CN101516910A - Bst2抑制剂的作用 - Google Patents

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Abstract

本申请案揭示一种阻止免疫细胞与其他细胞结合的方法，其包括使免疫细胞和其他细胞与包含骨髓基质抗原－2(Bst2)拮抗剂的组合物接触。

Description

Bst2抑制剂的作用
本申请案主张2006年6月20日申请的美国专利申请案第11/471,853号的优先权，所述专利申请案的内容全部并入本文中参考。
技术领域
本发明涉及抑制发炎期间细胞间粘附的分子和其用途。本发明也涉及在抑制参与炎症的细胞的细胞间粘附和激活中使用骨髓基质抗原-2(BoneMarrow Stromal Antigen-2，Bst2)蛋白或其片段作为诱饵或Bst2结合抗体以及小分子。本发明也涉及发现Bst2配位体和Bst2配位体抑制剂的方法。本发明也涉及包含前述物质的组合物和预防或治疗炎症相关疾病的方法。
背景技术
炎症是身体保护组织免于感染、损伤或疾病的正常反应。炎症反应以由受感染组织中的细胞产生和释放化学因子开始。化学因子引起发红、肿胀、疼痛、发热和功能丧失。发炎组织中的细胞产生募集白细胞到发炎部位的信号。白细胞必须粘附于内皮细胞以从血流迁移到发炎部位。同时，白细胞应粘附于抗原呈递细胞(antigen presenting cell)以允许正常的特异性免疫反应，且最后应粘附于合适靶细胞以溶解病原体感染细胞、癌细胞或其类似细胞。所募集到的白细胞清除任何感染性或有害因子，且从损伤组织去除损坏细胞的碎片。
浸润白细胞通过吞噬入侵微生物或死细胞而在正常炎症的组织再生和免疫反应中发挥关键作用。然而，浸润白细胞在病理性慢性炎症中引起严重或致命的状态。因持续炎症反应而将自身细胞异常识别为非自身(外来)或过度发炎引起多种发炎性疾病，包括糖尿病、动脉粥样硬化、白内障、再灌注损伤、感染性脑膜炎、类风湿性关节炎、哮喘、脓毒症(败血症)、发炎性肠病和多发性硬化症。
白细胞与内皮细胞之间的相互作用如下。
白细胞具有双重功能，可以在血流中循环和粘附于特定细胞的形式起作用。具体来说，粘附的白细胞与内皮细胞相互作用，使与抗原呈递细胞的细胞间粘附稳定或充当迁移到发炎性或感染部位的效应细胞(effectorcell)。对于正常特异性免疫反应，白细胞应粘附于抗原呈递细胞，且最终应粘附于合适靶细胞以溶解病原体感染细胞、癌细胞或其类似细胞。在同种异体移植排斥、皮肤感染或损伤区域出现白细胞的大量入侵，且在多种疾病中也被观察到，这些疾病包括退化性关节疾病(诸如，骨关节炎)、银屑病(牛皮癣)、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎、接触性皮炎和发炎性肠病。
在这些疾病中，大于95％的骨髓细胞(myeloid cell)移到发炎部位并在发炎部位积聚。白细胞是发炎性反应的关键因子，其发挥抗菌、分泌和吞噬活性。其通过产生水溶性介体或通过特异性粘附于各种细胞聚集在出现炎症或需要出现炎症的组织中。实际上，诸如非类固醇消炎药(nonsteroidalanti-inflammatory drug，NSAID)或糖皮质激素的消炎剂透过阻止白细胞的粘附和流入发挥治疗功效。在动物模型中，对细胞间粘附的抑制可改良或预防自体免疫疾病动物模型中的疾病或同种异体移植排斥。最近临床研究已揭露抑制LFA-1/ICAM-1或VLA-4/VCAM-1相互作用的人化单克隆抗体对包括银屑病、多发性硬化症和发炎性肠病的自体免疫疾病具有显著的功效和良好的安全性。
为炎症相关疾病的发病机理的重要特征：白细胞对内皮细胞不受控制的入侵，乃通过多步过程发生，这一过程以白细胞粘附且结合于内皮细胞的表面开始。白细胞与内皮细胞表面的结合由存在于白细胞和内皮细胞表面上的细胞表面分子所促成(Bevilacqua，J.Clin.Invest.11：767-804，1993)。细胞表面分子因白细胞从血流中迁移出而过度表达。
白细胞与内皮细胞之间的相互作用是许多发炎性疾病的关键因素。举例来说，有人提出增强的白细胞-内皮细胞相互作用导致肝微灌注病症是肝功能衰竭的主要促成因素(Croner等人，Microvasc.Res.67：182-191，2004)。举例来说，动脉粥样硬化是典型的发炎性疾病，其中包括T淋巴细胞和活化巨噬细胞的大量发炎性细胞集中于动脉粥样硬化部位。单核细胞于动脉内皮的离散片段中的积聚和粘附是动脉粥样化形成中最早的可检测的事件且为动脉粥样硬化发病机理的主要特征(Ross，Nature 362：801-809，1993)。在这一区域内，存在丰富的促发炎细胞因子，包括调控区域发炎性反应的干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。大量粘附分子表达于单核细胞表面上(Valente等人，Circulation 86：III20-25，1992)，且覆盖在动脉粥样硬化病灶上的内皮细胞表达大量血管配位体(Poston等人，Am.J.Pathol，140：665-673，1992)。
白细胞外渗穿过内皮屏障是诸如类风湿性关节炎的发炎性疾病发病机理中的关键事件。内皮细胞参与关节炎的基本机制，诸如肿瘤坏死因子-α和诱发炎症的细胞因子(诸如白细胞介素-1β)的多种炎症介体通过这一机制激活内皮细胞。这导致在类风湿性关节炎中内皮细胞粘附分子的表达升高，从而导致白细胞与内皮细胞之间的相互作用增强。将白细胞募集到血管内皮细胞也是哮喘的重要步骤。
在患有哮喘的患者的气管中，存在增大数目的已激活嗜酸性粒细胞、CD25阳性T淋巴细胞和具有血液单核细胞表型特征的不成熟巨噬细胞。人白细胞抗原(HLA)II类的表达在上皮细胞、巨噬细胞和其它浸润细胞中增加(Arm等人，Adv.Immunol.51：323-382，1992)。
白细胞迁移穿过血脑屏障的速率增加是多发性硬化症的主要症状。白细胞中的紧密连接蛋白质与内皮细胞中的紧密连接蛋白质之间的相互作用在生理条件下促使白细胞外渗到中枢神经***中且紧密连接蛋白质的表达改变是多发性硬化症的病理学先决条件(Worthylake等人，Curr.Opin.CellBiol.13：569-577，2001)。
如上所述，因为白细胞粘附于内皮细胞在多种疾病中很重要，所以对细胞间粘附的抑制可产生各种发炎性和免疫疾病的治疗策略。
在分子生物学方面，已知以下分子参与炎症。
细胞因子(cytokines)：一般针对严重细菌感染或外伤性损伤的会产生的全身性炎症可影响早期损伤的组织***末梢(Lush和Kvietys，Microcirculation 7：83-101，2000)。从受侵染组织释放的细菌产物和其它诱发炎症的介体诱导诱发炎症的介体的形成，所述介体包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素-1β、γ-干扰素和白细胞介素-6。在脓毒病中，血管内皮损伤促进TNF-α和白细胞介素-1β的产生。这些细胞因子直接作用于内皮细胞并增强白细胞粘附(Pober等人，J.Immunol.137：1893-1896，1986；Dustin和Springer，J.Cell Biol.107：321-331，1988；Cotran和Pober，J.Am.Soc.Nephrol.1：225-235，1988)。这些细胞因子也激活血液和血管内皮中的血液嗜中性粒细胞(Arai等人，Annu RevBiochem，59：783-836，1990)。举例来说，TNF-α通过自分泌或旁分泌通路诱导出一系列细胞因子、趋化因子和蛋白酶(Ghezzi和Cerami，Methods Mol.Med.98：1-8.2004)。白细胞介素-6通过粘附分子的表达诱发单核内皮细胞相互作用和发炎性损伤，从而启始动脉粥样硬化过程。白细胞介素-6血液浓度的增强涉及血管炎症和动脉粥样硬化发展(Rader，N.Engl.J.Med.343：1179-1182，2000)。白细胞介素-17诱导许多炎症介体的表达且参与嗜中性粒细胞的分化、成熟和趋化性(Witowski等人，Cell Mol Life Sci.61：567-579，2004)。白细胞介素-17含量的增加已与数种病理学病症相关，包括气管炎症、类风湿性关节炎、腹膜内脓肿和粘附、发炎性肠病、同种异体移植排斥、银屑病、癌症和多发性硬化症。
细胞表面粘附分子：多种发炎性细胞因子诱导内皮细胞-淋巴细胞粘附分子(endothelial cell-lymphocyte adhesion molecules，ELAMs)于细胞表面上的表达(Nortamo等人，Eur.J.Immunol.21：2629-2632，1991)。其被分为两类：细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和内皮细胞-淋巴细胞粘附分子-1(endothelial cell-lymphocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)(Staunton等人，Cell52：925-933，1988)。血管内皮回应于各种介体会表达特定细胞表面糖蛋白。血液白细胞的结合和外渗通过与特异性配位体或对应物受体的相互作用实现(Bevilacqua等人，1993，1994)。参与这一过程的分子包括作为CD18配位体的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、识别白细胞表面上的糖接合物的选择素(selectins)和与同一家族中的其它成员白细胞整合素(integrin)分子相互作用的免疫球蛋白超家族的成员(Panes等人，J.Physiol.269：H1955-1964，1995；Khan等人，Microcirculation10：351-358，2003；Nelson等人，Blood 82：3253-3258，1993；Bevilacqua和Nelson，J.Clin.Invest.91：379-387，1993)。白细胞循环受选择素调控，且白细胞于内皮细胞上的迁移和粘附由β2整合素、Mac-1(CD11b/CD18、aMb2、CR3)和LFA-1引发。Mac-1和LFA-1与表达于内皮细胞表面上的对应物受体ICAM-1相互作用。
与炎症治疗相关的先前技术包括以下各技术。
US5367056专利描述通过处理中断与作为受体或配位体的内皮细胞-白细胞粘附分子(ELAM)的结合的分子或其片段来抑制多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)与内皮细胞的结合。这一专利也描述抑止ELAM表达的反义核苷酸和核糖酶。这一专利更描述鉴别抑制ELAM与其配位体的结合的分子的方法和针对ELAM和其配位体的抗体。
US5863540专利揭示通过投与足以抑止T细胞激活的量的CD44蛋白肽或其衍生物抑止T细胞激活的方法。也揭示通过投与足以抑制CD44介导的细胞粘附或单核细胞IL1释放的量的CD44蛋白肽或其衍生物抑制CD44介导的细胞粘附或CD44介导的单核细胞IL1释放的方法。更揭示通过投与与药物或细胞毒性剂连接的CD44蛋白肽或其衍生物将药物或细胞毒性剂传输到炎症部位的方法。
US5912266专利涉及抑制由细胞表面分子的β2整合素家族介导的细胞间粘附。这一专利揭示适用于抑制或治疗与细胞粘附相关的发炎性和其它病理学反应的医药组合物。这一专利也揭示抑制或治疗白细胞与淋巴细胞引起细胞或组织损伤的病理学病状的方法。
WO03026692专利涉及针对CD3抗原复合体的抗体对患有慢性关节炎症和类风湿性关节炎的患者的治疗用途。
EP1304379专利涉及包含部分或整个能够与CD18抗原结合的抗原决定区的人化抗CD18抗体。
US6689869专利描述人化抗CD18抗体在脓毒病和其它感染性或非感染性外伤期间抑制白细胞流入肺和其它器官中的用途。人化抗CD18抗体可用于抑制患有内毒素休克或成人呼吸窘迫综合征的患者中白细胞进入肺和其它器官。可投与抗体以治疗哮喘或溶栓治疗后白细胞介导的再灌注损伤。这一抗体也可用于减轻或消除正被投与抗感染剂的患者的炎症或用于在抗癌剂化学治疗期间辅助向患者投与治疗药物。
US5821336专利描述为炎症介体或炎症介体前驱体、其衍生物(诸如突变体和片段)的分子量为160,000道尔顿的多肽和其制备方法。这一专利也揭示编码多肽和衍生物的核苷酸序列、包含核苷酸序列的载体、针对多肽或其衍生物的抗体和抗体衍生物。也描述使用抗体和抗体衍生物的针对发炎性病状和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin′s lymphomas)的诊断和治疗方法。
发明内容
炎症需要至少三个连续步骤来将包括白细胞的免疫细胞吸引到发炎部位，所述步骤如下：(1)通过细胞因子和/或细胞间相互作用激活包括白细胞的免疫细胞，诸如淋巴细胞、多形核白细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞；(2)所聚集的免疫细胞迁移且被募集到发炎部位，在发炎部位其通过粘附于内皮细胞将相关信号转导到内皮细胞中；(3)T淋巴细胞和巨噬细胞被激活并分泌细胞因子(诸如，白细胞介素-2)以增强发炎反应。
本发明的发明者发现Bst2蛋白介导免疫细胞的同型粘附或免疫细胞与内皮细胞之间的异型粘附，所述粘附在炎症中发挥关键作用，且进一步发现所述蛋白质的拮抗剂在炎症的主要的三个步骤中起作用且因此可用于预防和治疗炎症相关疾病，从而引出本发明。
一方面，本发明针对一种阻止免疫细胞结合其他细胞的方法，其包含使免疫细胞和/或其他细胞与包含Bst2拮抗剂的组合物接触。其它细胞可为免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、脑细胞、脊髓细胞、周围神经细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、血管细胞、胰腺细胞、大肠和小肠细胞、胃细胞、食道细胞、鼻咽细胞、膜细胞或***细胞。Bst2拮抗剂可为Bst2诱饵。且Bst2诱饵可为Bst2片段或其变异体，与Bst2蛋白相比，所述Bst2片段或其变异体对另一分子或蛋白质具有类似或改良结合。Bst2拮抗剂更可为融合于稳定蛋白质的Bst2诱饵、Bst2诱饵-Fc嵌合或融合构筑体、Bst2诱饵-白蛋白嵌合或融合构筑体或聚乙二醇化(pegylated_Bst2诱饵。另外，Bst2拮抗剂可为特异性结合Bst2和/或小鼠Damp1蛋白的单克隆抗体或抗体样蛋白质域。
在本发明的另一方面中，Bst2拮抗剂可为化学性化合物。
在又一方面中，在上述方法中，免疫细胞和其它细胞可位于发炎部位或位于远离发炎但能传输发炎性和免疫细胞因子或其它发炎性信号到发炎部位的部位。另外，组合物可包括细胞粘附或信号传输抑制化合物或免疫抑制化合物。在一优选实施例中，细胞粘附抑制化合物可为ICAM1拮抗剂或LFA拮抗剂。
在又一实施例中，本发明针对具有消炎活性的Bst2诱饵或Bst2诱饵-免疫球蛋白Fc嵌合体。优选地，可使诱饵融合于免疫球蛋白的任何域。具体来说，Bst2诱饵可融合于IgG重链Fc的铰链-CH2-CH3部分、可为通过IgGκ链-重链双硫键稳定的Bst2融合蛋白；或无其它Bst2二聚合对应物的Bst2诱饵-IgG Fc。
在另一实施例中，本发明针对对Bst2和/或Bst2同源物具有特异性的单克隆抗体。同源物可为小鼠Damp1蛋白。另外，单克隆抗体可包含两个臂，其中一个含有特异性结合除Bst2或其同源物以外的蛋白质的区域。具体来说，表达所述单克隆抗体所结合的Bst2的细胞阻止Bst2配位体-Bst2相互作用或Bst2-Bst2相互作用。
在另一替代实施例中，本发明针对分离Bst2配位体的方法，其包含：
(i)获得与Bst2结合的细胞；
(ii)从表达配位体的细胞中筛选与Bst2结合的配位体，从而分离Bst2的配位体。
在另一实施例中，本发明针对转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包含功能上受破坏的Damp或Bst2基因，其中受破坏基因在胚胎期时被引入小鼠或小鼠的祖先中，其中在受破坏基因纯合的情况下显示炎症相关病症。
