CN101528779A

CN101528779A - 炎症性疾病中的4-1bb配体

Info

Publication number: CN101528779A
Application number: CNA200780038601XA
Authority: CN
Inventors: 康永军; 韩佳怀
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2006-10-16
Filing date: 2007-10-16
Publication date: 2009-09-09

Abstract

本发明提供了4－1BBL阻断剂，以及作为用于持续性炎症的新型治疗介入的包含该阻断剂的药物组合物和制造物品。因此，本发明还提供了减少肿瘤坏死因子持续性生成的方法。

Description

炎症性疾病中的4-1BB配体

相关申请

本申请主张2006年10月16日提交的美国临时申请60/852,022和2007年5月11日提交的美国临时申请60/917,561的优先权，它们均在此全文引用作为参考。

有关联邦资助研究的声明

有关本申请的工作受到了美国政府的资助(GM67101，AI41637和AI54696)。政府对本发明具有一定的权利。

背景技术

巨噬细胞中促炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)的生成对于引发先天免疫应答并维持伴有脓毒症等病症的***炎性状态非常重要(Beutler，Nature 430：257-63(2004)；Cohen，Nature 420：885-91(2002))。Toll样受体(TLRs)是原发性的先天免疫传感器，其分别响应微生物来源的特异性分子(Janeway&Medzhitov，Annu.Rev.Immunol.20：197-216(2002))。TLR4是脂多糖(LPS)内毒素的受体，其通过募集信号转导衔接子，如脊髓分化原发性应答基因88(MyD88)和Toll/白介素-1受体/耐受性衔接蛋白(TRIF)(也称为TICAM-1)对LPS形成响应。这种募集可允许IRAK族成员和TNF受体-相关因子6(TRAF6)的相互作用和激活，从而激活能控制炎性细胞因子生成NF-κB的MAP和激酶途径(Akira&Takeda，Nat.Rev.Immunol.4：499-511(2004))。

尽管该NF-κB的MAP和激酶途径在脂多糖(LPS)治疗后数小时内在巨噬细胞中被短暂激活，如TNF等促炎症细胞因子的生成可持续多达24小时。因此，该炎性细胞因子的生成便成为以先引发后跟“维持”期为特征的炎症过程的一部分。该维持期通常在炎症引发剂分解后终止。维持的细胞因子生成对于保持炎症状态和炎症性疾病的形成非常重要，因为许多该类事件会在接近持续炎症应答的末期出现的炎症调节的破坏时达到最高峰。因此，持续TNF生成与许多炎症性疾病的病理学相关。

因此，可影响持续TNF生成的药剂可用于开发治疗炎症性疾病的疗法。

发明内容

综述

本发明涉及发现4-1BB配体(4-1BBL)对于在介导巨噬细胞激活中非常重要的促炎症细胞因子的生成的作用。特别地，本发明涉及发现4-1BBL对于导致炎症的肿瘤坏死因子(TNF)持续生成非常重要的后期信号转导事件的作用。4-1BBL在后期细胞因子生成中的作用依赖于4-1BB。因此，本发明涉及4-1BBL依赖于其已知受体4-1BB的新功能，并提供了减少炎性细胞因子生成的方法。本发明还涉及4-1BBL拮抗剂和阻断剂，以及包含该种拮抗剂和阻断剂的药物组合物和制造物品。此外，本发明提供了筛选4-1BBL阻断剂和拮抗剂的方法。

本发明的一方面为包含4-1BBL阻断剂和药学可接受的载体的药物组合物，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。该组合物中可采用治疗有效量的该阻断剂。

本发明的一方面为包含4-1BBL阻断剂和作为抗炎药物的第二药剂的药物组合，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。该组合中可采用治疗有效量的该阻断剂和/或该抗炎药物。该抗炎药物可以是特异性针对肿瘤坏死因子的抗体。

本发明的另一方面是特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

本发明的另一方面是特异性结合哺乳动物4-1BBL的可溶性4-1BB。在部分实施方式中，该哺乳动物4-1BBL是人、小鼠、兔、猪或马的4-1BBL。在部分实施方式中，该可溶性4-1BB具有对应于人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186、对应于小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187、对应于人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186、对应于小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187或另一哺乳动物4-1BB中的相应区域的序列。在部分实施方式中，该可溶性4-1BB具有SEQ ID NO：7，8，20或21的序列。

本发明的另一方面是包含容器的制造物品，该容器中包含4-1BBL阻断剂和对该4-1BBL阻断剂在减少炎症和/或减少炎性细胞因子生成中的使用说明。在部分实施方式中，对该4-1BBL阻断剂的使用的说明包括对该4-1BBL阻断剂在炎症性疾病治疗中的使用的说明。该容器中可采用治疗有效量的该阻断剂。

在部分实施方式中，该炎症性疾病为类风湿关节炎，青少年类风湿关节炎，牛皮癣关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，Crohn病，类风湿关节炎，***性青少年慢性关节炎，骨质疏松症，或肠应激综合征。

本发明的另一方面是减少哺乳动物中炎性细胞因子生成的方法，其包括向该哺乳动物施用4-1BBL阻断剂。可施用治疗有销量的该阻断剂。在部分实施方式中，该方法进一步包括鉴定患有或易患炎症性疾病的哺乳动物。在部分实施方式中，该哺乳动物为人、小鼠、兔、猪或马。

本发明的另一方面是减少哺乳动物中炎症的方法，其包括向该哺乳动物施用4-1BBL阻断剂。可施用治疗有销量的该阻断剂。在部分实施方式中，该哺乳动物为人、小鼠、兔、猪或马。

本发明的另一方面是筛选4-1BBL阻断剂的方法，其包括(a)将表达4-1BBL的细胞与候选药剂接触；和(b)检测该候选药剂是否减少炎性细胞因子的生成，或者该候选药剂是否防止4-1BBL寡聚化，其中如果该候选药剂减少炎性细胞因子的生成或能防止4-1BBL寡聚化，则该候选药剂为4-1BBL阻断剂。在部分实施方式中，该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或IL-6。在部分实施方式中，该细胞为人细胞，巨噬细胞和/或RAW264.7细胞。

本发明的另一方面是筛选4-1BBL阻断剂的方法，其包括(a)向哺乳动物施用候选药剂；和(b)检测该候选药剂是否减少炎症或减少炎性细胞因子的生成，其中如果该候选药剂在该哺乳动物体内减少炎症或减少炎性细胞因子的生成，则该候选药剂为4-1BBL阻断剂。在部分实施方式中，该哺乳动物具有炎症性疾病。在部分实施方式中，该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或者减少20％，25％，30％或超过30％。。在部分实施方式中，该哺乳动物为小鼠、大鼠、兔或猪。

在本发明的部分实施方式中，该4-1BBL为哺乳动物4-1BBL。在部分实施方式中，该4-1BBL是人、小鼠、兔、猪或马的4-1BBL。在部分实施方式中，该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2中所示的序列。该部分实施方式中，该阻断剂为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。在部分实施方式中，该阻断剂为具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38，和45-56的序列的寡聚核苷酸。在部分实施方式中，该阻断剂为结合人4-1BBL的可溶性4-1BB。在部分实施方式中，该可溶性4-1BB具有对应于人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186、对应于小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187、对应于人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186或对应于小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187的序列。在部分实施方式中，该阻断剂为具有SEQ ID NO：7，8，20或21所示的序列的可溶性4-1BB。在部分实施方式中，该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或IL-6。

除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等同于本发明所属领域普通技术人员的普遍理解。尽管其它与此处所述类似或等同的方法和材料也可用于对本发明的实施，下文描述了适用的方法和材料。此处涉及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献均在此全文引用作为参考。如同本发明所述领域的普通技术人员的一般理解，氨基酸代号可包括全称、三字母或单字母代号。在产生冲突的情况下，将受本说明书包括定义所支配。此外，该材料、方法和实施例仅作阐释目的，并非意在限制。

从下文具体描述和权利要求中可显而易见地得到本发明的其它特征和优势。

附图说明

图1A-D为显示了4-1BBL是TLR4-相互作用蛋白的结果。(A)以编码TLR4的氨基酸653-839和4-1BBL的氨基酸5-254(克隆1)，4-1BBL的氨基酸3-254(克隆2)，显性阴性p38α(AF)、p53或核纤层蛋白的表达质粒转染的酵母细胞在缺组氨酸的培养基上的生长。4-1BBL，而非无关蛋白，可与TLR4胞内结构域相互作用。(B)

对以空质粒(对照)或表达红血球凝集素-标记的4-1BBL(HA-4-1BBL)和Flag-标记的TLR4或IL-3R的质粒转染的293T细胞进行免疫测定，在转染后24小时进行细胞溶解；三分之二的溶解产物被抗红血球凝集素(HA)免疫沉淀(IP)。TLR4，而非IL-3R，被4-1BBL下拉(pulled down)。(C)以表达GFP-标记的4-1BBL和Flag-标记的TLR4、缺失胞质结构域的TLR4(TLR4-ΔCyt)、IL-3R(左)或者Myc-标记的TLR4或具有P712H替换的TLR4(TLR4-P712H；右)的质粒转染的293T细胞的免疫测定；以抗-Flag或抗-Myc进行溶解产物的免疫沉淀。该TLR4胞内结构域涉及与4-1BBL的相互作用，且该TLR4 Toll-IL-1R结构域的不同部分与4-1BBL和MyD88相互作用。(D)以表达单独的Flag-标记的TLR4和GFP或者GFP-标记的4-1BBL、缺失胞质结构域的4-1BBL(4-1BBL-ΔCyt)、缺失胞外结构域的4-1BBL(4-1BBL-ΔExt)或仅包含胞质结构域的4-1BBL(4-1BBL-Cyt)的质粒转染的293T细胞的免疫测定。4-1BBL需要4-1BBL胞质结构域和与该细胞膜的联系，从而与TLR4相互作用。IP：免疫沉淀；IB：免疫印迹。结果代表两至三个独立实验。

图2A-D为显示了4-1BBL抑制的体内作用的结果。(A)以0.5mg LPS/25g体重腹膜内注射的野生型和4-1BBL-缺陷小鼠的存活。4-1BBL敲除(KO)小鼠耐受LPS的致死量。以300μg LPS/25g体重(B)或500μg LPS/25g体重(C)联合同型对照IgG2a或抗-4-1BBL(250μg LPS/25g体重)腹膜内注射的野生型小鼠的存活。通过抗-4-1BBL的施用减小了LPS对野生型小鼠的致死效应。(D)来自注射了LPS的野生型或4-1 BBL-缺陷小鼠的血清中的TNF的ELISA。与野生型小鼠相比，4-1 BBL KO小鼠中的LPS-诱导的TNF生成大大降低。在(A)和(B)中采用了对数秩(Log-rank)检验。(A)中P＝0.0017；(B)的左图中P＝0.018；(B)的右图中P＝0.048。(C)中的数据表示为±s.d.*，P＜0.005，**，P＜0.001(学生t检验)。

图3A-H是显示LPS-刺激的巨噬细胞中持续的TNF生成对4-1BBL的需求的结果。(A)在未处理(无)或以LPS(100ng/mL；LPS)处理24小时的野生型(WT)或4-1BBL-缺陷(4-1BBL KO)腹膜巨噬细胞中TNF，IL-6，IL-1β或IL-12的p40链(Il-12p40)的ELISA。下方右图，由IL-1β(10ng/mL；对照)诱导的IL-6的生成。4-1BBL-缺陷型巨噬细胞比野生型巨噬细胞生成更少的TNF，IL-6和IL-12。(B和C)以LPS处理(时间，横轴)的野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞(B)或4-1BB-缺陷型巨噬细胞(4-1BB KO；C)的培养基中TNF生成的ELISA。4-1BBL对于LPS刺激后期TNF生成非常关键，但无需4-1BB促进持续的LPS-诱导的TNF生成。(D)以LPS处理(时间，横轴)的野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞的TNF mRNA的定量PCR。AU：任意单位。4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞中的TNF mRNA在LPS刺激后两小时达到类似数量的峰值，但在LPS刺激后期4-1BBL-缺陷型细胞中的TNF mRNA远低于野生型细胞。(E)以LPS(100ng/mL；时间，上方横条)刺激的野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞中TNF和甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH；对照)转录速率的核转录活性测定(nuclear run-on analysis)的RNA点印迹。在LPS刺激后一小时4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞中的均出现LPS引发的Tnf转录，但4-1BBL-缺陷型巨噬细胞的Tnf转录在LPS处理后期有所下降。(F)在LPS刺激后3小时野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞中TNF mRNA稳定性的实时PCR分析。使用放射菌素D(10μg/mL)抑制转录。数值为相对0小时的数值(设为100％)剩余百分比。4-1BBL的缺失对于TNF mRNA的稳定性具有较大的影响。(G)以放射标记的探针(左侧边缘)评估的LPS(时间，上方横条)刺激的野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞的核抽提物的EMSA。4-1BBL缺失对于LPS-诱导的NF-κB激活或LPS-诱导的转录因子AP-1激活没有影响。(H)以LPS(时间，上方横条)刺激的野生型或4-1BBL-缺陷型巨噬细胞的溶解产物的免疫印迹。NF-κB和MAP激酶途径未受到缺失、p-、磷酸化的明显影响。^*，P＜0.01，和^**，P＜0.005，相对对照(学生t检验)。数据为三次重复的平均±s.d.(A-D)并代表了二至三次实验(A-H)。

图4A-D是显示RAW264.7巨噬细胞中持续的TNF生成对4-1BBL的需求的结果。(A)以含p抑制因子对照siRNA或者4-1BBL-siRNA#1或#2稳定转染的RAW 264.7细胞。通过免疫印迹检测4-1BBL的蛋白水平。(B)以LPS(100ng/mL)处理指定时间的对照和4-1BBL抑制(knochdown)细胞中测定的TNF生成。(C)以肽聚糖(PG，10μg/mL)，聚I:C(25μg/mL)，LPS(100ng/mL)，CpG(5μg/mL)或培养基处理24小时后测定对照和4-1BBL抑制细胞中的TNF生成。两种siRNAs均有效抑制RAW264.7细胞(A)中的4-1BBL表达，并抑制LPS-和其它TLR配体诱导的TNF生成(B和C)。4-1BBL对于以I-κB-α降解反映的RAW264.7细胞中LPS-诱导的NF-κB激活没有作用(D)。数据显示为两次重复的三个独立实验的平均±s.d.。*，P＜0.05，和**，P＜0.01相对对照。(a)中的结果代表3次实验。

图5A-B为显示了4-1BB未涉及RAW264.7巨噬细胞中LPS-诱导的TNF生成的结果。(A)以含p抑制因子对照siRNA，4-1BBL-siRNA#1或#2稳定转染的RAW 264.7细胞。通过RT-PCR检测4-1BB。(B)以LPS(100ng/mL)处理24小时的对照和4-1BBL抑制细胞中测定的TNF生成。小干扰RNA有效地抑制了RAW264.7细胞中的4-1BB生成(A)，但对LPS-诱导的TNF生成未观察到作用(B)。数据显示为两次重复的三个独立实验的平均±s.d.。

图6A-D为显示了4-1BB涉及巨噬细胞中TLR-配体诱导的TNF生成的结果(A)以空(对照)或HA-4-1BBL表达载体联合Flag-TLR2，Flag-TLR3，Flag-TLR4，或Flag-TLR9转染293T细胞。转染后24小时溶解细胞。以抗-Flag抗体对细胞溶解产物进行免疫印迹，以抗-HA进行免疫沉淀后以抗-HA和抗flag抗体进行免疫印迹。在共免疫沉淀测定中所有测试的TLR均被4-1BBL下拉。(B)以Pam3(1μg/mL)，聚I:C(25μg/mL)，LPS(100ng/mL)，R848(100nM)，CpG(5μg/mL)，IL-1β(10ng/mL)或培养基(无)处理野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞。在处理后24小时测定TNF生成。在4-1BBLKO细胞中Pam3(TLR2配体)-，PolyI:C(TLR3配体)-，R848(TLR7&8配体)-，CpG(TLR9配体)-诱导的TNF生成被减少。(C)以0，1，2.5或5μg/mL的处理野生型和TLR4-缺陷型巨噬细胞并孵育24小时，或者(D)以1μg/mL的CpG DNA处理并在指定时间点收集上清液以测定TNF生成。在使用低剂量的CpG(1μg/mL)时，在TLR4-缺陷型巨噬细胞中出现了少量但具有统计意义的TLR9-诱导的TNF生成的下降。数据表示为三次重复的平均±s.d.。*，P＜0.05，**，P＜0.01，***，P＜0.005.结果代表两至四次实验。

