列同一性关系百分比：默认缺口权重(3.00)，默认缺口长度权重(0.10)和加权终止缺口。PILEUP可以从GCG序列分析软件包中获得(如，7.0版(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12：387-95，1984)或更晚的)。

适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别由Altschul等(Nuc.Acids Res.25：3389-402，1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法包括：首先通过在查询序列中识别长度W的短字段来识别高分序列对(HSPs)，其在与数据库序列的同样长度字段比对时匹配或满足一定阳性阈值评分T。T被认为是邻近字段评分阈值(上述Altschul等)。这些最初的邻近字段命中作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSPs。字段命中沿着各序列双向延伸，只要累计的比对分数增加。对于核苷酸序列，累计分数使用参数M(匹配残基对的奖分；始终大于0)和N(不匹配残基的罚分；始终小于0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计分数。字段命中在各方向的延伸停止于：累计比对分数从它最大获得值降低数量X时；由于一个或更多个负分残基比对的累积，累计分数达到或低于0时；或者到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3，期望值(E)10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。

BLAST算法也执行两条序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-87，1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P((N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于大约0.2，典型地低于大约0.01，以及更典型地低于大约0.001，那么该核酸被认为是与参考序列相似的。

术语“核酸延伸速率”指的是生物催化剂(例如酶，诸如聚合酶、连接酶等)以模板依赖或非模板依赖方式把一个或更多个核苷酸加到核酸上(例如共价地)来延伸该核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)的速率。相对于DNA聚合酶未经修饰的形式，此处描述的特定的突变型DNA聚合酶相对于这些DNA聚合酶的未修饰形式具有改良的核酸延伸速率，使得在一组给定的反应条件下它们可以以比未经修饰的形式更高的速率延伸引物。

术语“逆转录效率”指的是在给定的逆转录反应中RNA分子逆转录为cDNA的分数。在特定的实施方式中，相对于这些DNA聚合酶未经修饰的形式，本发明的突变型DNA聚合酶具有改良的逆转录效率。也就是说，在一组特定的反应条件下突变型DNA聚合酶比它们的未经修饰的形式逆转录更高分数的RNA模板。

附图简述

图1描述了来自多种嗜热菌的示例性热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域中区域的氨基酸序列比对：嗜热栖热菌(Tth)(SEQ ID NO：4)、Thermus caldophilus(Tca)(SEQ ID NO：5)、栖热菌种Z05(Z05)(SEQ IDNO：6)、水生栖热菌(Taq)(SEQ ID NO：7)、黄栖热菌(Tfl)(SEQ ID NO：8)、丝状栖热菌(Tfi)(SEQ ID NO：9)、栖热菌种sps17(Sps17)(SEQ ID NO：10)、海栖热袍菌(Tma)(SEQ ID NO：11)、那不勒斯栖热袍菌(Tne)(SEQ IDNO：12)、非洲栖热腔菌(Taf)(SEQ ID NO：13)和热坚芽孢杆菌(Bca)(SEQID NO：14)。氨基酸序列比对还包括来自名为CS5(SEQ ID NO：15)和CS6(SEQ ID NO：16)的有代表性的嵌合热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域中的区域。此外，还包括显示在这些示例性序列中的一致氨基酸序列的序列(Cons)(SEQ ID NO：17)。进一步地，显示的多肽区域包括氨基酸基序XXXXRXXXKLXXTYXX(SEQ ID NO：1)、TGRLSSXXPNLQN(SEQ ID NO：2)和XXXXXXXDYSQIELR(SEQ ID NO：3)，其中的可变位点在此处进一步定义。在各聚合酶序列中这些基序用粗体突出显示。适于根据本发明的突变的氨基酸位点用星号(*)指出。比对中的缺口用圆点(.)指出。

图2A给出嵌合热稳定DNA聚合酶CS5的氨基酸序列(SEQ IDNO：18)。

图2B给出编码嵌合热稳定DNA聚合酶CS5的核酸序列(SEQ IDNO：20)。

图3A给出嵌合热稳定DNA聚合酶CS6的氨基酸序列(SEQ IDNO：19)。

图3B给出编码嵌合热稳定DNA聚合酶CS6的核酸序列(SEQ IDNO：21)。

图4是显示G46E L329A E678G(GLE)CS5 DNA聚合酶各种突变体的标准化延伸速率的条形图。y轴代表相对延伸速率，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，I＝I669F，S＝S671F，和E＝E678G)的DNA聚合酶。突变型聚合酶获得的延伸速率值相对于设为1.00的GLE CS5 DNA聚合酶获得的延伸速率值来标准化。

图5是显示G46E L329A E678G(GLE)CS5 DNA聚合酶各种突变体的标准化延伸速率的条形图。y轴代表相对延伸速率，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，I＝I669F，S＝S671F，和E＝E678G)的DNA聚合酶。突变型聚合酶获得的延伸速率值相对于设为1.00的GLE CS5 DNA聚合酶获得的延伸速率值来标准化。

图6是显示Z05DNA聚合酶、ΔZ05DNA(图6中的dZ05)聚合酶(参见1995年10月3日授予Abramson等的名为“MUTATEDTHERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROMTHERMUS SPECIES Z05”的美国专利号5,455,170和1997年10月7日授予Abramson等的名为“DNA ENCODING THERMOSTABLENUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIESZ05”的美国专利号5,674,738)和G46E L329A(GL)CS5 DNA聚合酶各种突变体的标准化延伸速率的条形图。y轴代表相对延伸速率，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，I＝I669F，S＝S671F，和E＝E678G)的DNA聚合酶。突变型聚合酶获得的延伸速率值相对于设为1.00的GLE CS5 DNA聚合酶获得的延伸速率值来标准化。

图7是显示Z05 DNA聚合酶、ΔZ05 DNA(图7中的dZ05)聚合酶和G46E L329A(GL)CS5 DNA聚合酶各种突变体的标准化延伸速率的条形图。y轴代表相对延伸速率，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，I＝I669F，S＝S671F，和E＝E678G)的DNA聚合酶。突变型聚合酶获得的延伸速率值相对于设为1.00的GLE CS5 DNA聚合酶获得的延伸速率值来标准化。

图8是显示在变化的盐(KOAc)浓度下不同DNA聚合酶延伸速率的图表。y轴代表延伸速率(任意单位)，x轴代表KOAc浓度(mM)。图表附带的图例显示图表中相应于每一条迹线的DNA聚合酶。特别地，delta Z05代表ΔZ05 DNA聚合酶，Z05代表Z05 DNA聚合酶，指示的其它酶代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F，和E＝E678G)的突变型CS5 DNA聚合酶。

图9是显示在变化的盐(KOAc)浓度下不同DNA聚合酶延伸速率的图表。y轴代表延伸速率(任意单位)，x轴代表KOAc浓度(mM)。图表附带的图例显示图表中相应于每一条迹线的DNA聚合酶。特别地，指示的其它酶代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F，和E＝E678G)的突变型CS5 DNA聚合酶。

图10是显示在RT-PCRs中各种突变型CS5 DNA聚合酶获得的阈循环(Ct)值的条形图。y轴代表Ct值，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，和S＝S671F)的DNA聚合酶。

图11是显示在具有变化的RT孵育时间的Mg⁺²活化的RT-PCRs中各种突变型CS5 DNA聚合酶获得的阈循环(Ct)值的条形图。y轴代表Ct值，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，和S＝S671F)的DNA聚合酶。

图12是显示在具有变化的RT孵育时间的Mn⁺²活化的RT-PCRs中各种突变型CS5 DNA聚合酶获得的阈循环(Ct)值的条形图。y轴代表Ct值，x轴代表具有特定点突变(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F)的DNA聚合酶。

图13A和B是说明此处描述的某些酶在各种包括核糖核苷酸的条件下产生全长扩增子的能力的琼脂糖凝胶照片。如同照片上标记的，测试的酶是GQDSE、CS6-GQDSE、GLQDSE、GDSE、GLDSE、GLDE、GE(G46ECS5R)以及4∶1混合的GL和GLE(GL CS5/GLE)，其中G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F，和E＝E678G。除CS6-GQDSE指示的酶外所有这些酶都是CS5酶。

图14A是关于图13A和B中描述的酶的delta Cts(y轴)对测试的各种rATP条件(y轴)的图表，而图14B是关于图13A和B描述的酶的rNTP掺入百分率(y轴)对测试的各种rNTP条件(y轴)的图表。

图15A和B是说明此处描述的某些酶在各种包括生物素化的核糖核苷酸的条件下产生全长扩增子的能力的琼脂糖凝胶照片。如同照片上标记的，测试的CS5酶是GQDSE、GDSE、GE(G46E CS5R)以及4∶1混合的GL和GLE(GL/GLE混合(4∶1))，其中G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F，和E＝E678G。

图16A是测试的各种rCTP条件(图例)下关于图15A和B描述的酶(x轴)的delta Cts(y轴)的图表，而图14B是测试的各种生物素标记的rCTP条件(图例)下那些酶(x轴)的delta Cts(y轴)的图表。

图17是显示在利用G46E L329A E678G(GLE)CS5 DNA聚合酶的焦磷酸解活化的聚合作用(PAP)中酶浓度对阈循环(Ct)值的作用的条形图。y轴代表Ct值，x轴代表酶浓度(nM)。图表附带的图例显示相应于图中每一条迹线的模板核酸的拷贝数(没有模板核酸拷贝(notemp)，1e⁴个模板核酸拷贝(1E4/rxn)，1e⁵个模板核酸拷贝(1E5/rxn)，1e⁶个模板核酸拷贝(1E6/rxn))。

图18是显示在利用G46E L329A D640G S671F E678G(GLDSE)CS5DNA聚合酶的焦磷酸解活化的聚合作用(PAP)中酶浓度对阈循环(Ct)值的作用的条形图。y轴代表Ct值，x轴代表酶浓度(nM)。图表附带的图例显示相应于图中每一条迹线的模板核酸的拷贝数(没有模板核酸拷贝(no temp)，1e⁴个模板核酸拷贝(1E4/rxn)，1e⁵个模板核酸拷贝(1E5/rxn)，1e⁶个模板核酸拷贝(1E6/rxn))。

图19是显示栖热菌种Z05 DNA聚合酶各种突变体的标准化延伸速率的条形图。y轴代表相对延伸速率，x轴代表栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)和具有特定点突变(Q＝T541R，D＝D580G，和S＝A610F)的各种Z05 DNA聚合酶。x轴还代表ES112(E683R Z05 DNA聚合酶，参见Smith等于2001年3月30日提交的名为“High temperature reversetranscription using mutant DNA polymerases”的美国专利申请号20020012970)和ES112-D(D580G E683R Z05 DNA聚合酶)。突变型聚合酶获得的延伸速率值相对于设为1.00的Z05 DNA聚合酶获得的延伸速率值来标准化。

图20是显示涉及PAP相关的HIV DNA模板滴定分析的PCR产物检测的凝胶照片。

图21是显示对用于包含封闭的(blocked)或非封闭的(unblocked)引物的扩增的各种突变型K-Ras质粒模板拷贝数观察到的阈循环(C_T)值的图表。

图22是显示对用于包含K-Ras质粒模板的扩增的各种酶及酶浓度观察到的阈循环(C_T)值的图表。

图23是显示HCV RNA的PAP逆转录反应数据的条形图，其中cDNA反应产物使用HCV cDNA特异的定量PCR分析来测定。y轴代表Ct值，x轴代表用于反应的酶单位数。如同指出的，这些反应中使用的酶是Z05 DNA聚合酶(Z05)或者G46E L329A Q601R D640G S671FE678G(GLQDSE)和G46E L329A Q601R D640G S671F(GLQDS)CS5DNA聚合酶的混合物。

图24显示进行双向PAP时产生的BRAF癌基因扩增的PCR增长曲线。x轴显示标准化的积累荧光，y轴显示PAP PCR扩增的循环数。

发明详述

本发明提供在聚合酶结构域有一个或更多个氨基酸相对于功能性的DNA聚合酶突变了的新的突变型DNA聚合酶。本发明的突变型DNA聚合酶是相对于聚合酶未经修饰的形式具有改良的核苷酸掺入速率的活性酶，在特定的实施方式中还具有伴随的逆转录酶活性和/或扩增能力的增加。可在更低的浓度下使用突变型DNA聚合酶，来达到超过亲本酶或与其等效的性能。在特定的实施方式中，此处描述的突变型DNA聚合酶相对于亲本酶具有改良的热稳定性。因此突变型DNA聚合酶对涉及引物延伸以及多核苷酸模板的逆转录或扩增的多种应用是有用的，包括，例如在重组DNA研究和疾病的医疗诊断中的应用。

适于依照本发明的突变的DNA聚合酶未经修饰的形式具有包括下列氨基酸基序的功能性聚合酶结构域：

(a)

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Leu-Xaa-Xaa-Thr-Tyr-Xaa-Asp

(此处也用单字母编码称为

X_a1-X_a2-X_a3-X_a4-R-X_a6-X_a7-X_a8-K-L-X_a11-X_a12-T-Y-X_a15-X_a16(SEQ IDNO：1))；其中

X_a1是Ile(I)或Leu(L)；

X_a2是Gln(Q)或Leu(L)；

X_a3是Gln(Q)、His(H)或Glu(E)；

X_a4是Tyr(Y)、His(H)，或Phe(F)；

X_a6是Glu(E)、Gln(Q)或Lys(K)；

X_a7是Ile(I)、Leu(L)或Tyr(Y)；

X_a8是Gln(Q)、Thr(T)、Met(M)、Gly(G)或Leu(L)；

X_a11是Lys(K)或Gln(Q)；

X_a12是Ser(S)或Asn(N)；

X_a15是Ile(I)或Val(V)；以及

X_a16是Glu(E)或Asp(D)；

(b)Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-Xaa-Xaa-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn

(此处也用单字母编码称为

T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N(SEQ ID NO：2))；其中

X_b7是Ser(S)或Thr(T)；

X_b8是Asp(D)、Glu(E)或Asn(N)；和

(c)Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Asp-Tyr-Ser-Gln-Ile-Glu-Leu-Arg

(此处也用单字母编码称为

X_c1-X_c2-X_c3-X_c4-X_c5-X_c6-X_c7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ ID NO：3)；其中

X_c1是Gly(G)、Asn(N)或Asp(D)；

X_c2是Trp(W)或His(H)；

X_c3是Trp(W)、Ala(A)、Leu(L)或Val(V)；

X_c4是Ile(I)或Leu(L)；

X_c5是Val(V)、Phe(F)或Leu(L)；

X_c6是Ser(S)、Ala(A)、Val(V)或Gly(G)；以及

X_c7是Ala(A)或Leu(L)。

这些基序存在于许多家族A型DNA依赖的DNA聚合酶，尤其是来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶的活性位点的大约100氨基酸的区域。例如，图1显示来自若干种嗜热菌的DNA聚合酶聚合酶结构域的区域的氨基酸序列比对：海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种sps17、栖热菌种Z05、那不勒斯栖热袍菌、非洲栖热腔菌、热坚芽孢杆菌和Thermus caldophilus。图1显示的氨基酸序列比对也包括来自代表性的嵌合热稳定DNA聚合酶聚合酶结构域的区域。如同所示，SEQ ID NOs.1、2和3每一基序都存在于这些聚合酶中间的每一个，显示这些活性位点区域的保守功能。