在另一实施例中，本发明针对转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包含完全或部分用Bst2基因置换的Damp基因，其中Bst2基因在胚胎期时被引入小鼠或小鼠的祖先中。
在另一方面中，本发明针对减轻个体炎症的方法，其包含向发炎部位投与包含Bst2拮抗剂的组合物。
在另一方面中，本发明针对治疗具有与炎症相关疾病的症状的个体的方法，其包含向有需要的个体投与包含Bst2拮抗剂的组合物。组合物可包含另一消炎化合物。且所指示的疾病可为动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、哮喘、脓毒症、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、白内障、多发性硬化症、急性心肌梗塞、心脏病发作、银屑病、接触性皮炎、骨关节炎、鼻炎、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、自体免疫疾病、恶病质(cachexia)、急性胰腺炎、自体免疫血管炎、自体免疫和病毒性肝炎、延迟型过敏反应、充血、冠状动脉再狭窄、肾小球肾炎、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、与角膜移植相关的发炎性眼病、由外伤所致的脑损伤、癫痫症、出血、中风、镰刀形红细胞贫血症、II型糖尿病、肥胖症、年龄相关黄斑变性(age-related maculardegeneration，AMD)、湿疹、皮炎、学习/认知障碍、神经退化性疾病、帕金森病(Parkinson′s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、溃疡性结肠炎、辐射诱发的损伤、灼烧或电诱发的损伤、引起组织死亡和免疫细胞浸润的中毒、药物诱发的损伤、吸入诱发的损伤、辐射、抽吸诱发的肺损伤、由化学治疗或放射性治疗引起的炎症、自体免疫疾病、狼疮、舍格伦病(Schogren disease)、包括多发性硬化症的脱髓鞘疾病、包括多发性肌炎的发炎性肌病、硬皮病、结节性多动脉炎、肉状瘤病、局部和全身骨化性肌炎、包括阿尔茨海默病的淀粉样相关疾病、椎间盘突出、脊髓和神经损伤、雷意氏综合征(Reye syndrome)、细菌性和病毒性脑炎和脑膜炎、朊病毒相关疾病、古立安-白瑞综合征(Guillain-Barre syndrome)、狂犬病、脊髓灰质炎、大脑出血、颅内出血相关损伤、慢性疲劳综合征、血栓静脉炎、痛风、肉芽肿病、包括肾小球肾炎和间质性肾炎的肾炎、昆虫刺过敏、过敏性反应、再生障碍性贫血、骨髓衰竭、多发性器官衰竭、甲状腺炎、胰岛炎、肝硬化(慢性和急性肝炎)、肺栓塞、毒素和药物诱发的肝病、胰腺炎、缺血性肠病、急性呼吸窘迫综合征或心包炎。
在又一方中面，本发明针对检定有效抑制Bst2介导的细胞-细胞结合的化合物的方法，其包含测定与Bst2结合的化合物。另外，Bst2诱饵可重组表达于宿主细胞中。
由以下发明说明、其所附参考图式和其所附的权利要求书，将对本发明的这些和其它目标更透彻地了解。
附图说明
由下文所给的具体实施方式和仅以说明的方式给出且因此不限制本发明的随附图式，将对本发明更透彻地了解。
图1是绘示人类Bst2与小鼠Damp1之间的序列相似性的氨基酸序列比对。
图2A-2B绘示将人类Bst2诱饵和小鼠Damp1诱饵克隆到表达载体中的方法中所使用的聚合酶链反应(PCR)引物的位置。
图3A-3B绘示人类Bst2诱饵和小鼠Damp1诱饵的电泳分析的结果。
图4绘示U937细胞同型聚集过程中Bst2基因的表达模式。
图5绘示Bst2过度表达对U937细胞同型聚集的促进作用。
图6A-6E绘示Bst2诱饵对U937细胞同型聚集的作用。
图7A-7G绘示Bst2诱饵对人类血管内皮(human vascular endothelial，HUVEC)细胞与U937细胞之间的细胞间粘附的作用。
图8A-8F绘示Bst2诱饵对HUVEC与U937细胞之间的细胞间粘附的剂量依赖型作用。
图9A-9G绘示Bst2siRNA对HUVECs与U937细胞之间的细胞间粘附的作用。
图10A-10B绘示Bst2过度表达对Jurkat细胞的聚集和Jurkat细胞中白细胞介素-2(IL-2)的产生的作用。
图11A-11I绘示Bst2诱饵和Bst2 siRNA对Jurkat细胞聚集的作用。
图12A-12B是绘示Bst2诱饵对Jurkat细胞聚集和IL-2产生的作用的曲线图。
图13绘示处理Bst2诱饵后所沉降的免疫细胞的数目的变化。
图14绘示处理Bst2诱饵后细胞因子的含量减少。
图15A-15D绘示人类Bst2与小鼠Damp1之间的功能相似性。
图16A-16D绘示Bst2诱饵和小鼠Damp1诱饵对小鼠的卵白蛋白诱发的哮喘的抑制作用。
图17绘示用于制备Bst2诱饵的聚乙二醇(PEG)接合形式的PEG部分。
图18绘示PEG接合Bst2诱饵的代谢降解改良。
图19绘示炎症相关疾病中Bst2的表达和分布。
图20A-20D绘示融合于Fc区的Bst2诱饵的示意图。A：Bst2诱饵自身；B：融合于IgG重链Fc的铰链-CH2-CH3部分的Bst2诱饵；C：通过自然存在的IgGκ链-重链双硫键而稳定的Bst2融合蛋白；D：表达Bst2诱饵-IgG Fc而无其它Bst2二聚对应物。
图21A-21D绘示图20的Bst2诱饵-IgG Fc融合蛋白的代表性载体图。
图22绘示PCR克隆和融合策略。
图23A-23B绘示经纯化Bst2诱饵和其它Fc融合体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。A：描绘亲和力纯化后各种Bst2融合蛋白的经考马斯亮兰(Coomassie)染色的代表性PAGE凝胶(4～12％梯度凝胶，英杰(Invitrogen))。B：尺寸排阻色谱法后的PAGE。
图24A-24B绘示A：Bst2涂布板和B：BSA涂布板上的Bst2诱饵与免疫细胞的直接结合。
图25绘示Bst2诱饵或Fc融合体的血浆半衰期。
图26绘示Bst2诱饵-Fc融合体在Bst2诱饵与细胞之间的结合中的抑制作用。
图27A-27D绘示Bst2诱饵-Fc融合体对小鼠哮喘模型的作用。
图28A-28B绘示人类-小鼠嵌合Bst2小鼠的产生。A：鼠类(上图，黑色)和人类(下图，灰色)的基因组座位(genomic locus)。外显子(Exon)以矩形框形式绘示。跨膜域的末端用箭头指示，且起始甲硫胺酸(ATG)的位置用星号指示。整个编码外显子的大概物理距离在基因组座位下方指示。这个图未按比例绘制。B：制造嵌合人类-小鼠BST2的策略。
图29A-29E绘示内源性Bst2为受IFNγ刺激后的内皮细胞(HUVEC)与单核细胞(U937)之间的异型聚集所需。A：对照；B：炎症的IFNγ刺激；C：炎症的IFNγ刺激+对照siRNA；D：炎症的IFNγ刺激+Bst2 siRNA；E：由A-D产生的Bst2 siRNA的定量分析。
图30绘示Bst2 siRNA处理或ICAM1 siRNA处理分别不影响经IFNγ处理的HUVEC的ICAM1表达或Bst2表达。执行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析。
图31A-31G绘示Bst 2siRNA与ICAM1 siRNA的组合处理，且绘示在异型粘附检定中的叠加效应。A：对照；B：炎症的IFNγ刺激；C：炎症的IFNγ刺激+对照siRNA；D：炎症的IFNγ刺激+Bst2 siRNA；E：炎症的IFNγ刺激+ICAM1 siRNA；F：炎症的IFNγ刺激+ICAM1 siRNA+Bst2 siRNA；G：由A-F产生的Bst2 siRNA和ICAM1 siRNA的定量分析。
图32A-32M绘示异型粘附检定中抗ICAM1或Bst2诱饵的剂量依赖型反应。A绘示对照；B、C、D、E和F绘示炎症的IFNγ刺激+渐增剂量的ICAM-1Ab；G绘示炎症的IFNγ刺激+对照BSA；H绘示炎症的IFNγ刺激+对照IgG；I、J、K和L绘示炎症的IFNγ刺激+渐增剂量的BST2诱饵；M绘示由A-L产生的抗ICAM1和Bst2诱饵的剂量依赖型反应的定量分析。
图33A-33C绘示Bst2诱饵与抗ICAM的组合处理对细胞粘附产生叠加效应。使用次最佳剂量的Bst2诱饵(100ng/ml)和抗ICAM1(1μg/ml)。当使用Bst2诱饵与抗ICAM1时，细胞粘附完全被抑制到对照水平。
图34绘示细胞因子处理后Bst2 mRNA的相对表达量。如所指示，绘示Jurkat、人类血管内皮细胞(human vascular endothelial cell，HUVEC)、HeLa或冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cell，CASMC)经血清、佛波酯(PMA)(12或18小时)、T淋巴细胞(OKT)(12或18小时)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ或PGJ2处理后的Bst2mRNA含量(以对数比表示)。由实时PCR测量Bst2mRNA含量。
图35绘示迫使细胞A(其表达Bst2配位体)与细胞B(其表达蛋白质或化合物Y的受体)之间相互作用和信号转导的方法的示意图。包含Bst2诱饵和蛋白质或化合物Y的二价融合蛋白可充当迫使细胞A与细胞B之间相互作用的连接物。如此可改良细胞A与细胞B之间的信号转导。
图36绘示噬菌体克隆与Bst2/Damp1诱饵的结合。
图37A-37B绘示抗Bst2/Damp1单克隆抗体(A)重链可变区和(B)κ链可变区。
图38A-38B绘示经瞬时表达且在PAGE凝胶上纯化的抗Bst2单株抗体。
(A)在非还原条件下；(B)在还原条件下。
图39绘示在小鼠的卵白蛋白诱发的哮喘中经抗Bst2/Damp1单克隆抗体处理后所沉降的免疫细胞的数目的变化。
具体实施方式
在本中请案中，“一”用于指单个或多个目标。
如本文中所使用，“拮抗剂”或“阻断剂”是指抑制、阻断或降低诱发炎症的蛋白质的活性的物质。拮抗剂的作用机制不受特别限制。拮抗剂的实例包括有机或无机化合物；聚合化合物，诸如蛋白质、碳水化合物和脂质；和多种化合物的复合物。如本文中所使用，“Bst2拮抗剂”或“Bst2阻断剂”是指抑制、阻断或降低Bst2蛋白的诱发炎症活性方面的活性的物质。
如本文中所使用，“Bst2配位体”或“BstL”是指与Bst2特异性结合的分子。
如本文中所使用，蛋白质的“同源物”是在不考虑与参考蛋白质的总序列相似性的程度的情况下，认为具有与参考蛋白质相似的活性或相似的比活性的蛋白质。
如本文中所使用，术语“发炎性疾病”是指由身体抵抗有害影响的防御反应或感染反应所引起的所有疾病，其产生具有诸如发红、肿胀、压痛、疼痛、发烧和功能障碍的症状的状态(物理、化学和生物状态)。
如本文中所使用，术语“修饰”指示非肽聚合物与Bst2蛋白或其片段连接的过程。
如本文中所使用，术语“非肽聚合物”是指两个或两个以上重复单元彼此连接的生物相容性聚合物。非肽聚合物的实例包括聚乙二醇、聚丙二醇(polypropylene glycol，PPG)、共聚乙二醇/丙二醇、聚氧化乙烯(polyoxyethylene，POE)、聚氨基甲酸酯、聚磷腈(polyphosphazene)、多糖、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基***、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳素(chitin)、透明质酸和肝素。优选非肽聚合物为聚乙二醇。
如本文中所使用，术语“可操作性连接”是指核酸表达控制序列与编码标靶蛋白质的第二核酸序列之间以使得允许出现一般功能的方式的功能性连接。举例来说，启动子可与编码蛋白质的核酸序列可操作性连接并影响编码序列的表达。与载体的可操作性连接可使用所属领域中熟知的基因重组技术来制备，且位点特异性DNA裂解和连接可使用所属领域中通常已知的酶来实现。
如本文中所使用，术语“预防”意指通过投与组合物抑制发炎性疾病或延迟发炎性疾病发生的所有活动。如本文中所使用，术语“治疗”是指减轻并有利地影响患有发炎性疾病的人类的所有活动(治愈性治疗、预防治疗性治疗和预防性治疗)。
如本文中所使用，术语“siRNA”是指能够通过裂解标靶mRNA诱导RNA干扰(RNAi)的短双链RNA分子。如本文中所使用，术语“特异性”或“对...具有特异性”意指仅抑制标靶基因而不影响细胞中的其它基因的能力。在本发明中，提供对Bst2具有特异性的siRNA分子。
如本文中所使用，与参考活性“相似”的活性视为如由指定活性的客观定义的参数所测量，大于约80％。
如本文中所使用，“小分子量化合物或调节剂”或“化合物”是指不同于诸如碳水化合物、多肽、核酸或脂质的生物分子的化合物。小分子化合物或调节剂可包括(但不限于)拮抗剂、激动剂、肽模拟剂、抑制剂、配位体和用于Bst2/Bst2L结合的结合因子。
如本文中所使用，“变异体”是指因缺失、***、非保守性或保守性取代或其组合而具有不同于蛋白质的原生氨基酸序列的序列的蛋白质或其片段。举例来说，所属领域中已知蛋白质和肽中的通常不改变蛋白质或肽的活性的氨基酸交换(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，NewYork，1979)。最常发生的交换为双向Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
如本文中所使用，描述能够在合适宿主细胞中表达所关注蛋白质的载体的术语“载体”是指包含基因***以在宿主细胞中表达的方式与其可操作性连接的必要调控元件的基因构筑体。
Bst2蛋白
Bst2在炎症期间参与细胞间粘附。在一方面中，本发明提供骨髓基质抗原-2(Bone Marrow Stromal Antigen-2，Bst2)蛋白的拮抗剂以在炎症期间阻止免疫细胞与内皮细胞或免疫细胞彼此之间的细胞间粘附和激活。
本发明者通过使用(1)人类U937单核细胞同型聚集模型来研究Bst2对免疫细胞聚集的效用，(2)U937细胞与HUVEC之间的异型聚集模型来研究Bst2对免疫细胞与内皮细胞之间的细胞间粘附的效用，(3)Jurkat T细胞模型来研究Bst2对T淋巴细胞激活的效用，发现Bst2蛋白参与发炎过程，其中白细胞迁移到发炎部位，识别细胞外基质组分以与细胞相互作用并粘附于细胞。本发明者更发现Bst2蛋白拮抗剂有效抑制所述细胞间粘附且因此能够有效治疗发炎性疾病。
Bst2蛋白最初在骨髓基质细胞中被鉴别出且认为参与细胞的分化和增生。1995年克隆出编码Bst2的cDNA，且发现BST-2基因位于人类染色体19p13.2上(Ishikawa等人，Genomics 26：527-534，1995)。Bst2基因由5个外显子和4个内含子组成。Bst2是由180个氨基酸组成的30,000至36,000道尔顿II型跨膜蛋白质(Ohtomo等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.258：583-591，1999)。人类Bst2基因的小鼠同源物Damp1基因与人类Bst2基因具有45％的DNA序列一致性，且如图1中所示，与人类Bst2具有小于40％的氨基酸序列相似性。Bst2蛋白主要表达于肝、肺、心脏和胎盘中，且以较低水平表达于胰腺、肾、骨骼肌和脑中。于成纤维细胞上的BST-2表面表达加速鼠类骨髓来源的前B细胞的基质细胞依赖型生长。这一结果提示Bst2调控前B细胞生长或在类风湿性关节炎中的B细胞激活中发挥关键作用。Bst2也过度表达于一些类型的癌症中，包括口腔癌、乳癌、腺瘤和***。应注意，参考图1，跨膜域的边缘不限于图示序列。横跨膜区可能在区域的N-末端或C-末端外加或减去5个氨基酸。