图7A-F是显示LPS-处理的巨噬细胞中持续的TNF生成对4-1BBL诱导和细胞表面定位的需求的结果。(A)来自以LPS处理(时间，上方横条)的野生型巨噬细胞和TLR4(TLR4KO)、MyD88(MyD88KO)或TRIF(TRIF KO)缺陷的巨噬细胞的溶解产物中4-1BBL的免疫印迹。LPS以TLR4-、MyD88-和TRIF-依赖性方式诱导了巨噬细胞中4-1BBL的快速表达。(B)对无预处理(无)或者以NF-κB(20μM柳氮磺胺吡啶)、p38(10μM SB203580)、Jnk(5μMSP600125)或MEK(10μM PD98059)的抑制剂预处理1小时的野生型巨噬细胞，以LPS处理(时间，上方横条)后的4-1BBL mRNA的半定量PCR。LPS-诱导的4-1BBL mRNA被NF-κB抑制剂柳氮磺胺吡啶和蛋白酶体抑制剂MG-132(数据未显示)有效地抑制。此外，该p38抑制剂SB203580、Jnk抑制剂SP600125和Mek抑制剂PD98059也对4-1BBL表达具有一定抑制作用。(C)以编码4-1BBL的重组腺病毒(Adv)感染18小时后，对LPS-诱导的4-1BBLmRNA(处理1小时；LPS)或异位(ectopically)表达的4-1BBL mRNA的稳定性的实时PCR分析。放射菌素D可用于抑制转录。数值为相对0小时的数值(设为100％)剩余百分比。LPS-诱导的mRNA稳定性的改变也可涉及LPS-诱导的4-1BBL表达。(D)以LPS处理(时间，图例)的野生型腹膜巨噬细胞的4-1BBL表达的流式细胞计数：右侧，表面表达；左侧，以0.1％皂素形成透过性的细胞中的总表达。LPS-诱导的4-1BBL定位在细胞表面上。(E)野生型腹膜巨噬细胞经过(+)或未经(-)布雷菲德菌素A(3μg/mL)预孵育1小时，然后以LPS处理(时间，左侧边缘)并以抗-4-1BBL免疫染色后免疫荧光显微观察。初始放大x 100。布雷菲德菌素A通过抑制蛋白从内质网向高尔基体的易位阻断蛋白细胞表面的易位。(F)如E所述进行处理的细胞的溶解产物中的4-1BBL和TNF mRNA的半定量PCR。布雷菲德菌素A在1小时后既未影响LPS-诱导的4-1BBLmRNA的增加，也未影响LPS-诱导的TNF mRNA，但在2、4和6小时减少了TNF mRNA。GAPDH(A，B，F)：甘油醛磷酸脱氢酶(加载对照)。数据表示了三次独立实验。

图8A-F为显示了TLR配体，而非IL-1β，在巨噬细胞中诱导4-1BBL表达的结果。以LPS，IL-1β，聚I:C，肽聚糖，CpG DNA，或R848处理野生型巨噬细胞指定的时间段。采集未处理、以LPS或IL-1β处理24小时的细胞的培养上清液，并通过ELISA测定IL-6水平。(B)中的数据表示为三次重复的平均±s.d.。4-1BBL表达可采用抗-4-1BBL抗体经Western印迹进行分析。GAPDH被用作对照。结果代表两至三次实验。

图9A-G为显示了4-1BBL的表达和交联引发TNF生成的结果。以不同剂量(上方横条和横轴)的不表达(对照)或表达4-1BBL的腺病毒感染的野生型巨噬细胞(A)，野生型和4-1BB-缺陷型巨噬细胞(B)，野生型和TLR-缺陷型巨噬细胞(C)，野生型和TLR-2缺陷型巨噬细胞(D)或者野生型和TRF-缺陷型巨噬细胞(E)生成的4-1BBL的免疫印迹分析(上图)和TNF的ELISA分析(下图)。PFU：空斑形成单位。4-1BBL表达以不需要4-1BB(B)的剂量依赖性方式(A)诱导TNF生成。TNF诱导在由TLR4-/-小鼠分离的巨噬细胞中受到部分损伤(C)，并在TLR2-缺陷型巨噬细胞中有所下降(D)。TNF诱导独立于TRIF，因为TRIF缺陷对于4-1BBL-诱导的TNF生成没有影响(E)。(F)以联合培养基的山羊抗人Fc(抗-Fc；1.5μg/mL)、4-1BB-Fc(5μg/mL)或单独的培养基(无)处理24小时后的野生型巨噬细胞或者4-1BBL、MyD88、TRIF、TLR2、TLR4或MyD88和TRIF同时缺陷的巨噬细胞生成的TNF的ELISA。需要两个以上4-1BBL分子的交联以引发TNF生成。(G)与单独的培养基(无)或LPS或者与Fc、4-1BB-Fc或抗-4-1BBL(α-4-1BBL；0，2 or 5μg/mL，分别添加同型抗体IgG2a至总计为5μg/mL)孵育24小时后的野生型巨噬细胞的TNF生成的ELISA。4-1BB-Fc和抗-4-1BBL抗体均抑制LPS-诱导的TNF生成。^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，^***，P＜0.005，相对对照(学生t检验)。数据为三次重复样本的平均±s.d.，并代表二至四次实验。

图10A-I显示了存在两个连续TLR4复合物。(A)以LPS(时间，上方横条)处理的野生型巨噬细胞的免疫测定；总细胞溶解产物(溶解产物；上方)或与抗-TLR4、抗-MyD88或抗-4-1BBL免疫沉淀的溶解产物可通过与抗-4-1BBL、抗-TLR4和/或抗-MyD88进行免疫印迹分析。虚线框，同型抗体(免疫沉淀的阴性对照)；实线框，4-1BBL或MyD88的免疫印迹的阳性对照。在LPS-处理的巨噬细胞中，MyD88-TLR4复合物负责初始细胞应答，而4-1BBL-TLR4复合物涉及持续的TNF生成。(B)Flag-TLR4，而非flag-4-1BBL，被MyD88所下拉，显示MyD88不能与4-1BBL相互作用。(C)4-1BBL与TRAF6相互作用，而不与TRAF2相互作用。(D)TRAF6的抑制损伤了LPS、聚I:C和IL-1β诱导的细胞因子生成，但对于TNF-诱导的IL-6生成没有影响。(E)以表达GFP(Adv-GFP)或4-1BBL(Adv-4-1BBL)的腺病毒感染(时间，上方横条)的野生型巨噬细胞的核抽提物的EMSA，以放射标记的探针分析(左侧边缘)。LPS(底部右侧)，LPS-处理的样本(NF-κB的阳性对照)。4-1BBL的表达激活CREB和C/EBP，但不激活NF-κB。(F)在E中所述的细胞的总溶解产物中的各种蛋白(左侧边缘)的免疫印迹。(G)以表达4-1BBL的腺病毒感染，感染后6小时以NF-κB(20μM柳氮磺胺吡啶)、p38(10μM SB203580)、Jnk(5μM SP600125)或MEK(10μM PD98059)的抑制剂处理，并在感染后24时进行分析的野生型巨噬细胞的TNF生成的ELISA。^*，P＜0.01，^**，P＜0.005，相对对照(学生t检验)。(H)顶部，以表达4-1BBL的腺病毒感染(时间，上方横条)的野生型巨噬细胞的TNF mRNA的半定量PCR。底部，以腺病毒感染18小时或以LPS处理1小时的野生型巨噬细胞的TNF mRNA的稳定性。放射菌素D可用于抑制转录。数值为相对0小时的数值(设为100％)剩余百分比。数据表示三次实验的平均±s.d.(G)，并表示两个(A，G，H)、三个(E)或四个(F)实验。在过量表达4-1BBL的细胞中未观察到IκBα的降解(F)。4-1BBL的表达引发p38、Jnk和Erk的部分磷酸化(F)，并对p38、Jnk和Erk(但不抑制NF-κB)减少的4-1BBL-介导的TNF生成形成抑制(G)。4-1BBL的删除导致了后期更少的LPS-诱导的TNF mRNA转录，而4-1BBL过量表达导致了更多的TNF mRNA(H)。TNF转录物在过量表达4-1BBL和LPS-处理的细胞中具有类似的半衰期(H)。(I)LPS-处理的巨噬细胞中的连续信号转导的模型。TLR4-LPS结合导致数小时内包括TNF的炎症基因的MyD88-和TRIF-依赖性表达。4-1BBL被该早期应答所诱导，并易位至细胞表面，从而与TLR相互作用，并启动TNF等炎症基因的持续表达的信号转导。

图11A-F总结了显示4-1BBL与IL-6诱导的关系的数据。响应LPS时，4-1BBL-/-小鼠生成的IL-6明显少于野生型小鼠(A)。来自野生型小鼠的巨噬细胞比来自4-1BBL-/-小鼠的巨噬细胞生成了明显更多的IL-6(B)。以Pam3、聚I:C、LPS、R848和CpG处理的野生型巨噬细胞比以相同诱导剂处理的4-1BBL-/-巨噬细胞生成明显更多的IL-6(C)。与LPS和4-1BB-Fc孵育的巨噬细胞比单独与LPS孵育的巨噬细胞生成了明显更少的IL-6，而与LPS和上升浓度的抗-4-1BBL抗体孵育的巨噬细胞显示了下降的IL-6生成水平(D)。由4-1BBL-特异性siRNA明显减少了4-1BBL表达的RAW264.7细胞比用对照siRNA处理的RAW264.7细胞生成了明显更少的IL-6(E)。由4-1BBL-特异性siRNA明显减少了4-1BBL表达并以肽聚糖(PG，10μg/mL)、聚I:C(25μg/mL)、LPS(100ng/mL)、CpG(5μg/mL)处理的细胞比用对照siRNA转染并以肽聚糖(PG，10μg/mL)、聚I:C(25μg/mL)、LPS(100ng/mL)、CpG(5μg/mL)处理的细胞生成了明显更少的IL-6(图11F)。

图12是显示小鼠4-1BBL(A)和人4-1BBL(B)的结构域的示意图。“Cyt”指细细胞质结构域，“TM”指跨膜结构域，“Ext”指胞外结构域，“Sig”指信号肽。

图13为显示了小鼠4-1BB结构域(A)、人4-1BB结构域(B)和可溶性小鼠4-1BB-人Ig-Fc融合蛋白(C)的示意图。“Cyt”指细胞质结构域，“TM”指跨膜结构域，“Ext”指胞外结构域，“Sig”指信号肽。

发明详述

本发明涉及发现4-1BB配体(4-1BBL)对于在巨噬细胞激活中的促炎症细胞因子的生成的作用。特别地，本发明涉及可形成导致过度持续的炎症的炎症细胞因子(如TNF)的持续生成的后期信号转导事件中4-1BBL作用的发现。4-1BBL在后期信号转导中的作用依赖于4-1BB。因此，本发明提供了4-1BBL阻断剂，以及能够通过独立于4-1BB的方式减少炎性细胞因子(如TNF和IL-6)的生成的包含该种阻断剂的药物组合物和制造物品。本发明提供了减少炎症的方法，减少炎性细胞因子生成的方法，以及筛选4-1BBL阻断剂的方法。

4-1BBL多肽和核酸

此处描述的研究显示巨噬细胞中TNF表达和持续TNF生成的初始诱导受到早期和后期信号转导时间的调节。Toll样受体(TLR)4-介导的巨噬细胞中的TNF生成通常在数小时内发生，并维持几乎一天(参见Galanos等人Proc.Natl.Acad.ScL USA 76：5939-43(1979))。维持的TNF生成涉及受到细胞表面4-1BB配体(4-1BBL)控制的TLR-信号转导。该4-1BBL功能独立于骨髓分化初次应答基因88(MyD88)和Toll/白介素-1受体/耐受性衔接蛋白(TRIF)，但依赖于TNF受体-相关因子6(TRAF6)。因此，信号小体(signalsome)TLR4/MyD88/TRIF负责炎症基因的启动和早期表达，而4-1BBL负责后期持续TNF生成。4-1BBL是巨噬细胞中响应炎症刺激的早期诱导的蛋白之一，并仅在巨噬细胞激活的早期被诱导。新合成的4-1BBL易位至细胞表面，以针对后期持续TNF生成形成新的信号转导期。因此，与炎性细胞因子(例如，TNF或IL-6)的过量生成或是与持续炎症应答的调节故障相关的疾病可通过能够抑制或减少4-1BBL多肽活性或是4-1BBL核酸表达的药剂进行治疗。

4-1BBL(4-1BB配体)是激活的抗原呈递细胞(如激活的B细胞和巨噬细胞)上表达的II型细胞表面糖蛋白的TNF家族的成员。4-1BBL多肽已为本领域所知，并可来自于任何来源，例如，来自小鼠，兔，猪，狗，牛，猴或人。小鼠4-1BBL多肽的范例如下(GenBank索取号NP_033430)：

1 MDQHTLDVED TADARHPAGT SCPSDAALLR DTGLLADAAL LSDTVRPTNA

51 ALPTDAAYPA VNVRDREAAW PPALNFCSRH PKLYGLVALV LLLLIAACVP

101 IFTRTEPRPA LTITTSPNLG TRENNADQVT PVSHIGCPNT TQQGSPVFAK

151 LLAKNQASLC NTTLNWHSQD GAGSSYLSQG LRYEEDKKEL VVDSPGLYYV

201 FLELKLSPTF TNTGHKVQGW VSLVLQAKPQ VDDFDNLALT VELFPCSMEN

251 KLVDRSWSQL LLLKAGHRLS VGLRAYLHGA QDAYRDWELS YPNTTSFGLF

301 LVKPDNPWE (SEQ ID NO：1)

人4-1BBL多肽的范例如下(GenBank索取号P41273)：

1 MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL LAAACAVFLA

51 CPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV

101 LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR

151 RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ

201 GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS

251 PRSE (SEQ ID NO：2)

4-1BBL可根据功能或序列进行鉴定。例如，尽管本发明部分基于如下发现：在巨噬细胞中，4-1BBL以不依赖于4-1BB的方式介导TNF生成，同样已知4-1BBL可与4-1BB(在激活的CD4和CD8T细胞上表达的跨膜蛋白的TNF受体超家族的成员)相互作用，从而在T细胞受体激活过程中生成共刺激信号。Watts，Annu.Rev.Immunol.23：23-68(2005)。此外，图12显示了人和小鼠4-1BBL的功能结构域。

此处所用的“4-1BBL”或“4-1BBL多肽”包括该全长多肽的任意生物活性片段，以及适合用作免疫原来形成针对生物活性4-1BBL的抗体的任意片段。因此，4-1BBL多肽可具有与SEQ ID NO：1或2所示的序列基本一致的氨基酸序列。一般而言，术语“基本一致的”表示一个氨基酸序列与参考序列的区别仅在保守氨基酸替换，例如，一个氨基酸替换另一个同类氨基酸(例如，缬氨酸替换甘氨酸，精氨酸替换赖氨酸)，或者区别在于位于不破坏该蛋白功能的氨基酸序列位置上的一个或多个非保守替换、删除或***。如果多肽(或核酸)序列与参考序列显示了约50％的同源性，例如，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或95％以上的同源性，则其与参考序列基本一致。例如，4-1BBL多肽可与SEQ ID NO：1和2具有至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或超过90％的一致性。

4-1BBL核酸为编码4-1BBL多肽的DNA或RNA的聚合物。4-1BBL核酸可以是基因组DNA和信使RNA。它可被整合进入质粒载体或病毒DNA。它可以是单链或双链，环状或线性。4-1BBL核酸的范例包括，但不限于，编码SEQ ID NO.1和2所示的小鼠和人4-1BBL多肽序列的核酸。编码小鼠4-1BBL多肽(SEQ ID NO：1)的4-1BBL核酸的范例为如下序列，其可通过索取号NM_009404由GenBank获得：

1 atggaccagc acacacttga tgtggaggat accgcggatg ccagacatcc

51 agcaggtact tcgtgcccct cggatgcggc gctcctcaga gataccgggc

101 tcctcgcgga cgctgcgctc ctctcagata ctgtgcgccc cacaaatgcc

151 gcgctcccca cggatgctgc ctaccctgcg gttaatgttc gggatcgcga

201 ggccgcgtgg ccgcctgcac tgaacttctg ttcccgccac ccaaagctct

251 atggcctagt cgctttggtt ttgctgcttc tgatcgccgc ctgtgttcct

301 atcttcaccc gcaccgagcc tcggccagcg ctcacaatca ccacctcgcc

351 caacctgggt acccgagaga ataatgcaga ccaggtcacc cctgtttccc

401 acattggctg ccccaacact acacaacagg gctctcctgt gttcgccaag

451 ctactggcta aaaaccaagc atcgttgtgc aatacaactc tgaactggca

501 cagccaagat ggagctggga gctcatacct atctcaaggt ctgaggtacg

551 aagaagacaa aaaggagttg gtggtagaca gtcccgggct ctactacgta

601 tttttggaac tgaagctcag tccaacattc acaaacacag gccacaaggt

651 gcagggctgg gtctctcttg ttttgcaagc aaagcctcag gtagatgact

701 ttgacaactt ggccctgaca gtggaactgt tcccttgctc catggagaac

751 aagttagtgg accgttcctg gagtcaactg ttgctcctga aggctggcca

801 ccgcctcagt gtgggtctga gggcttatct gcatggagcc caggatgcat

851 acagagactg ggagctgtct tatcccaaca ccaccagctt tggactcttt

901 cttgtgaaac ccgacaaccc atgggaatga (SEQ ID NO：3)