据此，在一些实施方式中，DNA聚合酶未经修饰的形式是野生型或天然存在的DNA聚合酶，例如，来自上列的任何种的嗜热菌的聚合酶。在一个变种中，未经修饰的聚合酶来自于栖热菌属的种。在本发明的其它实施方式中，未经修饰的聚合酶来自于除了栖热菌属外的嗜热菌种。许多热稳定DNA聚合酶的核酸和氨基酸的完整序列是可获得的。水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)、栖热菌种Z05、栖热菌种sps17、海栖热袍菌(Tma)和非洲栖热腔菌(Taf)聚合酶的序列已经在PCT国际专利公开号WO 92/06200中公布。来自黄栖热菌的DNA聚合酶的序列已经被Akhmetzjanov和Vakhitov公布(Nucleic Acids Research 20：5839，1992)。来自Thermus caldophilus的热稳定DNA聚合酶的序列在EMBL/GenBank登录号U62584发现。来自丝状栖热菌的热稳定DNA聚合酶的序列可以使用例如美国专利号4,889,818提供的方法以及表1提供的序列信息从ATCC保藏号42380中重新获得。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列来自于GeneSeq专利数据库登录号R98144和PCTWO 97/09451。来自热坚芽孢杆菌的热稳定DNA聚合酶的序列由例如Uemori等描述(J BioChem(Tokyo)113(3)：401-410，1993；也参见Swiss-Prot数据库登录号Q04957以及GenBank登录号D12982和BAA02361)。可以如此处描述修饰的DNA聚合酶未经修饰的形式的例子也描述于，例如，2001年5月8日授予Gelfand等的名为“Mutantchimeric DNA polymerase”的美国专利号6,228,628；2002年2月12日授予Gelfand等的名为“Thermostable DNA polymerases incorporatingnucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes”的6,346,379；2006年4月18日授予Ankenbauer等的名为“Thermostableenzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases-forimprovement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro”的7,030,220；2005年4月19日授予Sobek等的名为“Mutant B-type DNApolymerases exhibiting improved performance in PCR”的6,881,559；2004年9月21日授予Markau等的名为“Modified DNA-polymerase fromcarboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reversetranscription and polymerase chain reaction”的6,794,177；2002年10月22日授予Ankenbauer等的名为“Thermostable DNA polymerase fromcarboxydothermus hydrogenoformans”的6,468,775；以及Schoenbrunner等于2003年3月26日提交的名为“Thermostableor thermoactive DNApolymerase molecules with attenuated 3′-5′exonuclease activity”的美国专利申请号20040005599；Smith等于2001年3月30日提交的名为“Hightemperature reverse transcription using mutant DNA polymerases”的20020012970；Ankenbauer等于2005年9月29日提交的名为“Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNApolymerases-for improvement of nucleic acid synthesis and amplification invitro”的20060078928；Sobek等于2002年12月11日提交的名为“Reversibly modified thermostable enzymes for DNA synthesis andamplification in vitro”的20040115639。

已经预先修饰过的功能性DNA聚合酶(例如通过氨基酸取代、***或缺失)只要保留SEQ ID NOs.1、2和3的氨基酸基序，同样适于此处描述的突变。因此，合适的未经修饰的DNA聚合酶也包括野生型或天然存在的聚合酶的功能性变体。上述变体通常与野生型或天然存在的聚合酶具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80％的序列同一性，更典型地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在特定的实施方式中，未经修饰的DNA聚合酶具有逆转录酶(RT)活性和/或掺入核糖核苷酸或其它2′-修饰的核苷酸的能力。

合适的聚合酶还包括，例如，包括来自两个或更多酶的多肽区域的特定的嵌合DNA聚合酶。上述嵌合DNA聚合酶的例子描述于例如美国专利号6,228,628。特别合适的是嵌合CS家族DNA聚合酶，其包括CS5(SEQ ID NO：18)和CS6(SEQ ID NO：19)聚合酶及与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有基本上的序列同一性或相似性的变体(典型地至少80％序列同一性，更典型地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)。CS5和CS6 DNA聚合酶是来源于栖热菌种Z05和海栖热袍菌(((Tma)DNA聚合酶的嵌合酶。它们包括栖热菌酶N-末端的5′-核酸酶结构域和Tma酶的C-末端的3′-5′核酸外切酶以及聚合酶结构域。这些酶具有有效的逆转录酶活性，可以延伸包含核苷酸类似物的引物，并可以掺入α-硫代磷酸dNTPs、dUTP、dITP以及荧光素和花菁染料家族标记的dNTPs。CS5和CS6聚合酶还是有效的Mg²⁺活化的PCR酶。编码CS5和CS6聚合酶的核酸序列分别在图2B和3B中提供。CS5和CS6嵌合聚合酶进一步描述于，例如美国专利申请公开号2004/0005599中。

在一些实施方式中，DNA聚合酶未经修饰的形式是已经预先修饰的聚合酶，典型经过重组，以给予一定的选择优势。上述修饰包括，例如，CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶中的氨基酸取代G46E、L329A和/或E678G，或其它聚合酶中的相应突变。据此，在特定的变种中，DNA聚合酶未经修饰的形式是下列的一种(除了指定的取代外各自都具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的氨基酸序列)：G46E；G46E L329A；G46E E678G；或G46E L329A E678G。E678G取代，例如，容许核糖核苷酸及其他2′修饰的核苷酸的掺入，但是该突变看来似乎还导致延伸已经引发的模板的能力的削弱。在特定的实施方式中，提高突变型聚合酶延伸速率的本发明突变改善了E678G突变的这个特殊的性质。

相对于未经修饰的聚合酶，本发明的突变型DNA聚合酶在活性位点包括一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方式中，氨基酸取代是在下列氨基酸位点的至少一个：

SEQ ID NO：1规定的基序的位点X_a8；

SEQ ID NO：2规定的基序的位点X_b8；

SEQ ID NO：3规定的基序的位点X_c4；和

SEQ ID NO：3规定的基序的位点X_c6。

在这些位点的一个或更多个氨基酸取代提供了改良的核苷酸掺入活性，得到相对于未经修饰的聚合酶有改良的(更快的)核酸延伸速率的突变型DNA聚合酶。此外，在一个或更多个这些位点的氨基酸取代提供了相对于未经修饰的聚合酶增加的3′-5′核酸外切酶(校正)活性。并不局限于任何特定的理论，本发明人相信本发明的突变型聚合酶的改良的核酸延伸速率是与模板更紧密结合的结果，即更少地从模板频繁解离，导致更高的“持续合成能力”的酶。这些性质容许在例如引物延伸反应中，相对于涉及未经修饰的DNA聚合酶的反应，使用更低浓度的突变型聚合酶。因此，可以想象地，在足够高的酶浓度下，未经修饰的聚合酶(即缺乏本发明主题的特定突变)的延伸速率可以接近突变型酶的延伸速率。在高离子强度下突变型聚合酶的表现看来似乎也大大优于未经修饰的形式。尽管如此，在低离子强度下，足够高酶浓度的未经修饰的聚合酶的性能可能接近突变型聚合酶的性能。

由于DNA聚合酶未经修饰的形式是单一的，对于每一突变型聚合酶，相应于X_a8、X_b8、X_c4和X_c6中每一个的氨基酸位点典型是不同的。氨基酸和核酸序列比对程序可容易地获得(参见，例如上文提及的那些)，和在给出此处鉴定的特定基序的情况下，用来帮助依照本发明的修饰的确切氨基酸(和相应的密码子)的鉴定。代表性的嵌合热稳定DNA聚合酶和来自示例性的嗜热菌物种的热稳定DNA聚合酶的相应于X_a8、X_b8、X_c4和X_c6中每一个的位点显示于表1。

表1.在示例性的热稳定聚合酶中相应于基序位点X_a8、X_b8、X_c4和X_c6的氨基酸位点。

在一些实施方式中，氨基酸取代是单一的氨基酸取代。突变型聚合酶可以，例如，分别地包括在位点X_a8、X_b8、X_c4或X_c6的任何一个氨基酸取代。可选择地，突变型聚合酶包括在这些位点的2、3或所有4个取代的各种组合的任何一种。例如，在一个实施方式中，本发明的突变型DNA聚合酶包括位点X_b8和X_c6的每一个氨基酸取代。典型地，在位点X_a8、X_b8、X_c4或X_c6的氨基酸用不相应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3各自规定的基序的氨基酸取代。因此，典型地，在位点X_a8的氨基酸如果被取代那么不是Q、T、M、G或L；在位点X_b8的氨基酸如果被取代那么不是D、E或N；在位点X_c4的氨基酸如果被取代那么不是I或L；和/或在位点X_c6的氨基酸如果被取代那么不是S、A、V或G。在特定的实施方式中，氨基酸取代包括在位点X_a8的精氨酸(R)，在位点X_b8的甘氨酸(G)，在位点X_c4的苯丙氨酸(F)，和/或在位点X_c6的苯丙氨酸(F)。在一个或更多个鉴定的位点的其它合适的氨基酸取代可以使用，例如已知的定点诱变的方法和在此处进一步描述或此外为本领域技术人员所知的试验中引物延伸性能的测定来确定。

如同先前讨论的，在一些实施方式中，本发明的突变型DNA聚合酶源自于CS5 DNA聚合酶(SEQ ID NO：18)，CS6 DNA聚合酶(SEQ IDNO：19)，或那些聚合酶的变体(例如，G46E；G46E L329A；G46E E678G；G46E L329A E678G等)。如同上面所提及的，在CS5 DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶中，位点X_a8相应于在601位的谷氨酰胺(Q)；位点X_b8相应于在640位的天冬氨酸(D)；位点X_c4相应于在669位的异亮氨酸(I)；而位点X_c6相应于在671位的丝氨酸(S)。因此在本发明的特定变种中，相对于CS5 DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶，突变型聚合酶在S671、D640、Q601和/或I669包括至少一个氨基酸取代。示例性的CS5 DNA聚合酶和CS6 DNA聚合酶突变体包括含有氨基酸取代S671F、D640G、Q601R和/或I669F的突变体。在一些实施方式中，突变型CS5聚合酶或突变型CS6聚合酶包括，例如，在D640和S671两处的氨基酸取代(例如D640G和S671F)。其它示例性的CS5 DNA聚合酶和CS6 DNA聚合酶突变体包括下列(除指定的取代外各自具有SEQID NO：18或SEQ ID NO：19的氨基酸序列)：

G46E S671F；

G46E D640G；

G46E Q601R；

G46E I669F；

G46E D640G S671F；

G46E L329A S671F；

G46E L329A D640G；

G46E L329A Q601R；

G46E L329A I669F；

G46E L329A D640G S671F；

G46E S671F E678G；

G46E D640G E678G；

G46E Q601R E678G；

G46E I669F E678G；

G46E D640G S671F E678G；

G46E Q601R D640G S671F E678G；

G46E Q601R D640G S671F I669F E678G；

G46E L329A S671F E678G；

G46E L329A D640G E678G；

G46E L329A Q601R E678G；

G46E L329A I669F E678G；

G46E L329A D640G S671F E678G；和

G46E L329A Q601R D640G S671F E678G.

除此处描述的SEQ ID NOs 1、2和/或3的基序的突变之外，本发明的突变型DNA聚合酶还可以包括其它非取代的修饰。上述修饰可以包括，例如，本领域已知的共价修饰以给予包括引物延伸的应用中的另外的优点。例如，在特定的实施方式中，突变型DNA聚合酶进一步包括热可逆的共价修饰。在这些实施方式中，将修饰物基团共价地附着到蛋白质，导致酶活性的全部或几乎全部损失。修饰物基团是经过选择的，以便经过高温孵育逆转该修饰。包括上述热可逆修饰的DNA聚合酶特别适合于热起动的应用，例如，各种热起动的PCR技术。适于依照本发明的突变型DNA聚合酶应用的热可逆修饰物试剂描述于，例如，Birch等的美国专利号5,773,258。示例性的修饰包括，例如，通过赖氨酸残基的ε-氨基的化学修饰的赖氨酸残基可逆封闭(参见上文的Birch等)。在特定的变种中，热可逆共价修饰包括如上文的Birch等描述的二羧酸酐共价附着到赖氨酸残基的ε-氨基。

例如，包含热可逆共价修饰的特别合适的突变型聚合酶由热稳定酶和具有如下列式I规定的通式的二羧酸酐的混合物在碱性pH和低于约25℃的温度下进行的反应产生：

其中R₁和R₂是氢或有机基团，它们可以连在一起；或具有下列式II：

其中R₁和R₂是有机基团，它们可以连在一起，并且氢是顺式的，基本上如Birch等所描述的。在包含热可逆共价修饰的特定的实施方式中，未经修饰形式的聚合酶是G64E CS5 DNA聚合酶。

本发明的突变型DNA聚合酶可以通过突变编码相应的未经修饰的聚合酶(例如，野生型聚合酶或者本发明的突变型聚合酶来源自的相应变体)的DNA序列来构建，例如通过使用通常称为定点诱变的技术。编码未经修饰形式的聚合酶的核酸分子可以通过本领域普通技术人员熟知的各种聚合酶链式反应(PCR)技术来突变。(参见，例如，PCRStrategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand，and J.J.Sninsky eds.，1995，Academic Press，San Diego，CA)第14章；PCR ProtoCols：A Guide toMethods and Applications(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，and T.J.White eds.，Academic Press，NY，1990)。

作为非限制性实例，来自Clontech的转化位点定点诱变试剂盒使用的双引物***可以用来将定点突变引入编码聚合酶未经修饰的形式的多核苷酸。***中的靶质粒变性之后，两条引物同时退火到质粒；引物中的一条包含需要的定点突变，另一条包含在该质粒中引起限制性位点消除的另一个位点的突变。接着进行第二条链的合成，紧密连接这两个突变，然后将产生的质粒转化入大肠杆菌mutS菌株。质粒DNA从转化的细菌中分离，用相关的限制酶限制性酶切(从而线性化未突变的质粒)，然后重新转化入大肠杆菌。该***容许直接在表达质粒上产生突变，而不必亚克隆或者产生单链的噬粒。两个突变的紧密连接和随后的未突变质粒的线性化导致高的突变效率并容许最少的筛选。在初始限制性位点引物的合成之后，对每一个突变位点该方法只需要使用一种新的引物类型。不是分别准备各位点的突变体，可以合成一组“设计的简并”寡核苷酸引物，用于同时在给定的位点引入所有需要的突变。转化体可以通过对诱变处理区域的质粒DNA测序来筛选以鉴定并分类突变体克隆。每条突变型DNA被限制性酶切并用电泳分析，例如，在突变检测增强凝胶(Mallinckrodt Baker，Inc.，Phillipsburg，NJ)上进行以证实在该序列上没有别的改变存在(通过与未诱变处理的对照进行带移比较)。或者可以对整个DNA区域测序以证实在靶区域之外没有另外的突变事件发生。