关于Bst2蛋白，已报导编码Bst2蛋白的基因的分离和表达(EP1033401)和Bst2蛋白在癌症诊断中的用途(WO01/57207和WO01/51513)。Bst2蛋白分为三个域：细胞质域、跨膜域和细胞外域，且细胞内域包含细胞质域和跨膜域。
发炎性疾病
本发明组合物可用于预防或治疗所有类型的涉及Bst2过度表达的发炎性疾病。实际上，Bst2在多种发炎性疾病中过度表达，包括哮喘、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎、慢性活动性胃炎、急性阑尾炎和红斑狼疮(图19)。因此，可由本发明的组合物预防或治疗的疾病包括(但不限于)动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、哮喘、脓毒症、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、急性心肌梗塞、心脏病发作、银屑病、接触性皮炎、骨关节炎、鼻炎、克罗恩氏病、II型糖尿病、糖尿病性神经病、慢性阻塞性肺病、恶病质、急性胰腺炎、自体免疫血管炎、自体免疫和病毒性肝炎、延迟型超敏反应、充血、冠状动脉再狭窄、肾小球肾炎、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、可能与角膜移植相关的发炎性眼病、由外伤所致的脑损伤、癫痫症、出血或中风。Bst2阻断剂也可适用于治疗镰刀形红细胞贫血症。镰刀形红细胞贫血症中存在复发性炎症和血管病变。已证明白细胞与其它血细胞和内皮细胞的粘附造成镰刀形红细胞贫血症中的血管阻塞(Okpala I.Curr Opin Hematol.2006，Jan；13(1)：40-4)。另外，近年来出现的观念：促发炎性通路的激活可为肥胖症相关胰島素抵抗的机制(Roytblat等人，Obes Res.2000，8(9)：673-5；Straczkowski等人，Science.1996，271(5249)：665-8；Hirosumi等人，Nature.2002，420(6913)：333-6)。Bst2阻断剂也可能对胰岛素抵抗、II型糖尿病和肥胖症有益。
其它炎症相关疾病包括年龄相关黄斑变性(AMD)、湿疹、皮炎、学习/认知障碍、神经退化性疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、溃疡性结肠炎、辐射诱发的损伤、灼烧或电诱发的损伤、引起组织死亡和免疫细胞浸润的中毒、药物诱发的损伤、吸入诱发的损伤、辐射、抽吸诱发的肺损伤、由化学治疗或放射性治疗引起的炎症、包括狼疮、舍格伦病的自体免疫疾病、包括多发性硬化症的脱髓鞘疾病、包括多发性肌炎的发炎性肌病、硬皮病、结节性多动脉炎、肉状瘤病、局部和全身骨化性肌炎、包括阿尔茨海默病的淀粉样相关疾病、椎间盘突出、脊髓和神经损伤、雷意氏综合征、细菌性和病毒性脑炎和脑膜炎、朊病毒相关疾病、古立安-白瑞综合征、狂犬病、脊髓灰质炎、大脑出血、颅内出血相关损伤、慢性疲劳综合征、血栓静脉炎、痛风、肉芽肿病、包括肾小球肾炎和间质性肾炎的肾炎、昆虫刺过敏、过敏性反应、再生障碍性贫血、骨髓衰竭、多发性器官衰竭、甲状腺炎、胰岛炎、肝硬化(慢性和急性肝炎)、肺栓塞、毒素和药物诱发的肝病、胰腺炎、缺血性肠病、急性呼吸窘迫综合征和心包炎。
Bst2诱饵
Bst2蛋白或其片段或变异体的任何可溶性形式可用作诱饵，诱饵会竞争性结合至本來與表达Bst2的免疫细胞结合将诱发炎症的分子或位点。用作诱饵的Bst2片段不受特别限制，只要其通过抑制细胞间粘附具有发炎抑制作用，但优选具有整个或部分细胞内域缺失的Bst2蛋白。在一例示性实施例中，Bst2蛋白片段是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的Bst2蛋白片段。Damp1蛋白片段是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的Damp1蛋白片段。发现Bst2蛋白片段和Damp1蛋白片段有效抑制由Bst2诱发的细胞间粘附。
在本发明的某些方面中，可使用小鼠Damp1替代Bst2且其可互换使用。举例来说，当使用Bst2诱饵时，也预期可使用Damp1诱饵，包括Damp1诱饵的任何嵌合体。也预期Damp1和其变异体可与Bst2一起用于治疗或减轻个体的炎症。因此，应了解，本申请案中所指示的Bst2的任何特定用途也适用于Damp1且可以相同的方式主张。
本发明的范畴包括具有Bst2蛋白原生氨基酸序列的蛋白质或其片段或变异体和能够编码通过抑制细胞间粘附和信号转导而具有发炎抑制作用的蛋白质的DNA和RNA。
另外，本发明中提供的蛋白质或其片段可呈具有原生糖链、与原生形式相比糖链增加或与原生形式相比糖链减少的形式或可呈去糖基化形式。蛋白质糖链的增加、减少或去除可由普通方法达成，诸如化学法、酶促法或使用微生物的基因工程法。基因工程法包括使Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc原生序列中存在的一或多个碳水化合物部分缺失和/或添加一或多个原生蛋白质中不存在的糖基化位点。
Bst2诱饵/Bst2诱饵-Fc变异体
尤其小型蛋白质的过快清除可限制治疗功效。所注射的蛋白质治疗剂可被血浆蛋白酶加工，与内皮细胞或血细胞上的血浆蛋白质或受体结合，这可能导致蛋白质被吸收。逃离血管捕获的蛋白质可随后在肝或肾小球中清除。在肾***中，蛋白质将进入尿中并离开身体。肾小球屏障基于分子尺寸和分子电荷区分蛋白质(Brenner等人，Am J Physiol.，1978，234：F455)。因此，分子尺寸或负电荷的增加可降低肾清除率(Wilson等人，J Gen.Physiol.，1970，74：495)。
改良活体内的Bst2诱饵活性和作用持续时间的一般策略包括聚乙二醇化、旨在降低清除率的化学修饰、与白蛋白的蛋白质交联、多聚化、使用DNA重组技术与白蛋白直接融合、与Fc融合等。另外，糖基工程化也适合作为增加Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc的活体内活性和延长其作用持续时间的策略。使额外N-键联寡糖与一致序列连接(Asn-X/Ser/Thr，其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)(Imperiali B和Shannon KL.Biochemistry，1991，30：4374)。也已经向诸如Epo、Mpl配位体或甚至通常完全不含碳水化合物的瘦体素(leptin)的蛋白质中添加N-键联碳水化合物。糖基工程化蛋白质大体上展示活体内活性和作用持续时间的增加(Elliott S.等人，Nat.Biotechnol.2003，21：414)。
可产生以较高亲和力与Bst2L结合Bst2诱饵(Bst2诱饵-Fc)变异体。Bst2的二聚域可参与控制Bst2的配位体结合亲和力。一般认为Bst2的二聚化在Bst2信号转导中发挥作用。白细胞介素2、3、5和6和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的受体含有两个不同亚单元(Hatakeyama M，等人，Science.1989，244(4904)：551-6；Kitamura T，等人，Cell.1991，66(6)：1165-74)。粒细胞集落刺激因子受体、催乳素受体和生长激素受体的配位体结合亚单元形成同源二聚体(Larsen A等人，J Exp Med.1990，172(6)：1559-70；Kelly PA等人，Recent Prog Horm Res.1993，48：123-64)。一般认为二聚化产生高亲和力受体且提供信号转导通路中的第一步(Cunningham BC等人，Science.1991，254(5033)：821-5；NicolaNA，MetcalfD，Cell.1991，67(1)：1-4)。
因为Bst2的同源二聚作用(homodimerization)很可能在Bst2L(Bst2配位体)诱导的信号转导中发挥作用，所以预期可通过使潜在二聚域内的氨基酸残基突变来产生以较高亲和力结合的Bst2诱饵(Bst2诱饵-Fc)变异体。
对Bst2的SMART分析预测卷曲螺旋域存在于人类Bst2的编号96-153(或大鼠Bst2的102-149)氨基酸区域中或存在于小鼠Damp1的相应区域中。Bst2的卷曲螺旋域可能参与Bst2二聚化。
确定Bst2的二聚域
细胞因子诱发的Bst2二聚化可透过经两种不同标签标记的Bst2(诸如，HA-Bst2和Bst2-Flag)转染的稳定细胞中证明或透过经标签标记的Bst2的表达载体瞬时转染后证明。通过共免疫沉淀经标签标记Bst2蛋白证明Bst2的二聚化。可展示野生型Bst2受体的二聚化。当Bst2的二聚化得以证实时，通过缺失分析、丙胺酸扫描突变分析和/或定点突变诱发，可获得有关二聚作用的关键残基的信息。突变可在整个细胞外域或卷曲螺旋域中进行。当可展示野生型受体的二聚作用时，在用于二聚作用的重要残基中含有缺失或取代的突变体将不共免疫沉淀。当瞬时转染到含Bst2细胞中时，二聚域中含有缺失或取代的Bst2突变体可充当在细胞因子刺激后阻断发炎性反应且抑制细胞-细胞粘附的显性消极突变体。当在Damp1-/-细胞(例如，Damp1-/-小鼠胚胎成纤维细胞)中稳定表达时，这些突变体可能不能有效表现出发炎性反应或细胞-细胞粘附。
筛选许多缺失变异体、***变异体或取代变异体以作为高亲和力Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc。可将缺失、***或取代引入如以上所述鉴别出的完整细胞外域、卷曲螺旋域或二聚域中的标靶突变位点中。突变位点的位置可例如：位于人类Bst2、大鼠Bst2和小鼠Damp1中的低同源性区域中。可进行标靶氨基酸残基的缺失、邻接标靶氨基酸残基***一或多个氨基酸残基或标靶氨基酸残基的取代。标靶氨基酸残基可为单个氨基酸残基或多个氨基酸残基。氨基酸序列缺失或***可由1-5个连续残基构成，因为基团缺失/***可导致生物活性的完全丧失。
用于缺失、***或取代的标靶氨基酸残基包括如以上所述鉴别出对Bst2二聚化来说关键的残基。所关注的其它位点包括氨基酸残基与人类Bst2、大鼠Bst2和小鼠Damp1中相似或一致的位点。对于取代突变诱发来说，可进行随机突变诱发。
筛选Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc变异体
1.使用细胞-细胞粘附检定筛选Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc变异体。具有较高亲和力的变异体比亲本Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc蛋白更有效地抑制细胞-细胞粘附。
2.使用此处所述的固相检定筛选Bst2诱饵-Fc变异体。将板涂布抗Fc抗体并与Bst2诱饵-Fc变异体一起培育。然后用3H-胸苷放射性标记Bst2L的源细胞系(参见实例29-1，在鉴别Bst2L的丰富活体外细胞源下)或U937细胞(参见实例20)并添加到孔中。分离和验证Bst2L后(参见实例28-34)，可放射性标记经Bst2L的表达载体转染的COS7细胞而且也用于检定中。固定后，测量经放射性标记细胞的粘附。
3.本文中所述的方法使得所属领域的一般技术人员能够在不需要蛋白质纯化的情况下鉴别具有较高结合亲和力的突变体。设计突变诱发Bst2PCR引物以随机突变诱发所选氨基酸残基或细胞外域、卷曲螺旋域或二聚化域中的任何随机氨基酸。将编码突变的PCR产物亚克隆于经消化的Bst2表达载体中。用突变型Bst2 cDNA瞬时转染COS7细胞。在这一方法中，使细胞外域、卷曲螺旋域或二聚化域中含有突变的Bst2变异体表达于经转染细胞的表面上以便淘选。向涂有经纯化Bst2L的淘选板中添加细胞。然后用经异硫氰酸荧光素(FITC)标记的人类Bst2L-Fc通过间接免疫荧光或荧光激活细胞分选技术(FACS)分析，接着进行二级抗体染色来筛选表达对Bst2L具有较高亲和力的Bst2诱饵的细胞。从附着于板上的细胞回收质粒DNA并用于下一富集循环中。修饰Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc以含有所选突变型序列。在细胞-细胞粘附检定中测试含有所选突变的变异Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc以进行功能性验证。
产生Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc蛋白、Bst2L、这些蛋白质的一部分或这些蛋白质的突变体
本发明的范畴包括构筑Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc蛋白、Bst2L、这些蛋白质的一部分或这些蛋白质的突变体的表达载体的方法，表达于哺乳动物、昆虫、真菌、植物或细菌来源的宿主细胞中，和纯化这些蛋白质的方法。Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc或Bst2L包括来源于小鼠、大鼠、兔子、犬、灵长类动物和其它动物的Bst2和Bst2L同源物的那些蛋白质。关于构筑用于重组蛋白质制备的表达载体，将有必要化学合成具有对于各表达***经密码子优化的核苷酸序列的Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc、Bst2L或其突变体的相应基因或片段。
通过在可呈质粒或病毒形式的宿主细胞特异性载体中邻接宿主细胞特异性启动子***编码Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc或Bst2L的DNA片段构筑经设计以用于在哺乳动物、昆虫(杆状病毒、施奈德细胞(Schneidercell))、真菌、植物或细菌细胞中表达Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc或Bst2L的表达载体。这些蛋白质可以经标签标记融合蛋白质形式表达于哺乳动物、昆虫、真菌、植物或细菌细胞中。标签为对抗体或经特定修饰的固体支撑物具有高结合亲和力的短蛋白质序列。标签可包括(但不一定限于)组氨酸、Flag、V5、GST和HA标签。基于标签对固体支撑物(诸如管柱或珠粒)的亲和力纯化经标签标记的Bst2诱饵。可使用包括液相色谱的其它步骤以增加所有Bst2相关蛋白质的纯度。
必要时可通过乙酸化N-末端胺，酰胺化C-末端羧基，磷酸化丝氨酸、酥胺酸或酪氨酸残基，甲基化赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基的α-氨基，使谷氨酰胺酰(glutaminyl)和天冬酰胺酰(asparaginyl)残基脱酰胺化，羟化脯氨酸和赖氨酸，生物素标记，棕榈酰化(palmitylation)，硫酸化，法尼基化(farnesylation)和其类似方法修饰Bst2、Bst2诱饵或Bst2L的蛋白质或片段。
通过抑制细胞间粘附而具有炎症抑制作用的Bst2或Bst2L蛋白、Bst2诱饵、其片段或其变异体可经天然分离或合成(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.，85：2149-2156，1963)或可通过基于DNA序列的重组方法制备(Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York，USA，第2版，1989)。当使用基因重组技术时，可通过将编码Bst2或Bst2L蛋白、其片段或其变异体核酸***合适表达载体中，用表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞以表达合乎需要的蛋白质和从培养物中回收所产生的蛋白质来获得合乎需要的蛋白质。
1.制备重组Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc、Bst2L、这些蛋白质的一部分或突变体
