CN101526466B - 基于核酸外切酶ⅲ末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸外切酶III末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术，它包括末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用及核酸外切酶III保护分析和基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。本发明利用寡核苷酸DNA链3’末端修饰的小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基于核酸外切酶III末端保护作用，通过被保护的寡核苷酸DNA链与双链嵌合染料的复合物的荧光进行小分子与蛋白相互作用以及小分子或其结合蛋白的检测。该方法操作简便、经济快速、灵敏、特异性强，可望成为食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选等的通用技术。
Description
技术领域
本发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，包括末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用及核酸外切酶III保护分析和基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。
背景技术
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术需要复杂的操作，精密的仪器，成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于核酸外切酶III末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术，它对DNA序列没有依赖性，可以检测小分子与蛋白的结合作用，也可检测结合蛋白，或通过竞争反应检测小分子，并且操作简便、快速、灵敏。
本发明的技术方案是，所述基于核酸外切酶III末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术包括：
(1)末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用及核酸外切酶III保护分析；
(2)基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。
以下对本发明做出进一步说明。
所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用的检测及核酸外切酶III保护分析采用以下步骤实现：
对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是：取所述小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中；然后加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；再加入核酸外切酶III反应；
对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是：取所述小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中；然后加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶III反应。
所述末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的定量检测可采用标准的双链荧光嵌入染料指示剂法进行检测。
本发明中，所述双链结构寡核苷酸DNA的末端有机小分子的修饰通过现有的交联反应技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与3’端NH2标记的包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与与3’端标记有巯基的包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。
进一步地，本发明中，所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用的检测及核酸外切酶III保护分析采用以下步骤实现：
a.对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是：取5μl所述小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中，加入1.5μl 10×核酸外切酶III反应缓冲溶液，该溶液为10mM Bis Propane-HCL，pH 7.0，10mM MgCL，1mM DTT)；然后加入8μl包含小分子结合蛋白的样品溶液，在37℃恒温反应0.5小时；再加入10U核酸外切酶III，置于37℃反应5分钟后，升温至80℃反应20分钟进行热灭活以终止酶反应；
b.对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是：取5μl所述小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中，加入1.5μl 10×核酸外切酶III反应缓冲溶液，该溶液为10mM Bis Propane-HCL，pH 7.0，10mM MgCL，1mM DTT)；然后加入5μl包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体溶液3μl，单克隆抗体终浓度为加入的小分子修饰寡核苷酸DNA链浓度的5倍；在37℃恒温反应0.5小时，再加入10U核酸外切酶III，置于37℃反应5分钟后，升温至80℃反应20分钟进行热灭活以终止酶反应。
注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在1％～100％内变化。
本发明中，所述末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的定量检测可采用标准的双链荧光指示剂法进行，以下是用双链荧光嵌入染料SYBR-GREEN 1指示剂法对末端保护的发夹型寡核苷酸DNA链的定量检测步骤：
在所述保护反应溶液中，加入5μl SYBR-GREEN 1(一种双链荧光嵌入染料，1∶30000稀释)，用核酸外切酶反应缓冲液稀释到100μl，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、520nm为发射波长测其荧光信强度。