在pET(或者其它)过表达载体上验证的突变型双链体可以用于转化大肠杆菌，例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS，来达到突变型蛋白质的高水平生产，并用标准规程来纯化。FAB-MS作图的方法，例如，可用于快速检查突变体表达的保真度。该技术提供遍及整个蛋白质的片段的测序并提供测序任务中必要的置信度。在该类型的作图实验中，蛋白质用蛋白酶消化(选择将取决于要修饰的特定区域，因为该片段是主要关心的而剩余的图谱应该与未诱变处理蛋白质的图谱一致)。切割片断组通过，例如微内径HPLC(反相或离子交换，同样取决于要修饰的特定区域)分级分离以提供在各部分的若干肽，这些肽的分子量用标准方法诸如FAB-MS测定。然后将各片段测定的质量与预测序列消化得到的期望的肽的分子量比较，并快速确定测序的正确性。因为进行蛋白质修饰的诱变是定点的，如果MS数据与预测相符，改变的肽的测序不是必要的。如有必要验证变化的残基，CAD-串联MS/MS可以用于所讨论的混合物的肽的测序，或者靶肽可以根据修饰位置被纯化来消减Edman降解或羧肽酶Y消化。

具有一个以上氨基酸取代的突变型DNA聚合酶可以用多种方式产生。在氨基酸密集地位于多肽链上情况下(如同SEQ ID NO：3规定的基序的氨基酸Xc4和Xc6)，它们可以使用编码所有需要的氨基酸取代的一条寡核苷酸来同时突变。然而如果氨基酸彼此定位隔开一定距离(例如被10个以上氨基酸分开)，则产生编码所有需要的变化的单一寡核苷酸更困难。作为替代，可以用两种可选方法中的一种。在第一种方法中，对每个要取代的氨基酸产生分离的寡核苷酸。然后将寡核苷酸同时退火到单链模板DNA上，而从模板合成的DNA第二条链将编码所有需要的氨基酸取代。一个可选方法涉及两个或更多循环的诱变以产生需要的突变体。第一个循环如同单突变体描述的那样：编码未经修饰的聚合酶的DNA用作为模板，将编码第一个需要的氨基酸取代的寡核苷酸退火到该模板上，然后产生异源双链DNA分子。第二个循环的诱变利用第一个循环的诱变产生的突变DNA作为模板。因此，该模板已经包含一个或更多个突变。然后将编码另外的需要的氨基酸取代的寡核苷酸退火到该模板，于是产生的DNA链现在编码来自第一个和第二个循环的诱变两者的突变。产生的DNA能够在第三个循环的诱变中用作为模板，等等。或者可以利用Seyfang和Jin的多位点诱变法(Anal.BioChem.324：285-291.2004)。

相应地，也提供编码本发明的任何突变型DNA聚合酶的重组核酸。使用本发明的编码突变型DNA聚合酶的核酸可以产生各种载体。包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体可被用于实施本发明。通常，表达载体包括与编码突变型DNA聚合酶的核酸可操纵连接的转录和翻译调控核酸区域。术语“控制序列”指的是在特定的宿主生物体中为可操纵连接的编码序列的表达所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵基因序列，和核糖体结合位点。此外，载体可以包含正反向调控元件(PositiveRetroregulatory Element，PRE)以提高转录的mRNA的半衰期(参见Gelfand等的美国专利号4,666,848)。转录和翻译调控核酸区域通常适合于用来表达聚合酶的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的许多合适的表达载体和合适的调节序列。大体上，转录和翻译调节序列可以包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活序列。在典型的实施方式中，调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体典型地也包括含有若干用于外源DNA***的限制性位点的多接头区域。在特定的实施方式中，“融合标志”用于帮助纯化和随后标签/标志序列的去除(如果需要的话)，例如“组氨酸标签(His-Tag)”。然而，当从嗜温宿主(例如大肠杆菌)中纯化热激活和/或热稳定蛋白质时这些通常是不必要的，其可使用“热步骤(heat-step)”。包括编码复制序列，调节序列，表型选择基因，和所关心的突变型聚合酶的DNA的合适的载体的构建使用标准重组DNA程序制备。分离的质粒、病毒载体和DNA片段的以特定的次序切割、裁剪和连接到一起以产生需要的载体，其是本领域所熟知的(参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，NY，2nd ed.1989))。

在特定的实施方式中，表达载体包括选择性标记基因以容许转化的宿主细胞的选择。选择基因是本领域所熟知的，其随使用的宿主细胞而变。合适的选择基因可以包括，例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，其使以这些载体转化的细胞能够在这些抗生素存在的情况下生长。

在本发明的一方面，编码突变型DNA聚合酶的核酸以单独或与载体结合的形式被引入细胞。此处“引入”或语法上的等价物表示核酸以一种适于随后的核酸整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入的方法主要由靶细胞类型支配。示例性的方法包括CaPO₄沉淀，脂质体融合，电穿孔，病毒感染等。

原核生物通常用作本发明最初的克隆步骤的宿主细胞。它们对于大量DNA的迅速生产，用作为定点诱变模板的单链DNA的生产，同时筛选许多突变体和产生的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCC No.31，446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC No.27，325)、大肠杆菌K12菌株DG116(ATCC No.53，606)、大肠杆菌X1776(ATCC No.31，537)和大肠杆菌B；然而大肠杆菌的诸如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539的许多其它菌株，以及许多其它种和属的原核生物包括诸如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的杆菌、诸如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)的其它肠杆菌科和各种假单胞菌属(Pseudomonas species)的菌种全部都能用作为宿主。原核宿主细胞或其它具有刚性细胞壁的宿主细胞典型使用如上文的Sambrook等在1.82节描述的氯化钙方法转化。或者可采用电穿孔法转化这些细胞。原核生物转化技术阐述于，例如，Dower，in Genetic Engineering，Principles andMethods 12：275-296(Plenum Publishing Corp.，1990)；Hanahan等，Meth.Enzymol.，204：63，1991。典型用于大肠杆菌转化的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCI18、pUC119和Bluescript M13，它们所有都描述于上文的Sambrook等的1.12-1.20部分。然而，许多其它合适的载体也是可利用的。

本发明突变型DNA聚合酶典型在适合诱导或引起突变型DNA聚合酶表达的条件下由培养用包含编码突变型DNA聚合酶的核酸的表达载体转化的宿主细胞产生。在适于蛋白质表达的条件下培养转化的宿主细胞的方法是本领域所熟知的(参见，例如，上文的Sambrook等)。用于从包含λpL启动子的质粒载体生产突变型聚合酶的合适的宿主细胞包括大肠杆菌菌株DG116(ATCC No.53606)(参见美国专利号5,079,352和Lawyer，F.C.等，PCR Methods and Applications 2：275-87，1993)。继表达之后，可以收获和分离突变型聚合酶。纯化热稳定DNA聚合酶的方法描述于，例如，上文的Lawyer等。

纯化后，突变型DNA聚合酶延伸已经引发的模板的能力可以在用于测量核苷酸掺入的任何各种已知的试验中测试。例如，在有已经引发的模板分子(例如M13 DNA等)、合适的缓冲液、整套dNTPs(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)和金属离子的情况下，DNA聚合酶将延伸引物，把单链DNA(ssDNA)转变为双链DNA(dsDNA)。转变可以通过，例如添加诸如SYBR Green I的结合dsDNA的染料来检测和定量。使用动态热循环仪(参见，Watson，等Anal.BioChem.329：58-67，2004，也可以从例如Applied Biosystems、Stratagene和BioRad获得)，可以获得反应板的数字影像(例如，以10-30秒的间隔)，从而容许后续反应的改进。检测的荧光数值可以容易地转变为延伸速率。使用上述常规试验，可以测定突变体相对于聚合酶未经修饰的形式的延伸速率。

本发明的突变型DNA聚合酶可以用于其中上述酶活性是必要或需要的任何目的。相应地，在本发明的另一个方面，提供了使用突变型聚合酶的引物延伸方法。适于引物延伸的条件是本领域已知的。(参见，例如，上文的Sambrook等。也参见Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology(4th ed.，John Wiley&Sons 1999))。通常，把引物退火，即杂交到靶核酸以形成引物-模板复合物。在合适的环境中将引物-模板复合物同突变型DNA聚合酶及游离核苷酸接触，容许一个或更多个核苷酸附加到引物的3′-末端，从而产生与靶核酸互补的延伸的引物。引物可以包括，例如，一个或更多个核苷酸类似物。此外，游离核苷酸可以是常规核苷酸、非常规核苷酸(例如核糖核苷酸或标记的核苷酸)或其混合物。在一些变种中，引物延伸反应包括靶核酸的扩增。适于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件也是本领域已知的(例如PCR扩增方法)。(参见，例如，上文的Sambrook等；上文的Ausubel等；PCR Applications：ProtoCols for Functional Genomics(Innis等eds.，Academic Press 1999))。在其它非互斥的实施方式中，引物延伸反应包括RNA模板的逆转录(例如RT-PCR)。提供改良的延伸速率的本突变型聚合酶的使用容许，例如，以相对短的孵育时间，降低的酶浓度和/或增加的成品收率实施上述引物延伸反应的能力。

在其它实施方式中，突变型聚合酶用于在DNA测序、DNA标记或引物延伸产物标记的背景下的引物延伸。例如，用Sanger双脱氧核苷酸法(Sanger等，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463，1977)的DNA测序被本发明改进，因为聚合酶能够掺入非常规的链终止核苷酸。基础的Sanger等的方法的发展提供了新的载体(Yanisch-Perron等，Gene33：103-119，1985)和碱基类似物(Mills等，ProC.Natl.Acad.Sci.USA76：2232-2235，1979；和Barr等，Biotechniques 4：428-432，1986)。一般来说，DNA测序需要在有链终止碱基类似物的情况下的模板依赖的引物延伸，产生随后按大小分离的部分片段的分布。基础的双脱氧测序程序包括(i)将任选地被标记的寡核苷酸引物退火到模板；(ii)在4个分离的反应中用DNA聚合酶延伸引物，各反应包含未标记的dNTPs和限制数量的诸如ddNTP的任选地被标记的链终止剂的混合物；和(iii)在高分辨率的变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶上分离4组反应产物。反应产物可以通过放射自显影法或通过荧光检测在凝胶上检测，取决于使用的标记，然后可以检查影像以推断核苷酸序列。这些方法利用诸如大肠杆菌Pol I的Klenow片段或修饰的T7 DNA聚合酶的DNA聚合酶。

热稳定聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的可用性，导致了改良的用热稳定DNA聚合酶的测序方法(参见Innis等，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 85：9436，1988)及称为“循环测序”的其变型方法(Murray，Nuc AcidsRes.17：8889，1989)。相应地本发明的突变型热稳定聚合酶可被用于所述方法。作为基础的双脱氧法测序的替代，循环测序是在有链终止剂的情况下互补于模板序列的靶序列的线性的、不对称的扩增。单个循环产生所有可能长度的延伸产物的家族。继延伸反应产物从DNA模板变性之后，多循环的引物退火和引物延伸在诸如ddNTPs的终止剂的存在下发生。循环测序只需要比常规的链终止测序更少的模板DNA。热稳定DNA聚合酶在循环测序中具有若干优势；它们耐受引物与核酸靶的特定杂交需要的严酷的退火温度以及耐受多循环的发生在每个循环的高温变性，例如90-95℃。为此，DNA聚合酶及其衍生物和后裔，例如AmpliTaq CS DNA聚合酶和AmpliTaq FS DNA聚合酶已经包含在诸如Perkin-Elmer(Norwalk，CT)和Applied Biosystems(FosterCity，CA)的公司商业化的Taq循环测序试剂盒中。

链终止测序法的变种包括染料-引物测序和染料-终止剂测序。在染料-引物测序中，ddNTP终止剂是未标记的，而标记的引物用来检测延伸产物(Smith等，Nature 32：674-679，1986)。在染料-终止剂DNA测序中，DNA聚合酶用于在引物DNA的末尾上掺入dNTPs和荧光标记的ddNTPs(Lee等，Nuc.Acids.Res.20：2471，1992)。该过程提供了不必合成染料标记的引物的优势。此外，染料-终止剂反应在全部4个反应可以在相同管中进行这一点上是更方便的。

染料-引物和染料-终止剂法两者都可以用Applied Biosystems(FosterCity，CA)生产的自动测序仪(美国专利号5,171,534)自动操作。当使用该仪器时，完成的测序反应混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶或装在该仪器上的毛细管上分级分离。荧光产物用仪器底部的激光检测，因为它们根据大小电泳穿越凝胶。

两种荧光染料通常用来标记用于染料-终止剂测序的终止剂--带负电荷的和两性离子的荧光染料。带负电荷的荧光染料包括荧光素和BODIPY家族的荧光染料。氟硼荧染料(BODIPY dyes，4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene)描述于国际专利公布WO 97/00967。两性离子荧光染料的包括罗丹明家族的那些。市场上可买到的循环测序试剂盒使用罗丹明衍生物标记的终止剂。然而，罗丹明标记的终止剂是相当昂贵的并且产物在上样到凝胶上之前必须从未掺入的染料-ddNTPs中分离，因为它们与测序产物共同迁移。罗丹明染料家族终止剂似乎使富含GC的区域的发夹结构稳定，导致产物反常迁移。这需要使用dITP，其使二级结构松散并且还影响终止剂掺入的效率。

相反，荧光素标记的终止剂在凝胶上样前除去了分离步骤，因为它们具有更大的净负电荷并比测序产物迁移得更快。此外，荧光素标记的测序产物比罗丹明标记的测序产物具有更好的电泳迁移。尽管野生型Taq DNA聚合酶不能有效地掺入荧光素家族染料标记的终止剂，现在可以通过利用如美国专利申请公开号2002/0142333描述的修饰的酶有效地完成。相应地，如US2002/0142333描述的修饰可被用于本发明的背景以产生具有改良的引物延伸速率的荧光素家族染料掺入的热稳定聚合酶。例如，在特定的实施方式中，按照本发明的未经修饰的DNA聚合酶是如US2002/0142333描述的修饰的热稳定聚合酶并具有SEQ IDNOs.1、2和3规定的基序。

在其中能使用本发明的突变型DNA聚合酶的其它示例性的核酸测序方式包括涉及包括核糖核苷酸的2′-PO₄类似物的终止剂化合物的那些(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398，以及Bodepudi等于2004年6月29日提交的名为″SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OFNUCLEIC ACIDS COMPRISING 2′-TERMINATOR NUCLEOSIDES″的国际申请号WO2005/026184和Gelfand等于2004年6月29日提交的名为″2′-TERMINATOR RELATED PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATEDPOLYMERIZATION″的国际申请号WO2005/005667)。此处描述的突变型DNA聚合酶通常，例如，通过降低循环的延伸反应需要的时间和/或通过降低用于达到满意的性能的酶的数量或浓度来改善这些测序法。