成功的基于重组蛋白质的方法要求可容易地扩大规模以供大量生产的产生生物学活性蛋白质的能力。上述Bst2相关蛋白质的原生基因序列与表达宿主的原生基因序列之间的密码子使用率相容性是一个重要的考虑因素。
除Bst2诱饵和Bst2诱饵Fc蛋白的治疗效用外，还需要Bst2、Bst2 decoy、Bst2诱饵Fc、Bst2L、这些蛋白质的一部分或这些蛋白质的突变体的重组蛋白质以供筛选抗-Bst2抗体或抗Bst2L抗体的变异体。
重组Bst2、Bst2诱饵和Bst2诱饵Fc蛋白在检定中也用于鉴别参与结合相互作用的Bst2L。Bst2L可为Bst2本身或其它蛋白质、肽或分子。
Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc和Bst2L、其部分和突变体可用于筛选Bst2-Bst2L相互作用的肽或小分子抑制剂或激动剂。所述筛选检定包括适于鉴别小分子药物候选物的高通量蛋白质-蛋白质结合检定、基于细胞的检定、免疫检定或化学文库的生物化学筛选检定。
重组Bst2、Bst2诱饵、Bst2L、其部分和突变体也可适用于基于重组蛋白质的疫苗方法。
1-1.在哺乳动物细胞中表达Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc、Bst2L、这些蛋白质的一部分或这些蛋白质的突变体(各种Bst2相关蛋白质)
许多哺乳动物表达载体和宿主细胞***可购得。哺乳动物表达***描述于实例4中。
1-2.在杆状病毒中表达各种Bst2相关蛋白质
除哺乳动物细胞外，糖基化Bst2、Bst2诱饵、Bst2L和其它Bst2相关蛋白质也可来源于无脊椎动物细胞(包括昆虫细胞，诸如果蝇S2、Sf9)以及植物细胞。关于杆状病毒表达，将相应Bst2或Bst2L序列融合于经标签标记的抗原决定基，例如经poly-his标记的杆状病毒表达载体的上游。Bst2诱饵Fc可在无其它标签的情况下使用。许多杆状病毒表达载体可购得。病毒感染和蛋白质表达如O’Reilley等人，Baculovirus expression vectors：Alaboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994)所述执行。重组杆状病毒通过将Bst2、Bst2诱饵杆状病毒载体和BaculoGold病毒DNA(Pharmingen)共转染到Sf9细胞(ATCC)中来产生。在28℃下培育4-5天后，收集所释放的病毒且用于扩增。
用Ni2+螯合物亲和力色谱法纯化经Poly-his标记的Bst2、Bst2诱饵或Bst2L(Rupert等人，Nature，362：175，1993)。可使用蛋白质A管柱色谱法执行Bst2诱饵Fc的纯化。
1-3.在甲醇毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达各种Bst2相关蛋白质
甲醇毕赤酵母是单细胞真核生物，其在克隆外来基因的简易性以及具有于易于操作的培养物中的紧密受控可诱导表达方面与大肠杆菌(E.coli)具有许多相似性(Kocken，C.H.等人，Infect.Immun.67：43-49.1999)。作为真核生物，甲醇毕赤酵母能够进行数种翻译后修饰，例如，能够形成使得蛋白质能够适当折叠的双硫键，且也已知毕赤酵母可能将蛋白质糖基化(Yadava A和Ockenhouse，Infect.Immun.71：4961，2003)。
各种Bst2相关蛋白质的基因使用关于毕赤酵母密码子使用率经优化的核苷酸序列化学合成。使用例如PicZα(Invitrogen)(一种吉欧霉素(zeocin)可选择质粒)的甲醇毕赤酵母构筑体来于甲醇毕赤酵母中克隆和表达Bst2相关蛋白质。质粒含有用于将蛋白质引导到分泌途径中的与来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α交配因子(mating factor)融合的来自甲醇毕赤酵母的醇氧化酶1启动子。用甲醇诱导后，蛋白质在醇氧化酶1启动子的控制下表达且分泌到培养基中。
构筑各种Bst2相关蛋白质的PicZα表达载体后，用构筑体转化大肠杆菌XL-1蓝细胞，且通过PCR和限制性消化筛选吉欧霉素抗性克隆的***物。使用阳性克隆来转化甲醇毕赤酵母。将转化混合物涂铺于含有吉欧霉素的酵母-蛋白胨-右旋糖-山梨糖醇板上。对于表达，使阳性克隆在经缓冲甘油培养基中生长约24小时。再过24小时，将细胞团粒化并用含有1％甲醇的新鲜培养基诱导。通过ELISA或西方印迹法(Western blotting)关于表达测试上清液以检测各种Bst2相关蛋白质。从培养物上清液中纯化毕赤酵母表达的蛋白质。
1-4.在酵母中表达各种Bst2相关蛋白质
使用密码子优化序列构筑酵母表达载体以用于细胞内产生或分泌。关于分泌，可将编码Bst2、Bst2诱饵、Bst2L、这些蛋白质的部分或突变体的DNA克隆到所选具有编码ADH2/GAPDH启动子、酵母α因子分泌信号/前导序列的DNA的质粒中。可用表达质粒转化酵母细胞并在所选择的发酵培养基中培养(Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3829，1979)。通过三氯乙酸沉淀(TCA precipitation)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮兰染色(Coomassie blue staining)分析酵母上清液。可使用选定管柱色谱法从浓缩上清液中分离出重组Bst2相关蛋白质。
1-5.在大肠杆菌中表达Bst2、Bst2诱饵
在某些条件下，一些上述Bst2相关蛋白质可在大肠杆菌中产生。然而，已知不是所有在大肠杆菌中产生的可溶性蛋白质都可恰当地折叠，且不恰当折叠的蛋白质可能形成呈包涵体形式的不可溶聚集体(Carrio，M.M.和A.Villaverde.2002.J.Biotechnol.96：3-12)。
使用含有合适限制性酶位点的PCR引物扩增编码经选择用于在大肠杆菌***中表达的Bst2相关蛋白质的DNA序列。多种表达载体可购得。用限制性酶消化载体并去磷酸化。然后将PCR扩增的序列连接到载体中。随后使用连接混合物转化大肠杆菌菌株。选择转化株且分离质粒DNA。使所选择的克隆生长于液体培养基中，然后用于较大规模的培养，期间开启表达启动子。可溶解细胞团粒，且然后如果溶解的Bst2相关蛋白质从含有poly-his序列和肠激酶裂解位点的载体中表达，那么可使用(例如)金属螯合管柱纯化所述蛋白质。
2.通过肽合成制备Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc、Bst2L、这些蛋白质的一部分或突变体
Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc、Bst2L、其各种部分或突变体可使用固相技术或固相与液相方法的组合由直接肽合成产生(Stewart等人，SolidPhase peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA，(1969)；BarlosK等人，Int J Pept Protein Res.1991；37：513-520；Babiker E等人，J Org Chem.1978；43：4196-4199)。这些Bst2相关蛋白质的各种部分可单独化学合成和使用化学或酶促方法组合以产生全长Bst2、Bst2诱饵、Bst2L或突变体。
肽合成方法也可能适用于产生这些蛋白质的经修饰型式(例如，磷酸化型式)。
肽可使用L型或D型氨基酸合成。具体来说，哺乳动物蛋白酶和肽酶不能降解由D-氨基酸合成的肽。D型Bst2诱饵或D型Bst2诱饵的各个部分尽管其尺寸小但在活体内将很稳定，且可于饮用水中或与食物混合、以空气喷雾和/或贴片形式投与。
本发明中提供的通过抑制细胞间粘附或相互作用和免疫细胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段可呈单体或多聚体形式。多聚体可由所属领域中通常已知的各种方法形成，且形成多聚体的方法不受特别限制。
多聚体可为(但不限于)二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等等。举例来说，多聚体可使用诱发多聚体形成的序列制备，所述序列例如诱发三聚体形成的异亮氨酸拉链(isoleucine zipper，ILZ)序列或诱发十二聚体形成的表面活性剂蛋白-D(surfactant protein-D，SP-D)。另外，多聚体可(例如)使用连接子通过接合两个或两个以上各以单体形式产生的多肽制备。
多聚体可形成Bst2蛋白或其片段的平行或反平行结构或平行与反平行结构的组合。虽然认为Bst2以同源二聚体形式行使功能，但尚不知同源二聚体中各单体的定向。关于构筑含有Bst2蛋白或其片段的反平行结构的多聚体的表达载体，应以密码子优化核苷酸序列化学合成反平行结构化Bst2蛋白或其片段的编码序列。在表达载体中，各Bst2蛋白(或片段)单元可由合成连接子连接。合成连接子包括富含Gly/Ser的合成连接子(Berezov A等人，2001，J Med Chem 44：2565)或柔性Gly连接子(Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10092，1999)。
当Bst2片段单元足够小从而可通过肽合成直接合成时，可产生L型与D型多聚体两者。
可由非肽聚合物修饰通过抑制细胞间粘附或相互作用和免疫细胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段。
在另一详述方面中，拮抗剂包括经非肽聚合物修饰的Bst2蛋白或其片段，其通过抑制细胞间粘附或相互作用和免疫细胞激活而具有炎症抑制作用。
Bst2蛋白或其片段与非肽聚合物的键联包括共价键和所有类型的非共价键，诸如氢键、离子相互作用、范德华力(van der Waals force)和疏水性相互作用。聚合物优选通过特定反应性基团与蛋白质连接。聚合物的反应性基团的实例包括醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基、酮基、乙烯砜基、硫醇基、酰肼基、羰基二咪唑(carbonyldimidazole，CDI)基、硝基苯基碳酸酯(nitrophenyl carbonate，NPC)基、甲苯磺酸酯基、异氰酸酯基和琥珀酰亚胺衍生物。非肽聚合物与多肽的反应性基团反应，所述反应性基团例如氨基酸残基的N-末端、C-末端和/或侧链(例如，赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱胺酸残基的侧链)。
通过抑制细胞间粘附或相互作用和免疫细胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白可与非肽聚合物以1∶1至1∶10、优选1∶1至1∶2的摩尔比连接。当Bst2蛋白或其片段经两个或两个以上非肽聚合物修饰时，非肽聚合物可相同或不同。通过经非肽聚合物修饰，蛋白质可具有改良的活体内稳定性和新陈代谢。
在另一方面中，本发明提供预防或治疗发炎性疾病的组合物，其包含一或多种选自如以上所述通过抑制细胞间粘附或相互作用和免疫细胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段；通过抑制细胞间粘附而具有炎症抑制作用的经非肽聚合物修饰的Bst2蛋白或其片段的蛋白质。
本发明组合物可施用于发炎性疾病可通过投与Bst2而得以抑制或降低的人类以及家畜，诸如牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、犬和猫。在这种情况下，本发明者发现人类Bst2和小鼠Damp1具有功能相似性且作用于具有相同来源以及不同来源的细胞。
在另一详述方面中，本发明涉及预防或治疗发炎性疾病的方法，其包含向患者投与一或多种选自通过抑制细胞间粘附或相互作用和免疫细胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段的蛋白质。
通过Fc融合使诱饵蛋白质稳定
描述诱饵Bst2与抗体Fc部分的融合。所得融合体能够延长诱饵Bst2蛋白的治疗作用，从而提供更有利的给药时程。也展示与白蛋白的融合延长小蛋白质的血清半衰期。类似Bst2诱饵与抗体Fc部分的融合，Bst2诱饵与白蛋白的融合可增长Bst2诱饵的血清半衰期。
包括Bst2诱饵的许多潜在治疗性蛋白质小于40,000道尔顿，且因此容易因肾小球过滤而被肾清除。这些小蛋白质很少产生理想的医药品。促成较长的血清半衰期的蛋白质的重新设计是重要的医学和商业目标。因为蛋白质通常必须通过注射投与，所以优选具有使蛋白质投药频率最小化的治疗性蛋白质。
一般来说，蛋白质的有效分子量可通过与异源载体蛋白质(诸如可有助于纯化蛋白质的白蛋白或抗体Fc区)融合来增加(Capon等人，Nature.1989年2月9日；337(6207)：525-31；Yeh P.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，89：1904-1908，1992)。异源序列可为任何序列，只要其允许所得嵌合蛋白质保留Bst2诱饵的至少一种生物活性。
认为Bst2以同源二聚体形式存在于细胞表面上(Ohtomo等人，BiochemBiophys Res Commun.1999，258(3)：583-91)。也认为Bst2需要二聚化以获得其活性。因此，优选促进Bst2诱饵单体缔合形成二聚体、三聚体和更高多聚体形式的异源序列。使用分子量小于40,000道尔顿的小蛋白质构筑Fc嵌合蛋白质使得血清半衰期显著延长(Lo等人，PCT WO00/40615，2000)。Bst2诱饵-Fc是由人类Bst2的细胞外域和人类IgG的Fc区组成的重组嵌合融合蛋白质。Bst2诱饵-Fc以二聚体形式且在一定程度上以更高多聚体形式产生。
大鼠Bst2诱饵-Fc
大鼠Bst2与人类Bst2和小鼠Damp1分别具有44％和70％的氨基酸相似性(Kupzig等人，2003，Traffic 4(10)：694)。推定的卷曲螺旋域存在于人类Bst2蛋白的氨基酸96-153(或102-149)区和大鼠Bst2蛋白和小鼠Damp1蛋白的相应区中。
观察到小鼠Damp1诱饵抑制人类内皮细胞与人类单核细胞U937细胞之间的细胞-细胞相互作用，且人类Bst2诱饵在小鼠哮喘模型中具有功能指示Bst2诱饵和Bst2诱饵-Fc以物种交叉方式行使功能。小鼠Damp1诱饵(Fc融合体)、大鼠Bst2诱饵(Fc融合体)或人类Bst2诱饵(Fc融合体)蛋白质的功效可在包括小鼠、大鼠、兔子、犬或灵长类动物的任何动物疾病模型中互换研究而无物种障碍。或者，可使用来源于兔子、犬或灵长类动物的Bst2同源物的诱饵的Fc融合体。关于小鼠中的抗体治疗，可使用抗小鼠Damp1抗体或大鼠抗Damp1抗体。关于大鼠、兔子、犬或灵长类动物中的抗体治疗，可使用对来自这些动物的Bst2同源物具有特异性的抗体。一种产生针对小鼠Damp1的单克隆抗体组的方法为使用Damp1-/-小鼠。
Damp1-/-(敲除)小鼠由熟知的同源重组方法产生。
大鼠抗Damp1单克隆抗体可使用大鼠杂交瘤技术产生(Lebacq-Verheyden等人，Hybridoma.1983，2(3)：355-8)。类似地，可使用小鼠抗大鼠Bst2单克隆抗体执行大鼠中的抗体治疗。
组成性Damp1-/-(敲除knock-out)小鼠
Damp 1-/-小鼠由同源重组方法产生。如上所指示，可使用Damp1-/-小鼠获得小鼠抗Damp1单克隆抗体。另外，Damp1-/-小鼠适用于产生有关可用Bst2阻断剂(Bst2(Damp1)诱饵、抗Bst2(Damp1))研究的疾病模型的信息。因为产生用于临床前研究的经纯化蛋白质药物成本非常高，所以难以尝试很多疾病模型。另一方面，例如用于关节炎模型的胶原或佐剂治疗、用于哮喘模型的卵白蛋白治疗或动物模型中常用的任何其它治疗的大部分用于动物模型的疾病诱导性治疗可在无需太高成本的情况下容易地实施。通过比较各种疾病诱导性治疗后Damp1-/-与野生型小鼠的症状的严重程度和疾病进展，可获得关于何种疾病模型可用Bst2阻断剂研究的有价值的信息。以此方式，可产生更多使用Bst2阻断剂的治疗选项。