编码人4-1BBL多肽(SEQ ID NO：2)的4-1BBL核酸的范例为如下序列，其可通过索取号U03398由GenBank获得：

1 gtcatggaat acgcctctga cgcttcactg gaccccgaag ccccgtggcc

51 tcccgcgccc cgcgctcgcg cctgccgcgt actgccttgg gccctggtcg

101 cggggctgct gctgctgctg ctgctcgctg ccgcctgcgc cgtcttcctc

151 gcctgcccct gggccgtgtc cggggctcgc gcctcgcccg gctccgcggc

201 cagcccgaga ctccgcgagg gtcccgagct ttcgcccgac gatcccgccg

251 gcctcttgga cctgcggcag ggcatgtttg cgcagctggt ggcccaaaat

301 gttctgctga tcgatgggcc cctgagctgg tacagtgacc caggcctggc

351 aggcgtgtcc ctgacggggg gcctgagcta caaagaggac acgaaggagc

401 tggtggtggc caaggctgga gtctactatg tcttctttca actagagctg

451 cggcgcgtgg tggccggcga gggctcaggc tccgtttcac ttgcgctgca

501 cctgcagcca ctgcgctctg ctgctggggc cgccgccctg gctttgaccg

551 tggacctgcc acccgcctcc tccgaggctc ggaactcggc cttcggtttc

601 cagggccgct tgctgcacct gagtgccggc cagcgcctgg gcgtccatct

651 tcacactgag gccagggcac gccatgcctg gcagcttacc cagggcgcca

701 cagtcttggg actcttccgg gtgacccccg aaatcccagc cggactccct

751 tcaccgaggt cggaataacg cccagcctgg gtgcagccca cctggacaga

801 gtccgaatcc tactccatcc ttcatggaga cccctggtgc tgggtccctg

851 ctgctttctc tacctcaagg ggcttggcag gggtccctgc tgctgacctc

901 cccttgagga ccctcctcac ccactccttc cccaagttgg accttgatat

951 ttattctgag cctgagctca gataatatat tatatatatt atatatatat

1001 atatatttct atttaaagag gatcctgagt ttgtgaatgg acttttttag

1051 aggag ttgt ttgggggggg ggtcttcgac attgccgagg ctggtcttga

1101 actcctggac ttagacgatc ctcctgcctc agcctcccaa gcaactggga

1151 ttcatccttt ctattaattc attgtactta tttgcctatt tgtgtgtatt

1201 gagcatctgt aatgtgccag cattgtgccc aggctagggg gctatagaaa

1251 catctagaaa tagactgaaa gaaaatctga gttatggtaa tacgtgagga

1301 atttaaagac tcatccccag cctccacctc ctgtgtgata cttgggggct

1351 agcttttttc tttctttctt ttttttgaga tggtcttgtt ctgtcaacca

1401 ggctagaatg cagcggtgca atcatgagtc aatgcagcct ccagcctcga

1451 cctcccgagg ctcaggtgat cctcccatct cagcctctcg agtagctggg

1501 accacagttg tgtgccacca cacttggcta actttttaat ttttttgcgg

1551 agacggtatt gctatgttgc caaggttgtt tacatgccag tacaatttat

1601 aataaacact catttttcc (SEQ ID NO：4)

4-1BBL核酸还可编码SEQ ID NO.1和2所示多肽序列的片段，条件是该核酸编码能够如同上述讨论适合用作免疫原来形成针对生物活性4-1BBL的抗体的生物活性多肽或片段。

一般4-1BBL阻断剂

4-1BBL阻断剂可以是抑制或减少4-1BBL的表达和/或活性的大分子或小分子。4-1BBL阻断剂可以抑制或减少4-1BBL的活性。该种4-1BBL阻断剂的范例包括，但不限于，4-1BBL-特异性抗体，4-1BB的可溶性形式，以及干扰蛋白易位至细胞表面的药剂或小分子，如布雷菲德菌素A。这些4-1BBL阻断剂可通过干扰4-1BBL寡聚化和/或干扰TNF生成中涉及的后期信号转导事件中4-1BBL与适当的信号转导分子(例如，TLR和TRAF6)的相互作用形成作用。此处所用的术语“4-1BBL寡聚化”指4-1BBL-介导的炎性细胞因子(例如，TNF或IL-6)生成所需的4-1BBL分子的聚集物的形成。4-1寡聚化指形成超过两个4-1BBL分子的聚集物，例如，三至四个4-1BBL分子的聚集物。4-1BBL阻断剂干扰蛋白向细胞表面的易位，因为在信号转导后期的正确运行需要4-1BBL的细胞表面定位。

4-1BBL阻断剂还可通过抑制或减少4-1BBL核酸的表达形成作用。4-1BBL阻断剂可在转录或翻译水平形成作用，从而改变细胞生成的4-1BBL的数量。4-1BB阻断剂可减少4-1BBL mRNA转录物的生成或降低该mRNA转录物的稳定性。这些阻断剂包括，但不限于，寡聚核苷酸如反义RNA，siRNA和核酶。该种基于寡聚核苷酸的4-1BBL阻断剂可在生理条件(例如，约37℃，pH 7至7.8，以及生理浓度的电解质)或者在严格或高度严格的条件下与4-1BBL核酸杂交，并抑制或减少该4-1BBL核酸的表达。该阻断剂还可包括涉及4-1BBL表达或活性的其它分子的抑制剂。

寡聚核苷酸是长度大于3个核苷酸的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。低聚核苷酸可包含天然存在的核苷酸；合成的、修饰的或是假核苷酸，如硫代磷酸酯；以及具有可测标记如P³²、生物素或地高辛配基的核苷酸。

可减少4-1BBL核酸的表达的低聚核苷酸，即本发明的低聚核苷酸，可与该4-1BBL核酸完全互补。替代性地，在序列间可容许一些变化。能够与4-1BBL核酸在生理条件下(例如，生理温度和盐浓度)或在严格或高度严格的杂交条件下进行杂交的寡聚核苷酸具有充分的互补性来抑制4-1BBL核酸的表达。一般而言，严格杂交条件可选定为较特定离子强度pH下的热熔点(T_m)低大约5℃。然而，根据本文另行指定的目标严格性程度，严格条件包括低于该选定序列的热熔点约1℃至约20℃范围内的温度。包含例如，2，3，4或5或者更多个与4-1BBL编码序列精确互补的邻近核苷酸伸展(stretches)，且分别被不与相邻编码序列互补的邻近核苷酸伸展所分离的抑制性寡聚核苷酸，可抑制4-1BBL核酸的功能。一般而言，每个邻近核苷酸伸展的长度至少为4，5，6，7，或8或者更多个核苷酸。非互补性***序列的长度可以是1，2，3或4个核苷酸。本领域技术人员可以通过与正义核酸杂交的寡聚核苷酸的计算熔点简单估算在抑制特定目标核酸表达中所能允许的错配程度。本发明的基于低聚核苷酸的4-1BBL阻断剂包括，例如，小干扰RNA(siRNA)，反义核酸或核酶。

4-1BBL阻断剂抑制或减少4-1BBL的表达和/或活性的量可以是，例如，2％，5％，10％，20％，40％，60％，80％，95％或100％。4-1BBL的活性可通过本领域已知的方法测定，包括此处所述的方法，例如，但不限于，测定持续TNF生成，检测4-1BBL是否与TLR或TRAF6相互作用，例如，测定4-1BBL是否在细胞表面。4-1BBL的表达也可通过本领域已知的方法测定，包括但不限于，northern杂交以检测4-1BBL转录物的水平或者western杂交以检测4-1BBL多肽的水平。

下文详细讨论了各种类型的4-1BBL阻断剂的范例。

4-1BBL-特异性抗体

4-1BBL阻断剂可以是针对4-1BBL多肽的拮抗性抗体。术语“抗体”指免疫球蛋白分子，例如单克隆抗体，以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分。单克隆抗体是特异性结合特定抗原表位的抗体分子群。免疫球蛋白分子的免疫活性部分包括F(ab)和F(ab′)2片段。抗-4-1BBL抗体可以是，但不限于，鼠源、嵌合、人源化和/或全人源抗体。鼠源抗体是完全来自于鼠类来源的抗体，例如，来自由小鼠骨髓瘤细胞和小鼠B-淋巴细胞融合形成的鼠杂交瘤的抗体。嵌合抗体是可变区来自非人来源(例如，鼠或灵长动物)，而恒定区来自于人来源的抗体。人源化抗体具有来自于小鼠来源的抗原结合区(例如，决定簇互补区)，而剩余的可变区和恒定区来自于人类来源的抗体。全人源抗体是来自人类细胞或来自于携带人类抗体基因的转基因小鼠的抗体。

针对4-1BBL多肽的抗体为4-1BBL-特异性抗体，因此，它将结合4-1BBL多肽而不结合非4-1BBL多肽。4-1BBL-特异性抗体是拮抗性抗体，其干扰或阻断正确的4-1BBL功能。例如，参见图2A-D。拮抗性抗体可以，例如，干扰两个以上4-1BBL的寡聚化，或者阻断与持续TNF生成有关的下游信号转导分子(例如，TLR或TRAF6)的结合，从而减少炎性细胞因子的生成。例如，该种拮抗性抗体可结合两个4-1BBL，并防止介导细胞因子生成所需的两个以上4-1BBL的聚集物的形成。该种拮抗性抗体还可结合4-1BBL上的特定区域，从而阻止其与介导细胞因子生成所需的下游信号转导分子(例如，TLR2，TLR3，TLR4，TLR7，TLR8，TLR9和TRAF6)的结合。

抗4-1BBL抗体是否为拮抗性抗体可通过此处披露的方法进行测定。例如，可在该抗体存在或缺失的情况下测定炎性细胞因子(例如TNF)的生成。如果抗体的存在导致炎性细胞因子生成的水平或时间期限的下降，则该抗体是拮抗性抗体。

生成抗体的方法为本领域所公知。例如，可通过分离的4-1BBL多肽或该4-1BBL多肽的抗原性片段免疫适当的哺乳动物进行制备4-1BBL多克隆抗体。该哺乳动物可以是，例如，兔，山羊或小鼠。该4-1BBL多肽或抗原片段可采用重组DNA技术表达，通过化学合成制备，或者采用标准的蛋白纯化技术进行纯化。在免疫后的适当时间，可从该哺乳动物(例如，从该哺乳动物的血液或其它体液)分离抗体分子，并进一步采用标准技术(包括，但不限于，硫酸铵沉淀，凝胶过滤层析，离子交换层析或使用蛋白A的亲和层析)进行纯化。此外，可分离该哺乳动物的产抗体细胞并用于制备分泌4-1BBL单克隆抗体的杂交瘤细胞。制备单克隆抗体分泌杂交瘤细胞的技术已为本领域所知。例如，参见Kohler和Milstein，Nature256：495-97(1975)and Kozbor等人Immunol Today 4：72(1983)。4-1BBL单克隆抗体还可通过本领域已知的其它方法制备，例如，由重组DNA分子表达，或通过4-1BBL多肽筛选重组组合免疫球蛋白库。

生成嵌合和人源化单克隆抗体的方法同样为本领域公知，并包括，例如，涉及重组DNA技术的方法。可通过编码抗体分子的非人源可变区和人源恒定区的核酸的表达生成嵌合抗体。例如，参见Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.86：6851(1984)。可通过编码非人源抗原结合区(决定簇互补区)和人源可变区(无抗原结合区)以及人源恒定区的核酸的表达生成人源化抗体。例如，参见Jones等人，Nature 321：522-24(1986)；and Verhoeven等人，Science239：1534-36(1988)。可通过对仅表达人重和轻链基因的工程转基因小鼠的免疫生成完全人源抗体。此时，可通过常规的杂交瘤技术或的具有治疗用途的单克隆抗体。例如，参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。涉及抗体设计和生成的核酸和技术已为本领域公知。例如，参见，Batra等人，Hybridoma 13：87-97(1994)；Berdoz等人，PCR Methods Appl.4：256-64(1995)；Boulianne等人Nature 312：643-46(1984)；Carson等人，Adv.Immunol.38：274-311(1986)；Chiang等人，Biotechniques 7：360-66(1989)；Cole等人，MoI.Cell.Biochem.62：109-20(1984)；Jones等人，Nature321：522-25(1986)；Larrick等人，Biochem Biophys.Res.Commun.160：1250-56(1989)；Morrison，Annu.Rev.Immunol.10：239-65(1992)；Morrison等人，Proc.Nat′l Acad.ScL USA 81：6851-55(1984)；Orlandi等人，Pro.Nat′I Acad.Sci.U.S.A.86：3833-37(1989)；Sandhu，Crit.Rev.Biotechnol.12：437-62(1992)；Gavilondo和Larrick，Biotechniques 29：128-32(2000)；Huston和George，Hum.Antibodies.10：127-42(2001)；Kipriyanov和Le Gall，MoI.Biotechnol.26：39-60(2004)。

可溶性4-1BB

4-1BBL阻断剂还可以是可溶性4-1BB分子。4-1BB是激活的T细胞上表达的I型跨膜蛋白的TNF受体家族的成员。参见Watts，Annu.Rev.Immunol.23：23-68(2005)。示范性小鼠4-1BB为如下序列，其可通过索取号NP 035742在GenBank获取：

1 MGNNCYNVVV IVLLLVGCEK VGAVQNSCDN CQPGTFCRKY NPVCKSCPPS

51 TFSSIGGQPN CNICRVCAGY FRFKKFCSST HNAECECIEG FHCLGPQCTR

101 CEKDCRPGQE LTKQGCKTCS LGTFNDQNGT GVCRPWTNCS LDGRSVLKTG

151 TTEKDVVCGP PVVSFSPSTT ISVTPEGGPG GHSLQVLTLF LALTSALLLA

201 LIFITLLFSV LKWIRKKFPH IFKQPFKKTT GAAQEEDACS CRCPQEEEGG

251 GGGYEL(SEQ ID NO：5)

示范性人4-1BB为如下序列，其可通过索取号NP_001552在GenBank获取：

1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP

51 NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS

101 MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG

151 TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL

201 FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE

251 GGCEL (SEQ ID NO：6)

如图13所示的小鼠和人多肽，4-1BB多肽通常包括信号序列，胞外结构域，跨膜结构域以及细胞质结构域。

可溶性4-1BB指作为跨膜蛋白不结合生成它的细胞，且能够抑制和/或减少4-1BBL活性的4-1BB多肽。例如，可溶性4-1BB可以是由全长4-1BB的胞外结构域组成的单个多肽。此处所用的“全长4-1BB”是由具有编码它的内源性核酸的细胞所表达的多肽。全长4-1BB具有胞外结构域，跨膜结构域和细胞质结构域。它可以具有或不具有信号肽。相反地，可溶性4-1BB可以是任意非全长的4-1BB形式，至少它不作为跨膜蛋白结合细胞。可溶性4-1BB多肽的范例为对应于全长多肽胞外结构域的多肽，或是由C末端与不相关多肽片段(例如免疫球蛋白分子的Fc片段，例如，IgG₁ Fc片段，或是任意常规的蛋白质标记或是融合部分，例如GFP，HA以及FLAG和GST)融合的4-1BB胞外结构域的组成的融合多肽。可溶性4-1BB可以是多个多肽或是二聚体，例如实施例中讨论的小鼠4-1BB/Fc。同样为二聚体的可溶性4-1BB的范例为实施例部分讨论的小鼠4-1BB/人Ig-Fc多肽。

可溶性4-1BB多肽的范例为具有如下序列的小鼠4-1BB的胞外结构域：

23 VQNSCDN CQPGTFCRKY NPVCKSCPPS

51 TFSSIGGQPN CNICRVCAGY FRFKKFCSST HNAECECIEG FHCLGPQCTR

101 CEKDCRPGQE LTKQGCKTCS LGTFNDQNGT GVCRPWTNCS LDGRSVLKTG

151 TTEKDVVCGP PVVSFSPSTT ISVTPEGGPG GHSLQV (SEQ ID NO：7)

可溶性4-1BB多肽的另一范例为具有如下序列的人4-1BB的胞外结构域：

SLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP

51 NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS

101 MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG

151 TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSP (SEQ ID NO：8)

可溶性4-1BB多肽的其它实施例包括分别由SEQ ID NO：20和21所示的小鼠4-1BB的前186个氨基酸或人4-1BB的前185个氨基酸。

1 MGNNCYNVVV IVLLLVGCEK VGAVQNSCDN CQPGTFCRKY NPVCKSCPPS

51 TFSSIGGQPN CNICRVCAGY FRFKKFCSST HNAECECIEG FHCLGPQCTR

101 CEKDCRPGQE LTKQGCKTCS LGTFNDQNGT GVCRPWTNCS LDGRSVLKTG

151 TTEKDVVCGP PVVSFSPSTT ISVTPEGGPG GHSLQV (SEQ ID NO：20)

1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP

51 NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS

101 MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG

151 TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSP (SEQ ID NO：21)

可溶性4-1BB多肽还可在SEQ ID NO：7，8，20或21的N或C末端具有一个或多个附加的氨基酸，只要该多肽能够抑制或减少4-1BBL的活性，且如果该多肽由细胞生成，它不作为跨膜蛋白结合进入该细胞的膜。例如，可溶性4-1BB多肽可以是由融合至，例如谷胱甘肽s转移酶(GST)，人IgG的Fc区，组氨酸标记，或上述讨论的任意不相关氨基酸序列的SEQ ID NO：7，8，20或21组成的融合蛋白。可溶性4-1BB多肽还可以是胞外结构域的片段，例如，SEQ ID NO：7，8，20或21的片段，只要该片段具有生物活性，即该片段能够抑制或减少4-1BB活性。测定该片段是否具有生物活性，即，该片段是否能够抑制或减少4-1BBL活性的方法包括，但不限于，此处讨论和示范的方法，例如，通过测定响应LPS的细胞(如巨噬细胞)生成的炎性细胞因子的方法，且存在的4-1BB、可溶性4-1BB及其生物活性片段可来自任何来源。例如，它们可从小鼠、兔、猪、狗、牛、猴或人分离得到。它们可从宿主细胞(例如，CHO，S2和E.coli)或宿主动物(例如，猪或猴或兔)的重组核酸表达，然后采用本领域技术人员已知的蛋白纯化技术进行分离。替代性地，它们可通过常规的肽合成方法进行合成。可溶性4-1BB可来自于全长多肽的肽酶消化的制备物。制备融合蛋白(例如，小鼠4-1BB-人Ig-Fc多肽)的方法已为本领域公知，并包括，例如，涉及重组DNA技术的方法。更具体而言，可将编码相关4-1BB结构域的核酸序列连接至编码Fc片段的核酸，然后在适当的宿主细胞中表达。许多编码了融合部分、并可向其克隆编码4-1BB或其生物活性片段的核酸的表达载体已经市场化。所用的该可溶性4-1BB购自一家公司。