在本发明的另一个方面，提供用于此处描述的引物延伸方法的试剂盒。典型地，试剂盒被划区以便于使用并包含至少一个提供根据本发明的突变型DNA聚合酶的容器。还可以包括一个或更多个提供另外的试剂的另外的容器。上述另外的容器可以包括用于根据上面描述的方法的引物延伸程序的为熟练技术人员所知的任何试剂或其它元件，包括用于，例如，核酸扩增程序(例如PCR、RT-PCR)，DNA测序程序或DNA标记程序的试剂。例如，在特定的实施方式中，试剂盒进一步包括提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5′有义引物，或包括5′有义引物和相应的3′反义引物的引物对。在其它非互斥的变种中，试剂盒包括一个或更多个提供游离核苷酸(常规的和/或非常规的)的容器。在特定的实施方式中，试剂盒包括α-硫代磷酸(α-phophorothioate)dNTPs、dUTP、dITP，和/或标记的dNTPs，例如荧光素或花菁染料家族dNTPs。在其它非互斥的实施方式中，试剂盒包括一个或更多个提供适于引物延伸反应的缓冲剂的容器。

实施例

应当了解，此处描述的实施例和实施方式只是用于说明性目的并且不意味着限制请求保护的发明的范围。同样应当理解的是，基于此处描述的实施例和实施方式的各种修饰或变化将被启发给本领域技术人员，并包括在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围内。

实施例I：具有改良的酶活性的突变型DNA聚合酶的识别和特征鉴定

识别了提供如改良的在有游离核苷酸的情况下延伸引物DNA的能力的CS家族聚合酶中的突变。简单地说，该筛选程序中的步骤包括文库生成，突变型酶的表达和部分纯化，需要的性质的酶的筛选，DNA测序，克隆纯化，和进一步的选择的候选突变体的特性鉴定，以及来自选择的突变体的突变组合的产生、纯化和特性鉴定。这些步骤中的每一个都进一步描述于下文。

通过该方法识别的突变包括单独或以不同组合的S671F、D640G、Q601R和I669F。这些突变位于若干CS家族聚合酶，包括G46E CS5、G46E L329A CS5、G46E E678G CS5和G46E L329A E678G CS5。这些突变型聚合酶中的一些列于表2。其它示例性的已经获得的突变型聚合酶包括CS6 G46E Q601R D640G S671F E678G DNA聚合酶和某些栖热菌种Z05 DNA聚合酶突变体。产生的突变型聚合酶通过在一系列动态热循环(KTC)实验中分析它们的性能来鉴定。

表2.示例性的CS5突变型DNA聚合酶

G46E D640G	G46E S671F E678G
		G46E S671F	G46E D640G S671F E678G
G46E Q601R D640G	G46E Q601R D640G S671F E678G
		G46E D640G S671F	G46E L329A Q601R E678G
G46E Q601R D640G S671F	G46E L329A D640G E678G
		G46E L329A D640G	G46E L329A S671F E678G
G46E L329A Q601R D640G S671F	G46E L329A Q601R S671F E678G
		G46E L329A S671F	G46E L329A D640G S671F E678G
G46E L329A Q601R D640G	G46E L329A Q601R D640G S671F E678G
		G46E L329A D640G S671F	G46E L329A D640G I669F S671F E678G
L329A D640G	L329A Q601R E678G
		L329A D640G S671F	L329A S671F E678G
L329A Q601R D640G S671F	S671F
		L329A S671F	D640G S671F
D640G	Q601R D640G S671F

经识别的突变S671F、D640G、Q601R和I669F导致如改良的延伸已经引发的模板的能力。在E678G突变的特定背景中，其容许核糖核苷酸及其他2′-修饰的核苷酸的掺入，但是其也导致延伸已经引发的模板的能力的削弱，S671F、D640G、Q601R和I669F突变改善该削弱的引物延伸能力的性质。识别的突变，尤其是单独的S671F和S671F加上D640G，当位于G46E CS5和G46E L329A CS5 DNA聚合酶中时也显示改良的逆转录效率。本发明的突变型DNA聚合酶的其它性质进一步描述于下。

克隆文库生成：使编码CS5 E678G DNA聚合酶的聚合酶结构域的核酸在包含该核酸序列的质粒的Bgl II和Hind III限制性位点之间经受易错(诱变)PCR。使用从1.8-3.5mM的范围的Mg⁺²浓度进行PCR，以便产生具有相应范围突变率的文库。缓冲液条件是：50mM N-二[羟乙基]甘氨酸pH 8.2，115mM KOAc，8％w/v甘油，0.2mM每种dNTPs和0.2X SYBR Green I。以0.15U/μl使用GeneAmp AccuRT热启动PCR酶。以每50μl反应体积5×10⁵拷贝的线性化CS5 E678G质粒DNA起始，进行30循环的扩增，使用60℃的退火温度15秒，72℃的延伸温度45秒，以及95℃的变性温度15秒。

产生的扩增子经过Qiaquick旋转柱(Qiagen，Inc.Valencia，CA，USA)纯化，用Bgl II和Hind III切割，然后重新纯化。载体质粒，在BglII和HindIII位点之间的聚合酶结构域携带大段缺失的G46E L329ACS5修饰，通过用相同的两种限制酶切割并用小牛肠磷酸酶(CIP)处理来制备。切开的载体和突变的***片段以不同的比率混合并用T4连接酶在15℃处理整夜。纯化连接产物并用电穿孔法将其转化入大肠杆菌宿主菌株。

将表达培养物的等分样品覆盖在氨苄青霉素选择培养基上以便测定在各转化中单个转化体的数目。在有甘油作为冷冻保护剂的情况下，将各诱变率下具有最多单个转化体的转化存储于-70到-80℃。

然后把各文库涂布在大号氨苄青霉素选择性琼脂平板上。用自动菌落挑选机(QPix2，Genetix Ltd)把单菌落转入包括含氨苄青霉素和10％w/v甘油的2X Luria肉汤的384孔板中。这些平板于30℃孵育整夜，让培养物生长，然后存储于-70到-80℃。加到2X Luria肉汤中的甘油量足够低以容许培养物生长，然而足够高以提供冷冻保护。用这种方法制备了用于随后使用的若干诱变(Mg⁺²)水平下的数千个菌落。

提取物文库制备部分1——发酵：从上述克隆文库制备适于筛选目的的部分纯化提取物的相应文库。该程序的第一步是制备各克隆的小规模表达培养物。这些培养物以96孔形式生长；因此每块384孔文库平板有4块表达培养平板。从克隆文库平板的每个孔转移1μl到包含150μl培养基A(参见下面的表3)的96孔种子平板的一个孔。种子平板在iEMS平板孵育器/振荡器(ThermoElectron)中于30℃下在1150rpm振荡整夜。然后这些种子培养物被用于接种相同的培养基，这次在大号96孔板(Nunc#267334)上接种10μl入300μl培养基A中。这些平板于37℃孵育整夜。表达质粒包含转录调控元件，其容许在37℃表达而不能在30℃表达。整夜孵育后，培养物典型地以总细胞蛋白质的1-10％表达克隆蛋白质。通过离心从这些培养物中收获细胞。这些细胞被冻存(-20℃)或如下所述立即处理。

表3.培养基A(使用前过滤灭菌)

成分	浓度
		MgSO₄.7H₂O	0.2g/L
柠檬酸.H₂O	2g/L
		K₂HPO₄	10g/L
NaNH₄PO₄.4H₂O	3.5g/L
		MgSO₄	2mM
酪蛋白氨基酸	2.5g/L
		葡萄糖	2g/L
硫胺素.HCl	10mg/L
		氨苄青霉素	100mg/L

提取物文库制备部分2——提取：来自发酵步骤的细胞团在30μl裂解缓冲液(下表4)中重悬浮并转入384孔热循环仪平板。注意本缓冲液包含溶菌酶以帮助细胞裂解，和两种核酸酶以从提取物中除去RNA和DNA。使平板经受3个循环的冷冻-解冻(-70℃冷冻，37℃解冻，每一步骤不少于15分钟)以裂解细胞。添加硫酸铵(5μl的0.75M溶液)并在75℃孵育平板15分钟以便沉淀和失活污染蛋白质，包括外源添加的核酸酶。平板于3000×g离心15分钟然后把上清液转入新的384孔热循环仪平板。这些提取物平板于-20℃冻存以用于随后的筛选。每孔包含大约0.5-3μM的突变型文库聚合酶。

表4.裂解缓冲液

成分	浓度或百分比
		Tris pH 8.0	20mM
EDTA	1mM
		MgCl₂	5mM
TLCK	1mM
		亮抑酶肽	1μg/ml
PefabloC	0.5mg/ml
		Tween 20	0.5％v/v
溶菌酶(粉末)	2mg/ml
		RNase	0.025mg/ml
DNase I	0.075单位/μl

为改良的延伸速率筛选提取物文库：M13mp18单链DNA(M13；GenBank登录号X02513)，用具有如下序列的寡核苷酸引发：5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3’(SEQ ID NO：72)

作为延伸试验筛选的模板分子。把0.5-1.0μl提取物添加到384孔PCR平板上的10-20μl包含0.5-1nM已经引发的M13模板的反应母液中。已经引发的模板的延伸用CCD照相机在改进的动态热循环仪中每10-30秒检测(见Watson，上文)。典型的反应母液列于如下。母液总是包括金属离子，通常是1-4mM的镁，全部4种dNTPs或dNTP类似物的混合物，控制pH和离子强度的缓冲剂成分，典型是25mM两性离子缓冲剂(Tricine)pH 8.3/35mM KOAc，以及0.6×的SYBR Green I(分子探针)，其容许引物链延伸的荧光检测。为了从本底荧光中辨别延伸衍生的荧光，实验中包括引物链延伸被阻止的平行孔，例如，通过添加诸如EDTA的金属螯合剂或从反应母液中除去核苷酸。

为了找到在有核糖核苷酸的情况下具有改良的核酸延伸速率的突变型酶，使用上述方法在存在及缺少核糖核苷酸的情况下运行延伸反应并比较产生的延伸速率。添加高水平的核糖核苷酸(例如rATP和dATP的50∶50混合物)降低亲本酶G46E L329A E678G CS5的延伸速率。在该筛选中识别出展现降低的核糖核苷酸抑制水平的突变体提取物。在数千提取物的规模上进行初步的筛选。选择最高的若干百分比的提取物用于重新筛选。相应于最高的提取物的培养孔被取样到新鲜的生长培养基并重新生长以产生包含所有最高的生产者的新的培养平板，以及用于比较的若干亲本的培养物。然后把这些培养平板送入相同的筛选程序，以得到更多的关于候选突变体的数据。在该第二轮筛选之后，相对小数目的提取物看起来仍然一致地显示出相对于亲本克隆的改良的延伸速率。这些克隆被选择用于进一步的测试。首先把它们在选择性琼脂平板上划线以确保克隆的纯净，然后对聚合酶基因突变的区域的DNA序列进行测序以确定存在于任何单个克隆的突变。与该工作并行地，在摇瓶培养中生产充足的突变型酶，以类似于制备初步提取物的方式部分纯化后用基于凝胶的光密度测定法测定其浓度。这些定量的提取物在用于筛选的条件下与相等蛋白质浓度的亲本酶相比较。该最终筛选保证观察到的差异不是简单的蛋白质浓度效应。

在最后一轮筛选之后，4个克隆在有核糖核苷酸的情况下看起来仍然具有改良的延伸速率。确定编码相对于亲本菌株的下列氨基酸变化的这4个克隆的序列：

克隆1：S553T D640G D664G E830A

克隆2：S671F

克隆3：F557L I669F

克隆4：Q601R Y739C V749A

对于克隆2，很明显S671F突变必然决定着观察到的表型，因为它是该克隆中的唯一氨基酸突变。对于其它3个克隆，起初不可能断定哪个突变，或突变的组合决定着观察到的表型。因此，使用限制性片断交换把来自突变型质粒的DNA与亲本质粒组合，从而使单独的突变彼此分离。在要分离的突变之间存在载体独特的限制性位点的情况下这是容易实现的。对于克隆1，上述位点存在于全部4个突变之间，相应地可能制备分别包含每个突变的质粒以及携带4个原始突变中任何2个或3个的其他质粒。对于克隆4，在Y739C和V749A之间没有上述位点，但是在Q601R和Y739C之间有一个位点。因此可能制备编码仅仅携带Q601R突变的聚合酶的质粒DNA，和另一个携带Y739C/V749A组合的质粒。

把这些新的质粒转化入大肠杆菌宿主，并表达、纯化到同质和定量聚合酶蛋白质。把这些产生的新的突变型酶在原始筛选条件下与亲本型和原始的突变型酶相比。从该数据很清楚地看出突变D640G单独地决定突变体克隆1改良的表型，突变I669F决定着突变体克隆3中的改良，而突变Q601R决定着突变体克隆4中的改良。

然后把这些活性突变彼此结合，并移入不同的CS型主链(参见，例如，上文的表2)，如上所述，再次用限制性片断交换来创造需要的表达质粒，然后把质粒转化入大肠杆菌宿主，最后表达、纯化到同质和定量突变型聚合酶。在有核糖核苷酸的情况下测试这些新组合的突变体延伸已经引发的M13 DNA的能力。有趣地，发现组合突变D640G、S671F和Q601R相对于只携带单一突变的克隆产生的延伸速率增加。测试的二重组合突变体，包括D640G S671F和Q601R S671F，也显示出相对于只携带单一突变的菌株的改良的延伸速率。此外，组合突变体也证明了与亲本型相比，当只存在dNTPs时在已经引发的M13 DNA上的改良的延伸速率，以及还观察到当延伸速率实验在低的酶浓度或相对高的盐浓度下进行时，相对于亲本型的改良程度最大。当把组合突变移到没有包括核糖掺入突变(riboincorporating mutation)E678G的遗传主链时这些观察结果被重复。令人惊讶地，甚至在E678背景下，单独的突变型酶和组合突变型酶甚至比它们的相应E678“亲本”“更快”。本发明的突变型聚合酶的这些和其它特征进一步于下列实施例中阐明。

实施例II：G46E L329A E678G CS5突变型DNA聚合酶在变化的盐浓度下的性质

G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶的各种突变体的核酸延伸速率在有90％核糖腺苷三磷酸(ribo ATP或rATP)的情况下测定。反应混合物包含25mM两性离子缓冲剂pH 8.3，20mM(图4)或60mM(图5)KOAc，3mM MgCl₂，2.5％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mMKCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，1％DMSO，1×SYBR Green I，0.5nM已经引发的M13，和5nM酶。核苷酸以0.1mM dGTP、0.1mM dTTP、0.1mM dCTP、0.01mM dATP和0.09mM ribo ATP的终浓度加入。不包含核苷酸的并行反应也被建立。全部反应以20μl体积一式四份地运行于384孔热循环仪平板上。已经引发的M13模板的延伸在动态热循环仪中于64℃下用荧光检测，每10秒获取读数。算出相同反应的重复实验的平均数并减去并行的阴性核苷酸反应。从产生的数据中用线性回归分析估算延伸速率。