组织特异性Damp1-/-(敲除)小鼠
虽然Damp1或Bst2或如上所述的简单的Damp1-/-(敲除)显性消极蛋白质的转基因表达可能与人类疾病或发炎性/自体免疫通路相关，但特定细胞类型中Damp1的缺失对研究Damp1/Bst2的基因功能和推断Bst2的基因功能同样会很有价值。
可使用位点特异性重组酶***，诸如广泛使用的CreloxP***(CreloxPsystem)(Lasko M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：5860，1996；Orban P等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6861，1992)。在这一***中，需要两种转基因小鼠细胞系以促进组织特异性Damp1敲除。第一小鼠细胞系在所选择的组织特异性启动子的控制下表达Cre重组酶。目前，差不多40至50种Cre细胞系可获得，且Cre细胞系的可用性和种类在增加。第二细胞系在Damp1附近带有loxP位点。杂交后，从表达Cre重组酶的细胞中除去Damp1基因。可靶向Damp1基因中的一个或两个拷贝以(例如)检查Damp1基因的剂量敏感性。
组织特异性可诱导性Damp1-/-(敲除)小鼠
疾病中Damp1基因功能的生理学相关性除组织特异性外还可能进一步要求时序控制。一种实现组织特异性Cre重组酶的可诱导性表达的方式是通过使突变型***受体(estrogen receptor，ER)配位体结合域与Cre的C-末端融合使用Cre的类固醇受体配位体调控形式。这些融合蛋白质由合成***拮抗剂4-OH他莫昔芬(tamoxifen)诱导但对内源性β-***不敏感。可利用三种不同的突变型***受体小鼠ERTM(Danielian PS，Curr.Biol.8：1323，1998)、人类ERT(Logie和Stewart，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：5940，1995)和人类ERT2(Feil R等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.237：752，1997)。通过将CreER放置在组织特异性启动子的控制下，可以组织特异性、他莫昔芬诱导性方式产生Damp1敲除***。第二转基因细胞系在Damp1附近带有loxP位点。杂交后，以他莫昔芬诱导性方式从表达Cre重组酶的细胞中除去Damp1基因。
在另一方法中，可使用四环素敏感性***。四环素结合四环素激活因子蛋白(tetracycline transactivator protein，tTA)或反式四环素激活因子蛋白(reverse tetracycline transactivator protein，rtTA)。这些复合物通过结合Tet操纵子(Tet operator，tetO)阻遏或激活Damp1表达。为以组织特异性方式达成Damp1的Tet诱导性敲除，需要三重转基因小鼠。在第一细胞系中，在组织特异性启动子/强化子的控制下表达tTA或rtTA蛋白。第二细胞系带有Tet操纵子启动子(tetO)和Cre重组酶。仅在tTA或rtTA存在下且在饮用水中传递四环素，tetO启动子才被激活且Cre重组酶得以表达。第三细胞系带有侧接Damp1的loxP位点。然后，Cre重组酶以组织特异性Tet诱导性方式切除Damp1基因。
使用shRNA通过RNAi(RNA干扰)获得转基因Damp1或Bst2敲弱(knockdown)动物
鉴于向除小鼠以外的物种应用基因敲除技术的困难性，在使Damp1或Bst2分别于小鼠或其它动物中的表达沉默中可使用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。在转基因动物中使用Damp1或Bst2siRNA的短片段将有可能使Damp1基因在小鼠中或Bst2同源物在其它动物中沉默。使用RNA干扰导致的组织特异性Damp1或Bst2敲弱可为产生功能损失模型的替代方法。
RNA干扰是由与沉默基因序列同源的小双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默。序列特异性信使RNA降解的调节剂是由较长dsRNA裂解产生的21和22个核苷酸的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)(Bernstein E等人，Nature 409：363，2001；Elbashir SM等人，Nature 411：494，2001)。将这些siRNA并入多蛋白RNA诱导沉默复合物(multiprotein RNA-inducing silencing complex)中。反义链将沉默复合物引导到其同源标靶mRNA，从而导致裂解。已证明称为Dicer的细胞内部的双链特异性核糖核酸酶(RNase)可加工小发夹RNA结构(small hairpin RNA structure，shRNA)，从而产生微RNA。通过抑制翻译，微RNA可有效使基因表达沉默，从而使得有可能仅使用一个载体靶向基因。shRNA***可用于产生稳定地使基因表达沉默的转基因动物。
Damp1或Bst2 siRNA：可通过合并图9中所使用的人类Bst2 siRNA的相应序列设计Damp1或Bst2 siRNA或可重新设计siRNA。为选择用于产生Damp1(Bst2)shRNA的潜在Damp1(Bst2)-siRNA序列，用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-Damp1(Bst2)融合构筑体外加针对Damp1(Bst2)的不同siRNA共转染诸如Cos-7细胞的哺乳动物细胞。通过免疫印迹法分析Damp1(Bst2)-GFP融合蛋白的表达和敲弱。
构筑Damp1(Bst2)-shRNA表达载体：使用pol III与pol II启动子合成用于在哺乳动物细胞和动物中敲弱基因表达的短发夹RNA(shRNA)。为构筑shRNA表达载体，随后将如上所筛选的最有效siRNA克隆到shRNA表达质粒中，其中短Damp1(Bst2)序列的有义和反义链在(例如)U6启动子的控制下以编码Damp1(Bst2)-shRNA的DNA序列的形式转录为发夹结构，且然后由细胞内的双链特异性核糖核酸酶Dicer加工为功能性siRNA。通过将相应DNA寡核苷酸克隆到shRNA表达质粒(诸如来自Ambion的pSilencer 1.0-U6)(Austin，TX，USA)中产生shRNA表达载体。寡核苷酸涵盖Damp1(Bst2)的有义和反义序列和7个碱基对之环，且退火产物含有适当的限制性酶位点。将这一双链体连接到pSilencer 1.0-U6中。然后使用这一载体内源性在哺乳动物细胞中表达shRNA。通过***表达与小鼠或人类基因组中的任何已知序列具有有限同源性的siRNA的序列构筑对照RNAi载体。
产生表达Damp1或Bst2-shRNA的转基因动物：使用原核注射方法，Xia等人(PLoS Genet.2006；2(1)：e10)能够证明从人类Pol II启动子(诸如人类泛素C启动子)转录的shRNA可在小鼠中介导基因沉默。通过将线性化构筑体原核注射到受精卵中制造转基因小鼠。类似地，可使用任何种类的与用于通过简单原核注射产生转基因小鼠的Damp1-或Bst2 shRNA偶合的组织特异性启动子。
或者，可使用表达Damp1-或Bst2 shRNA的腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体(A.Auricchio等人，Hum.Mol.Genet.10(2001)，第3075-3081页)或慢病毒载体(Golding MC等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006年4月4日；103(14)：5285-90)将转基因传递到动物中。
表达Bst2、Bst2L、Bst2或Bst2L的部分或突变体的转基因动物
过度表达完整Bst2或Bst2L(或其任何部分)的转基因动物(小鼠或大鼠)适用于研发和筛选治疗上适用的试剂，诸如抗Bst2、Bst2诱饵、Bst2诱饵Fc和抗Bst2L。转基因细胞系可经设计以可诱导性方式、组织特异性方式或组织特异性/可诱导性方式组成性表达Bst2或Bst2L蛋白。
表达Bst2或Bst2L(或其任何部分)的转基因动物可展示与Bst2或Bst2L过度表达相关的病理学病状。可用Bst2阻断剂治疗这些动物，且与未经治疗的带有Bst2或Bst2L转基因的动物相比，病理性病状的发病率的降低将指示潜在的治疗益处。当鉴别出Bst2(Damp1)或Bst2L(Damp1L)的显性消极型式(干扰野生型蛋白质的功能的型式)时，可产生表达这些蛋白质的显性消极形式的转基因动物以测试疾病过程是否受到抑制。在测试疾病过程之前，可将表达人类Bst2的显性消极蛋白质的转基因动物与Bst2敲入小鼠交配。
转基因表达序列盒含有包括Kozak一致序列的转录单元、Bst2或Bst2L、这些蛋白质的部分或突变体的编码外显子、终止信号(多聚-A-尾巴(poly-A-tail))和控制转基因表达的调控元件。很多组织-特异性启动子/强化子可在文献中获得。可购得控制时序表达的可诱导性***(包括四环素或他莫昔芬诱导性***)(参见上文，在组织特异性、可诱导性Damp1-/-(敲除)小鼠下)。产生转基因小鼠或大鼠的方法已变成常规方法(美国专利第4,736,866号和第4,870,009号)。
表达Bst2诱饵、Bst2诱饵-Fc和Bst2诱饵-白蛋白融合体的转基因动物
可使用表达与Fc片段或白蛋白融合的Bst2或Damp1细胞外域(或其任何部分)或Bst2细胞外域或Damp1(或其任何部分)的转基因动物来评估Bst2诱饵(Fc)在病理学条件下的治疗作用。可使表达这些蛋白质的转基因小鼠与表达Bst2的敲入小鼠交配以评估Bst2诱饵(Fc)蛋白在单一治疗或组合治疗中在任何病理性条件下的治疗作用。转基因细胞系可经设计以可诱导性方式、组织特异性方式或组织特异性/可诱导性方式组成性表达这些蛋白质。
敲入(Knock-in)小鼠：产生人类-小鼠嵌合Bst2小鼠
因为人类Bst2与小鼠Damp1/大鼠Bst2之间的氨基酸序列同源性并不高，所以不可能在鼠类或大鼠免疫发炎性疾病模型中测试抗人类Bst2抗体组的功效。一种克服这一问题的方法在于产生表达人类Bst2(也就是表达人类小鼠嵌合Bst2)的敲入小鼠。敲入小鼠可具有经人类置换的Damp1的完整编码区或仅具有经人类Bst2细胞外域置换的Damp1的细胞外域，从而产生嵌合蛋白质。虽然可使用表达人类Bst2的转基因小鼠达成这一目的，但过度表达***不是测试Bst2阻断剂功效的理想***。允许人类-小鼠嵌合Bst2在生理学水平下表达的敲入方法取代转基因方法。可根据标准敲入同源重组方案制造表达人类-小鼠嵌合Bst2的敲入小鼠，且可使用诸如图28中所绘示的例示性构筑体进行。处理敲入小鼠以诱发免疫发炎性病状。投与抗人类Bst2抗体。
这些小鼠也适用于测试具有抗人类Bst2抗体或Bst2诱饵-Fc与各种针对小鼠蛋白质标靶的大鼠抗体的组合治疗的功效。举例来说，可用胶原处理表达人类Bst2的敲入小鼠以诱发关节炎(Andren等人，J Immunol.2006，63(4)：282-9)，且然后用与大鼠抗小鼠TNFR(TNFα受体I或II)(Abcam)、大鼠抗小鼠IL-6受体(Genzyme)、大鼠抗小鼠IL-1受体(Abcam)或鼠类CTLA4-Ig(内部)中的任何一个因子、两个因子、三个因子或四个因子组合的人类Bst2诱饵-Fc或抗人类Bst2处理。已证明鼠类CTLA4-Ig抑制大鼠中的T细胞反应(Shiraishi T等人，2002，Am J Transplant 2：223)。
测试Bst2阻断剂功效的动物疾病模型
适用于测试Bst2阻断剂功效的动物模型包括(但不限于)大鼠或小鼠胶原诱发关节炎模型(Webb等人，Eur J Immunol.1996，26(10)：2320-8；Andren等人，Scand J Immunol.2006，63：282)、大鼠或小鼠佐剂诱发关节炎模型(Haruna等人，Arthritis Rheum.2006，54(6)：1847-1855；Hida等人，JAutoimmun.2005年9月；25(2)：93-101)、卵清蛋白诱发哮喘模型(Sy等人，Int Immunopharmacol.2006，6(7)：1053-60)、骨关节炎模型(Averbeck等人，JRheumatol.2004年10月；31(10)：2013-20)、移植物抗宿主病(graft versus-hostdisease，GvHD)模型(Zhang等人，Blood，2006，107：2993-3001；Baliga等人，Transplantation.1994，58(10)：1082-90)、非肥胖性糖尿病(non-obesediabetic，NOD)小鼠或BB(BioBreeding)大鼠中的1型糖尿病模型(YangY Santamaria P.Clin Sci.2006，110(6)：627-39)、缺血/再灌注模型(Arumugam等人，Nat Med.2006年6月；12(6)：621-3)、脓毒性休克模型(Motobu等人，Phytother Res.2006，20(5)：359-63)、自体免疫葡萄膜炎模型(Yilmaz等人，Curr Eye Res.2005，30(9)：755-62)、为用于多发性硬化症的动物模型的小鼠中的实验性过敏性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)(Mujtaba等人，J Immunol.2005，175(8)：5077-86)、兔子中的脑栓塞模型(Chapman DF，Stroke.2001，32(3)：748-52)、用于克罗恩氏病和发炎性肠病的小鼠结肠炎模型(Yen D等人，J Clin Invest.2006，116(5)：1310-6)、自体免疫或病毒性肝炎的刀豆球蛋白A(concanavalin A)诱发肝损伤模型(Li等人，Hepatology.2006年6月；43(6)：1211-9)、银屑病模型(Gudjonsson JE，Elder JT.Eur J Hum Genet.2006，14(1)：2-4)和兔子中的角膜移植排斥反应模型(Shirao E，Deschenes J，Char DH.Curr Eye Res.1986，5(11)：817-22)。已描述研究年龄相关黄斑变性(AMD)的动物模型(Dithmar等人，ArchOphthalmol 2001，119(11)：1643-9；Cousins等人，Exp Eye Res.2002，75(5)：543-53)。
对Bst2的阻断通过稳定所构建的动脉粥样硬化可抑制动脉粥样硬化的早期加速。这一假设可在链脲佐菌素(streptozotocin)治疗的(糖尿病性)apoE-缺失小鼠或低密度脂蛋白(LDL)受体敲除小鼠(杰克逊实验室(Jackson laboratories))中加以测试(Bucciarelli等人，Circulation，2002，106(22)：2827；Csaky K.Exp Eye Res.2002，75(5)：543-53)。许多患有II型糖尿病的患者出现动脉粥样硬化。Bst2阻断剂在II型糖尿病和动脉粥样硬化中的作用可在db/db apoE-缺失双重突变型小鼠中加以测试。