4-1BBL-特异性反义RNA

反义RNA可通过例如抑制转录和/或翻译，用于特异性减少4-1BBL的表达。反义RNA与编码4-1BBL的正义核酸互补。例如，它可与双链cDNA分子的编码链互补，或者可与mRNA序列互补。它可与整个编码链或仅与其一部分互补。它还可与编码4-1BBL的核酸的完整或部分非编码区互补。该非编码区包括在编码区侧翼的5′和3′区，例如，5′和3′未翻译序列。反义RNA的长度至少为六个核苷酸，但可以有约8，12，15，20，25，30，35，40，45，或50个核苷酸的长度。可以采用更长的寡聚核苷酸。反义RNA可通过本领域已知的方法制备，例如，通过由编码该反义RNA的表达载体或由表达盒(expression cassette)进行表达。替代性地，它可采用非天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸进行制备，该修饰的核苷酸经设计以提高RNA的生物稳定性或提高该反义RNA和该正义核酸之间形成的双链体的生理稳定性。修饰的核苷酸的范例包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-半乳糖基Q核苷，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶，beta-D-甘露糖基Q核苷，S′-甲氧基羧甲基1尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸，wybutoxosine，假尿嘧啶，Q核苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。因此，本发明的反义RNA可包括修饰的核苷酸和天然的核苷酸，且它可具有与SEQID NO：3和4中提供的序列互补的上述任意长度。

4-1BBL-特异性SiRNA

小干扰RNA可用于特异性减少4-1BBL翻译，从而降低4-1BBL多肽水平。SiRNA可以序列特异性的方式介导转录后的基因沉默。例如，参见http://www.ambion.com/techlib/hottopics/rnai/rnai_may2002_print.html(最后检索日2006年5月10日)。一般整合进入RNA诱导的沉默复合物，siRNA通过将该复合物引导至同源性mRNA转录物，由该复合物裂解该转录物，从而介导该同源性内源mRNA转录物的裂解。该siRNA可与该G蛋白mRNA转录物的任意区域同源。该同源区域可具有30个核苷酸或以下的长度，优选小于25个核苷酸，更优选的长度为约21至23个核苷酸。SiRNA通常为双链，并可能具有两个核苷酸3′悬挂，例如，3′悬挂UU二核苷酸。设计siRNA的方法已为本领域技术人员所知。例如，参见Elbashir等人Nature 411：494-498(2001)；Harborth等人AntisenseNucleic Acid Drug Dev.13：83-106(2003)。通常选择以AA开始，同时在正义和反义siRNA链上具有3′UU悬挂，并具有约50％G/C含量的目标位点。SiRNA可被化学合成，通过内外转录生成，或者由siRNA表达载体或PCR表达盒进行表达。例如，参见http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html(最后检索日2006年5月10日)。当siRNA从表达载体或PCR表达盒进行表达时，编码该siRNA的***物可作为折叠成siRNA发夹的RNA转录物进行表达。因此，该RNA转录物可包含通过间隔序列连接至其反互补性反义siRNA序列以形成该发夹的环和3′端U串的正义siRNA序列该发夹的环可具有任意适当的长度，例如，3至30个核苷酸，优选地，3至23个核苷酸，并可具有各种核苷酸序列，包括AUG，CCC，UUCG，CCACC，CTCGAG，AAGCUU，CCACACC和UUCAAGAGA(SEQ ID NO：9)。SiRNA也可通过直接引入的或通过转基因或病毒引入的双链RNA在体内的裂解生成。在部分有机体中可发生经RNA-依赖性RNA聚合酶的扩增。

可杂交至4-1BBL mRNA转录物的示范性siRNA序列包括如下序列及其互补序列：

SEQ ID NO.序列

10 AAGACGGCGCAGGCGGCAGCG

11 AAGAGGCCGGCGGGATCGTCG

12 ATAGTAGACTCCAGCCTTGGC

13 ATTCCGACCTCGGTGAAGGG

22 AAGAGGCCGGCGGGAUCGUCG

23 AUAGUAGACUCCAGCCUUGGC

24 AUUCCGACCUCGGUGAAGGG

它们的互补序列为：

25 CGCTGCCGCCTGCGCCGTCTT

26 CGACGATCCCGCCGGCCTCTT

27 GCCAAGGCTGGAGTCTACTAT

28 CCCTTCACCGAGGTCGGAAT

29 CGCUGCCGCCUGCGCCGUCUU

30 CGACGAUCCCGCCGGCCUCUU

31 GCCAAGGCUGGAGUCUACUAU

32 CCCUUCACCGAGGUCGGAAU

靶向小鼠4-1BBL的小干扰RNA还包括：

5’-GCTCTATGGCCTAGTCGCT-3’(SEQ ID NO：14)；

5’-GCAAAGCCTCAGGTAGATG-3’(SEQ ID NO：15)

5’-GCUCUAUGGCCUAGUCGCU-3’(SEQ ID NO：33)

5’-GCAAAGCCUCAGGUAGAUG-3’(SEQ ID NO：34)

它们的互补序列为：

AGCGACTAGGCCATAGAGC(SEQ ID NO：35)

CATCTACCTGAGGCTTTGC(SEQ ID NO：36)

AGCGACUAGGCCAUAGAGC(SEQ ID NO：37)

CAUCUACCUGAGGCUUUGC(SEQ ID NO：38)

本发明的附加siRNA序列包括SEQ ID NO：18和19及其互补序列，以及如下序列：

AAGACGGCGCAGGCGGCAGCGTT(SEQ ID NO：45)

AAGAGGCCGGCGGGAUCGUCGTT(SEQ ID NO：46)

AUAGUAGACUCCAGCCUUGGCTT(SEQ ID NO：47)

AUUCCGACCUCGGUGAAGGGTT(SEQ ID NO：48)

CGCUGCCGCCUGCGCCGUCUUTT(SEQ ID NO：49)

CGACGAUCCCGCCGGCCUCUUTT(SEQ ID NO：50)

GCCAAGGCUGGAGUCUACUAUTT(SEQ ID NO：51)

CCCUUCACCGAGGUCGGAAUTT(SEQ ID NO：52)

GCUCUAUGGCCUAGUCGCUTT(SEQ ID NO：53)；

GCAAAGCCUCAGGUAGAUGTT(SEQ ID NO：54)

AGCGACUAGGCCAUAGAGCTT(SEQ ID NO：55)

CAUCUACCUGAGGCUUUGCTT(SEQ ID NO：56).

本发明的siRNA还可被化学修饰以提高其在生理条件下(例如在血清中，在循环中或在哺乳动物细胞中)的稳定性。本发明的化学修饰的siRNA包括胆固醇结合的、脂包膜的和抗体连接的siRNA。本发明的小干扰RNA还包括结合至其它疏水液体分子(例如，例如结合高密度脂蛋白以形成亲脂结合物)的小干扰RNA，或者它们具有部分硫代磷酸酯骨架和在正义或反义链上的2′-O-甲基糖修饰。siRNA的亲脂结合物包括结合了饱和、烷基链(例如硬脂酰(C18)和二十二烷基(C22))的结合物以及结合了石胆酸和油酰胺混合物(石胆酸-油烯基，C43)的结合物。

4-1BBL-特异性核酶

4-1BBL阻断剂也可是核酶。核酶是具有能够裂解单链核酸(例如，具有同源区的mRNA)的催化活性的RNA分子。例如，参见Cech，Science 236：1532-1539(1987)；Cech，Ann.Rev.Biochem.59：543-568(1990)；Cech，Curr.Opin.Struct.Biol.2：605-609(1992)；Couture and Stinchcomb，Trends Genet.12：510-515(1996)。核酶可被用于催化裂解4-1BBL mRNA转录物，从而抑制该mRNA的翻译。例如，参见美国专利5,641,673。核酶具有针对4-1BBL核酸的特异性，并可基于SEQ ID NO：3和4的核苷酸序列进行设计。能够以高度序列特异性的方式反向裂解RNA分子的核酶的设计和构建方法已在本领域内得到了开发和描述。例如，参见。Haseloff等人，Nature 334：585-591(1988).核酶可通过将分散的“杂交”区工程改造进入核酶，以靶向特定的RNA。该杂交区包含与支持该核酶特异性杂交靶标的该靶标RNA互补的序列。例如，参见Gerlach等人，EP321,201。该靶标序列可以是选自SEQ ID NO：3或4的核苷酸序列的约10，12，15，20，或50个连续核苷酸的片段。可使用更长的互补序列以提高该靶标的杂交序列的亲和性。核酶的杂交和裂解区可整体关联；因此，通过互补区杂交至该靶标RNA后，该核酶的催化区可裂解该靶标。替代性地，编码4-1BBL的mRNA可用于从RNA分子集合中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如，参见Bartel和Szostak，Science 261：141 1-1418(1993)。

其它4-1BBL阻断剂

4-1BBL阻断剂还包括4-1BBL表达或活性中涉及的其它分子的抑制剂，包括减少这些分子表达的寡聚核苷酸或是这些分子本身活性的抑制剂。涉及4-1BBL表达或活性的分子包括，例如NF-κB；CREB；C/EBP；TLRs包括TLR2，TLR3，TLR4，TLR7，TLR8，and TLR9；MyD88；TRIF；p38；Jnk；Mek；以及TRAF6。减少这些分子的表达的寡聚核苷酸类似于上述用作基于寡聚核苷酸的4-1BBL阻断剂的寡聚核苷酸。它们包括针对涉及4-1BBL表达或活性的分子的siRNA(例如，SEQ ID NO：18和19)，反义核酸或核酶。活性抑制剂包括，例如，NF-κB抑制剂柳氮磺胺吡啶，蛋白酶体抑制剂MG-132，p38抑制剂SB203580，Jnk抑制剂SP600125，以及Mek抑制剂PD98059。

减少炎症

4-1BBL阻断剂可用于预防或治疗炎症性疾病。4-1BBL阻断剂可通过减少炎性细胞因子(例如，TNF或IL-6)的过量生成减少炎症。因此，在一个实施方式中，本发明提供了减少哺乳动物中炎性细胞因子生成的方法。该哺乳动物可以是患有炎症性疾病或易于患有该种疾病的哺乳动物。

炎症性疾病包括，但不限于，类风湿关节炎，青少年类风湿关节炎，牛皮癣关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，Crohn病，肠应激综合征，***性青少年慢性关节炎，或骨质疏松症。患有炎症性疾病的哺乳动物可根据该疾病的已知症状进行鉴定。例如，患有Crohn疾病或类风湿性关节炎的哺乳动物可相比相同物种的未患病哺乳动物显示出更高的促炎症细胞因子(例如，IL-1，IL-6，MCP-1和TNF)生成水平或期限。该种上升的量可以是，例如，5％，10％，15％，20％或超过20％。炎症性疾病的其它症状包括，但不限于，病理性炎症和关节破坏。易患炎症性疾病的哺乳动物可根据例如在Vyse&Todd，Cell 85：31 1-18(1996)；Kinne等人Arthritis Research3：319-330(2001)and Rioux&Abbas，Nature 435：584-9(2005))中讨论的遗传异常进行鉴定。

4-1BBL阻断剂可通过多种途径施用。示范性的施用途径包括肠胃外，静脉，皮内，皮下，口服，吸入，透皮(局部)，透粘膜，和直肠施用。可以通过透粘膜或透皮方式进行全身给药。例如，可根据需要或医生的决定皮下注射施用基于多肽的阻断剂。还可通过数小时的IV输注进行施用。基于寡聚核苷酸的4-1BBL阻断剂(例如反义或siRNA)可被***载体，并用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过静脉注射、局部施用或立体定向注射传递至对象。例如，参见美国专利5,328,470以及Chen等人，PNAS 91：3054(1994)。因此，可通过在组织位点直接注射或原位生成向对象施用4-1BBL阻断剂。替代性地，它可经过修饰以靶向选定的细胞，然后全身施用。例如，可对反义分子进行修饰，使得它们结合选定细胞表面表达的受体或抗原。其它的小分子型阻断剂可口服施用。

4-1BBL阻断剂可单用或与第二药剂联用，该第二药剂为，例如，已知的抗炎症药剂，例如，阿达木单抗

依法利珠单抗

依那西普(Enbrel)，英失利昔单抗氨甲蝶呤(Rheumatrex)，以及奥马佐单抗

向哺乳动物施用的剂量可以是适于减少4-1BBL表达或活性的任意数量。该剂量可以是有效剂量或其适当的分数。这取决于个体患者的参数，包括年龄、身体状况、身材、体重、被治疗的疾病、该疾病的严重性以及任何同步的治疗。确定适当剂量的因素已为本领域普通技术人员公知，并可通过常规实验确定。例如，可采用标准化学和生物测定，并通过化学、药理和毒理领域已知的数学模型技术确定物理化学、毒理和药代动力学属性。可通过该种技术的结果以及通过使用适当的药代动力学和/或药效动力学模型外推治疗效用和给药方案。向患者施用的精确数量将由出诊医生的负责给出。然后，4-1BBL阻断剂可以基于该哺乳动物体重约0.05至约2000mg/kg，优选约1至约200mg/kg的剂量通过口服或注射施用。基于寡聚核苷酸的阻断剂可以基于该哺乳动物体重约0.05至500mg/kg约，优选0.5至50mg/kg的剂量进行施用(例如，口服或注射施用)。成人的剂量范围通常在4至40,000mg/天，优选40至4,000mg/天。由于本发明的部分药剂具有长效作用，它们可有利地在第一天以80至4,000mg的初始剂量施用，随后数天以20至1,000mg的较低剂量施用。患者也可处于医学原因、心理原因或者事实上任何其它原因坚持施用较低的剂量或耐受剂量。作为药物组合物的成分的第二药剂的有效量将遵循该第二药剂生产商的推荐，出诊医生的判断，且受到医生桌上参考手册(PHYSICIAN′S DESK REFERENCE)中提出的关于数量和剂量的方案和施用因素的指导。

治疗方法的有效性可通过对患者已知的疾病的病征或症状的改善进行评估。例如，可通过监测促炎症细胞因子生成(例如IL-1，IL-6，TNF或MCP-1生成)的水平和期限测定炎症的改善。促炎症细胞因子生成的水平或期限的任意减少，例如5％，10％，15％，20％或20％以上的减少，表示该患者的改善。

4-1阻断剂的药物组合物

4-1BBL阻断剂可被结合进入适于向哺乳动物施用的药物组合物(在此称本发明的药物组合物)。本发明的药物组合物通常包含活性剂和药学可接受的载体。此处所用的短语“药学可接受的载体”指本领域已知与施用至哺乳动物的药物相容的任意和所有的溶剂、分散介质、覆层、抗菌和抗真菌剂、等张和吸收延缓剂等。除非任意常规介质或药剂与该活性化合物不相容，则其可用于本发明的药物组合物。此外，也可在该药物组合物中包含补充性的活性化合物。例如，本发明的药物组合物还可包括上述第二抗炎剂。

在本发明的组合物和方法中可采用治疗有效量的阻断剂。该种治疗活性量的阻断剂通常足以在目标细胞或组织或者哺乳动物中减少4-1BBL表达或活性。在部分实施方式中，该阻断剂的治疗有效量是足以减少炎症的数量。阻断剂的治疗有效量的范例为前文章节中所述的剂量。因此，4-1BBL阻断剂可以基于该哺乳动物体重以约0.05至约2000mg/kg，优选约1至约200mg/kg的剂量施用。基于寡聚核苷酸的阻断剂可以基于该哺乳动物体重约0.05至500mg/kg约，优选0.5至50mg/kg的剂量(例如1，3，5mg/kg)进行口服或注射施用。成人的剂量范围通常在4至40,000mg/天，优选40至4,000mg/天。由于本发明的部分药剂具有长效作用，它们可有利地在第一天以80至4,000mg的初始剂量施用，随后数天以20至1,000mg的较低剂量施用。

本发明的药物组合物可经过配制以适合目标施用途径。可用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液包括(1)无菌稀释液，例如注射用水，盐水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；(2)抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；(3)抗氧化剂，抗坏血酸或例如亚硫酸氢钠；(4)螯合剂，例如乙二胺四乙酸；以及(5)缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可通过酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。该肠胃外制剂可包封在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

还可根据4-1BBL阻断剂的性质配制和施用药物组合物。寡聚核苷酸型4-1BBL阻断剂(例如，siRNA)可通过如下示范性方式传递：Li和Rossi，Methods Mol.Biol.309：261-72(2005)所述的基于载体的传递***，Song等人，Nat.Med.9：347-51(2003)；Soutschek等人，Nature 432：173-178(2004)；Morrissey等人，Nat.Biotechnol23：1002-1007(2005)；Song等人，Nat.Biotechnol.23：709-717(2005)；以及Wolfrum等人，Nat.Biotechnol.25：1149-1157(2007)所述的高压静脉注射siRNA和化学修饰的siRNA(包括胆固醇结合的、脂包膜的和抗体连接的siRNA)。寡聚核苷酸型4-1BBL阻断剂(例如，siRNA和核酶)还可例如由Yano等人，In Vivo Antitumor Activityof a New Cationic Liposome siRNA Complex，in NON-VIRAL GENETHERAPY，Springer Tokyo，2005所述的阳离子脂质体进行传递。