如上面指出的，图4和5显示从这些分析中获得的结果。例如，图4和5阐明当核糖核苷酸存在于反应混合物并掺入到DNA模板上时，改良的核酸延伸速率源于此处描述的各种突变体。进一步显示，例如，当某些突变组合在单个突变型酶中时，甚至观察到进一步的延伸速率改良。

实施例III：G46E L329A CS5 DNA聚合酶突变体在变化的盐浓度下的性质

G46E L329A CS5 DNA聚合酶的各种突变体，以及栖热菌种Z05DNA聚合酶及其截短型deltaZ05 DNA聚合酶(参见，例如，1995年10月3日授予Abramson等的名为″Mutated thermostable nucleic acidpolymerase enzyme from Thermus species Z05″的美国专利号5,455,170和1997年10月7日授予Abramson等的名为″DNA encoding thermostablenucleic acid polymerase enzyme from thermus species Z05″的美国专利号5,674,738)的核酸延伸速率被测定。反应混合物包含25mM两性离子缓冲剂pH 8.3，0mM(图6)或60mM(图7)KOAc，3mM MgCl₂，2.5％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，1％DMSO，1×SYBR GreenI，0.5nM已经引发的M13，和5nM酶。核苷酸以0.1mM dGTP、0.1mMdTTP、0.1mM dCTP和0.1mM dATP的终浓度加入。不包含核苷酸的并行反应也被建立。全部反应以20μl体积一式四份地运行于384孔热循环仪平板上。已经引发的M13模板的延伸在动态热循环仪中于64℃下用荧光检测，每10秒获取读数。算出相同反应的重复实验的平均数并减去并行的阴性核苷酸反应。从产生的数据中用线性回归分析估算延伸速率。

显示于图6和7的数据阐明，例如，甚至当核糖核苷酸不存在于反应混合物，以及甚至在没有包括核糖核苷酸掺入突变E678G的遗传主链中，此处描述的某些突变引起改良的核酸延伸速率。进一步显示，例如，当突变在单一突变型酶中组合时该速率改良甚至更大。

实施例IV：盐浓度对各种突变型CS5 DNA聚合酶的延伸速率的效果

G46E L329A CS5 DNA聚合酶的各种突变体，以及栖热菌种Z05DNA聚合酶及其截短型deltaZ05 DNA聚合酶的核酸延伸速率被测定。反应混合物包含25mM两性离子缓冲剂pH 8.3，0-100mM KOAc，3mM MgCl₂，2.5％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mMTris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，1％DMSO，1×SYBR Green I，0.5nM已经引发的M13，以及25nM(图8)或5nM(图9)的酶。核苷酸以0.1mM dGTP、0.1mM dTTP、0.1mM dCTP和0.1mM dATP的终浓度加入。不包含核苷酸的并行反应也被建立。全部反应以20μl体积一式四份地运行于384孔热循环仪平板上。已经引发的M13模板的延伸在动态热循环仪中于64℃下用荧光检测，每10秒获取读数。算出相同反应的重复实验的平均数并减去并行的阴性核苷酸反应。从产生的数据中用线性回归分析估算延伸速率。

显示于图6和7的数据连同其它性质一道阐明，例如，此处描述的某些突变体给予的增加的核酸延伸速率在很宽的盐和酶浓度范围内保持，以及这些突变给予在包含完全校正活性的遗传背景中增加的延伸速率。

实施例V：各种突变型CS5 DNA聚合酶在RT-PCR中的使用

基于Mg²⁺的RT：在有Mg⁺²的情况下评估单独的和组合的突变Q601R、D640G和S671F对PCR和RT-PCR效率的影响。反应都包括下列成分：50mM两性离子缓冲剂pH 8.0，2.5mM Mg(OAc)₂，6％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mMEDTA，1mM DTT，0.2％Tween 20)，0.2×SYBR Green I，0.02单位/μlUNG，dATP，dCTP和dGTP各0.2mM，dUTP 0.3mM，dTTP 0.03mM，以及每种引物200nM，其中引物在3′-末端包含2′-氨基-C。

酶按它们预先测定的浓度和KOAc最适条件使用。这些在表5中给出。

表5.

聚合酶	Pol(nM)	KOAc(mM)	聚合酶	Pol(nM)	KOAc(mM)
						G	236	25	GL	236	25
GD	59	50	GLD	59	50
						GS	118	25	GLS	118	25
GDS	23.6	25	GLDS	23.6	25
						GQDS	23.6	100	GLQDS	23.6	100

每种酶都与10⁶拷贝/50μl反应的DNA模板(pAW109质粒DNA)和10⁶拷贝/50μl反应的RNA模板(pAW109转录物)一起测试。反应在动态热循环仪(ABI 5700thermalcycler)中进行。热循环参数为：50℃2分钟；65℃45分钟；93℃1分钟；然后40循环的：93℃15秒和65℃30秒。分析荧光数据以测定Ct值(在基线以上荧光的出现)(图10)。更具体地说，显示于图10的数据(也参见图11)连同其它性质一道阐明，例如，相对于相应的亲本或非突变型酶，单独的或组合的此处描述的突变改良了突变型酶的Mg²⁺活化的逆转录活性的效率。例如，当逆转录允许的时间缩短至5分钟时，GLDS酶表现良好，如图11(涉及下列其它的)所示。

RT时间缩短的基于Mg²⁺的RT：使用45分钟或者5分钟的RT时间，在有Mg⁺²的情况下评估单独的和组合的突变Q601R、D640G和S671F对RT-PCR效率的影响。反应都包括下列成分：50mM两性离子缓冲剂pH 8.0，2.5mM Mg(OAc)₂，6％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.2％Tween20)，1％DMSO，0.2×SYBR Green I，0.02单位/μl UNG，dATP、dCTP和dGTP各0.2mM，dUTP 0.3mM，dTTP 0.03mM，以及每种引物200nM，其中引物在3′-末端包含2′-氨基-C。

酶按它们预先测定的浓度和KOAc最适条件使用。这些在表6和7中给出：

表6.45分钟RT时间：

表7.5分钟RT时间：

聚合酶	Pol(nM)	KOAc(mM)	聚合酶	Pol(nM)	KOAc(mM)
						G	118	25	GL	236	55
GD	～	～	GLD	94.4	50
						GS	118	25	GLS	118	25
GDS	23.6	25	GLDS	106.2	50
						GQDS	～	～	GLQDS	23.6	100

～表示该条件没有进行

每种酶都与10⁶拷贝/50μl反应的RNA模板(pAW109转录物)一起测试。反应在动态热循环仪(ABI 5700)中进行。热循环参数为：50℃2分钟；65℃5分钟或45分钟；93℃1分钟；然后40循环的：93℃15秒和65℃30秒。分析荧光数据以测定Ct值(在基线以上荧光的出现)(图11)。

RT时间缩短的基于Mn²⁺的RT：使用45分钟或者5分钟的RT时间，在有Mn⁺²的情况下评估单独的和组合的突变Q601R、D640G和S671F对RT-PCR效率的影响。反应都包括下列成分：50mM两性离子缓冲剂pH 8.0，1mM Mn(OAc)₂，6％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.2％Tween20)，1％DMSO，0.2×SYBR Green I，0.02单位/μl UNG，dATP、dCTP和dGTP各0.2mM，dUTP 0.3mM，dTTP 0.03mM，以及每种引物200nM，其中引物在3′-末端包含2′-氨基-C。

酶按它们预先测定的浓度和KOAc最适条件使用。这些在表8和9中给出：

表8.45分钟RT时间：

聚合酶	Pol(nM)	KOAc(mM)	聚合酶	Pol(nM)	KOAc(mM)
						G	236	55	GL	236	55
GD	～	～	GLD	59	55
						GS	118	55	GLS	118	55
GDS	23.6	55	GLDS	23.6	70
						GQDS	23.6	100	GLQDS	23.6	100

表9.5分钟RT时间：

聚合酶

Pol(nM)

KOAc(mM)

聚合酶

Pol(nM)

KOAc(mM)

G

～

GL

354

68

GD

～

GLD

～

GS

～

GLS

59

55

GDS

～

GLDS

23.6

70

GQDS

59

100

GLQDS

11.8

100

～表示该条件没有进行

每种酶都与10⁵拷贝/50μl反应的RNA模板(pAW109转录物)一起测试。反应在动态热循环仪(ABI 5700)中进行。热循环参数为：50℃2分钟；65℃5分钟或45分钟；93℃1分钟；然后40循环的：93℃15秒和65℃30秒。分析荧光数据以测定Ct值(在基线以上荧光的出现)(图12)。更具体地说，显示于图12的数据连同其它性质一道阐明，例如，改良的Mn²⁺活化的逆转录效率由单独的或组合的此处描述的特定突变引起，并且当提供用于逆转录的时间缩短时这种改良增强。

实施例VI：使用低水平核糖核苷三磷酸掺入产生的断裂

使PCR产物断裂有时是有用的，例如当在基于杂交的试验中分析产物时。如果核糖核苷酸已经掺入PCR产物，断裂可以用碱和热处理轻易地完成。对于上述应用相对低水平的核糖取代足以获得最适长度的片段。各种突变型DNA聚合酶产生长度为1kb的核糖取代的PCR产物的能力在下面的实施例中证明。

反应混合物由100mM两性离子缓冲剂pH 8.3，75mM KOAc，5％v/v甘油，2.5mM Mg(OAc)₂，50nM酶，0.1％v/v DMSO，和2.5％v/v酶存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mMEDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)组成。测试了dNTPs和rNTPS的各种混合物。在所有情况下，rATP和dATP的总量为200μM，dCTP和rCTP以及dGTP和rGTP的总量也是。dTTP和rTTP的总量为40μM，而dUTP和rUTP的总量为360μM。在该分析中共同添加全部4种rNTPS最高达总数的10％(参见图13A和B的″rNTP系列″(％rNTP在凝胶相应的泳道上方标明))，或者单独添加rATP最高达总数的50％(参见图13A和B的″rATP系列″(％rATP在凝胶相应的泳道上方标明))。测试的酶是GQDSE、CS6-GQDSE、GLQDSE、GDSE、GLDSE、GLDE、GE以及GL和GLE的4∶1混合物(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F，E＝E678G)。

反应混合物包含用于从M13模板产生1kb产物的引物。引物以每种200nM使用，其中所述引物在3′-末端包含2′-氨基-C。每100μl反应液添加10⁶拷贝的M13 DNA。

反应在ABI 9700热循环仪中运行。热循环参数为50℃15秒；92℃1分钟；然后30循环的：92℃15秒和随后62℃4分钟的延伸步骤。在测试的各种条件下制备全长扩增子的能力通过琼脂糖凝胶电泳测定，在2％的egel-48(invitrogen)上每泳道上样5μl的每种反应液(图13A和13B)。更具体地说，这些图显示，例如，此处描述的某些突变型酶在反应混合物中存在比相应的亲本或非突变型G46E CS5R酶更高水平的核糖核苷酸下能够生产全长(1kb)扩增子。例如，GL CS5和GLE酶的混合物在该实施例试验的最高水平的核糖核苷酸下制备扩增子，但是因为GL CS5聚合酶不能掺入核糖核苷酸，这些扩增子中含有掺入扩增子的核糖核苷酸水平相对较低。

然后按如下使这些扩增子断裂：2μl扩增子在0.3N NaOH和20mMEDTA中稀释27.5×，然后于98℃加热10分钟。通过添加2.5μl 6N HCl中和断裂的扩增子。为测定达到的断裂程度，在断裂前后使用不含UNG的定量PCR比较扩增子的内部片段的拷贝数。由于断裂观察到的循环延迟是断裂程度(以及核糖核苷酸掺入)的指标。增加的核糖核苷酸掺入导致Ct延迟增加。对于该扩增，反应混合物由100mM两性离子缓冲剂pH 8.3，50mM KOAc，5％v/v甘油，2.5mM Mg(OAc)₂，20nM GQDS，0.5％DMSO，0.1×SYBR Green I，2.5％v/v酶存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，dCTP、dGTP和dATP各200μM，dUTP 360μM，和dTTP40μM组成。反应混合物用于从断裂的和未断裂的扩增子产生340bp的产物，自用于断裂的稀释液再10,000倍稀释这些模板。引物序列以每种200nM使用，其中所述引物在3′-末端包含2′-氨基-C。

反应在动态热循环仪中以每反应20μl运行于384孔板上。热循环参数为：50℃15秒；92℃1分钟；然后46循环的：92℃15秒和随后62℃1分钟的延伸步骤。测定阈Ct并比较相应的断裂的和未断裂的Ct，从而对于各酶/测试的rNTP条件产生delta Ct。在该实施例中，掺入NTP的数量(反映改良的在有dNTPs的情况下掺入NTPs的能力)越大，deltaCt或碱诱导断裂后的Ct延迟越大。这些显示于图14A和14B。数据显示，例如，本发明的突变型酶在产生具有提高程度的核糖核苷酸取代的PCR产物中ATP或NTP的掺入方面是优越的。把任何示范性的酶与亲本混合物“GL/GLE”或与“C5R”比较。增加的断裂来源于增加的核糖核苷酸掺入和改良的在脱氧核苷酸存在下掺入限制浓度的核糖核苷酸的能力。

杂交试验经常涉及将生物素连接到检测的分子。因此把生物素掺入进PCR产物是有用的。如果生物素被连接到核糖核苷酸，每个片段(除3′最末端的片段，其通常与其它引物互补因此不能提供信息)将携带单一的生物素部分，这将导致每一片段产生相等信号。

测定了各种酶将与生物素连接的核糖核苷酸掺入进PCR产物中的能力，如下所述。反应混合物由100mM两性离子缓冲剂pH 8.3，75mMKOAc，5％v/v甘油，2.5mM Mg(OAc)₂，50nM酶，0.1％DMSO，2.5％v/v酶存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，dCTP+类似物、dGTP和dATP各200μM，dUTP 360μM，以及dTTP 40μM组成。测试了最高达总量40％的rCTP或最高达总量50％的生物素-LC-rCTP。测试的酶(CS5聚合酶)是GE、GQDSE、GDSE以及GL和GLE的4∶1混合物(G＝G46E，L＝L329A，Q＝Q601R，D＝D640G，S＝S671F，E＝E678G)。

反应混合物用于通过包括2′-氨基-C的每种200nM引物序列从M13模板产生1kb产物。每50μl反应液中添加5×10⁵拷贝M13 DNA。反应在ABI 9700热循环仪中运行。热循环参数为50℃15秒；92℃1分钟；然后30循环的：92℃15秒和随后62℃4分钟的延伸步骤。在各种测试条件下产生全长扩增子的能力通过琼脂糖凝胶电泳测定，在2％egel-48(Invitrogen)上每泳道每种反应液上样5μl(图15A和B)。更具体地说，图15A和B显示，例如，突变型GQDSE和GDSE都能比相应的亲本或非突变型G46E CS5R酶在更高水平的rCTP和生物素化的rCTP中产生扩增子。更进一步地虽然GL/GLE混合物可以产生扩增子，这些扩增子将具有低水平的rCTP或生物素化的rCTP掺入，因为GL酶不能掺入这些化合物。