最初通过如Linsley PS，Wallace PM，Johnson J，Gibson MG，Greene JL，Ledbetter JA，Singh C，Tepper MA.Science.1992，257(5071)：792-5所述测量对绵羊红血球细胞和钥孔螺血蓝蛋白(key hole limpet hemocyanin)的抗体反应测试干扰Bst2作用是否对抗体介导的自体免疫疾病有益的概念。
其他自体免疫疾病模型包括狼疮样疾病(Finck等人，Science.1994，265(5176)：1225-7)和大鼠肾小球肾炎模型(Nishikawa等人，Eur J Immunol.1994，24(6)：1249-54)。可使用已接受胰岛细胞异种移植(pancreatic islet cellxenograft)的糖尿病小鼠测试供体特异性移植耐受性(Lenschow等人，Science，1992，257(5071)：751)。耐受性也可在血管化鼠类心脏同种异体移植模型(Larsen等人，Nature，1996，381(6581)：434-8；Pearson等人，Transplantation，1995，59(3)：450)和小鼠皮肤同种移植排异反应模型(Tepper等人，Transplant Proc.1994，26(6)：3151-4)和肾移植模型(Laskowski IA.J AmSoc Nephrol.2002，13(2)：519-27)中证明。
组合治疗
免疫发炎性疾病是由免疫发炎性信号转导复杂网络介导的复杂病症。这些事件可能彼此密切相关，但根本细胞和分子过程可相差甚远。因此，免疫发炎性疾病的完全好转可能需要组合治疗。通常，已证明影响在各种促发炎过程的能力方面可能不同的组合治疗优于单一治疗。
已用细胞-细胞粘附检定使用细胞间粘附分子(intercellular adhesionmolecule，ICAM1)作为实例(实例25和实例26)活体外测试使用Bst2阻断剂的组合治疗的概念。因为已证明ICAM1调控对免疫发炎性通路很重要的许多因子且已对其在许多发炎性免疫疾病中的参与进行了广泛研究，所以选择ICAM1。
ICAM1是表达于白细胞中的整合素亚族成员淋巴细胞功能相关抗原LFA-1(CD11c/CD18)的标靶细胞反受体。这两种分子之间的相互作用为引发细胞免疫反应的关键。也认为ICAM-1在同种异体移植组织的急性排斥反应中发挥作用。ICAM1和LFA1参与抗原呈递细胞与T细胞之间的细胞-细胞相互作用。抗原呈递细胞(APC)上的ICAM1可结合T细胞上的其受体LFA1且T细胞上的ICAM1可结合APC上的LFA1(Mackay CR，ImhofBA，Immunol Today，1993，14：99)。越来越多的证据支持先前认为是粘附分子的数个分子也能够传递用于T细胞激活的共刺激信号的观点(LFA3、LFA1和ICAM1)(Mackay CR Imhof BA，Immunol Today，1993，14：99)。共刺激分子对T细胞提供使得增生启始和增强的其它信号(Steinman RMYoung JW.1991，Curr.Opin Immunol 3：361)。
心血管疾病的组合治疗
心血管疾病的组合治疗可使用士他汀(statin)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、β阻断剂、钙离子通道阻断剂、ReoPro、克罗匹多(Clopidogrel)和肾素血管紧张素抑制剂实现。内皮细胞功能障碍与诸如动脉粥样硬化、高血压和血管平滑肌细胞增生的心血管病症相关。Bst2表达由诸如FNFα、干扰素γ和组胺的发炎性细胞因子诱导，这表明Bst2可能牵涉于心血管疾病中。因此，阻断Bst2作为单一治疗或与包括士他汀、ACE抑制剂、β阻断剂、钙离子通道阻断剂、ReoPro、克罗匹多和肾素血管紧张素抑制剂的常规治疗的组合可改良对心血管疾病的治疗。
此外，Bst2由平滑肌细胞中的发炎性细胞因子诱导。平滑肌细胞增生可降低血管成形术的成功率，血管成形术是增加动脉粥样硬化动脉(通常冠状动脉)的直径的手术。阻断Bst2可能降低平滑肌细胞增生并增加血管成形术的成功率。
类风湿性关节炎的组合治疗
用于类风湿性关节炎的与CTLA4-Ig或TNFα、IL6或IL1的阻断剂的组合治疗。类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑液炎症、骨侵蚀和软骨破坏为特征的发炎性病症。在临床试验中，阻断单一促发炎细胞因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNFα)有效抑制关节炎过程。然而，仅由TNFα阻断剂很少达成RA的病征和病状的完全好转，这提示数个促发炎通路可能独立于TNFα起作用。已证明TNFα阻断阻滞大量炎症临床病征不展示反应的患者的骨侵蚀。TNFα对骨的作用与疾病的病征和症状的临床反应无关。因此，TNFα在关节炎症、骨侵蚀和软骨破坏中的相对作用可能不同。
已证明阻断TNFα、白细胞介素-1(IL-1)的主要标靶分子对RA具有一定作用。IL-1已证明其对软骨损伤的作用，但IL-1受体拮抗剂的单一治疗并不清除大多数患者的关节炎的临床病征和症状。虽然由任何单一治疗、甚至连TNF抑制也很少达成RA的病征和症状的完全好转，但TNFα/IL-1、TNFα/RANKL或TNFα/IL-1/RANKL在实验模型中的组合抑制的初步结果提示所述治疗可具有叠加效应。这些结果强化使用超过一个促发炎通路的组合阻断治疗类风湿性关节炎的基本原理。
最近，也已证明抗IL6或细胞毒性淋巴细胞相关抗原4-Ig(cytotoxic Tlymphocyte associated-antigen 4-Ig，CTLA4-Ig)对治疗关节炎有益。Bst2基因的启动子区具有信号转导与转录激活因子(STAT3)结合位点，STAT3介导白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)应答基因表达，这提示Bst2的表达可能受IL6-STAT3通路调控(Ohtomo等人，Biochem Biophys ResCommun.1999，258(3)：583-91)。对为IL6下游标靶的Bst2的阻断可能对治疗RA有益。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte associatedantigen 4，CTLA4)是在T细胞激活后上调的T细胞受体。在大多数状况下，仅来自T-细胞受体(T-cell receptor，TCR)的信号不能胜任产生最佳免疫反应，且需要第二共刺激信号来克服T细胞应答阈值。TCR信号的这一增强主要由T细胞上的CD28提供，CD28可由表达于抗原携带细胞上的B7引发。一旦激活，T细胞就表达也可结合同一B7分子的第二受体CTLA-4。与CD28相反，CTLA-4抑制T-细胞反应。
CTLA4-Ig是由人类CTLA4细胞外域和人类IgG Fc区组成的重组嵌合融合蛋白(Abatacept，Bristol-Myers Squibb)。CTLA4-Ig结合APC(抗原呈递细胞)B7分子，阻断其与T细胞上CD28受体的相互作用，从而阻断与T细胞上CD28的共刺激相互作用(Linsley等人，J Exp Med.1991，174(3)：561-9)。已证明CTLA4-Ig有效治疗类风湿性关节炎(Moreland等人，Nat Rev Drug Discov.2006，5(3)：185-6)。因此，Bst2阻断剂与CTLA4-Ig或TNFα、IL6或IL1的阻断剂的组合治疗可对治疗关节炎有益。
可使用大鼠胶原诱发关节炎模型或大鼠佐剂诱发模型。可与小鼠抗大鼠TNFR、小鼠抗大鼠IL6受体或小鼠抗大鼠IL1受体单克隆抗体或与鼠类CTLA4-Ig组合测试小鼠抗大鼠Bst2抗体、人类Bst2诱饵-Fc、大鼠Bst2诱饵-Fc或小鼠Damp1诱饵-Fc。如Lane等人(Lane等人，Immunology，1993，80(1)：56-61)中所报导制备的鼠类CTLA4-Ig可用于其它研究(Shiraishi等人，Am J Transplant.2002，2(3)：223-8)所示的大鼠模型中。小鼠CTLA4-Ig可由小鼠CTLA-4基因的细胞外部分与人类IgG1的恒定区的嵌合基因产生。人类CTLA4-Ig(Abatacept，Bristol Squibb)也可用于胶原诱发关节炎的大鼠模型中。
也可使用表达人类Bst2的敲入小鼠。用胶原或佐剂处理敲入小鼠以诱发关节炎病状，且然后用抗人类Bst2抗体或人类Bst2诱饵-Fc与大鼠抗小鼠TNFα受体(Abcam)、大鼠抗小鼠IL6受体(Genzyme)或大鼠抗小鼠IL1受体(Abcam)单克隆抗体或与小鼠CTLA4-Ig组合处理。抗Bst2治疗也可用于治疗也具有发炎性组分的更普通形式的关节炎、骨关节炎。
哮喘的组合治疗
描述尤其使用茶碱、糖皮质激素、TNFα阻断剂或抗ICAM1的哮喘组合治疗。哮喘的病理学特征的大部分描述包括支气管平滑肌肥大/收缩、粘膜水肿和上皮基底膜增厚和粘膜下层组织中的发炎性细胞，尤其嗜酸性粒细胞。认为这些事件以相继方式出现，从而产生哮喘的病理学特征。哮喘的目前治疗包括：抗胆碱能药、类固醇、腺苷竞争性激动剂和长效和短效β2激动剂。Bst2阻断剂与这些常规治疗的组合治疗可能对哮喘有益。此外，我们的基因表达概况数据指示在诸如干扰素γ的发炎性刺激后在平滑肌细胞中具有高可诱导性(图34)。这些数据指示Bst2可能参与平滑肌细胞生理学和Bst2阻断剂在哮喘治疗过程期间除先前表征的消炎反应外还可能显现一些其它有益作用的可能性。出于这些原因，Bst2阻断剂与常规哮喘治疗的组合治疗可具有叠加效应。
当哮喘逐渐变得更严重或患者不对茶碱治疗具有反应时，用皮质类固醇治疗患者。Bst2阻断剂与皮质类固醇的组合治疗可能使得皮质类固醇的剂量减小，从而降低其副作用。
已证明ICAM1、α4整合素和TNFα在大鼠或灵长类动物卵白蛋白诱发的哮喘模型中的作用(Taylor等人，Am J Respir Cell Mol Biol.1997，17(6)：757-66)。用ICAM1、TNFα和/或α4整合素的阻断剂对Bst2的组合抑制可有效治疗哮喘。可购得小鼠抗大鼠ICAM1抗体、大鼠抗小鼠ICAM1抗体、小鼠抗大鼠TNFR抗体、大鼠抗小鼠TNFR抗体、小鼠抗大鼠α4整合素抗体和大鼠抗小鼠α4整合素抗体用于使用鼠类或大鼠模型的临床前研究。可购得小鼠抗大鼠ICAM1抗体、大鼠抗小鼠ICAM1抗体、小鼠抗大鼠TNFR抗体、大鼠抗小鼠TNFR抗体、小鼠或大鼠抗TNFα抗体、小鼠抗大鼠α4整合素抗体和大鼠抗小鼠α4整合素抗体用于使用鼠类或大鼠模型的临床前研究。
自体免疫肝炎的组合治疗
描述尤其使用皮质类固醇的自体免疫肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)组合治疗。自体免疫肝炎是慢性进行性肝病。可能的引发因素包括病毒、其它自体免疫病症和药物。自体免疫肝炎的自然史展示不良预后，其中在未经治疗的患者中频繁进展为肝硬化和肝功能不全。AIH很少经历自发好转。
造成发病机理的分子机制包括：自体抗体抗自体抗原、细胞粘附分子和细胞因子的反应；和出现血管生成(Medina等人，Aliment Pharmacol Ther。2003，17(1)：1-16)。患有AIH的患者中出现细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(sVCAM-1)、(s)E-选择素、(s)P-选择素和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)、IL4、LFA1、LFA3、TGFβ的血清含量升高(Simpson等人，Eur J Gastroenterol Hepatol.1995，7(5)：455-60)。在慢性病毒性肝炎、自体免疫肝炎中，T细胞介导的免疫机制在组织损伤发病机理中发挥重要作用(Bruck等人，Isr Med Assoc J.2000，2Suppl：74-80)。
所选用于AIH患者的治疗是呈单一治疗形式或与硫唑嘌呤(azathioprine)组合的糖皮质激素(Czaja AJ，Drugs 57：49-68，1999，Cook等人，Q J Med.1972，40：159；Murray-Lyon等人，Lancet，1973，I：735-7)。虽然皮质类固醇在最初治疗期间降低肝硬化的发病率，但即使治疗，在5-10年内超过90％的患者也出现肝硬化(Davis等人，1984，Gastroenterology87：1222-7)。
使用皮质类固醇治疗与熟知剂量依赖型副作用相关(Summerskill等人，Gut 16：876-83，1975，Czaja AJ，于Krawitt EL，Wiesner RH编.AutoimmuneLiver Disease.New York；Raven Press，1991：143-66中)。高血糖效应和高血压也很频繁。因此，必须特别注意糖尿病患者以及患有由肝病引发的代谢骨疾病的患者。
抗Bst2或Bst2诱饵与皮质类固醇的组合治疗可有益于维持疾病症状好转。这一组合可使得皮质类固醇的剂量减小，从而降低其副作用并达成比高剂量皮质类固醇更佳的效果。
可使用诸如小鼠刀豆球蛋白A诱发的肝损伤模型的模型(Kaneko等人，Biochem Biophys Res Commun.2006，345(1)：85-92)使用可使用Damp1-/-小鼠产生的小鼠抗Damp1抗体、大鼠抗小鼠Damp1或人类、大鼠或小鼠Bst2(Damp1)诱饵-Fc或在大鼠硫代乙酰胺诱发的肝硬化模型中(Zimmermann等人，Gastroenterol Hepatol.2006，21(2)：358-66)使用小鼠抗大鼠Bst2或人类、大鼠或小鼠Bst2(Damp1)诱饵-Fc研究抗Bst2或Bst2诱饵的用途。
对移植的组合治疗
描述尤其使用环孢霉素(cyclosporine)、雷帕霉素(rapamycin)或抗LFA1抗体的移植组合治疗。已证明粘附分子关键性参与移植排斥且为靶向介入治疗的显著分子候选物。粘附分子通过控制运输宿主白细胞进入同种异体移植物而影响同种异体移植排斥的细胞机制。运输细胞进入同种异体移植物是由循环白细胞与血管内皮细胞之间的粘附分子受体配位体对的结合所介导。在同种异体移植物内，粘附分子也可参与T-细胞对标靶细胞的识别。
免疫抑制性环孢霉素或雷帕霉素作为有效钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂用于移植医学中。然而，用钙调神经磷酸酶抑制剂治疗的患者与可导致肾衰竭的肾中毒作用相关(Miller等人，J Heart LungTransplant，1995，14：S227；Vitko S，Viklicky O.Transplant Proc.2004，36(增刊2)：243S-247S)。其它副作用包括神经毒性、高钾血症和高血压。
Bst2诱饵或抗Bst2与亚阈值或适度剂量的环孢霉素或雷帕霉素的组合治疗可具有肾中毒可能性降低的有益协同免疫抑制作用。
测试Bst2阻断剂的功效的移植动物模型包括小鼠皮肤同种移植排异反应模型(Tepper等人，Transplant Proc.1994，26(6)：3151-4)、移植物抗宿主疾病(graft versus-host disease，GvHD)模型(Zhang等人，Blood，2006，107：2993-3001；Baliga等人，Transplantation.1994，58(10)：1082-90)、兔子角膜同种异体移植排斥反应模型(Shirao等人，Curr Eye Res.1986，5(11)：817-22)、胰岛细胞异种移植模型(Lenschow等人，Science，1992，257(5071)：751)、鼠类心脏同种异体移植模型(Larsen等人，Nature，1996，381(6581)：434-8；Pearson等人，Transplantation，1995，59(3)：450)和肾移植模型。
对于临床前研究，视模型而定，将小鼠抗Damp1、大鼠抗小鼠Damp1、小鼠抗大鼠Bst2、人类、大鼠、小鼠Bst2(Damp1)诱饵-Fc与不同剂量的环孢霉素或雷帕霉素组合使用。检查移植物存活率和T细胞激活/增生。