适于注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌水溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉施用，适合的载体包括生理盐水，抑菌水或磷酸盐缓冲液。组合物必须在生产和贮存条件下无菌和稳定，且应当能在保存中防止微生物(例如，细菌和真菌)污染。该载体可以是一种溶剂或分散介质，其包含，例如，水，乙醇，多羟基化合物(丙三醇，丙二醇，以及液体聚乙二醇)，及其适当的混合物。适当的流动性可通过，例如，使用卵磷脂等覆层，在分散体中保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂得以实现。可通过使用各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，以及硫柳汞)防止微生物的作用。还可包含如等张剂或延缓吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)等其它成分。

无菌注射溶液可通过将含于适当溶剂的所需量的该活性剂根据需要与一种或多种上述讨论的成分结合，并通过无菌过滤进行制备。分散剂可通过将活性化合物结合进入包含了基础分散介质和所需其它上述成分的无菌溶媒得到。对于可用于制备可注射溶液的无菌粉末，其优选制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加所需成分。

口服组合物可包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可包封于凝胶胶囊或压入片剂。为进行口服治疗施用，该活性化合物可结合赋形剂，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可使用液体载体制备。药物相容的结合剂和/或辅佐物质也可作为该组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含如下任意的成分或类似性质的化合物：结合剂，例如微晶纤维素，黄芪树胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如，藻酸或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者调味剂，例如薄荷，甲基水杨酸或橙味调味剂。

为通过吸入进行施用，该组合物可从包含适当的推进剂(例如，气体，如二氧化碳)的压力容器或分配器或喷雾器中以气溶胶喷雾的形式传递。

为进行透粘膜或透皮施用，可使用本领域已知的适用于待穿透屏障的渗透剂。这些包括用于透粘膜施用的清洁剂，胆汁酸盐和夫西地酸衍生物，该施用可通过例如鼻部喷雾实现。对于透皮施用，该活性化合物被配制成本领域已知的油膏，软膏，凝胶或乳霜。

在一个实施方式中，本发明的药剂可结合能够保护该药剂不被身体快速清除的载体进行制备，例如包含了植入和微胶囊化传递***的控释制剂。也可使用可生物降解的生物相容性聚合物。其包括乙烯醋酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，以及聚乳酸。制备该种制剂的方法对本领域技术人员显而易见。可通过针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质悬浮液也可用作药学可接受的载体。它们可通过本领域已知的方法制备。

口服或肠胃外组合物可被制成剂量单位形式，以便于施用和给药的一致性。短语“剂量单位形式”指配合待处理对象的单位剂量的物理分散单位；每一个单位包含了结合了所需药物载体的经计算可以产生所需治疗效果的预定数量的活性化合物。剂量单位形式的规格依赖于该活性化合物的特殊性质和待实现的具体治疗效果。

该基因治疗载体的药物制剂可包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可包含包埋了该基因传递载体的缓释基质。

本发明的药物组合物可与服药说明一起包含在容器，包装或分配器内。该种制造物品将包括对于4-1BBL阻断剂在治疗持续性炎症中的使用说明。此外，该种制造物品还可包括用于治疗炎症的第二药剂的使用说明。

筛选测定

本发明还包括筛选新型4-1BBL阻断剂的方法。新型4-1BBL阻断剂可根据其干扰4-1BBL寡聚化、4-1BBL与其它信号转导分子(例如TRAF6或TLRs)相互作用或4-1BBL易位至细胞膜的能力进行鉴定。

能够防止4-1BBL寡聚化的4-1BBL阻断剂可在候选药剂存在或缺失的基于细胞的测定中得到鉴定。其存在可介导两种4-1BBL结合的候选药剂为能够防止4-1BBL的寡聚化(即，三个或多个4-1BBL的聚集物的形成)的4-1BBL阻断剂。一般而言，可通过标准方法测定两个4-1BBL的结合，该方法包括，但不限于，酵母双杂交***(参见Fields和Song，Nature 340：245-46(1989))和蛋白片段互补测定(参见http://www.abrf.org/JBT/Articles/JBT0012/jbt0012.html，最后检索日，2006年9月8日)，如β-内酰胺酶互补测定。在酵母双杂交***中，在酵母细胞中可表达两种4-1BBL融合蛋白。一种融合蛋白由融合至DNA-结合域的4-1BBL组成，另一种融合蛋白由融合至转录激活结构域的4-1BBL组成。4-1BBL的结合导致允许酵母在已知成分培养基上生长的报告基因的激活。在β-内酰胺酶互补测定中，可通过(Gly₄Ser)₃接头分别将由氨基酸26-196和198-290组成的两种β-内酰胺酶片段Bla(a)和Bla(b)与4-1BBL融合。以CCF2/AM加载被4-1BBL-Bla(a)和4-1BBL-Bla(b)转染的细胞。CCF2/AM扩散通过细胞膜，细胞质酯酶水解其酯官能团，释放该β-内酰胺酶底物CCF2。在409nm下激发CCF2中的香豆素供体，将FRET导向该荧光素受体，形成520nm下的绿色荧光发射。两个4-1BBL的结合将两个β-内酰胺酶片段带到一起，从而形成β-内酰胺酶。该β-内酰胺酶进一步水解CCF2，并分离供体和受体，导致FRET分解。结果，该分离的香豆素供体在447nm下发射出蓝色荧光。这可在显微镜下观察，或通过流式细胞仪检测。

能够抑制或减少4-1BBL与信号转导分子的相互作用的4-1BBL阻断剂可通过基于细胞的方法鉴定。此处描述了该种测定的范例。在用于鉴定能够抑制或减少4-1BBL与信号转导分子(例如，TLR或TRAF6)相互作用的4-1BBL阻断剂的基于细胞的方法中，采用候选药剂，然后测定4-1BBL是否与该信号转导分子相互作用。替代性地，能抑制4-1BBL与TLR或TRAF6的相互作用的药剂可以通过类似于上述针对4-1BBL聚合的基于细胞的筛选进行签定。例如，4-1BBL-酵母DNA结合蛋白和TRAF6-酵母转录激活结构域，或TRAF6-酵母DNA结合蛋白和4-1BBL-酵母转录激活结构域可用于上述酵母双杂交***中。类似地，由4-1BBL-Bla(a)和TRAF6-Bla(b)或TRAF 6-Bla(a)和4-1BBL-Bla(b)组成的融合蛋白可用于如上所述的4-1BBL和TRAF6的相互作用的测定。

能够抑制或减少4-1BBL向细胞表面易位的4-1BBL阻断剂可通过将表达4-1BBL的细胞与选定试剂接触，并测定该4-1BBL是否定位至细胞膜进行鉴定。该种细胞可以是哺乳动物细胞，例如RAW264.7细胞系。

4-1BBL阻断剂还可通过基于细胞的或是动物炎症模型剂进行鉴定。此处描述了基于细胞的测定的范例。例如，将响应适当的刺激(例如，暴露至LPS)时可表达炎性细胞因子(例如TNF，IL-6，IL-1或MCP-1)的细胞与候选药剂相接触。将与候选药剂接触的细胞的炎性细胞因子生成与未接触该候选药剂的细胞进行比较。针对基于细胞的测定，可使用任意能够响应引发炎症的刺激(例如LPS)生成炎性细胞因子的细胞。这些细胞包括，例如，RAW264.7细胞，原代鼠巨噬细胞以及原代人单核细胞。类似地，可通过炎症的动物模型签定4-1BBL阻断剂。例如，可向哺乳动物施用候选药剂，测定炎性细胞因子(TNF或IL-6)的生成或是与过度持续炎症相关的其它可观察显型(例如体温上升或关节肿胀)，并与未施用该候选药剂的类以动物进行比较。

本发明将进一步通过如下实施例进行描述，该实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。

实施例

实施例1：材料和方法

小鼠和试剂。TLR2-，TLR4-，MyD88-，TRIF(LPS2)以及TRIF-和MyD88-缺陷型小鼠的描述可见Hoebe等人，Nature 424：743-48(2003)和Kim等人，J.Exp.Med.197：1441-52(2003)。如DeBenedette等人，J.Immunol.163：4833-41(1999)所述，4-1BBL-缺陷型小鼠与C57BL/6小鼠回交八次。如Vinay，J.Immunol.173：4218-29(2004)所述，4-1BBL-缺陷型小鼠与C57BL/6小鼠回交至少七次。在相同实验中使用性别和年龄相当的小鼠。

Kim等人，J.Exp.Med.197：1441-52(2003)描述了腹膜巨噬细胞RAW264.7和293T细胞的制备和培养。以LPS腹膜注射性别和年龄相当的4-1BBL-缺陷型和野生型(WT)小鼠。收集血清样本或监测存活个体。使用动物的方案得到了斯克利普斯研究院实验动物管理与使用委员会的认可。

使用了如下试剂：Pam₃CysSer(Lys)₄(EMC microcollectionsGmbH)；来自E.coli O111:B4的LPS(List Biological Laboratories)；硫代磷酸酯-稳定化的CpG DNA和R-848(Invivogen)；聚I:C(Amersham Biosciences)；肽聚糖(Fluka)；IL-1β和TNF(R&Dsystems)；重组小鼠4-1BB-Fc和抗-4-1BBL(R&D systems)；针对4-1BBL的单克隆抗体(克隆TKS-I，e-Bioscience)；抗-Flag(Sigma)；抗-GFP(Clontech)；针对HA，Myc，MyD88，TLR4和TRAF6的抗体(Santa Cruz Biotechnology)；Alexa Fluor 594-结合的驴抗-山羊IgG(Molecular Probes)；抗-AU-1(Covance)；抗-GAPDH(Chemicon)；布雷菲德菌素A(Biolegend)；以及柳氮磺胺吡啶，SB203580，SP600125和PD98059(Calbiochem)。

质粒，重组腺病毒和PCR。可通过全长、胞外结构域缺失(ΔExt)或胞质结构域缺失(ΔCyt)的人4-1BBL cDNA构建哺乳动物表达载体，或者可通过全长、pro712his突变、胞外结构域缺失(ΔExt)或胞质结构域缺失(ΔCyt)的人TLR4 cDNA构建哺乳动物表达载体。这些可与GFP(于pEGFP-Cl)，Flag(于pcDNA3)或HA(于pcDNA3)融合。采用Bukczynski等人，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：1291-1296(2004)所述的针对人4-1BBL的“双质粒救援(two plasmidrescue)”法生成复制缺陷腺病毒-5-表达小鼠4-1BBL(Adv-4-1BBL)或未转基因的对照(Adv-对照)。

参照Kim等人，J.Exp.Med.197：1441-52(2003)所述进行半定量PCR。为进行实时PCR，以低聚(dT)₁₂作为引物，使用0.5μg的总RNA制备cDNA。在实时PCR分析中使用SYBR green PCRMaster Mix试剂盒(Applied Biosystems)。

将全长，胞质结构域，胞外结构域缺失(ΔExt)，或胞质结构域缺失(ΔCyt)人4-1BBL cDNA克隆进入融合了GFP(pEGFP-Cl)，flag(in pcDNA3)，或HA(pcDNA3)的哺乳动物表达载体。采用Bukczynski等人，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：1291-1296(2004)所述的相同方法生成复制缺陷腺病毒-5-表达小鼠4-1BBL(Adv-4-1BBL)或未转基因的对照(Adv-对照)。将寡聚核苷酸克隆进入p抑制因子以表达针对小鼠4-1BBL(#1，5′-GCTCTATGGCCTAGTCGCT-S′(SEQ ID NO：14)；#2，5′-GCAAAGCCTCAGGTAGATG-S′(SEQ ID NO：15))，小鼠4-1BB(#1，5′-ACCTGTAGCTTGGGAACATTT-S′(SEQ ID NO：16)；#2，5′-AATACAATCCAGTCTGCAAGA-S′(SEQ ID NO：17))，或空自对照的siRNA链。将人IL3R，TLR 2，3，4或9cDNA链克隆进入pcDNA3-flag表达载体。

转染。采用Lipofectamine 2000并参照生产商说明(Invitrogen)，以表达载体转染293T细胞，并在24小时后制备细胞溶解产物。对于siRNA转染，通过聚胺(Ambion)以针对小鼠TRAF6(#1，5′-GGAUCAUCAAGUACAUUGUTT-S′(SEQ ID NO：18)；#2，5′-GGGCUACGAUGUGG AGUUUTT-3′(SEQ ID NO：19)；预设计的siRNA(Ambion)或作为对照的GFP瞬时转染小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7。转染2天后，将细胞与刺激物一起孵育。在24小时后制备细胞溶解产物或培养悬浮液，以通过Western印迹分析TRAF6的抑制或通过ELISA分析TNF-α的生成。

电泳迁移率变动，核转录活性和酵母双杂交测定。参照前述方案制备核抽提物。通过[γ-³²P]对特定的寡聚核苷酸进行放射性标记。参照Promega方案的推荐进行ATP和EMSA。参照Han等人，Biochim.Biophys.Acta 1090：22-28(1991)所述的转录活性分析测定TNF转录速率。参照Han等人，Nature 386：296-299(1997)所述采用人胎脑和脾cDNA库进行双杂交筛选。将跨越细胞内蛋白结构域的人TLR4的一部分(氨基酸653-839)亚克隆进入pAS2载体，以用作诱饵(bait)。筛选5×10转化体。

4-1BBL或4-1BB-抑制稳定细胞系的生成。以p抑制因子-4-1BBL，4-1BB，或空载体稳定转染RAW 264.7细胞。为进行细胞的选择，将细胞在含有500μg/mLG418的培养基中孵育2周，然后汇集。将细胞维持在含有G418的培养基中。

流式细胞计数。将腹膜巨噬细胞在冰上悬浮于PBS，5％FCS，0.01％叠氮化钠(FACS缓冲液)中。采用与藻红蛋白结合的4-1BBL-特异性抗体(克隆TKS-I，eBioscience)评估表面4-1BBL表达。总4-1BBL表达可在固定固定-透化缓冲液(Biolegend)中固定和透化后进行评估。以透化缓冲液中的藻红蛋白结合的h FACS抗体对细胞染色，然后以FACS缓冲液洗涤。将藻红蛋白结合的大鼠IgG2a，κ作为同型对照。

免疫组化和免疫测定。将腹膜巨噬细胞接种在盖玻片上，并以4％多聚甲醛固定，然后通过在含有0.5％Triton X-100的PBS中孵育进行透化。以2％BSA封闭后，将细胞与抗小鼠4-1BBL孵育，然后在Alexa Fluor 594-结合的驴抗山羊IgG中孵育。使用AxioVision 3.1软件(Carl Zeiss，Inc.)对荧光图像进行可视化。收集巨噬细胞培养物的上清液或小鼠血清，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(eBioscience)参照生产商的方案检测TNF或IL-6浓度。在图例中显示了用于免疫沉淀和免疫印迹过程的抗体。该实验步骤可参照Zhou等人，Mol.Cell.Biol.26：3824-34(2006)所述。

细胞因子的测量。收集巨噬细胞培养物的上清液或小鼠血清，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(eBioscience)参照生产商的方案检测TNF-α或IL-6浓度。

统计学分析。绘制Kaplan-Meier图，并采用对数秩(对数秩)检验测定小鼠存活的差异。血清TNF的差异的统计学意义可通过学生t检验进行确定。

实施例2：4-1BBL是TLR4-相互作用蛋白

采用酵母双杂交筛选鉴定与TLR4的胞内结构域相互作用的蛋白。以pAS2-TLR4(653-839aa)联合pGAD10载体中的4-1BBL(5-254aa)(克隆1)、4-1BBL(3-254aa)(克隆2)、p38((AF)、p53或核纤层蛋白转染酵母细胞。“诱饵和猎物”的相互作用可通过酵母在缺乏组氨酸的培养基上的生长得到证实。七个阳性克隆中的两个为4-1BBL，细胞表面II型跨膜蛋白(参见Goodwin等人，Eur.J.Immunol.23：2631-2641(1993)和Alderson等人，Eur.J.Immunol.24：2219-2227(1994))。含有诱饵载体中编码的TLR4胞内结构域和猎物载体中编码的4-1BBL的酵母细胞能够由于相互作用介导的His3报告基因的表达而在缺乏组氨酸的培养基中生长的发现显示：4-1BBL，而非其它无关蛋白，可与该TLR4胞内结构域相互作用。(图1A)。

为了确认该相互作用，在293细胞中表达HA-4-1BBL或者与flag-TLR4或flag-IL-3受体(IL-3R)共表达，并通过共免疫沉淀测定其联合。用空pcDNA3载体(对照)或用4-1BBL表达载体联合空pcDNA3载体、flag-TLR4或flag-IL-3R表达载体转染293T细胞。转染后24小时溶解细胞。2/3的细胞溶解产物与抗-HA抗体免疫沉淀。将溶解产物和免疫沉淀物以抗-flag和抗-HA抗体免疫印迹，结果显示TLR4，而非IL-3R，被4-1BBL下拉(图1B)。

为了表征4-1BBL和TLR4之间的相互作用，进行了如下实验。

采用以表达GFP-4-1BBL和Flag-TLR4，Flag-TLR4缺失胞质结构域(ΔCyt)，Flag-TLR4缺失胞外结构域(ΔExt)，Flag-IL-3R，Myc-TLR4，或者Myc-TLR4-P712H(Lps^d)的质粒转染293T细胞，采用该细胞进行免疫测定。以抗-flag和抗-Myc免疫沉淀细胞溶解产物，并以所示的抗体对细胞溶解产物和免疫沉淀物进行免疫印迹。结果显示TLR4胞内结构域涉及与4-1BBL的相互作用，然而，LR4 TIR结构域中的突变(Lps^d，Pro712H)对于TLR4和4-1BBL之间的相互作用没有实质性影响(图1C)。由于Lps^d突变破坏了TIR结构域和MyD88之间的相互作用，但不破坏TIR结构域的结构(参见Xu等人，Nature 408：111-15(2000))，TLR4TIR结构域中的不同部分可能与4-1BBL和MyD88相互作用。