然后按如下使这些扩增子断裂：2μl扩增子在0.3N NaOH和20mMEDTA中稀释27.5×，然后于98℃加热10分钟。通过添加2.5μl 6N HCl中和断裂的扩增子。为测定达到的断裂程度，在断裂前后使用不含UNG的定量PCR比较扩增子的内部片段的拷贝数。由于断裂观察到的循环延迟是断裂程度(以及核糖核苷酸掺入)的指标。因而增加的核糖核苷酸掺入导致Ct延迟增加。对于该扩增，反应混合物由100mM两性离子缓冲剂pH 8.3，50mM KOAc，5％v/v甘油，2.5mM Mg(OAc)₂，20nMGQDS，0.5％DMSO，0.1×SYBR Green I，2.5％v/v酶存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，dCTP、dGTP和dATP各200μM，dUTP 360μM，和dTTP 40μM组成。反应混合物用于从断裂的和未断裂的扩增子产生340bp的产物，自用于断裂的稀释液再10,000倍稀释这些模板。引物序列以每种200nM使用，其中每个引物都包含2′-氨基-C。

反应在动态热循环仪中以每反应20μl运行于384孔板上。热循环参数为：50℃15秒；92℃1分钟；然后46循环的：92℃15秒和随后62℃1分钟的延伸步骤。测定阈Ct并比较相应的断裂的和未断裂的Ct，从而对于各酶/测试的rNTP条件产生delta Ct。这些显示于图16A和16B。更具体地说，图16A和16B阐明，例如，当使用rCTP或者生物素化的rCTP时用突变型酶可以增加断裂程度，因为它们比相应的亲本酶能产生具有更高水平的核糖核苷酸掺入的扩增子。

实施例VII：焦磷酸解作用活化的聚合

比较了G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶和G46E L329A D640S671F E678G CS5 DNA聚合酶执行焦磷酸解作用活化的聚合(“PAP”)的能力。反应缓冲液由100mM两性离子缓冲剂pH 8.0，2.5-50mMG46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶或2.5-50mM G46E L329A D640GS671F E678G CS5 DNA聚合酶，50nM KOAc，10％v/v甘油，0.04U/μlUNG，4mM Mg(OAc)₂，1％DMSO，0.2×SYBR Green I，2.5％v/v酶存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mMEDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，dATP、dCTP和dGTP各0.2mM，dUTP 0.4mM，和100μM焦磷酸盐组成。交叉滴定M13模板和酶。使用的M13浓度为每20μl反应液0、10⁴、10⁵和10⁶拷贝。使用的酶浓度为2.5nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、35nM和50nM。反应在384孔热循环仪中一式三份设置，使用下列循环参数：50℃2分钟；90℃1分钟；然后46循环的：90℃15秒和随后62℃的延伸温度60秒。

一条引物在3′-末端包含2′-氨基-C，另一条引物在3′-末端包含2′-PO₄-A(即2′-终止核苷酸)。以每种0.1μM添加到反应混合物的这些引物将从M13模板产生348bp的产物。然而，在第二条引物3′末端的2′-PO₄-A残基有效地产生终止剂效果。为了用作引物，它必须被焦磷酸解切除末端残基活化。

分析荧光数据以测定elbow值(C(t))(在基线上荧光的出现)。G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶的C(t)值显示于图17。G46E L329AD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶的C(t)值显示于图18。更进一步地，图17和18显示，例如，使用突变型酶比相应的非突变型或亲本酶在更低的酶浓度下引起更有效的PAP-PCR。凝胶分析表明，该实施例中无模板反应物中的扩增子可能是来源于环境的M13的特定产物。

实施例VIII：选择的突变对栖热菌种Z05 DNA聚合酶延伸速率的影响

通过实施例I描述的筛选分离的若干突变被转入栖热菌种Z05 DNA聚合酶(参见，例如，1995年10月3日授予Abramson等的名为“MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASEENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”的美国专利号5,455,170和1997年10月7日授予Abramson等的名为“DNA ENCODINGTHERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROMTHERMUS SPECIES Z05”的美国专利号5,674,738)。首先，相应于这些突变的氨基酸位点通过使用显示于图1的比对测定。这些突变按如下命名：″Q″＝T541R；″D″＝D580G；而″S″＝A610F。通过使用被称为重叠延伸PCR(overlap extension PCR)(参见，例如，Higuchi，R.in PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，ed.Innis，Gelfand，Sninsky and White，Academic Press，1990，和Silver等，“Site-specificMutagenesis Using the Polymerase Chain Reaction”，in“PCR Strategies”，ed.Innis，Gelfand，and Sninsky，Academic Press，1995)的方法把这些突变引入编码Z05 DNA聚合酶的质粒。在该方法中，首先产生两个扩增子，两者分别在诱变位点的上游和下游，所述突变引入每个反应的一条引物。然后使用外侧的非诱变引物组合和重新扩增这些扩增产物。产生的扩增子包含引入的突变以及被设计成横跨载体独特的限制性位点，因此能用于将扩增子克隆进载体质粒DNA。为了便于从可能包含突变型和野生型克隆的混合物的产生的克隆中选择需要的突变，可以按照需要把诊断性限制性位点引入进诱变引物。该程序可能引入由低保真度PCR引起的不需要的突变，因此有必要对产生的克隆进行测序以证实只产生了需要的突变。一旦突变被证实，按照先前描述的限制性片断交换将它们彼此组合或与先前分离的E683R突变(ES112)(参见Smith等于2001年3月30日提交的名为″High temperature reverse transcription usingmutant DNA polymerases″的美国专利申请号20020012970)组合。

用该方法产生的表达质粒被用于按照之前实施例I中的描述制备各种突变体的纯化蛋白质。然后测定各种突变体的核酸延伸速率。反应混合物包含25mM两性离子缓冲剂pH 8.3，100mM KOAc，3mM MgCl₂，2.5％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，1％DMSO，1×SYBR GreenI，0.5nM已经引发的M13，和5nM酶。核苷酸以0.1mM dGTP、0.1mMdTTP、0.1mM dCTP和0.1mM dATP的终浓度加入。不包含核苷酸的并行反应也被建立。全部反应以20μl体积一式四份地运行于384孔热循环仪平板上。已经引发的M13模板的延伸在动态热循环仪中于64℃下用荧光检测，每10秒获取读数。算出相同反应的重复实验的平均数并减去并行的阴性核苷酸反应。从产生的数据中用线性回归分析估算延伸速率(参见图19)。该数据表明，例如，在一些情况下此处描述的突变在非嵌合栖热菌属DNA聚合酶的背景中也具有有益的效果。

实施例IX：HIV DNA模板滴定

在基因组DNA存在和不存在的情况下进行PAP相关的HIv DNA模板滴定。图20是显示在该分析中变化的反应条件下PCR产物检测的凝胶照片。该数据表明，例如，使用此处描述的封闭引物可以获得相对于不使用那些引物的反应的改良的扩增特异性和灵敏度。

更具体地说，反应是使用ABI 5700序列检测***以下列温度分布进行的：

50℃2分钟

93℃1分钟

93℃，15秒→52℃，4分钟×4循环

90℃，15秒→55℃，4分钟×56循环

下列反应条件为所有反应共有：

母液成分	浓度
		两性离子缓冲剂(pH 8.0)	100mM
dATP	200μM
		dCTP	200μM
dGTP	200μM
		dTTP	30μM
dUTP	300μM
		引物3或引物1	200nM
引物4或引物2	200nM
		KOAc	110mM
SYBR Green I	0.2X
		NaPPi	225μM
Mg(OAc)₂	2.5mM
		Tth存储缓冲液(0.2％Tween)	6％v/v
GLQDSE CS5 DNA聚合酶	10nM

注意，“GLQDSE CS5 DNA聚合酶”指的是G46E L329A Q601R D640GS671F E678G CS5 DNA聚合酶。进一步注意，″Tth存储缓冲液″包含0.2％Tween 20、20mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA、100mM KCl、1mM DTT和50％v/v甘油。此外，每个反应体积用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水加到50μl。

变化的反应成分包括非封闭引物(图20中“非封闭引物”表示的反应)和用2′-磷酸-U封闭的引物(即在2′位置包括磷酸基团的2′-终止核苷酸，参见图20中“封闭的引物”表示的反应)。反应也包含(参见图20中“25ng基因组DNA”表示的反应)或者缺乏(参见图20中“净靶”表示的反应)加入到混合物的25ng人类基因组DNA。如同图20中进一步显示的，反应还包含10⁵、10⁴、10³、10²或10¹拷贝的包含靶核酸的线性化质粒DNA，其在1μl HIV样品稀释剂(10mM Tris，0.1mM EDTA，20μg/mL Poly A，和0.09％NaN₃)中稀释，或者在“阴性(Neg)”反应中还包含1μl HIV样品稀释剂。指定的引物对从质粒DNA扩增170bp的产物。

实施例X：在野生型K-ras质粒模板背景中突变型K-ras质粒模板的扩增

在野生型K-Ras质粒模板背景中扩增各种拷贝数的突变型K-Ras质粒模板，并比较封闭和非封闭引物。图21是显示对于这些反应中使用的各种突变型K-Ras质粒模板拷贝数(X轴)观察到的阈循环(C_T)值(y轴)的图表。图21进一步阐明，例如，使用此处描述的封闭引物可以获得改良的分辨力。

反应是使用ABI 5700序列检测***以下列温度分布进行的：

50℃2分钟

93℃1分钟

92℃，15秒→65℃，2分钟×60循环

下列反应条件为所有反应共有：

母液成分	浓度
		两性离子缓冲剂(pH 8.0)	100mM
dATP	200μM
		dCTP	200μM
dGTP	200μM
		dTTP	30μM
dUTP	300μM

引物7或引物5	200nM
		引物8或引物6	200nM
SYBR Green I	0.1X
		NaPPi	225μM
Mg(OAc)₂	2.5mM
		Ung	2U
Tth存储缓冲液(0.2％Tween)	6％v/v
		GDSE CS5 DNA聚合酶	5nM
线性化的野生型质粒DNA	10⁶拷贝

注意，“GDSE CS5 DNA聚合酶”指的是G46E D640G S671F E678G CS5DNA聚合酶。此外，每个反应体积用DEPC处理过的水加到50μl。

变化的反应成分包括非封闭引物(图21中“非封闭的”表示的反应)和用2′-磷酸-C或2′-磷酸-A封闭的引物(即在2′位置包括磷酸基团的2′-终止核苷酸)。此外，10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹或0拷贝(NTC反应)(图21中分别为10e6c、10e5c、10e4c、10e3c、10e2c、10elc和NTC)的线性化突变型K-Ras质粒DNA也被加入反应中。突变型质粒DNA的相关子序列与封闭引物和非封闭引物两者都完全匹配。进一步地，突变型K-Ras质粒DNA在1μl HIV样品稀释剂(见上文)或“NTC”反应中的1μl HIV样品稀释剂(见上文)中稀释。另外，10⁶拷贝的线性化野生型K-Ras质粒DNA存在于所有反应中。野生型K-Ras质粒DNA与突变型质粒DNA除用引物5和7中最末端的3′碱基(dC)产生C:C错配外序列吻合。封闭和非封闭引物对都在突变型线性化质粒模板上产生92bp的扩增子。

实施例XI：用变化浓度的各种酶的K-RAS质粒模板扩增

用变化浓度的各种酶的K-Ras质粒模板进行扩增。图22是显示对于这些反应中使用的各种酶和浓度(x轴)观察到的阈循环(C_T)值(y轴)的图表。这些数据显示，例如，使用此处描述的特定酶可以获得改良的PAP扩增效率。

反应是使用ABI 5700序列检测***以下列温度分布进行的：

50℃2分钟

93℃1分钟

92℃，15秒→60℃，2分钟×60循环

下列反应条件为所有反应共有：

母液成分	浓度
		两性离子缓冲剂(pH 8.0)	100mM
dATP	200μM
		dCTP	200μM
dGTP	200μM
		dTTP	30μM
dUTP	300μM
		引物9	200nM
引物10	200nM
		SYBR Green I	0.1X
NaPPi	225μM
		Mg(OAc)₂	2.5mM
Ung	2U
		Tth存储缓冲液(0.2％Tween)	6％v/v
线性化的K-Ras质粒DNA	10⁴拷贝

反应成分包括用2’-磷酸-U或2’-磷酸-A封闭的引物(即在2’位置包含磷酸基团的2’-终止核苷酸)。引物对在线性化K-Ras质粒模板上产生92bp的扩增子。此外，每个反应体积用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水加到50μl。

按如下对每种单独的聚合酶最优化聚合酶浓度和KOAc浓度

聚合酶	聚合酶浓度(nM)	KOAc(mM)
			GLQDSE	5，10，15，20，30或40nM	110
GLDSE	5，10，15，20，30或40nM	25
			GLE	5，10，15，20，30或40nM	25

注意，“GLQDSE”指的是G46E L329A Q601R D640G S671F E678G CS5DNA聚合酶，“GLDSE”指的是G46E L329A D640G S671F E678G CS5DNA聚合酶，而“GLE”指的是G46E E678G CS5 DNA聚合酶。

实施例XII：比较非封闭和封闭RT引物的丙型肝炎病毒(HCV)RNA 到cDNA的逆转录(RT)

比较在逆转录反应中的HCV RNA模板上非封闭HCV RT引物的延伸与封闭引物的延伸。这些RT比较是使用各种聚合酶进行的。为说明，图23是显示对于这些使用包含5′-核酸酶探针的实时PCR测量cDNA的反应中使用的各种酶(x轴)观察到的阈循环(Ct)值(y轴)的图表。

下列反应条件为所有RT反应共有：

RT母液成分	浓度
		两性离子缓冲剂pH8.0	100mM
KOAc	100mM
		DMSO	4％(v/v)
引物1或2	200nM
		dATP	200μM
dCTP	200μM
		dGTP	200μM
dTTP	30μM
		dUTP	300μM
UNG	0.2单位
		Mn(OAc)₂	1mM
PPi	175uM

变化的反应成分包括3’-OH非封闭引物(图23中：3’OH引物(非封闭的)”表示的反应)和用2′-磷酸-A或2’-单磷酸-3’-羟基腺苷酸封闭的引物(即在2′位置包括磷酸基团的2′-终止核苷酸，参见图23中“2’PO4(封闭的)”表示的反应)。进一步地，在cDNA反应中比较下列聚合酶条件(参见图23)：

Z05 DNA聚合酶(13nM)

GLQDSE CS5 DNA聚合酶(100nM)和GLQDS CS5 DNA聚合酶(25nM)