多发性硬化症的组合治疗
描述尤其使用α4整合素阻断剂的多发性硬化症组合治疗。多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是具有假定自体免疫发炎性病因学的中枢神经***(central nervous system，CNS)的常见脱髓鞘和发炎性疾病。阻断激活T细胞与内皮细胞粘附的抗体可降低多发性硬化症斑块的发炎性特征。目前治疗包括针对α4整合素的单克隆抗体(那他珠单抗(Natalizumab))、干扰素β和格拉默(glatiramer)(Ropper AH，2006，N Engl J Med.354：965；Rudick RA等人，N Engl J Med.2006，354(9)：899-910)。
抗Bst2或Bst2诱饵与针对α4整合素的单克隆抗体的组合治疗可能为有益的。可使用小鼠实验性过敏性脑脊随炎(experimental allergicencephalomyelitis，EAE)模型使用抗Damp1抗体、可使用Damp1-/-小鼠产生的小鼠抗小鼠Damp1、大鼠抗小鼠Damp1或人类、大鼠或小鼠Bst2(Damp1)诱饵-Fc与大鼠抗小鼠α4整合素(Abcam)研究抗Bst2或Bst2诱饵的用途。
最小化组织损伤的组合治疗
组织损伤可因缺血、出血、外伤、肿胀、灼伤或暴露于化学品、毒素或药物而发生。由组织损伤的发炎性反应所致的细胞死亡通常增强组织损伤。通过阻断Bst2，可使组织损伤最小化。举例来说，使用诸如糖皮质激素的类固醇使中风后脑损伤最小化。中风期间或中风后即刻与类固醇组合阻断Bst2可使最终脑损伤的程度最小化。类似地，心肌梗塞期间或心肌梗塞后即刻阻断Bst2可降低心脏损伤的程度。
克罗恩氏病的组合治疗
描述尤其使用抗α整合素抗体的克罗恩氏病组合治疗。克罗恩氏病是以严重T辅助细胞(helper cell，Th)1驱动的结肠炎症为特征的慢性虚弱病。可使用小鼠结肠炎模型测试Bst2拮抗剂的作用(Gonzalez-Rey等人，Gastroenterology.2006年6月；130(6)：1707-20)。关于发炎性肠病，具有抗α4整合素抗体的组合治疗可能有益。
代谢综合征的组合治疗
描述尤其使用二甲双胍(metformin)、噻唑烷二酮(TZD)、士他汀、NSAID、ACE抑制剂和血管紧张素受体阻断剂的代谢综合征组合治疗。
近年来，出现促发炎通路的激活可为肥胖症相关胰岛素抵抗机制的概念。肿瘤坏死因子α(TNF)在肥胖啮齿动物的脂肪组织和血液中升高，且对TNFα的阻断改良胰岛素敏感性。白细胞介素(IL)-6和单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)也可引起胰岛素抵抗，且已报导在糖尿病和胰岛素抵抗患者中TNFα、IL-6和IL-8的含量升高(Roytblat等人，Obes Res.2000，8(9)：673-5；Straczkowski等人，J ClinEndocrinol Metab.2002，87(10)：4602-6；Hotamisligil等人，Science.1996，271(5249)：665-8；Sartipy P，Loskutoff DJ.Proc Natl Acad Sci USA.2003，100(12)：7265-70；Hotamisligil等人，J Clin Invest.1995，95(5)：2409-15)。另外，在患有胰岛素抵抗的患者中观察到发炎性指标C-反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)的含量升高(Visser等人，JAMA.1999，282(22)：2131-5)。此外，在肥胖啮齿动物中用高剂量水杨酸酯治疗可抑制发炎性通路中的主要激酶IκB激酶(IKK)且逆转葡萄糖耐受性和胰岛素抵抗(Yuan等人，Science.2001，293(5535)：1673-7)。
胰岛素抵抗可促进内皮功能障碍，且抗TNF-α阻断产生内皮功能的快速改良。全身性炎症、胰岛素抵抗和内皮功能障碍已牵涉于心血管疾病的发展中。内皮负责维持血管体内平衡。在生理学病状中，其通过保持血管紧张度、血流和膜流动性起作用。代谢综合征中出现的内皮功能障碍是诸如TNF-α的发炎性细胞因子的作用的结果。因此，代谢综合征视为伴有内皮功能障碍的慢性炎症状态，例如引起缺血性心血管事件发病率增加、胰岛素抵抗和高死亡率。因此，认为能够阻断发炎性病状的治疗必然使归因于代谢综合征的心血管风险、II型糖尿病和血脂异常最小化。
以下药物广泛用于治疗代谢综合征：口服抗糖尿病药，诸如二甲双胍和噻唑烷二酮(TZD)；抗高血压药，诸如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素受体阻断剂(angiotensin receptor blocker，ARB)；和降脂士他汀药物和非类固醇消炎药(NSAID)。展示这些已证明降低2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病率和/或延迟其发作的药物具有明显的消炎性质。
已证明二甲双胍激活在调控能量体内平衡和代谢应激中发挥重要作用的腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)。二甲双胍也剂量依赖性抑制肿瘤坏死因子(TNF)α诱发的NFκB激活和TNF-α诱发的IκB激酶活性(IKK)。此外，二甲双胍削弱多种促发炎和细胞粘附分子(诸如血管细胞粘附分子-1(VCAM1)、E-选择素、细胞间粘附分子-1(ICAM1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP1))的TNF-α诱发的基因表达。血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂和血管紧张素受体阻断剂(ARB)降低炎症指标并降低发展出2型糖尿病的风险。胰岛素增敏药物噻唑烷二酮(TZD)是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome-proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的选择性配位体。PPAR是转录因子的核激素受体超家族成员且是各种与能量代谢(包括脂质和碳水化合物代谢)和炎症相关的生理病原性过程中的关键调控剂。PPARγ大量表达于脂肪组织中，且据报导PPARγ信号转导通路通过抑制NF-κB发挥消炎作用。与这些结果一致，活体外与活体内研究提供TZD具有消炎性质的证据。TZD抑制巨噬细胞激活并降低发炎性细胞因子在巨噬细胞和单核细胞中的表达并释放。活体内TZD治疗降低循环单核细胞核NF-kB含量而增加同一细胞中的抑制发炎性调节剂(诸如白细胞介素-1β(IL-1β)、IL6、粘附分子、VCAM-1和P-选择素和单核细胞)的NK-kB抑制剂IkB的表达。
Bst2配位体(Bst2L)
由受体蛋白Bst2的细胞外域组成的Bst2诱饵活体外抑制同型与异型细胞-细胞相互作用。因为任何给定受体的细胞外域是与其配位体相互作用的域，所以Bst2诱饵介导的对细胞-细胞相互作用的抑制指示：1)存在天然存在的Bst2配位体(Bst2L)，2)细胞-细胞粘附需要Bst2与Bst2L之间的相互作用，和3)Bst2诱饵必须与天然存在的Bst2L相互作用且在粘附检定中通过中和Bst2L抑制细胞-细胞相互作用，从而负面调控免疫发炎性反应。
Bst2诱饵抑制U937附着于HUVEC的观察结果指示Bst2L存在于未受刺激的U937细胞的细胞表面上。Bst2诱饵抑制激活T细胞或激活U937细胞的同型聚集的另一观察结果提示Bst2L可能表达于激活之前和之后的T细胞和/或U937细胞的表面上。Bst2L表达在T细胞或U937细胞激活之后可能上调。因此，Bst2L可能表达于激活之前或之后(例如T细胞激活条件或脂多糖(LPS)刺激条件)的U937细胞(或其它单细胞核细胞系)、T细胞或初级造血细胞中。Bst2L也可能表达于B细胞、树突状细胞、内皮细胞或纤维母细胞中。
Bst2L可为蛋白质或分子。Bst2L可为膜蛋白质或可溶性蛋白质。有可能可存在许多展示Bst2受体的不同结合特异性和功能特征的不同Bst2L蛋白或分子。也涵盖Bst2本身可为Bst2的潜在功能配位体，因为已知Bst2形成同源二聚体。发炎细胞上的Bst2可识别浸润白细胞和免疫细胞上的Bst2。有可能所有Bst2L蛋白或分子在功能或结合特征方面可彼此完全无关。因此，应彻底测试其是否调节发炎性或免疫反应中的限速步骤的功能特征以确立Bst2诱饵(Bst2诱饵-Fc)的治疗标靶，且随后研发用于预防和/或治疗发炎性病状的治疗物质。其它可能不处于发炎性通路中的限速步骤中的Bst2L蛋白或分子可介导不同疾病过程中的其它重要通路。
证明Bst2L的存在是本发明的显著特征，因为Bst2L可为与消炎分子相互作用的标靶。针对Bst2L的抗体可成为治疗各种免疫和发炎性疾病的治疗抗体。Bst2L的细胞外域与Fc的嵌合分子也可为有益的。有可能，Bst2L可参与(例如)T细胞激活的T细胞共刺激(或抑制)信号转导。虽然Bst2L将与Bst2结合，但Bst2L可能与T细胞或抗原呈递细胞上的介导共刺激或共抑制信号的许多其它受体相互作用。这些新颖种类的受体的激动性抗体或拮抗性抗体或Fc融合蛋白可成为治疗各种免疫发炎性疾病的蛋白质治疗药物。
另外，通过使用Bst2L，可建立直接结合检定或结合竞争检定以筛选Bst2的Bst2诱饵-(Fc)变异体或小分子调节剂。这些检定使得本发明者能够筛选Bst2的Bst2诱饵变异体或小分子调节剂来抑制或增强Bst2-Bst2L相互作用。
抗Bst2L抗体
如果投与Bst2L(小鼠Damp1L)增强免疫发炎性反应，那么产生抗Bst2L来治疗各种免疫发炎性疾病是合乎逻辑的。也涵盖抗Bst2抗体与抗Bst2L抗体的组合治疗。
抗Bst2抗体
常规IgG抗体为具有结合两种抗原的能力的二价抗体。这一能力大大增强其功能性亲和力并赋予于许多细胞表面受体和抗原上的长滞留时间。抗Bst2抗体可为分别抑制或增强免疫发炎性反应的拮抗性抗体或激动性抗体。拮抗性与激动性抗Bst2抗体可在许多不同抗Bst2抗体格式的以下实例中获得。
1.本发明的抗Bst2抗体可为人化单克隆抗体或人类单克隆抗体。当将鼠类抗体的小部分嫁接于人类免疫球蛋白分子上以产生仅免疫球蛋白分子的Fc部分为人类的嵌合抗体或仅免疫球蛋白的互补决定区(complementarity determining region，CDR)为鼠类的且分子的90％至95％为人类的人化抗体时，完全抗原性鼠类mAb变得对人类友好。在一个方面中，完全人类单克隆抗体可在转基因小鼠中通过采用常规方法(诸如HuMAb-Mouse(GenPharm-Medarex)或XenoMouse(Abgenix，Inc.)技术)产生。人化抗体包括将来自接受者CDR的残基用来自具有合乎需要的特异性、亲和力和生物功能的非人类物种(诸如小鼠、大鼠或兔子)的CDR残基置换的人类免疫球蛋白。
人类抗体也可使用诸如噬菌体呈现文库的技术产生(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol，1991，227：381；Marks等人，J.Mol.Biol.1991，222：581)。熟知人化非人类抗体的方法。人化可按照Jones等人，Nature，1986，321：522；Riechmann等人，Nature，1988，332：323和Verhoeyen等人，Science，1988，239：1534中所揭示的Winter等人的方法通过用啮齿动物CDR序列或CDR替换人类抗体的相应序列来执行。所述人化抗体为嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)。人化抗体通常为CDR残基经来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代的抗体。
2.本发明的抗Bst2抗体可为纳米抗体(Nanobody)。在无轻链的情况下起作用的重链抗体天然存在于护士鲨(nurse shark)、斑纹须鲨(wobbegongshark)和骆驼科(Camelidae)中(Greenberg AS.等人，1995，Nature 374：168；Nuttall SD.等人，Mol.Immunol.2001，38：313；Hamers-Casterman C.等人，1993，Nature 363：446)。其抗原结合位点经缩减为单一域VhH域。因为重链抗体的可变域是分子质量仅15,000道尔顿的最小完全功能性抗原结合片段，所以这一实体称为纳米抗体。
纳米抗体可成为新颖类别的治疗抗体。与经典抗体相比，纳米抗体具有优越的性质，因为其小，极为稳定，易于大量制造且易于重新设计为多价或多特异性蛋白质。纳米抗体可通过非注射方式投与。因此，纳米抗体提供具有小分子的小尺寸、稳定性和药物动力学的抗体的结合亲和力和特异性。
纳米抗体的小尺寸使得其尤其适于靶向被阻塞位置(诸如渗透临界的肿瘤)或常规抗体不易接近的区域中的抗原。抗Bst2纳米抗体可适用于活体外诊断免疫检定和活体内成像应用。抗Bst2纳米抗体可穿过血-脑屏障且因此可将治疗纳米抗体传递到脑中。
抗Bst2纳米抗体可使用噬菌体呈现技术获得。纳米抗体文库如(ConrathKE.等人，Antimicrob Agents Chemother.2001，45：2807)所述由经免疫单峰驼构筑。然后使用噬菌体呈现文库淘选涂布于微量滴定板上的人类Bst2。由ELISA执行富集克隆的选择，且对克隆进行测序。从阳性克隆纯化蛋白质。
3.本发明的抗Bst2抗体可为双特异性抗体。双特异性抗体为单克隆抗体，优选具有双重靶向特异性的人类或人化抗体。双特异性抗体来源于具有不同特异性的两种抗体的可变域的重组；因此，双特异性抗体能够结合两个其亲本抗体的抗原。在抗Bst2的状况下，一种结合特异性可针对Bst2且另一种可针对Bst2L或任何其它细胞表面蛋白质，例如在发炎性或自体免疫病状下表达Bst2的T细胞上的受体或相同细胞表面上的其它发炎性蛋白质。这些双特异性抗Bst2抗体可充当拮抗性或激动性抗体。
熟知制备双特异性抗体的方法(Traunecker等人，EMBO J，1991，10：3655；WO 93/08829；Suresh等人，Methods in Enzmology，1986，121：210；Milstein和Cuello，1983，Nature，305：537)。简言之，使具有合乎需要的结合特异性的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域融合。这一融合体含有免疫球蛋白重链恒定域(铰链区的部分、CH2区和CH3区)且优选含有第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链的DNA***单独表达载体中并共转染。
4.本发明的抗Bst2抗体可为单链可变片段抗体(single-chain variablefragment antibody，scFV)。重组方法已促成单链可变片段抗体(scFv)的产生。单体scfv具有仅约30,000道尔顿的分子质量，其以经富含Gly/Ser的合成连接子连接的单一VL-VH对的形式表达于多种***中(Berezov A.等人，2001，J Med Chem 44：2565)。当表达于细菌或真核细胞中时，scFv折叠成类似于亲本抗体相应区域的构形。证明其保留可比于Fab的亲和力的亲和力(Kortt等人，1994，Eur J Biochem 221：151)。ScFv适于各种基因修饰，诸如人化和产生融合蛋白质以增强其作为治疗剂的潜能。举例来说，已证明与补体的C5组分结合的人化scFv培克珠单抗(Pexelizumab)在冠状动脉旁路移植手术期间降低心肌梗塞(Varrier等人，2004，JAMA 291：2319)。