本发明提出了一种基于双链结构的DNA寡核苷酸末端保护分析的方法，此方法对DNA序列没有依赖性，仅需设计一条发夹形的寡核苷酸探针或设计一对互补双链，在其3’端进行小分子标记，即可实现检测；它也可直接用于小分子结合蛋白的检测，还可通过样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA链竞争与抗体结合间接检测有机小分子，其操作快速简便、灵敏特异，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个通用技术平台。
具体实施方式：
实施例1：基于核酸外切酶末端保护分析检测赭曲霉素A
1)3’端NH2标记的寡核苷酸DNA链和赭曲霉素A的交联
称取9.3mg的赭曲霉素A溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260μl活化后的赭曲霉素A溶液加入到260μl浓度为1μM的3’端NH2标记的发夹型寡核苷酸DNA链(序列为5’-GAA TTC CAA GCGCGA AGT TTT CTT CGC GCT TGG AAT TC-3’)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2小时；反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。
把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中在4℃透析12小时，每隔3小时更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分管保存于-20℃的冰箱中备用。上述的-20℃保存的寡核苷酸DNA链用灭菌水稀释10倍并保存于4℃冰箱中作为次级储备液备用。
2)赭曲霉素A的检测
取上述赭曲霉素A标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，终浓度为100nM，加入5μl SYBR-GREEN 1(一种双链荧光嵌入染料，1∶30000稀释)和1.5μl的10×核酸外切酶III反应缓冲溶液(10mM Bis Propane-HCL，pH 7.0，10mM MgCL2，1mM DTT)，再加入5μl待检测的赭曲霉素A样品溶液，混合均匀后加入3μl浓度为1000nM的赭曲霉素A鼠源单克隆抗体，室温反应15分钟，反应后加入8U核酸外切酶III(NEB公司)在37℃酶切30分钟后，升温至80℃反应20分钟进行热灭活以终止酶反应；用核酸外切酶反应缓冲液稀释酶切终产物到100μl，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、520nm为发射波长测其荧光信强度。
按上述1)、2)步骤对7个配制的赭曲霉素A标准溶液(浓度从1nM到200nM，共做7个不同的浓度)进行检测，记录各标准溶液样品的荧光强度。用荧光强度值对标准溶液中赭曲霉素A浓度作图获得标准曲线。
实施例2：基于核酸外切酶端点保护分析检测叶酸结合蛋白
1)3’端NH2标记的寡核苷酸DNA链和叶酸的交联
称取10mg的叶酸溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15分钟，再加入2.8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260μl活化后的叶酸溶液加入到260μl浓度为1μM的3’端NH2标记的发夹型寡核苷酸DNA单链(序列：5’-GAATTC CAA GCG CGA AGTTTT CTT CGC GCT TGG AAT TC-3’)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4，在轻微搅拌下室温反应2小时；反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。
把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH2PO4，pH 7.4)中在4℃透析12小时，每隔3小时更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分管保存于-20℃的冰箱中备用上述的-20℃保存的寡核苷酸DNA链用灭菌水稀释10倍并保存于4℃冰箱中作为次级储备液备用。以上所有的反应均在遮光的条件下进行。
2)叶酸结合蛋白的检测：
取5μl上述叶酸标记的寡核苷酸DNA链次级储备液于微量管中，使最终DNA链的浓度为100nM，加入5μl SYBR-GREEB 1(一种双链荧光嵌入染料，1∶30000稀释)和1.5μl的10×核酸外切酶III反应缓冲溶液(10mM Bis Propane-HCL，pH 7.0，10mM MgCL2，1mMDTT)，再加入5μl待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，室温反应15min，反应后加入8U核酸外切酶III(NEB公司产品)在37℃酶切30min后，升温至80℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。用核酸外切酶反应缓冲液稀释酶切终产物到100μl，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、520nm为发射波长测其荧光信强度。
按上述1)、2)步骤对7个配制的叶酸结合蛋白标准溶液(浓度从1nM到200nM)进行检测，记录各标准溶液样品的荧光强度做叶酸结合蛋白的浓度和荧光强度的标准曲线，未知样品中叶酸结合蛋白所产生的荧光强度和标准的曲线对照确定其浓度。
Claims (1)
1.一种基于核酸外切酶III末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法，其特征是，该方法包括：
(1)末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用及核酸外切酶III保护寡核苷酸DNA链，然后对保护的寡核苷酸DNA链进行分析；
对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是：取所述有机小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中；然后加入包含有机小分子的结合蛋白的样品溶液；再加入核酸外切酶III反应；
对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是：取所述有机小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中；然后加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶III反应；
(2)基于双链指示染料对双链结构寡核苷酸DNA链进行末端保护，对所保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测；所述检测采用标准的双链荧光嵌入染料指示剂法进行。
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