此外，使用flag-TLR4表达载体联合表达GFP，GFP-4-1BBL，GFP-4-1BBL缺失胞质结构域(ΔCyt)，GFP-4-1BBL缺失胞外结构域(ΔExt)，或GFP-4-1BBL仅有胞质结构域(Cyt)的载体转染的293T细胞进行免疫测定。以抗-flag抗体免疫沉淀细胞溶解产物，并以抗-flag和抗-GFP抗体进行免疫印迹。结果显示为使4-1BBL与TLR4相互作用，它必须包含其胞质结构域，且它必须连接细胞膜，因为无胞质结构域的4-1BBL或单独的4-1BBL胞质结构域均不与TLR4共免疫沉淀(图1D)。

实施例3：4-1BBL缺失的小鼠更能抵抗LPS-诱导的死亡

为了确定4-1BBL的体内作用，对4-1BBL缺陷小鼠进行分析，其结果如下。缺失4-1BBL的小鼠可存活、生育，并且健康。这些小鼠具有正常的淋巴器官，但显示了对病毒的CD8⁺T细胞记忆的缺陷。野生型和4-1BBL-缺陷型小鼠中的腹膜巨噬细胞的数量相当(数据未显示)。将LPS腹膜注射进入4-1BBL-缺陷型和野生型小鼠，显示4-1BBL-缺陷型小鼠比野生型小鼠对LPS的致死作用更具耐受性(图2A)。特别地，LPS对野生型小鼠的致死作用可通过施用抗-4-1BBL得到缓和(图2B，C)。4-1BBL缺失的体内作用可能是由于巨噬细胞中4-1BBL-介导的TNF生成的缺失，和/或其它谱系(lineages)的细胞中4-1BBL对4-1BB的激活的缺失。令人感兴趣的是，由于它们具有更少的自然杀伤(NK)细胞和NKT细胞，缺乏4-1BB的小鼠同样对LPS和半乳糖胺注射引发的死亡具有耐受性。然而，4-1BBL-缺陷型和4-1BB-缺陷型小鼠的LPS耐受性的成因必然不同，因为4-1BBL-缺陷型小鼠含有正常数量的NK和NKT细胞(数据未显示)。

实施例4：4-1BBL涉及持续的TNF生成

A.体内研究

为确定4-1BBL是否涉及TLR4-介导的宿主应答，可参照如下采用0.5mg剂量的大肠杆菌LPS攻击4-1BBL敲除(KO)和野生型小鼠。向4-1BBL-/-和野生型小鼠腹膜注射0.5mg的LPS，测定2和6小时采集的血清中的TNF水平。

结果显示与野生型小鼠相比，4-1BBL KO小鼠中的LPS-诱导的TNF生成大大降低(图2D)。特别地，LPS诱导了血清TNF浓度的快速升高，其在LPS注射后1小时达到了峰值。4-1BBL-缺陷型小鼠中的血清TNF浓度与LPS注射一小时后野生型小鼠的浓度相当，并低于较晚时间野生型小鼠中的浓度(图2D)。这些数据下文给出的体外数据(图3A)一致，其中4-1BBL缺失仅在LPS处理后较晚的时间影响TNF生成；然而，LPS的体内TNF诱导似乎快于体外。

B.使用原代巨噬细胞的研究

由于巨噬细胞是LPS攻击的小鼠中TNF的主要来源(Beutler等人Nature 316：552-554(1985))，分离来自4-1BBL KO和野生型小鼠腹膜巨噬细胞，检测LPS刺激后的TNF生成。

首先，通过在LPS刺激后24小时的4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞培养基中测定细胞因子确定4-1BBL对巨噬细胞中LPS-诱导的细胞因子生成的影响。4-1BBL-缺陷型巨噬细胞比野生型巨噬细胞生成更少的TNF，IL-6和IL-12(图3A)。IL-1β未受影响或仅受到4-1BBL缺失的轻微影响(图3A)。4-1BBL-缺陷型巨噬细胞在1L-1β刺激后生成了野生型的IL-6数量，提示4-1BBL选择性参与LPS-诱导的细胞因子应答(图3A)。

此外，还测定了LPS诱导后6，12和18小时的TNF生成。将来自4-1BBL-/-和野生型小鼠的腹膜巨噬细胞以2x10⁶/微孔涂覆在六孔板中，然后以LPS(100ng/mL)处理。在6，12和18小时测定培养集中的TNF水平。令人感兴趣的是，在LPS刺激的前3个小时中，4-1BBL KO巨噬细胞中的TNF生成正常，但在该时间点以后几乎完全停止(图3B)，显示4-1BBL对于LPS刺激后期的TNF生成进一步上升的引发非常关键。

4-1BBL最初作为具有共刺激功能的T-细胞表面受体，4-1BB的配体进行克隆(参见Goodwin等人，Eur.J.Immunol 23：2631-2641(1993))。由于4-1BB同样在巨噬细胞中表达，对4-1BB是否参与4-1BBL-介导的LPS处理的细胞中的TNF表达进行了检验。进行如下实验以确定4-1BB是否参与LPS-诱导的TNF生成。

出乎意料的是，4-1BBL促进持续的LPS-诱导的TNF生成并不要求4-1BB的存在，因为LPS-诱导的TNF的数量与野生型和4-1BB-缺陷型巨噬细胞类似(图3C)。因此，4-1BBL-4-1BB相互作用或者未在巨噬细胞中发生，或者对持续的巨噬细胞TNF生成没有作用。

C.采用RAW264.7巨噬细胞进行的研究

为确定4-1BBL在巨噬细胞细胞系RAW264.7中的功能是否与原代巨噬细胞类似，采用siRNA按如下方式抑制4-1BBL表达。简单而言，以含p抑制因子对照siRNA或者4-1BBL-siRNA#1或#2稳定转染的RAW 264.7细胞。通过免疫印迹检测4-1BBL的蛋白水平。在(1)以LPS处理3，9和24小时的对照和4-1BBL抑制细胞和(2)以肽聚糖(PG，10μg/ml)，聚I:C(25μg/ml)，LPS(100ng/mL)，CpG(5μg/mL)或未处理的培养基(无)处理24小时的对照和4-1BBL抑制细胞中检测TNF生成。结果显示siRNA均有效抑制了RAW264.7细胞中的4-1BBL(图4A)，并抑制了LPS-和其它TLR配体-诱导的TNF生成(图4B，C)，因而正面了4-1BBL在RAW264.7和原代巨噬细胞中具有相同的作用。4-1BBL对于RAW264.7细胞中LPS-诱导的NF-κB激活没有作用，因为以LPS(100ng/mL)处理15，30，40，50，60和90分钟的对照和4-1BBL抑制RAW细胞显示了同等的I-κB-α降解(图4D)。

然后，使用siRNA按如下方式抑制RAW264.7细胞中的4-1BB表达。以含p抑制因子对照siRNA，4-1BBL-siRNA#1或#2稳定转染的RAW 264.7细胞。通过RT-PCR检查4-1BB mRNA。以LPS处理24小时的对照和4-1BBL抑制细胞中测定的TNF生成。siRNA非常有效地抑制了RAW264.7细胞中的4-1BB，但该种抑制未影响LPS-诱导的TNF生成(图5A-B)。4-1BB因此必然参与巨噬细胞中LPS-诱导的TNF生成，且因此与4-1BBL在持续TNF生成中的条件没有联系。综上，通过以siRNA抑制4-1BBL和4-1BB，在RA W264.7巨噬细胞细胞系中同样观察到了4-1BBL在LPS-处理的巨噬细胞中的持续TNF生成中的4-1BB-依赖性功能(图4A-C和图5A-B)。

D.转录研究

为确定4-1BBL是否影响转录和/或转录后阶段的TNF表达，在LPS处理的不同阶段检测4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞中的TnfmRNA(图3D)。在LPS刺激2小时后的4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞具有数量类似的TnfmRNA表达峰值；然而，在LPS刺激后期，4-1BBL-缺陷型细胞中的TnfmRNA数量远低于野生型巨噬细胞(图3D)。这些数据与TNF蛋白数据一致(图3B)，并显示4-1BBL影响了TnfmRNA转录物的表达。

为了确定4-1BBL是否影响Tnf的转录，进行了核转录后活性分析。在LPS刺激后1小时，在野生型和4-1BBL-缺陷型巨噬细胞中的均出现LPS引发的Tnf转录；然而，4-1BBL-缺陷型巨噬细胞的Tnf转录在LPS处理后期有所下降(图3E)。

为了确定在4-1BBL-缺陷型巨噬细胞中LPS刺激后的后期发现的较低TnfmRNA数量同样由mRNA稳定性的变化所引起，我们测定了LPS刺激后三小时4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞中的TnfmRNA的半衰期。4-1BBL缺失对于TnfmRNA的稳定性具有实质性的影响(图3F)。因此，4-1BBL同时影响了TNF生成的转录和转录后调节。

4-1BBL缺失是否影响LPS-诱导的NF-κB和其它转录因子的激活可通过如下的电泳迁移率变动测定(EMSA)进行确定。以LPS刺激4-1BBL-/-和野生型巨噬细胞1，2，4，8和12小时，然后收集进行核抽提物制备。使用放射标记探针进行EMSA。结果显示4-1BBL缺失LPS-诱导的NF-κB激活(在两小时达到峰值的早期应答)没有影响(图3G)。这与图3B的数据一致，显示LPS-诱导的TNF生成在前三个小时中未受到4-1BBL缺失的影响。4-1BBL缺失对于LPS-诱导的AP-1活性具有很小的影响或没有影响(图3G)。相反地，在LPS刺激后8小时发生的LPS-诱导的CREB和C/EBP活性受到了4-1BBL缺失的明显抑制(图3G)。该种受损的CREB和C/EBP活性可归因于4-1BBL-缺陷型巨噬细胞中持续TNF生成的缺陷。

为了考察LPS-诱导的信号转导途径，NF-κB和MAP激酶途径，以LPS(100ng/mL)处理来自野生型和4-1BBL KO小鼠的腹膜巨噬细胞0.5，1，2，4和6小时，以抗-IκB-α，抗磷酸-ERK(p-ERK)，抗-磷酸-JNK(p-JNK)，抗-磷酸-p38(p-p38)，抗-4-1BBL，或抗-GAPDH抗体对细胞溶解产物进行免疫印迹。结果显示NF-kB(IκB-α)抑制剂的降解速率在4-1BBL KO和野生型细胞中相同(图3H)，而4-1BBL KO细胞中的ERK1/2，JNK1/2，和p38MAP激酶激活(磷酸化)的水平等于或略低于野生型细胞(图3H)。

因此，TLR4的早期下游信号似乎未受4-1BBL缺失的影响，且从信号转导途径(图3H)和转录因子(图3G)激活的分析获得的数据与从分析TNF生成所得的数据一致(图3B)。此外，它支持了如下观点：TLR4的早期信号转导在4-1BBL敲除巨噬细胞中是完整的。

实施例5：4-1BBL与TLR2，TLR3，TLR4和TLR9相互作用，并参与TLR2-，TLR3-，TLR4-和TLR9-介导的巨噬细胞中的TNF生成

为了确定4-1BBL是否选择性参与TLR4-介导的细胞应答，将HA-4-1BBL与flag-TLR2，flag-TLR3，flag-TLR4或flag-TLR9按如下进行共表达。以空(对照)或HA-4-1BBL表达载体联合flag-TLR2，flag-TLR3，flag-TLR4，或flag-TLR9转染293T细胞。转染后24小时溶解细胞。以抗-flag抗体对细胞溶解产物进行免疫印迹，以抗-HA进行免疫沉淀后以抗-HA和抗flag进行免疫印迹。结果显示在共免疫沉淀测定中所有测试的TLR均被4-1BBL下拉(图6A)。该共免疫沉淀具有特异性，因为flag-IL-3R不与4-1BBL共免疫沉淀(图6A)。

为确定4-1BBL是否参与TLR2-，3-，4-或9-介导的细胞应答，可进行如下实验。以Pam3(1μg/mL)，聚I:C(25μg/mL)，LPS(100ng/mL)，R848(100nM)，CpG(5μg/mL)，IL-1β(10ng/mL)或未处理培养基(无)处理野生型和4-1BBL-/-巨噬细胞。在处理后24小时测定TNF生成。结果显示在4-1BBLKO细胞中Pam3(TLR2配体)-，PolyI:C(TLR3配体)-，R848(TLR7&8配体)-，CpG(TLR9配体)-诱导的TNF生成被减少(图6B)。该作用具有TLR特异性，因为IL-1β-诱导的4-1BBL KO细胞中的TNF生成是正常的(图6B)。因此，4-1BBL参与许多(如非全部)不同的TLR的信号转导。

实施例6：LPS-处理的巨噬细胞中的持续TNF生成需要4-1BBL诱导和细胞表面定位

4-1BBL在多数组织中不可测得，仅在巨噬细胞和树突细胞中有低水平表达(参见Futagawa等人，Int.Immunol.14：275-286(2002))。为了分析4-1BBL在LPS-处理的巨噬细胞中的持续TNF生成中的作用，从野生型以及TLR4-/-，MyD88-/-和TRIF-/-小鼠分离巨噬细胞，并以LPS处理0.5，1，2，4和8小时。使用抗-4-1BBL抗体以免疫印迹分析4-1BBL蛋白。GAPDH被用作加载对照。结果显示LPS在巨噬细胞中诱导了4-1BBL的快速表达，其峰值出现在4小时(图7A，所有图中的左1-5或1-6道)。4-1BBL诱导的时间与4-1BBL敲除巨噬细胞中损伤的持续TNF生成具有良好的相关性(图3B)。由于LPS-诱导的4-1BBL表达在TLR4-/-，MyD88-/-和TRIF-/-巨噬细胞中被损伤，其具有TLR4-，MyD88-和TRIF-依赖性(图7A)。4-1BBL表达被所有测试的TLR配体所诱导，但不被1L-1β诱导(图8A-F)。据显示4-1BBL在其合成后进行了翻译后修饰(可能通过糖基化)，因为在SDS-PAGE上观察到了转移的蛋白条带(图7A)。

编码带有多个NF-κB-结合位点的4-1BBL的基因的启动子，以及LPS-诱导的4-1BBL mRNA被NF-κB抑制剂柳氮磺胺吡啶(图7B)或蛋白酶体抑制剂MG-132(数据未显示)有效地抑制。p38抑制剂SB203580，Jnk抑制剂SP600125和Mek抑制剂PD98059同样对4-1BBL表达具有一定抑制性作用(图7B)。在未刺激的巨噬细胞中由腺病毒载体表达的LPS-诱导的4-1BBL mRNA(T_1/2＝67min)比4-1BBL mRNA(T_1/2＝33min)更稳定，显示LPS-诱导的4-1BBL表达中同样涉及LPS-诱导的mRNA稳定性的变化(图7C)。

采用抗-4-1BBL抗体，以流式细胞仪分析LPS-处理的野生型小鼠腹膜巨噬细胞中的4-1BBL表达。以同型抗体作为对照。以0.1％皂素透化，从而检测总4-1BBL。结果显示多数LPS-诱导的4-1BBL定位在细胞表面上(图7D)。

为了确定新合成的4-1BBL是否需要在细胞表面上以调节TNF表达，将腹膜巨噬细胞单独或联合布雷菲德菌素A(3μg/mL)预孵育1小时，然后以LPS处理指定时间。使用抗-4-1BBL抗体进行免疫染色。通过半定量PCR分析4-1BBL和TNF mRNA。GAPDH被用作对照。布雷菲德菌素A是通过抑制蛋白从内质网易位至高尔基体来阻断蛋白易位至细胞表面的特异性抑制(Klausner等人，J.CellBiol.116：1071-1080(1992))(图7E)。阻断新合成的4-1BBL易位至细胞表面并不影响LPS-诱导的4-1BBL mRNA的增加(图7F)。布雷菲德菌素A处理在1小时后不影响LPS-诱导的TNF mRNA，但在2，4和6小时减少了TNF mRNA，提示持续TNF生成不仅需要4-1BBL诱导，还需要4-1BBL的细胞表面定位。

实施例7：4-1BBL的表达和交联引发TNF生成

由LPS-处理的巨噬细胞中持续TNF生成要求4-1BBL的诱导，检查了4-1BBL的过量表达是否引发TNF生成。参照Bukczynski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：1291-1296(2004)所述通过腺病毒介导的基因传递在巨噬细胞中表达4-1BBL。简单而言，以不同剂量的空(对照)或编码4-1BBL的腺病毒感染巨噬细胞，并采用抗-4-1BBL抗体通过免疫印迹测定4-1BBL的表达。病毒感染后24小时检测培养基中的TNF水平。结果显示4-1BBL表达以剂量依赖的方式诱导TNF生成(图9A)。由于在对照病毒感染细胞的培养基中没有可测的TNF，该TNF诱导具有4-1BBL特异性。通过4-1BBL-表达进行的TNF诱导不需要4-1BB，因为以编码4-1BBL的腺病毒感染的4-1BBL-缺陷型和野生型巨噬细胞中的TNF生成类似(图9B)。