GLQDSE CS5 DNA聚合酶(50nM)和GLQDS CS5 DNA聚合酶(50nM

其中“GLQDSE CS5 DNA聚合酶”指的是G46E L329A Q601RD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶，而“GLQDS CS5 DNA聚合酶”指的是G46E L329A Q601R D640G S671F CS5 DNA聚合酶。此外，每个反应体积用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水加到20μl。

RT反应在ABI 9600热循环仪中于60℃孵育60分钟。RT孵育后，RT反应在DEPC处理过的水中稀释100倍。用设计来特定测量RT反应中的HCV cDNA产物的基于5′核酸酶探针的实时HCV PCR反应来证实cDNA的存在并定量。这些反应使用ABI Prism 7700序列检测器以下列温度分布进行：

50℃ 2分钟

95℃15秒→60℃1分钟×50循环。

实施例XIII：用于BRAF突变检测的双向PAP

图24显示当进行双向PAP时产生的BRAF癌基因扩增的PCR增长曲线。x轴显示标准化的累积荧光而y轴显示PAP PCR扩增的循环。更具体地说，这些数据在使用3′-末端核苷酸与突变精确位点重叠的2′-终止剂封闭的引物进行决定BRAF癌基因中的V599E密码子改变的T→A突变(参见，Brose等(2002)Cancer Res 62：6997-7000)的突变特异性扩增时产生。当野生型序列特异的引物与野生型靶或突变型靶起反应时，只有野生型靶被检测到。相反地，当突变型序列特异的引物与野生型靶或突变型靶起反应时，只有突变型靶被检测到。

下列反应条件为所有RT反应共有：

成分	浓度
		两性离子缓冲剂pH 8.0	100mM
KOAc	100mM
		甘油	3.5％v/v
引物F5W或F5M	200nM
		引物R5W或R5M	200nM
dATP	200μM
		dCTP	200μM
dGTP	200μM
		dTTP	30μM

dUTP	300μM
		UNG	1单位
PPi	175uM
		GLQDSE	15nM
SYBR I/羧基罗丹明	11/100,000(0.1×)
		Mg(OAc)₂	3.0mM

其中“GLQDSE”指的是G46E L329A Q601R D640G S671F E678G CS5DNA聚合酶。

变化的反应成分包括用2′-磷酸-A、2’-单磷酸-3’-羟基腺苷酸、2′-磷酸-U或2’-单磷酸-3’-羟基尿苷酸封闭的野生型BRAF引物(即在2′位置包括磷酸基团的2′-终止核苷酸，在图24中用“F5W/R5W”标记)。

此外，每个反应体积用DEPC处理过的水加到50μl。野生型反应(在图24中用“WT”标记)包含BRAF野生型序列的线性化DNA质粒而突变型反应(在图24中用“MT”标记)包含BRAF突变型序列的线性化DNA质粒。阴性反应(在图24中用“NEG”标记)包含没有DNA的HIV样品稀释剂(10mM Tris，0.1mM EDTA，20μg/mL Poly A，0.09％NaN₃)。PCR中的引物组合产生50bp的扩增子。进一步地，反应使用ABI Prism7700序列检测器在以下列温度分布进行：

50℃ 1分钟

93℃ 1分钟

90℃ 15秒

60℃ 150秒→×60循环。

实施例XIV：荧光PAP释放产物的检测

该预示性的实施例说明了涉及当引物被活化和延伸时封闭引物引起可检测信号产生的PAP活化的实时监控方案。

3’终止的双重标记寡核苷酸引物的构建：

下面的引物QX是包含附加到其自3′末端起第13个核苷酸(A)的猝灭染料分子Black Hole(BHQ)(Biosearch Technologies，Inc.)的DNA寡核苷酸。

QX寡核苷酸引物在溶液中与互补寡核苷酸R1(参见如下)混合，这样它们形成杂交双链体。该双链体进一步与下面表10提供的特别包含荧光素标记的脱氧核糖腺嘌呤四磷酸(即荧光素标记的2′-终止核苷酸)和能够掺入上述标记的四磷酸的DNA聚合酶的试剂混合。参见2004年6月28日提交的名为“SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF2′-TERMINATOR NUCLEOTIDES”的美国专利申请号10/879,494和2004年6月28日提交的名为“2’-TERMINATOR NUCLEOTIDE-RELATEDMETHODS AND SYSTEMS”的美国专利申请号10/879,493。在60℃温度下孵育该混合物，例如，一小时可以使序列QX的3′末端以模板指导的方式延伸核苷酸，结果至少一部分QX寡核苷酸在其3′末端延伸了荧光素标记的脱氧核糖腺嘌呤-2′-磷酸核苷酸，下面以引物QX^FAM表示。

表10

母液成分	浓度
		两性离子缓冲剂pH 8.3	50mM
KOAc	100mM
		甘油	8％(w/v)
引物QX	10μM
		寡核苷酸R1	15μM
荧光素dA4P	15μM
		G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶	50nM
Mg(OAc)₂	2.5mM

新延长的引物QX^FAM使用许多为本领域技术人员所知的纯化方法从上述混合物中纯化。上述能够从该混合物中纯化引物QX^FAM的方法的一个例子是高效液相色谱(HPLC)。选择HPLC纯化参数以使引物QX^FAM制品基本上不含未延伸的引物QX和荧光素标记的腺嘌呤四磷酸。双重HPLC(反相和阴离子交换HPLC)是已知的纯化上述分子的一种方法。

纯化后，在同一寡核苷酸上包含BHQ猝灭分子和荧光素分子的诸如引物QX^FAM的分子通常显示出由于能量被BHQ2“猝灭”分子吸收导致的抑制的荧光素信号。

任意地，引物QX^FAM按照，例如，美国专利公开号2007/0219361中的描述化学合成。

本实施例中涉及的序列如下：

引物QX 5’-GCAAGCACCCTATCA^QGGCAGTACCACA-3’(SEQ IDNO：73)

(其中Q代表BHQ分子的存在)

R1 3’-PCGTTCGTGGGATAGTCCGTCATGGTGTT-5’(SEQ ID NO：74)

(其中P代表3’磷酸)

引物QX^FAM 5’-GCAAGCACCCTATCA^QGGCAGTACCACA^F-3’(SEQ IDNO：75)

(其中Q代表BHQ分子的存在，而F代表荧光素标记的2’磷酸腺嘌呤)

引物HC2 5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCTTA-3’(SEQ ID NO：76).

PCR中引物的使用。

将上面描述的引物QX^FAM与表11中的试剂结合。

表11

成分	浓度
		两性离子缓冲剂pH 8.0	100mM
KOAc	100mM
		甘油	3.5％(v/v)
DMSO	5％(v/v)
		引物QX^FAM	150nM
引物HC2	150nM
		dATP	200μM
dCTP	200μM
		dGTP	200μM
dTTP	30μM
		dUTP	300μM
UNG	1单位
		PPi	175μM
GLQDSE	15nM
		靶序列	10⁶拷贝

Mg(OAc)₂

3.0mM

此外，每个反应体积用DEPC处理过的水加到50μl。一些反应包含作为PCR扩增底物的靶序列，而其它的不包含靶。例如，靶可以是与HCV基因组5′UTR区域相同的DNA序列。PCR中这些引物的组合预计产生大约244bp的扩增子。

反应可以使用ABI Prism 7700序列检测器以下列温度分布进行：

50℃ 1分钟

93℃ 1分钟

90℃ 15秒

60℃ 150″→×60循环

为进行上述PCR的改进，荧光素终止的引物QX^FAM的PAP活化是必要的，并将导致荧光素标记的脱氧腺嘌呤四磷酸分子的切除。上述释放预计在大约520nm波长产生荧光信号的增加。当PCR进行时，监测大约520nm波长的信号，将期待在那些包含靶核酸的反应中观察到荧光的增加而在不包含靶的反应中没有观察到荧光增加。

实施例XV：D580K、D580L、D580R和D580T突变对Z05 DNA聚合酶延伸速率的效果

测定了D580位点的各种取代对Z05 DNA聚合酶延伸速率的效果。首先，按照先前描述的，利用重叠PCR技术在Z05 DNA聚合酶上产生突变，并纯化和定量突变型酶。按照上述实施例II及其它地方的描述，使用Mg⁺²和Mn⁺²两者都作为金属辅因子，通过检测SYBR Green I荧光的增加来测定在已经引发的M13(单链DNA)模板上的延伸速率。在本实施例中，反应混合物包含50mM两性离子缓冲剂pH 8.3，40mMKOAc，1mM Mn(OAc)₂或2.5mM Mg(OAc)₂，1.25％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20)，1％DMSO，0.6×SYBR Green I，1.0nM已经引发的M13，和或5nM酶。核苷酸以0.2mM dGTP、0.2mM dTTP、0.2mMdCTP和0.2mM dATP的终浓度加入。不包含核苷酸的并行反应也被建立。全部反应以20μl体积一式四份地运行于384孔热循环仪平板上。已经引发的M13模板的延伸在动态热循环仪中于64℃下用荧光检测，每15秒获取读数。算出相同反应的重复实验的平均数并减去并行的阴性核苷酸反应。从产生的数据中用线性回归分析估算延伸速率。结果显示于下面的表12：

表12

Z05 D580X突变体的延伸速率。

(基于荧光的改变，任意单位)

数据显示Z05DNA聚合酶的位点580的所有5种氨基酸取代都在测试的条件下引起更快的延伸速率。

实施例XVI：RT-PCR中各种突变型Z05 DNA聚合酶的使用

基于Mn²⁺的RT：在有Mn⁺²的情况下评估突变D580G、D580K和D580R对于RT-PCR效率的效果。反应都包括下列组分：55mM两性离子缓冲剂pH 8.3，4％v/v甘油，5％v/v DMSO，110mM KOAc，2.7mMMn(OAc)₂，3.6％v/v存储缓冲液(50％v/v甘油，100mM KCl，20mM TrispH 8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.2％Tween 20)，0.04单位/μl UNG，dATP、dCTP、dUTP、dGTP各0.45mM；每种引物750nM，其中每种引物在3’-末端包含叔丁基苯甲基dA；和150nM用环己基-FAM、blackhole猝灭剂(BHQ-2)、3’-磷酸标记的TaqMan探针。两种引物共同在HCV-1B转录物上产生241bp的扩增子。每100μl反应添加10⁵拷贝RNA转录物HCV-1B。

没有转录物的并行反应也被建立。添加每种酶到终浓度为27nM。反应在Roche LC480动态热循环仪中运行。热循环条件为：50℃5分钟(″UNG″步骤)；66℃2、5或30分钟(″RT″步骤)；2循环的95℃15秒和随后58℃50秒；然后50循环的91℃15秒和随后58℃50秒。

表13显示从由于TaqMan探针切割的FAM信号增加获得的Ct值：

表13

结果显示D580位点的这三种突变容许更短的RT时间同时维持相当的RT效率。

基于Mg²⁺的RT：比较突变D580G和D580K与ES112(Z05 E683R)在有Mg⁺²的情况下进行RT-PCR的能力。已知相对于ES112，亲本酶和Z05 DNA聚合酶以显著延迟的Ct值进行基于Mg⁺²的RT-PCR，在本研究中不重新测试。使用的条件与上述刚描述的一致，除了KOAc改为50mM，Mn(OAc)₂替换为2mM Mg(OAC)₂，以及酶浓度减为10nM。热循环条件相同，除了只测试了30分钟RT时间。

表14显示从由于TaqMan探针切割的FAM信号增加获得的Ct值：

表14

结果显示D580G突变体以与ES112大致相同的效率进行基于Mg⁺²的RT PCR，而D580K突变体导致显著提前的Ct值，显示出在这些条件下大大提高的RT效率。

应当理解，此处描述的实施例和实施方式只是用于说明性目的，而且其各种修饰或变化将被启发给本领域技术人员，并包括在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围内。

序列表

<110>F.Hoffmann-La Roche AG

Roche Diagnostics GmbH

<120>突变型DNA聚合酶及相关方法

<130>23146 WO-KOE

<140>仍未指定

<141>仍未指定

<150>US 60/852,882

<151>2006-10-18

<160>76

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序a

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Gln，Thr，Met，Gly或Leu之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<400>1

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序b

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn之外的任何氨基酸

<400>2

Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn

1 5 10

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Ile或Leu之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>4

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自嗜热栖热菌(Tth)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的

活性位点区域

<400>4

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>5

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自Thermus caldophilus(Tca)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶

结构域的活性位点区域

<400>5

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Asn Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>6

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自来自栖热菌种Z05(Z05)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构

域的活性位点区域

<400>6

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>7

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自水生栖热菌(Taq)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的活

性位点区域

<400>7

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>8

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自黄栖热菌(Tf1)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的活性

位点区域

<400>8

Ile Val Asp Arg Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Ala Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Glu Gly Trp Val Leu Val

65 70 75 80

Val Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>9

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自丝状栖热菌(Tfi)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的活

性位点区域

<400>9

Ile Val Gly Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Met Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Arg Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Lys Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly His Leu Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>10

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自栖热菌种sps17(sps17)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构

域的活性位点区域

<400>10

Ile Val Gly Arg Ile Leu Glu Tyr Arg Glu Leu Met Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Arg Leu Val His Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Lys Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly His Leu Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>11

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自海栖热袍菌(Tma)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的活

性位点区域

<400>11

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>12

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自那不勒斯栖热袍菌(Tne)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构

域的活性位点区域

<400>12

Ile Val Pro Leu Ile Leu Glu Phe Arg Lys Ile Leu Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Thr Leu Pro Lys Leu Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Phe His Ala Ser Phe His Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asp Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>13

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自非洲栖热腔菌(Taf)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的

活性位点区域

<400>13

Ile Ala Lys Leu Leu Leu Glu Tyr Arg Lys Tyr Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ser Ile Pro Leu Ser Ile Asn Arg Lys Thr Asn Arg

20 25 30

Val His Thr Thr Phe His Gln Thr Gly Thr Ser Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asn Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Arg Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala ValArg Pro Gln Arg Gln Asp Trp Trp Ile

65 70 75 80

Leu Gly Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>14

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自热坚芽孢杆菌(Bca)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域的

活性位点区域

<400>14

Val Glu Asn Ile Leu Gln His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys Lys

20 25 30

Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly

50 55 60

Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile

65 70 75 80

Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>15

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS5的聚合酶结构域的活性位点区域

<400>15

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>16

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS6的聚合酶结构域的活性位点区域

<400>16

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>17

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>热稳定DNA依赖的DNA聚合酶的聚合酶结构域活性位点区域一致序列(Cons)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Val，Ile，Ala或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Glu，Pro，Gly，Asp，Lys或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Leu，Lys，Arg或Ile

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(10)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Gln，Thr，Met，Gly或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(19)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(20)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(21)

<223>Xaa＝Pro，Ala，Thr，Ser或Gly

<220>

<221>MOD_RES

<222>(22)

<223>Xaa＝Leu或Ile

<220>

<221>MOD_RES

<222>(24)

<223>Xaa＝Lys，Arg，Ser，Leu，Ala或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(25)