为检验4-1BBL过量表达介导的TNF生成是否具有TLR4-，MyD88-和TRIF-依赖性，以对照或4-1BBL表达病毒感染TLR4-/-和TRIF-/-巨噬细胞，然后检测细胞中的4-1BBL水平和培养基中的TNF水平。结果显示从TLR4-/-小鼠中分离的巨噬细胞中4-1BBL表达对TNF生成的介导被部分破坏(图9C)，提示除了TLR4外，其它可与4-1BBL相互作用的TLRs也参与4-1BBL-介导的TNF生成。事实上，在293T细胞中共表达时4-1BBL可与TLR2和其它TLRs相互作用(图6A)，且在TLR2-缺陷型巨噬细胞中由4-1BBL过量表达诱导的TNF生成有所下降(图9D)。这些结果支持了多种TLRs参与4-1BBL-介导的TNF生成的解释。尽管TLRs参与其中，TRIF缺陷对于4-1BBL-诱导的TNF生成没有影响(图9E)。由于从MyD88小鼠中分离的巨噬细胞不能被腺病毒有效感染，4-1BBL-诱导的TNF生成中对MyD88的需求需要通过另一种方法进行确定(参见下文)。

4-1BBL是TNF超家族成员(参见Watts，T.H.，Annu.Rev.Immunol.23：23-68(2005))。与该超家族的其它成员类似，它需要呈三聚体形式以实现其功能(参见Rabu等人，J.Biol.Chem.280：41472-41481(2005))。为检测该种可能性，使用4-1BB-Fc嵌合体(二硫化物连接的4-1BB的同源二聚体)，抗-Fc抗体，或者同时使用4-1BB-Fc和抗-Fc处理野生型巨噬细胞，检测培养基中的TNF水平。更具体而言，以山羊抗人Fc抗体(抗-Fc，1.5μg/mL)，小鼠4-1BB-人Ig-Fc结构域融合蛋白(4-1BB-Fc，5μg/mL)，4-1BB-Fc和抗-Fc一起，或者未处理的培养基处理巨噬细胞。24小时后测定培养基中的TNF水平。结果显示4-1BB-Fc可以交联两个4-1BBL分子，但不诱导TNF生成(图9F)。将4-1BB-Fc进一步与抗-Fc抗体交联可诱导TNF生成，但单用抗-Fc抗体不具有任何作用(图9F)。据显示需要两个以上4-1BBL分子的交联以引发TNF生成。交联诱导的TNF生成对4-1BBL的需求通过使用4-1BBL KO细胞得到了证实(图9F)。

为确定4-1BBL信号转导是否需要MyD88和TRIF，以4-1BB-Fc，抗-Fc抗体，以及4-1BB-Fc和抗-Fc抗体一起处理MyD88-/-和TRIF-/-巨噬细胞，并检测培养基中的TNF水平。结果显示4-1BBL交联介导的TNF生成具有MyD88-和TRIF-依赖性(图9F)。相反地，TLR2-缺陷型和TLR4-缺陷型巨噬细胞中由4-1BBL交联引发的TNF生成与野生型巨噬细胞相比具有统计学意义的减少(图9F)。

这些数据的一种解释是4-1BBL在细胞表面的表达和后续寡聚化引发了独立于MyD88-和TRIF-的TNF生成。由于TLR4和其它TLRs与4-1BBL的相互作用(图1A，1B，1D和6A)，且由于TLRs形成二聚体(参见Medzhitov等人，Nature 388：394-397(1997))，4-1BBL过量表达介导的TNF生成部分依赖于TLR4(图9C)的原因可能是由于导致4-1BBL交联的4-1BBL-TLR4相互作用。这可通过如下发现得到支持：4-1BBL过量表达介导的TNF生成受到TLR4或TLR2的缺失的部分抑制(图9C-F)。

由于4-1BB-Fc和抗-4-1BBL仅结合两个4-1BBL分子，且它们与4-1BBL的结合应抑制4-1BBL寡聚化或防止4-1BBL与其它分子如TLRs相互作用，它们被用于测试该种假设。根据如下方式在4-1BB-Fc或抗-4-1BBL抗体存在下以LPS刺激巨噬细胞。将巨噬细胞与LPS，LPS和4-1BB-Fc，LPS和0，2，或5μg/mL抗-4-1BBL抗体，或与未处理的培养基孵育24小时。结果显示4-1BB-Fc和抗-4-1BBL抗体均抑制LPS-诱导的TNF生成(图9G)。

由于4-1BBL受到多种TLR配体诱导(图8A-F)，检验了以TLR2配体(Pam3)，TLR3配体(聚I:C)，TLR4配体(LPS)，TLR7，8配体(R848)和TLR9配体(CpG)刺激的4-1BBL-缺陷型巨噬细胞的TNF生成。观察到TNF生成的减少(图6B)。这些数据显示了4-1BBL涉及不同TLR介导的TNF生成。由于TLR位于内涵体或内质网(ER)上(例如TLR9)，其不可能与位于质膜的4-1BBL相互作用，TLR9-诱导的4-1BBL的信号转导可能依赖于4-1BBL与细胞表面的其它TLR的相互作用。与此一致的是，在使用低剂量的CpG(1μg/mL)时，在TLR4-缺陷型巨噬细胞中检测到了少量但具有统计意义的TLR9-诱导的TNF生成的下降(图6C-D)。然而，除了4-1BBL和细胞表面TLR之间的相互作用以外，该机制还可以涉及4-1BBL信号转导，因为当该细胞以高剂量的CpG刺激时，由TLR4-缺失引起的下降并不明显。

实施例8：两种连续TLR4复合物

由于4-1BBL诱导依赖于TLR/MyD88/TRIF途径，4-1BBL-介导的信号转导独立于MyD88和TRIF，但与其和TLR的相互作用有关，参照下文对LPS-处理的巨噬细胞中是否有连续TLR4信号转导复合物进行了检验。以LPS处理巨噬细胞0.5，1，2，4，8和12小时。将总细胞溶解产物(1)以抗-4-1BBL，抗-TLR4和抗-MyD88进行免疫印迹；(2)以抗-TLR4抗体进行免疫沉淀并以抗-TLR4，抗-4-1BBL和抗-MyD88进行免疫印迹；(3)以抗-MyD88抗体进行免疫沉淀并以抗-MyD88，抗-TLR4和抗-4-1BBL进行免疫印迹；或者(4)以抗-4-1BBL抗体进行免疫沉淀并以抗-4-1BBL，抗-TLR4和抗-MyD88进行免疫印迹。将同型抗体作为所有免疫沉淀的阴性对照。针对4-1BBL或MyD88的免疫印迹的阳性对照显示于框中。结果显示在2至8小时暴露时间内LPS诱导4-4BBL表达，但对TLR4或MyD88的蛋白水平没有影响(图10A，细胞溶解产物)。在半小时至1小时LPS暴露时间内TLR4伴随MeD88，但随后与之分离，而该TLR4-4-1BBL复合物出现于2至12小时暴露时间内(图10A，IP：TLR4)。通过MyD88的免疫沉淀确认了TLR4-MyD88复合物(图10A，IP：MyD88)。Myd88不能下拉4-1BBL，显示MyD88与4-1BBL不在相同的TLR4复合物中。4-1BBL的免疫沉淀在2-12小时长的LPS-处理的细胞中下拉TLR4，但未能下拉MyD88，确认了MyD88和4-1BBL不在相同的复合物中(图10A，IP：4-1BBL)。因此，在LPS-处理的巨噬细胞中存在两种连续的TLR4复合物，一种是负责启动细胞应答的MyD88复合物，另一种是参与持续TNF生成的4-1BBL-TLR4复合物。

为了确认MyD88不能与4-1BBL相互作用，按照下文将AU1-标记的MyD88与flag-4-1BBL或flag-TLR4过量表达。以MyD88-AU1表达载体联合flag-4-1BBL或flag-TLR4表达载体转染293T细胞。在转染后24小时溶解细胞，以抗-AU1抗体对细胞溶解产物进行免疫沉淀，然后以抗-flag和抗AU1抗体进行免疫印迹。结果显示Flag-TLR4，而非flag-4-1BBL，被MyD88下拉(图10B)。

为了寻找与4-1BBL相互作用的蛋白，按照下文检测4-1BBL与TRAF2和TRAF6的相互作用。以HA-4-1BBL表达载体联合TRAF2-myc或TRAF6-myc表达载体转染293T细胞。以抗-HA抗体免疫沉淀细胞溶解产物，并以抗-myc和抗-HA抗体进行免疫印迹。结果显示4-1BBL与TRAF6相互作用，但不与TRAF2相互作用(图10C)。

由于4-1BBL和TRAF6的相互作用，检查了4-1BBL-介导的TNF生成是否需要TRAF6。SiRNA可用于参照下文抑制RAW264.7巨噬细胞中的TRAF6。以TRAF6-siRNA#1或#2，或者对照siRNA(C)转染巨噬细胞，通过针对TRAF6的免疫印迹分析TRAF6蛋白水平。与抗-Fc，4-1BB-Fc，4-1BB-Fc和抗-Fc一起，LPS，聚I:C(25μg/mL)，IL-1β(10ng/mL)，或未处理的培养基孵育24小时后，检测对照siRNA-，TRAF6-siRNA#1-或TRAF6-siRNA#2-转染的细胞的TNF生成水平。当细胞以培养基，LPS，或TNF(10ng/mL)处理时，检测IL-6水平。所有siRNA均有效减少了RAW264.7细胞中的TRAF6蛋白水平(图10D)。以4-1BB-Fc，抗-Fc抗体，或4-1BB-Fc和抗-Fc抗体一起处理TRAF6抑制和对照细胞，并检测培养基中的TNF水平。抑制TRAF6阻断了4-1BBL交联介导的TNF生成(图10D)。如同预期，TRAF6的抑制损伤了LPs、聚I:C和IL-1β诱导的细胞因子生成，但对于TNF-诱导的IL-6生成没有影响(图10D)。

为了说明4-1BBL引发的下游事件，检查转录因子激活。4-1BBL的表达激活CREB和C/EBP，但不激活NF-κB(图10E)，这与如下观察一致：4-1BBL缺失对于LPS-诱导的NF-κB激活没有影响，但削弱CREB和C/EBP激活(图3F)。类似地，在过量表达4-1BBL的细胞中未观察到IκBα的降解(图10F)。4-1BBL的表达引发p38，Jnk和Erk部分磷酸化(图10F)，且p38，Jnk和Erk(而非NF-κB)的抑制减少了4-1BBL-介导的TNF生成(图10G)，提示MAP激酶途径参与4-1BBL-介导的TNF生成。4-1BBL信号转导途径似乎影响TnfmRNA，因为4-1BBL缺失导致后期LPS-诱导的TnfmRNA转录的减少(图3E)，而4-1BBL过量表达则增加TnfmRNA数量(图10H)。比较了过量表达4-1BBL的细胞和以LPS处理的细胞中TnfmRNA的半衰期；Tnf转录物显示出类似的半衰期(图10H)。由于已知LPS稳定化TnfmRNA，而4-1BBL缺失降低LPS-诱导的TnfmRNA稳定化(图3F)，4-1BBL似乎是LPS-诱导的TnfmRNA稳定化的中介物。综上，此处所示的数据显示巨噬细胞中TNF表达的启动激活和TNF的持续生成受到早期和后期信号转导途径的调节(图10I)。

促炎症细胞因子的表达受到基因激活和失活机制的严格控制。此处所示的研究显示TNF表达的启动激活和TNF的持续生成受到早期和后期信号转导途径的调节(图10I)。公知的信号途径TLR4/MyD88/TRIF负责炎症基因的启动和早期表达。4-1BBL是早期诱导的蛋白，且仅在细胞激活的早期被诱导。新合成的4-1BBL易位至细胞表面，以针对持续TNF生成形成新的信号转导期。4-1BBL和TLR之间的相互作用似乎参与第二信号转导期的形成，且TLR在该连续信号转导复合物中的作用很可能是协助4-1BBL的寡聚化。4-1BBL复合物的信号转导机制不同于初始TLR4信号转导，因为它独立于MyD88和TRIF。然而，两个信号转导期均需要TRAF6。

炎性细胞因子的生成是炎症过程的一部分，其特征为通常终止于炎症引发剂的分解的起始期和随后的持续期(参见Triantafilou和Triantafilou，Trends Immunol.23：301-304(2002))。在持续炎症应答的末尾常出现炎症调节故障，且延长的持续TNF生成常伴随许多炎症性疾病的病状(参见Vassalli，P.，Annu.Rev.Immunol.10：41 1-452(1992))。因此，4-1BBL的鉴定是持续TNF生成中的关键调节因子，它提供了开发炎症性疾病新型治疗介入的新治疗靶标。

实施例9：4-1BBL在IL-6诱导中的作用

IL-6是涉及炎症的细胞因子。IL-6表达的上升与多种疾病过程(包括类风湿性关节炎(RA)，***性青少年慢性关节炎(JCA)，骨质疏松症，以及牛皮癣)的病状相关。为显示4-1BBL参与IL-6诱导，进行了如下实验。首先，对4-1BBL-/-和野生型小鼠腹膜注射0.5mg的LPS。然后在0，2和6小时采集血清，并检测IL-6水平。结果显示响应LPS时，4-1BBL-/-小鼠生成的IL-6明显少于野生型小鼠(图11A)。当以LPS(100ng/mL)处理来自4-1BBL-/-和野生型小鼠的腹膜巨噬细胞并在3，9和18小时检测培养基中的IL-6水平时，结果确认了来自野生型小鼠的巨噬细胞比来自4-1BBL-/-小鼠的巨噬细胞生成明显更多的IL-6(图11B)。将这些结果与采用Pam3(1μg/mL)，聚I:C(25μg/mL)，LPS(100ng/mL)，R848(100nM)，CpG(5μg/mL)，IL-1β(10ng/mL)，TNF-α(10ng/mL)，或未处理培养基(无)处理野生型和4-1BBL-/-巨噬细胞后24小时的IL-6生成水平进行比较。以Pam3，聚I:C，LPS，R848和CpG处理的野生型巨噬细胞比4-1BBL-/-巨噬细胞生成了明显更多的IL-6(图11C)。相反地，野生型和4-1BBL-/-巨噬细胞的IL-6生成水平相当。

当巨噬细胞与LPS，LPS和4-1BB-Fc，LPS和0，2，或5μg/mL抗-4-1BBL抗体，或未处理的培养基孵育24小时，然后在培养基中检测IL-6水平时，结果显示与LPS和4-1BB-Fc孵育的巨噬细胞比单独与LPS孵育的巨噬细胞生成了明显更少的IL-6(图11D)。与LPS和上升浓度的抗-4-1BBL抗体孵育的巨噬细胞同样显示出下降的IL-6生成水平(图11D)。

为了确认4-1BBL在IL-6生成中的作用，以以含p抑制因子对照siRNA或者4-1BBL-siRNA#1或#2稳定转染的RAW 264.7细胞。检测以LPS处理3，9和24小时的4-1BBL抑制细胞的IL-6生成，并与对照细胞比较。结果显示4-1BBL表达被抑制的RAW264.7细胞相比以对照siRNA转染的RAW264.7细胞生成了明显更少的IL-6(图11E)。这些结果与采用肽聚糖(PG，10μg/mL)，聚I:C(25μg/mL)，LPS(100ng/mL)，CpG(5μg/mL)或未处理的培养基(无)处理24小时的对照和4-1BBL抑制细胞的结果相一致(图11F)。

引用的文献

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其它实施方式

此处参考或提及的所有专利和出版物表示本发明所述领域技术人员的技术水平，且每一篇该种参考的专利或出版物在此引用的程度如同其在此单独或完全引用作为参考。申请人保留将任意所述引用的专利和出版物中的所有材料和信息结合进入本说明书的权利。

此处所述的特定方法和组合物代表了优选的实施方式，且具有示范性，并非对本发明的范围构成限制。本领域的技术人员在参考本说明书后可得到其它的目标、方面和实施方式，它们包含在权利要求书的范围所定义的本发明的精神之内。对本领域的技术人员显而易见的是，可对此处披露的本发明进行各种替换或修改，而不脱离本发明的范围和精神。在此示范性描述的本发明可在此处未作为关键特别披露的任何元素，限定的缺失下进行适当实施。此处示范性描述的方法和流程可以不同的步骤顺序适当实施，且它们不必然局限于此处或是权利要求书中指出的步骤顺序。除非另行明确指明，本说明书和权利要求书所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包含了复数对象。因此，例如”一种抗体”包括了复数量(例如，一种抗体溶液或一系列抗体制备)的该种抗体。任何情况下本发明不得解释为限定于此处披露的特定范例或实施例或方法。在任何情况下本发明均不得解释为受专利商标局的任何审查员或者其他官员或雇员的任何声明所限定，除非该申明是由申请人在书面回复中具体的不加限定和保留明确采纳。

此处所用的术语和表达方式用作描述的术语而非限制，且该术语和表达方式的使用并不排除与所显示或描述相等同的特征或部分等同的特征，但应认识到在本发明所主张的范围内可能进行各种修改。因此，应当认识到尽管本发明已通过优选实施例和可选特征进行了具体披露，本领域的技术人员可对此所披露的概念进行修改和变更，且该种修改和变更被认为在权利要求定义的本发明所披露的范围之内。

此处已对本发明作了广泛和一般的描述。落在普通披露范围内的更小的种类和亚属群组同样构成该发明的一部分。这包括了带有从上位概念中去除任何主题的条件或否定限制的对发明的一般描述，而不论其中是否明确列举了该离体材料。其它实施例在之后的权利要求之内。此外，对于发明中根据马库什组的形式描述的功能和部分，本领域中受教育人员可以认识到本发明同样根据该马库什组中任何单独成员或亚组成员进行了描述。