<223>Xaa＝Leu，Met，Val或Ser

<220>

<221>MOD_RES

<222>(26)

<223>Xaa＝Val或Ile

<220>

<221>MOD_RES

<222>(27)

<223>Xaa＝His，Asn或Arg

<220>

<221>MOD_RES

<222>(28)

<223>Xaa＝Pro或Arg

<220>

<221>MOD_RES

<222>(29)

<223>Xaa＝Lys，Arg，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(31)

<223>Xaa＝Gly，Lys或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(32)

<223>Xaa＝Arg或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(33)

<223>Xaa＝Leu，Ile，Val或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(35)

<223>Xaa＝Thr或Ala

<220>

<221>MOD_RES

<222>(36)

<223>Xaa＝Arg，Ser，Thr或Ile

<220>

<221>MOD_RES

<222>(38)

<223>Xaa＝Asn或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(40)

<223>Xaa＝Thr或Ala

<220>

<221>MOD_RES

<222>(41)

<223>Xaa＝Ala，Gly或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(43)

<223>Xaa＝Ala，Ser或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(50)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(51)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(57)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(59)

<223>Xaa＝Val，Thr或Ile

<220>

<221>MOD_RES

<222>(60)

<223>Xaa＝Arg或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(61)

<223>Xaa＝Thr，Ser或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(62)

<223>Xaa＝Pro或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(63)

<223>Xaa＝Leu或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(65)

<223>Xaa＝Gln，Lys或Arg

<220>

<221>MOD_RES

<222>(66)

<223>Xaa＝Arg，Glu或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(69)

<223>Xaa＝Lys，Arg或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(71)

<223>Xaa＝Phe，Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(72)

<223>Xaa＝Val，Ile或Arg

<220>

<221>MOD_RES

<222>(73)

<223>Xaa＝Ala或Pro

<220>

<221>MOD_RES

<222>(74)

<223>Xaa＝Gln或不存在的

<220>

<221>MOD_RES

<222>(75)

<223>Xaa＝Glu，Asp或Arg

<220>

<221>MOD_RES

<222>(76)

<223>Xaa＝Pro，Glu，Ala，Ser或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(77)

<223>Xaa＝Gly，Asp或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(78)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(79)

<223>Xaa＝Trp，Leu，Ala或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(80)

<223>Xaa＝Leu或Ile

<220>

<221>MOD_RES

<222>(81)

<223>Xaa＝Val，Leu或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(82)

<223>Xaa＝Ala，Ser，Gly或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(83)

<223>Xaa＝Leu或Ala

<220>

<221>MOD_RES

<222>(92)

<223>Xaa＝Val或Ile

<400>17

Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa

1 5 10 15

Thr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa

20 25 30

Xaa His Xaa Xaa Phe Xaa Gln Xaa Xaa Thr Xaa Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly

50 55 60

Xaa Xaa Ile Arg Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa

85 90

<210>18

<211>893

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS5

<400>18

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu

290 295 300

Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe

305 310 315 320

Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile

325 330 335

Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro

340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys

355 360 365

Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln

370 375 380

Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro

385 390 395 400

Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro

405 410 415

Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly

420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu

435 440 445

Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr

450 455 460

Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu

485 490 495

Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr

500 505 510

Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys

515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe

530 535 540

Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu

545 550 555 560

Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr

565 570 575

Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro

580 585 590

Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile

595 600 605

Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala

610 615 620

Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp

625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile

645 650 655

Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala

660 665 670

Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp

675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu

690 695 700

Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu

705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val

725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala

740 745 750

Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp

755 760 765

Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg

770 775 780

Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp

785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile

805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp

820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val

835 840 845

His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu

850 855 860

Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val

865 870 875 880

Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser

885 890

<210>19

<211>893

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS6

<400>19

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu

290 295 300

Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe

305 310 315 320

Ala Ile Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile

325 330 335

Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro

340 345 350

Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys

355 360 365

Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln

370 375 380

Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro

385 390 395 400

Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro

405 410 415

Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly

420 425 430

Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu

435 440 445

Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr

450 455 460

Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser

465 470 475 480

Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu

485 490 495

Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr

500 505 510

Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys

515 520 525

Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe

530 535 540

Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu

545 550 555 560

Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr

565 570 575

Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro

580 585 590

Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile

595 600 605

Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala

610 615 620

Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp

625 630 635 640

Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile

645 650 655

Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala

660 665 670

Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp

675 680 685

Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu

690 695 700

Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu

705 710 715 720

Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val

725 730 735

Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala

740 745 750

Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp

755 760 765

Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg

770 775 780

Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp

785 790 795 800

Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile

805 810 815

Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp

820 825 830

Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val

835 840 845

His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu

850 855 860

Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val

865 870 875 880

Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser

885 890

<210>20

<211>2682

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS5

<400>20

atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60

cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120

gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180

aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240

gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300

aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360

gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420

accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480

ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540

gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600

ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660

aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720

cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780

gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840

ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900

gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960

gctatcgatt tggaaactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020

gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080

ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140

atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200

gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260

ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320

ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380

gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440

ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500

aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560

ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620

ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680

ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740

ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800

cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860

aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920

cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980

gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040

atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100

gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160

atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220

ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280

gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340

ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400

aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460

gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520

agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580

aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640

ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga 2682

<210>21

<211>2682

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS6

<400>21

atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60

cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120

gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180

aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240

gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300

aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360

gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420

accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480

ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540

gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600

ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660

aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720

cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780

gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840

ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900

gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960

gcgatcgctc ttgcgactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020

gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080

ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140

atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200

gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260

ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320

ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380

gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440

ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500

aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560

ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620

ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680

ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740

ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800

cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860

aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920

cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980

gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040

atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100

gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160

atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220

ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280

gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340

ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400

aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460

gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520

agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580

aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640

ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga 2682

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>DNA聚合酶活性位点保守基序A

<400>22

Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5

<210>23

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶栖热菌种Z05(Z05)的示例性未修饰参考

聚合酶结构域的活性位点区域

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(10)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Gln，Thr，Met，Gly或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(19)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(20)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(50)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(51)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(76)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(77)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(78)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu 或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(79)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(80)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(81)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly

<220>

<221>MOD_RES

<222>(82)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>23

Ile Val Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa

1 5 10 15

Thr Tyr Xaa Xaa Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>24

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS5或CS6的示例性未修饰参考聚合酶结构域

的活性位点区域

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(10)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<22l>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Gln，Thr，Met，Gly或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(19)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(20)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(50)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(51)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(77)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(78)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(79)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(80)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(81)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(82)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly

<220>

<221>MOD_RES

<222>(83)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>24

Ile Ile Pro Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa

1 5 10 15

Thr Tyr Xaa Xaa Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>25

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

聚合酶结构域的活性位点区域

<220>

<221>MOD_RES

<222>(50)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(51)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn

<400>25

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Asn Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>26

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

的活性位点区域

<220>

<221>MOD_RES

<222>(50)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(51)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn

<400>26

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>27

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序a

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝D-或L-Ala，Cys，Asp，Glu，Phe，His，Ile，Lys，

Asn，Pro，Arg，Ser，Val，Trp或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<400>27

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>28

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序a

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Arg，Lys或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<400>28

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>29

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序a

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<400>29

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Arg Lys Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>30

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序b

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝D-或L-Ala，Cys，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Leu，

Met，Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp或Tyr

<400>30

Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn

1 5 10

<210>31

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序b

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Gly，Ala，Ser，Thr，Arg，Lys，Gln，Leu，Val或Ile

<400>31

Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn

1 5 10

<210>32

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序b

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Gly，Thr，Arg，Lys或Leu

<400>32

Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn

1 5 10

<210>33

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝D-或L-Ala，Cys，Asp，Glu，Phe，Gly，His，Lys，

Met，Asn，Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>33

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>34

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Phe或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>34

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>35

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>35

Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>36

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Ile或Leu之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Cys，Asp，Glu，Phe，His，Ile，Lys，Leu，Met，Asn，

Pro，Gln，Arg，Thr，Trp或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>36

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>37

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Ile或Leu之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Phe或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>37

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>38

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>改良DNA聚合酶修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Ile或Leu之外的任何氨基酸

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>38

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>39

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自栖热菌种Z05(Z05)的热稳定家族A型DNA依赖的DNA聚合酶的改良突变聚合酶

结构域的活性位点区域

<400>39

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>40

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>40

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>41

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>41

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>42

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>42

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>43

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>43

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>44

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>44

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>45

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>45

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>46

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>46

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>47

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>47

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>48

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>48

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>49

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>49

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>50

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>50

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>51

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>51

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>52

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>52

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>53

<211>91

<212>PRT

<213>人工的

<220>

结构域的活性位点区域

<400>53

Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Arg Lys Leu Lys Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly Arg

20 25 30

Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Phe Val

65 70 75 80

Phe Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val

85 90

<210>54

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>来自嵌合热稳定DNA依赖的DNA聚合酶CS5或CS6的改良突变聚合酶结构域的活性位

点区域

<400>54

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>55

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>55

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>56

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>56

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>57

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>57

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>58

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>58

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>59

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>59

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>60

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>60

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>61

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>61

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>62

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>62

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>63

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>63

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>64

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>64

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>65

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>65

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>66

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>66

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>67

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>67

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>68

<211>92

<212>PRT

<213>人工的

<220>

点区域

<400>68

Ile Ile Pro Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Arg Lys Leu Lys Ser

1 5 10 15

Thr Tyr Ile Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg

20 25 30

Ile His Ala Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Gly Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly

50 55 60

Lys Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Phe

65 70 75 80

Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile

85 90

<210>69

<211>16

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>DNA聚合酶未修饰基序a

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Leu或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Gln，His或Glu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Tyr，His或Phe

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Gln，Thr，Met，Gly或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa＝Lys或Gln

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)

<223>Xaa＝Ser或Asn

<220>

<221>MOD_RES

<222>(15)

<223>Xaa＝Ile或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(16)

<223>Xaa＝Glu或Asp

<400>69

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Xaa

1 5 10 15

<210>70

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>DNA聚合酶未修饰基序b

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ser或Thr

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn

<400>70

Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn

1 5 10

<210>71

<211>15

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>DNA聚合酶未修饰基序c

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa＝Trp或His

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa＝Ile或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa＝Val，Phe或Leu

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa＝Ala或Leu

<400>71

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

1 5 10 15

<210>72

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的M13mp18单链DNA模板引物

<400>72

gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 30

<210>73

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物QX

<220>

<221>修饰的_碱基

<222>(15)

<223>n＝被猝灭染料(Q)Black Hole猝灭剂(BHQ)修饰的a

<400>73

gcaagcaccc tatcnggcag taccaca 27

<210>74

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的互补寡核苷酸R1

<220>

<221>modified_base

<222>(28)

<223>n＝被3’磷酸修饰的c

<400>74

ttgtggtact gcctgatagg gtgcttgn 28

<210>75

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的荧光素标记的引物FAM-QX

<220>

<221>修饰的_碱基

<222>(15)

<223>n＝被猝灭染料(Q)Black Hole猝灭剂(BHQ)修饰的a

<220>

<221>修饰的_碱基

<222>(27)

<223>n＝被2’磷酸修饰的荧光素标记的a，

荧光素标记的脱氧腺苷四磷酸(dA4P)，

荧光素标记的2’-终止核苷酸

<400>75

gcaagcaccc tatcnggcag taccacn 27

<210>76

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的引物HC2

<400>76

gcagaaagcg tctagccatg gctta 25

Claims

1.一种DNA聚合酶，其在聚合酶结构域中包含至少下列基序：

SEQ ID NO：32所示的T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N,其中X_b7是氨基酸S；并且X_b8是氨基酸G，

其中所述DNA聚合酶选自：

(a)CS5DNA聚合酶；

(b)CS6DNA聚合酶；

(c)海栖热袍菌DNA聚合酶；或

SEQ ID NO：32所示的T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N,其中X_b7是氨基酸S；并且X_b8是选自G,T,R,K或L的氨基酸，

其中所述DNA聚合酶是栖热菌种Z05DNA聚合酶；

其中所述CS5DNA聚合酶、所述CS6DNA聚合酶、所述海栖热袍菌DNA聚合酶和所述栖热菌种Z05DNA聚合酶相对于X_b8是氨基酸D而其他方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率和／或改良的逆转录效率。

2.权利要求1的DNA聚合酶，其中位点X_b8的氨基酸是G。

3.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是SEQID NO：15的CS5DNA聚合酶或SEQ ID NO：16的CS6DNA聚合酶，而且第640位氨基酸是G。

4.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是SEQID NO：6的Z05DNA聚合酶，而且第580位氨基酸选自由G、T、R、K和L组成的组。

5.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包括嵌合的聚合酶，其中所述嵌合的聚合酶相对于SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19包含一个或更多个选自由下列氨基酸取代组成的组的氨基酸取代：G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F和E678G。

6.权利要求1的DNA聚合酶，其进一步包含热可逆共价修饰。

7.权利要求6的DNA聚合酶，其中所述包含热可逆共价修饰的聚合酶由热稳定DNA聚合酶和具有选自下列的通式的二羧酸酐的混合物在碱性pH和低于25℃的温度下进行的反应产生：

(a)式I：

其中R₁和R₂是氢或有机基团，和

(b)式II：

其中R₁和R₂是有机基团，且氢是顺式的。

8.权利要求7的DNA聚合酶，其中式I和／或式II中的R₁和R₂连在一起。

9.编码根据权利要求1的DNA聚合酶的重组核酸。

10.包含权利要求9的重组核酸的表达载体。

11.包含权利要求10的表达载体的宿主细胞。

12.一种生产DNA聚合酶的方法，所述方法包括：在适合编码DNA聚合酶的核酸表达的条件下培养权利要求11的宿主细胞。

13.一种实施引物延伸的非诊断方法，包括：

在适合引物延伸的条件下使权利要求1的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触，从而产生延伸的引物。

14.权利要求13的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA。

15.权利要求14的方法，其中所述适合延伸的条件包含Mg²⁺和Mn²⁺。

16.根据权利要求13的方法，其中所述游离核苷酸包括非常规核苷酸。

17.权利要求13的方法，其是用于多核苷酸扩增的方法，包括在适合多核苷酸扩增的条件下使DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触。

18.权利要求17的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA。

19.权利要求18的方法，其中所述适合扩增的条件包含Mg²⁺和Mn²⁺。

20.一种生产延伸的引物的试剂盒，包括：

至少一个容器，其中所述容器包含根据权利要求1的DNA聚合酶。

21.权利要求20的试剂盒，进一步包括一个或更多个选自由下列容器组成的组的另外的容器：

(a)包含在引物延伸条件下能够与预定的多核苷酸模板杂交的引物的容器；

(b)包含游离核苷酸的容器；和

(c)包含适合引物延伸的缓冲剂的容器。

22.一种反应混合物，包含根据权利要求1的DNA聚合酶、至少一种引物、多核苷酸模板和游离核苷酸。

23.权利要求22的反应混合物，其中所述多核苷酸模板是DNA。

24.权利要求22的反应混合物，其中所述多核苷酸模板是RNA。

25.权利要求23的反应混合物，其中所述反应混合物包含Mg²⁺和Mn²⁺。