序列表

<110>斯克利普斯研究院

康永军

韩家怀

<120>炎症性疾病中的4-1BB配体

<130>1361.078W01

<140>未知

<141>2007-10-16

<150>60/852,022

<151>2006,10-16

<150>60/917,561

<151>2007-05-11

<160>60

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>309

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>1

Met Asp Gln His Thr Leu Asp Val Glu Asp Thr Ala Asp Ala Arg His

1 5 10 15

Pro Ala Gly Thr Ser Cys Pro Ser Asp Ala Ala Leu Leu Arg Asp Thr

20 25 30

Gly Leu Leu Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Arg Pro Thr

35 40 45

Asn Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Val Asn Val Arg

50 55 60

Asp Arg Glu Ala Ala Trp Pro Pro Ala Leu Asn Phe Cys Ser Arg His

65 70 75 80

Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala

85 90 95

Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr

100 105 110

Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln

115 120 125

Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly

130 135 140

Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys

145 150 155 160

Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr

165 170 175

Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val

180 185 190

Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro

195 200 205

Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val

210 215 220

Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr

225 230 235 240

Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser

245 250 255

Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly

260 265 270

Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu

275 280 285

Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro

290 295 300

Asp Asn Pro Trp Glu

305

<210>2

<211>254

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210>3

<211>930

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>3

atggaccagc acacacttga tgtggaggat accgcggatg ccagacatcc agcaggtact 60

tcgtgcccct cggatgcggc gctcctcaga gataccgggc tcctcgcgga cgctgcgctc 120

ctctcagata ctgtgcgccc cacaaatgcc gcgctcccca cggatgctgc ctaccctgcg 180

gttaatgttc gggatcgcga ggccgcgtgg ccgcctgcac tgaacttctg ttcccgccac 240

ccaaagctct atggcctagt cgctttggtt ttgctgcttc tgatcgccgc ctgtgttcct 300

atcttcaccc gcaccgagcc tcggccagcg ctcacaatca ccacctcgcc caacctgggt 360

acccgagaga ataatgcaga ccaggtcacc cctgtttccc acattggctg ccccaacact 420

acacaacagg gctctcctgt gttcgccaag ctactggcta aaaaccaagc atcgttgtgc 480

aatacaactc tgaactggca cagccaagat ggagctggga gctcatacct atctcaaggt 540

ctgaggtacg aagaagacaa aaaggagttg gtggtagaca gtcccgggct ctactacgta 600

tttttggaac tgaagctcag tccaacattc acaaacacag gccacaaggt gcagggctgg 660

gtctctcttg ttttgcaagc aaagcctcag gtagatgact ttgacaactt ggccctgaca 720

gtggaactgt tcccttgctc catggagaac aagttagtgg accgttcctg gagtcaactg 780

ttgctcctga aggctggcca ccgcctcagt gtgggtctga gggcttatct gcatggagcc 840

caggatgcat acagagactg ggagctgtct tatcccaaca ccaccagctt tggactcttt 900

cttgtgaaac ccgacaaccc atgggaatga 930

<210>4

<211>1619

<212>DNA

<213>智人

<400>4

gtcatggaat acgcctctga cgcttcactg gaccccgaag ccccgtggcc tcccgcgccc 60

cgcgctcgcg cctgccgcgt actgccttgg gccctggtcg cggggctgct gctgctgctg 120

ctgctcgctg ccgcctgcgc cgtcttcctc gcctgcccct gggccgtgtc cggggctcgc 180

gcctcgcccg gctccgcggc cagcccgaga ctccgcgagg gtcccgagct ttcgcccgac 240

gatcccgccg gcctcttgga cctgcggcag ggcatgtttg cgcagctggt ggcccaaaat 300

gttctgctga tcgatgggcc cctgagctgg tacagtgacc caggcctggc aggcgtgtcc 360

ctgacggggg gcctgagcta caaagaggac acgaaggagc tggtggtggc caaggctgga 420

gtctactatg tcttctttca actagagctg cggcgcgtgg tggccggcga gggctcaggc 480

tccgtttcac ttgcgctgca cctgcagcca ctgcgctctg ctgctggggc cgccgccctg 540

gctttgaccg tggacctgcc acccgcctcc tccgaggctc ggaactcggc cttcggtttc 600

cagggccgct tgctgcacct gagtgccggc cagcgcctgg gcgtccatct tcacactgag 660

gccagggcac gccatgcctg gcagcttacc cagggcgcca cagtcttggg actcttccgg 720

gtgacccccg aaatcccagc cggactccct tcaccgaggt cggaataacg cccagcctgg 780

gtgcagccca cctggacaga gtccgaatcc tactccatcc ttcatggaga cccctggtgc 840

tgggtccctg ctgctttctc tacctcaagg ggcttggcag gggtccctgc tgctgacctc 900

cccttgagga ccctcctcac ccactccttc cccaagttgg accttgatat ttattctgag 960

cctgagctca gataatatat tatatatatt atatatatat atatatttct atttaaagag 1020

gatcctgagt ttgtgaatgg acttttttag aggagttgtt ttgggggggg ggtcttcgac 1080

attgccgagg ctggtcttga actcctggac ttagacgatc ctcctgcctc agcctcccaa 1140

gcaactggga ttcatccttt ctattaattc attgtactta tttgcctatt tgtgtgtatt 1200

gagcatctgt aatgtgccag cattgtgccc aggctagggg gctatagaaa catctagaaa 1260

tagactgaaa gaaaatctga gttatggtaa tacgtgagga atttaaagac tcatccccag 1320

cctccacctc ctgtgtgata cttgggggct agcttttttc tttctttctt ttttttgaga 1380

tggtcttgtt ctgtcaacca ggctagaatg cagcggtgca atcatgagtc aatgcagcct 1440

ccagcctcga cctcccgagg ctcaggtgat cctcccatct cagcctctcg agtagctggg 1500

accacagttg tgtgccacca cacttggcta actttttaat ttttttgcgg agacggtatt 1560

gctatgttgc caaggttgtt tacatgccag tacaatttat aataaacact catttttcc 1619

<210>5

<211>256

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>5

Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln

20 25 30

Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro

35 40 45

Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys

50 55 60

Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro

85 90 95

Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr

100 105 110

Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn

115 120 125

Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg

130 135 140

Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu

165 170 175

Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala

180 185 190

Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe

195 200 205

Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln

210 215 220

Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser

225 230 235 240

Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu

245 250 255

<210>6

<211>255

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210>7

<211>163

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>7

Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys

1 5 10 15

Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile

20 25 30

Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe

35 40 45

Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr His Asn Ala Glu Cys Glu Cys

50 55 60

Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys

65 70 75 80

Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys

85 90 95

Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro

100 105 110

Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr

115 120 125

Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro Pro Val Val Ser Phe Ser Pro

130 135 140

Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu Gly Gly Pro Gly Gly His Ser

145 150 155 160

Leu Gln Val

<210>8

<211>163

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp

1 5 10 15

Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser

20 25 30

Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly

35 40 45

Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys

50 55 60

Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys

65 70 75 80

Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys

85 90 95

Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg

100 105 110

Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly

115 120 125

Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser

130 135 140

Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly

145 150 155 160

His Ser Pro

<210>9

<211>9

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>9

uucaagaga 9

<210>10

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>10

aagacggcgc aggcggcagc g 21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>11

aagaggccgg cgggatcgtc g 21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>12

atagtagact ccagccttgg c 21

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>13

attccgacct cggtgaaggg 20

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>14

gctctatggc ctagtcgct 19

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>15

gcaaagcctc aggtagatg 19

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>16

acctgtagct tgggaacatt t 21

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>17

aatacaatcc agtctgcaag a 21

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>18

ggaucaucaa guacauugut t 21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>19

gggcuacgau guggaguuut t 21

<210>20

<211>186

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>20

Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val

1 5 10 15

Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln

20 25 30

Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro

35 40 45

Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys

50 55 60

Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr

65 70 75 80

His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro

85 90 95

Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr

100 105 110

Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn

115 120 125

Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg

130 135 140

Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu

165 170 175

Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val

180 185

<210>21

<211>185

<212>PRT

<213>智人

<400>21

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro

180 185

<210>22

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>22

aagaggccgg cgggaucguc g 21

<210>23

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>23

auaguagacu ccagccuugg c 21

<210>24

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>24

auuccgaccu cggugaaggg 20

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>25

cgctgccgcc tgcgccgtct t 21

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>26

cgacgatccc gccggcctct t 21

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>27

gccaaggctg gagtctacta t 21

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>28

cccttcaccg aggtcggaat 20

<210>29

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>29

cgcugccgcc ugcgccgucu u 21

<210>30

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>30

cgacgauccc gccggccucu u 21

<210>31

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>31

gccaaggcug gagucuacua u 21

<210>32

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>32

cccuucaccg aggucggaau 20

<210>33

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>33

gcucuauggc cuagucgcu 19

<210>34

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>34

gcaaagccuc agguagaug 19

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>35

agcgactagg ccatagagc 19

<210>36

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>36

catctacctg aggctttgc 19

<210>37

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>37

agcgacuagg ccauagagc 19

<210>38

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>38

caucuaccug aggcuuugc 19

<210>39

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>39

accuguagcu ugggaacauu u 21

<210>40

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>40

aauacaaucc agucugcaag 20

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>41

aaatgtccc aagctacagg t 21

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>42

tcttgcagac tggattgtat t 21

<210>43

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>43

aaauguuccc aagcuacagg u 21

<210>44

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>44

ucuugcagac uggauuguau u 21

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<400>45

aagacggcgc aggcggcagc gtt 23

<210>46

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>46

aagaggccgg cgggaucguc gtt 23

<210>47

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>47

auaguagacu ccagccuugg ctt 23

<210>48

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>48

auuccgaccu cggugaaggg tt 22

<210>49

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>49

cgcugccgcc ugcgccgucu utt 23

<210>50

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>50

cgacgauccc gccggccucu utt 23

<210>51

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>51

gccaaggcug gagucuacua utt 23

<210>52

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>52

cccuucaccg aggucggaau tt 22

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>53

gcucuauggc cuagucgcut t 21

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>54

gcaaagccuc agguagaugt t 21

<210>55

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>55

agcgacuagg ccauagagct t 21

<210>56

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>56

caucuaccug aggcuuugct t 21

<210>57

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>57

accuguagcu ugggaacauu utt 23

<210>58

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>58

aauacaaucc agucugcaag att 23

<210>59

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>59

aaauguuccc aagcuacagg utt 23

<210>60

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡聚核苷酸

<220>

<223>组合DNA/RNA

<400>60

ucuugcagac uggauuguau utt 23

Claims

1.包含4-1BBL阻断剂和药学可接受的载体的药物组合物，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中该拮抗性抗体为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2中所示的序列。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中该寡聚核苷酸具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中该可溶性4-1BB具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其中该可溶性4-1BB具有SEQ ID NO：7，8，20或21中所示的序列。

7.包含载体，权利要求1所述的4-1BBL阻断剂，以及作为抗炎药物的第二药剂的药物组合。

8.如权利要求7所述的药物组合，其中该抗炎药为特异性针对肿瘤坏死因子的抗体。

9.如权利要求7或8所述的药物组合，其中该拮抗性抗体为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

10.如权利要求7或8所述的药物组合，其中该4-1BBL具有SEQID NO：1或2中所示的序列。

11.如权利要求7或8所述的药物组合，其中该寡聚核苷酸具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列。

12.如权利要求7或8所述的药物组合，其中该可溶性4-1BB具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列。

13.如权利要求12所述的药物组合，其中该可溶性4-1BB具有选自SEQ ID NO：7-8和20-21的序列。

14.特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

15.如权利要求14所述的抗体，其中该抗体可结合至包含SEQ IDNO：1或2的4-1BBL多肽。

16.具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列的4-1BBL阻断剂。

17.具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列的可溶性4-1BB。

18.具有SEQ ID NO：7，8，20或21的序列的权利要求17所述的可溶性4-1BB。

19.减少哺乳动物中炎性细胞因子生成的方法，其包括向该哺乳动物施用4-1BBL阻断剂，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。

20.如权利要求19所述的方法，进一步包括在施用该4-1BBL阻断剂之前，鉴定患有或易患炎症性疾病的哺乳动物。

21.如权利要求19或20所述的方法，其中该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或IL-6。

22.如权利要求19或20所述的方法，其中该哺乳动物为人。

23.如权利要求19或20所述的方法，其中该拮抗性抗体为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

24.如权利要求19、20或23所述的方法，其中该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2的序列。

25.如权利要求19或20所述的方法，其中该4-1BBL阻断剂具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列。

26.如权利要求19或20所述的方法，其中该可溶性4-1BB具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列。

27.如权利要求26所述的方法，其中该可溶性4-1BB具有SEQ IDNO：7，8，20或21的序列。

28.减少哺乳动物细胞中炎性细胞因子生成的方法，其包括将该细胞与4-1BBL阻断剂相接触，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。

29.如权利要求28所述的方法，其中该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或IL-6。

30.如权利要求28或29所述的方法，其中该哺乳动物为人。

31.如权利要求28、29或30所述的方法，其中该拮抗性抗体为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

32.如权利要求28、29或30所述的方法，其中该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2的序列。

33.如权利要求28或29所述的方法，其中该4-1BBL阻断剂具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列。

34.如权利要求28或29所述的方法，其中该可溶性4-1BB具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列。

35.如权利要求34所述的方法，其中该可溶性4-1BB具有SEQ IDNO：7，8，20或21的序列。

36.减少哺乳动物中炎症的方法，其包括向该哺乳动物施用4-1BBL阻断剂，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。

37.如权利要求36所述的方法，其中该哺乳动物为人。

38.如权利要求36所述的方法，其中该炎症与类风湿关节炎，青少年类风湿关节炎，牛皮癣关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，Crohn病，类风湿关节炎，***性青少年慢性关节炎，骨质疏松症，或肠应激综合征有关或由之引起。

39.如权利要求36所述的方法，其中该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2的序列。

40.如权利要求36所述的方法，其中该拮抗性抗体为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

41.如权利要求36所述的方法，其中该4-1BBL阻断剂具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列。

42.如权利要求36所述的方法，其中该可溶性4-1BB具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列。

43.如权利要求42所述的方法，其中该可溶性4-1BB具有SEQ IDNO：7，8，20或21的序列。

44.包含容器的制造物品，该容器中包含4-1BBL阻断剂和对该4-1BBL阻断剂在减少炎性细胞因子生成中的使用说明，其中该4-1BBL阻断剂选自(a)特异性针对4-1BBL的拮抗性抗体；(b)在细胞中有效减少4-1BBL核酸表达的寡聚核苷酸；和(c)可溶性4-1BB。

45.如权利要求44所述的物品，其中对该4-1BBL阻断剂的使用的说明包括对该4-1BBL阻断剂在炎症性疾病治疗中的使用的说明。

46.如权利要求45所述的物品，其中该炎症性疾病为类风湿关节炎，青少年类风湿关节炎，牛皮癣关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，Crohn病，类风湿关节炎，***性青少年慢性关节炎，骨质疏松症，或肠应激综合征。

47.如权利要求44，45或46所述的物品，其中该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或IL-6。

48.如权利要求44、45或46所述的物品，其中该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2的序列。

49.如权利要求44、45或46所述的物品，其中该拮抗性抗体为特异性针对4-1BBL的嵌合或人源化抗体。

50.如权利要求44，45或46所述的物品，其中该4-1BBL阻断剂具有选自SEQ ID NO：10-15，22-38和45-56的序列。

51.如权利要求44，45或46所述的物品，其中该可溶性4-1BB具有对应于(a)人4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸186；(b)人4-1BB多肽的氨基酸23至氨基酸186；(c)小鼠4-1BB多肽的氨基酸1至氨基酸187；或(d)小鼠4-1BB多肽的氨基酸24至氨基酸187的序列。

52.如权利要求44，45或46所述的物品，其中该可溶性4-1BB具有SEQ ID NO：7，8，20或21的序列。

53.筛选4-1BBL阻断剂的方法，其包括：

(a)将表达4-1BBL的细胞与候选药剂接触；并

(b)检测该候选药剂是否减少炎性细胞因子的生成，或者该候选药剂是否防止4-1BBL寡聚化，其中如果该候选药剂减少炎性细胞因子的生成或能防止4-1BBL寡聚化，则该候选药剂为4-1BBL阻断剂。

54.如权利要求53所述的方法，其中该细胞为人细胞。

55.如权利要求53所述的方法，其中该细胞为巨噬细胞。

56.如权利要求55所述的方法，其中该细胞为RAW264.7细胞。

57.筛选4-1BBL阻断剂的方法，其包括：

(a)向哺乳动物施用候选药剂；并

(b)检测该候选药剂是否减少炎症或减少炎性细胞因子的生成，其中如果该候选药剂在该哺乳动物体内减少炎症或减少炎性细胞因子的生成，则该候选药剂为4-1BBL阻断剂。

58.如权利要求57所述的方法，其中该炎症与类风湿关节炎，青少年类风湿关节炎，牛皮癣关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，Crohn病，类风湿关节炎，***性青少年慢性关节炎，骨质疏松症，或肠应激综合征有关或由之引起。

59.如权利要求53-58任意一项所述的方法，其中该炎性细胞因子为肿瘤坏死因子或IL-6。

60.如权利要求53-58任意一项所述的方法，其中该炎性细胞因子的生成减少了20％，25％，30％或30％以上。

61.如权利要求53-58任意一项所述的方法，其中该4-1BBL具有SEQ ID NO：1或2的序列。

62.如权利要求57所述的方法，其中该哺乳动物为人。