具有不同特异性的scFv也可连接在一起以制造结合单一或不同细胞上的两种不同受体的双特异性抗体。在抗Bst2的状况下，其可为具有抗Bst2scFv和抗Bst2L scFv或具有抗Bst2scFv和任何其它细胞表面蛋白质的双特异性抗体样分子，所述其它细胞表面蛋白质例如在发炎性或自体免疫病状下表达Bst2的T细胞上的受体或相同细胞表面上的其它发炎性蛋白质。
可使用噬菌体呈现方法制造抗Bst2 scFv。在这一方法中，从B细胞收集抗体可变区cDNA的大型全套，且VH与VL的组合以scFv形式表达于丝状噬菌体表面上。将从抗原涂布板中淘选表达scFv的噬菌体。抗Bst2 scFv的亲和力可通过使构筑体的CDR突变，然后重复淘选工序来改良。
5.本发明的抗Bst2抗体可为Fab、Fab2双特异性抗体、Fab3三特异性抗体、二价微型抗体、三价三链抗体或四价四链抗体。
6.本发明的抗Bst2抗体可为单克隆抗体。单克隆抗体使用杂交瘤方法(诸如Kohler和Milstein(Nature，1975，256：495)所述的方法)制备。用免疫剂对小鼠、大鼠、仓鼠或其它宿主动物进行免疫以形成产生对免疫抗原具有结合特异性的抗体的淋巴细胞。在一替代方法中，可在活体外对淋巴细胞进行免疫。
针对Bst2的单克隆抗体
最近，在已确定疾病蛋白质标靶的状况下，使用免疫治疗已变得盛行。治疗抗体所允许的高度特异性靶向即使在相对较高的剂量下也几乎不产生副作用。这也利用抗体天然固有的血清稳定性，从而为长效治疗分子提供基础。
抗体治疗剂通常属于不互相排斥的两个类别中的一个。第一类别是根据抗体的可变区(标靶蛋白质识别部分)。由抗体识别的特异性抗原决定基将允许抗体抑制标靶蛋白质与其它蛋白质的结合(抑制或拮抗效应)从而干扰细胞-细胞相互作用或终止通过标靶蛋白质的信号转导，或由于其与标靶蛋白质的结合而在不存在所需二级蛋白质的情况下产生人工信号(激活或激动效应)，如同二聚化依赖型受体信号转导或受体依赖型配位体模拟的情况。第二类别根据抗体的恒定区(Fc部分)，这一恒定区决定(如果有)何种免疫效应功能将因抗体Fc部分与存在于免疫效应细胞上的其同源Fc受体的结合而激活。靶细胞表面上特异性标靶蛋白质的存在使得所述细胞成为由效应功能破坏的标靶。
通过研发对Bst2具有高度特异性的抗体，我们已能够产生共有诱饵Bst2分子的许多特征的治疗抗体，因为其能够干扰细胞-细胞粘附并在抑制疾病特异性发炎性反应中充当治疗蛋白质。
在涉及粘膜免疫***的发病机制的某些状况下，可经口或经鼻投与抗体。粘膜免疫***是独特的，因为在暴露于抗原后优先诱导出耐受性，且调控T细胞的诱导是经口耐受性的主要机制。经口投与的抗体可被肠管相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)快速吸收，在此处其发挥其免疫作用。经口投与抗体可以传递增强T细胞调控功能的微弱但有效的信号的方式对肠管中的T细胞传输信号。经口投与CD3特异性抗体已在实验性自体免疫性脑炎(experimental autoimmune encephalitis，EAE)模型中例示。这些研究证明不需要CD3特异性抗体的Fc部分。经口投与的CD3特异性抗体的F(ab′)2片段抑制EAE。
抗体工程化
1.抗体工程化
一旦利用治疗性抗Bst2抗体，下一步骤即为工程化抗原结合域(亲和力成熟，稳定性)和改变效应功能(抗体依赖型细胞毒性(antibody-dependentcellular cytotoxicity，ADCC)、补体依赖型细胞毒性(complement-dependentcellular cytotoxicity，CDC)和清除率)。改良抗Bst2抗体效力的另一方法为寻求抗体毒素接合物、双特异性抗体和/或研究Fc受体(Fc receptor，FcR)多态现象。
抗Bst2抗体在结合与Bst2结合的细胞后阻断Bst2与Bst2L之间的相互作用从而产生对细胞信号的介入。关于抗体工程化，表征抗Bst2抗体其是否交联以引发细胞凋亡的细胞内信号、内化作用后向细胞传递毒素或使用效应功能杀死细胞是重要的。抗Bst2的所有这些参数在治疗自体免疫/发炎性病状中可为重要的。
1-1.通过工程化抗原结合域改良抗Bst2抗体
1-1-1.抗Bst2的F(ab)片段
当需要快速清除和短半衰期时，诸如在ReoPro(Centocor)的状况下，可使用抗Bst2的F(ab)片段。F(ab)片段因其尺寸较小可较易穿透实体组织。F(ab)片段可在大肠杆菌中而不是哺乳动物细胞中制造。Bst2通过二价全长抗Bst2抗体的交联可能引起标靶细胞的凋亡。视待治疗的疾病而定，所述细胞凋亡可能是有利或有害的。如果Bst2通过全长抗Bst2抗体的交联是有害的的，那么使用F(ab)可为有利的。
1-1-2.亲和力成熟
免疫球蛋白基因的体细胞超突变为活体内产生高亲和力抗体的关键，但其仅在免疫后发生。因此，在来自非免疫供体的噬菌体呈现文库中，很少发现高亲和力抗体。通常需要活体外亲和力成熟来改良来自所述文库的抗体。不管抗Bst2抗体是来源于噬菌体文库、杂交瘤还是其它技术，抗体亲和力都可能需要改良。亲和力可能不仅对有效阻断Bst2-Bst2L相互作用来说重要，而且对降低剂量和成本效益来说也重要。
然而，关于抗体亲和力，可能情况并不总是具有最强结合的抗Bst2抗体将是最佳选择。一个抗体可能与Bst2强烈结合但仅覆盖Bst2上Bst2L结合位点的部分，而另一抗体可能与Bst2不太强烈地结合但完全覆盖Bst2L结合位点。后者可能是较佳选择。在Adams等人使用抗Her2抗体的研究中(Cancer Res.61：4750，2001)，最高亲和力的抗体并不展现穿透实体组织/肿瘤的最佳穿透性。高亲和力scFv片段滞留在肿瘤周围，而中等亲和力抗体穿透整个肿瘤。视待治疗的疾病而定，组织穿透性减弱可能是抗Bst2抗体亲和力成熟的潜在问题。
1-1-2-1.亲和力成熟(affinity maturation)的一般方法
在亲和力成熟(Levin和Weiss，Mol.BioSyst.2：49，2006)中，使用突变诱发改变CDR中的残基，且就改良的结合和功效筛选所得突变型抗体。已公开数种亲和力成熟方法。这些方法包括通过以下各方法进行亲和力成熟：噬菌体(Gram等人，PNAS 89：3576，1992；Lowman等人，J.Mol.Biol.，1993，234，564)、核糖体呈现(Lipovsek等人，J.Immunol.Methods 290(2004)，第51-67页)、酵母表面呈现(Graff等人，Protein Eng.Des.Sel.17(2004)，第293-304页)、易出错(error-prone)PCR(Schlapschy等人，Protein Eng.Des.Sel.17(2004)，第847-860页)、增变基因菌株(Low等人，J.Mol.Biol.260：359，1996)、逐步聚焦突变诱发(stepwise focused mutagenesis)(Wu等人，PNAS95：6037，1998)和饱和突变诱发(saturation mutagenesis)(Nishimiya等人，J.Biol.Chem.275：12813，2000；Yang等人，J.Mol.Biol.254：392，1995；Chowdhury和Pastan Nat.Biotechnol.17：568，1999)。其它技术通常使用丙氨酸扫描或定点突变诱发来产生特定变异体的有限集合。
1-1-2-2.通过精确突变(Look-Through Mutagenesis，LTM)方法亲和力成熟
最近，Rajpal等人(Bioren，San Carlos，CA)开发了使用酵母呈现***优化抗体的精确突变(LTM)技术。LTM可适用于抗Bst2抗体的亲和力成熟。LTM也可适用于筛选Bst2诱饵(或Bst2诱饵-Fc)的高亲和力变异体。以下说明用于抗Bst2抗体亲和力成熟的Rajpal等人的方法的简要描述。
LTM是允许各CDR的所有位置单一氨基酸突变以快速增强亲和力的多维突变诱发方法。在LTM中，用野生型残基或代表主要侧链化学的9种氨基酸(小(A)、亲核(S、H)、疏水性(L、P)、芳族(Y)、酸性(D)、酰胺(Q)或碱性(K))中的一种取代标靶位置。LTM在CDR内产生一系列单一突变，其中各野生型残基经9种所选择的氨基酸中的一种取代。
首先，使用经优化以用于酿酒酵母与大肠杆菌的密码子通过重叠PCR装配抗Bst2 scFv构筑体，并将其亚克隆到酵母呈现载体中。这一原始构筑体充当后续抗Bst2 LTM文库的模板。关于抗Bst2 LTM文库的构筑，合成个别CDR寡核苷酸以编码各CDR位置具有一个标靶氨基酸取代的突变型CDR。使用含有LTM寡核苷酸混合物的PCR扩增LTM取代的CDR片段。在三元CDR文库中，组合CDR1、CDR2和CDR3的寡核苷酸以产生具有三种突变型CDR(VH与VL域)的文库。然后使相应抗体文库呈现于酵母细胞表面上。
阳性选择后，对产生与Bst2结合的较高亲和力的克隆进行测序，且对那些有益的突变进行定位。为鉴别改良结合的协同突变，由混合简并DNA探针产生组合有益突变的文库。合成编码所选氨基酸突变和野生型氨基酸的简并寡核苷酸并装配以产生这些文库。关于阳性克隆选择，生物素标记Bst2(或Bst2诱饵)。将细胞与经生物素标记Bst2一起培育并与抗生蛋白链菌素(Streptavidin)珠粒结合。使用用经生物素标记Bst2(或Bst2诱饵)来标记酵母细胞并用未标记Bst2(或Bst2诱饵)追踪的脉冲追踪策略选择呈现与经生物素标记Bst2(或Bst2诱饵)结合较强的克隆。可由荧光激活细胞分选仪(FACS)分选这些克隆。数轮选择后，可获得赋予较高亲和力的突变。然后将所有scFv亚克隆于表达载体中并分泌于大肠杆菌中。通过使用BIAcore表面等离子体共振***(BIAcore，Switzerland)测量scFv抗体的结合亲和力。
1-1-3.未经亲和力成熟的高亲和力抗体
Dyax的Hoet等人已构筑具有获自人类供体的天然存在的重链CDR3和轻链序列与重链CDR1和CDR2中的抗原接触位点的合成多样性的组合的人类F(ab)文库。使用Dyax F(ab)文库就与四种人类药物标靶的结合所选择的F(ab)展示比所批准的治疗抗体高的亲和力(Hoet等人，NatureBiotechnol.23：344，2005)。所述F(ab)文库可提供不需要亲和力成熟而产生高亲和力抗Bst2抗体的有效方法。
1-1-4.消除可变区域中的Asn连接糖基化
抗体可变域中的Asn连接糖基化可影响抗原结合(Leibiger等人，Biochem J.338：529，1999)。如果在抗Bst2抗体可变域中观察到Asn连接糖基化且抗体的结合或生物活性不需要碳水化合物，那么可通过将Asn变为Ala、Gln或其它氨基酸来去除可变区中的Asn。
已报导CDR中的Asn-Gly或Asp-Gly序列经历自发异构化以形成异天冬氨酸(isoaspartic acid)(Cacia等人，Biochemistry 35：1897，1996)。形成异天冬氨酸盐可削弱或消除抗体的结合。如果抗Bst2抗体中的CDR含有这些序列，那么用Ala、Gln或Glu取代Asn或Asp可为有益的。可判定这些取代是否可维持抗体结合和功效。
如果甲硫氨酸经氧化且其干扰结合，那么CDR中甲硫氨酸的存在也会成为问题。如果抗Bst2抗体的情况也是如此，那么可研究用其它氨基酸取代甲硫氨酸。
1-1-5.通过对抗原结合域进行突变诱发增强抗Bst2稳定性
抗Bst2的稳定性可通过改变影响稳定性的特定残基、如Angal等人((Mol.Immunol.30：105，1993)所示将来自不稳定scFv的CDR接枝到较稳定的构架上或如Schuurman等人(Mol.Immunol.38：1，2001)所示通过引入双硫键改变VH-VL界面来获得。
1-2.通过Fc工程化改良抗Bst2抗体
不同于必须能够结合标靶并影响其功能的小分子量药物，治疗抗体可结合标靶并通过效应功能抗体依赖型细胞细胞毒性(ADCC)、补体依赖型细胞毒性(CDC)和吞噬作用引导免疫***攻击标靶。然而，通过阻断配位体-受体相互作用起作用的单克隆抗体(抗Bst2抗体可能也是如此)可在不利用效应机制的情况下起作用(Agus等人，J.Clin.Oncol.23(2005)，第2534-2543页；Wang等人，Angiogenesis 7(2004)，第335-345页)。
尽管如此，效应功能增强在抗Bst2抗体的作用中可为有益的。举例来说，所有CD20引导的单克隆抗体治疗归因于效应功能产生用于治疗自体免疫发炎性病状(尤其类风湿性关节炎)的暂时性B细胞耗尽。也已知英利昔单抗(Infliximab)(抗TNFα)在与TNFα活体内结合后产生CDC和ADCC(Scallon等人，Cytokine，1995)。
关于抗Bst2抗体，重要的是决定ADCC、CDC和/或随后的靶细胞破坏对疾病的治疗是有益还是有害的。一种评定ADCC和CDC对抗Bst2治疗功能的作用的方法是测试抗Bst2抗体在FcγR敲除小鼠中的功效。
1-2-1.使用Bst2敲入FcγR敲除(双重突变体)来决定效应功能是有利还是有害的
ADCC和吞噬作用通过与一组具有激活和抑制活性的密切相关Fcγ受体(Fc gamma receptor，FcγR)的相互作用介导；CDC通过与补体***中的蛋白质(例如，C1q、C3、C4等)的相互作用介导；且半衰期/清除率通过抗体与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor，FcRn)的结合介导。抗Bst2抗体的作用机制中FcγR(和潜在ADCC)的作用可通过使用缺乏常见γ链的小鼠(FcγR-/-)(Takai等人，Cell 76：519，1994)、缺乏激活Fc受体FcγRI和FcγRIII的小鼠和缺乏FcγRIIB的小鼠(Takai等人，Nature 379：346，1996)来研究。
将使用与FcγR敲除杂交的Bst2敲入小鼠。当在C57Bl/9小鼠中产生Bst2敲入时，例如使FcγR缺陷型品系与C57Bl/6杂交并回交以建立同基因品系。然后使这一同基因品系与Bst2敲入小鼠交配以产生FcγR-/-/Bst2/Bst2和FcγRIIB-/-/Bst2/Bst2小鼠。使这些双突变型小鼠经受疾病诱导性处理，然后用抗Bst2抗体处理小鼠。
1-2-2.通过增强效应功能和/或稳定性改良抗Bst2活性
如果抗Bst2抗体使用ADCC用于治疗作用，那么使IgG Fc工程化以改良效应功能(通过改良与FcγR和/或补体的结合)可有利增强治疗抗体。结合改良已通过使Fc中的残基突变(Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591，2001)、从Fc中的保守性碳水化合物中去除海藻糖部分(Shields等人，J.Biol.Chem.277：26733，2002；Shinkawa等人，J.Biol.Chem.276：3466，2003)和多个Fc(Scallon等人，Mol.Immunol.41：73，2004)达成。
1-2-2-1.通过Fc的氨基酸变化
已证明改变人类IgG中氨基酸残基增强FcγR结合和效应功能。大部分这些作用集中于铰链区(残基216-230)和下铰链区(残基231-236)。近年来，已公开人类IgG1上人类FcRI、FcRIIA、FcRIIB、FcRIIIA和FcRn受体的结合位点的明细图(Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591，2001和其中的参考文献)。在这一研究中，FcRIIIA的结合改良的所选IgG1变异体展现ADCC显著增强。也已报导，有可能通过改变特定IgG1残基改良C1q结合(Idusogie等人，J.Immunol.166(2001)，第2571-2575页)。
新生儿Fc受体(FcRn)在治疗性单克隆抗体的清除率中发挥作用(Lencer和Blumberg，Trends Cell Biol.15(2005)，第5-9页)。与为免疫球蛋白超家族成员的FcγR不同，FcRn在结构上与包含与α2小球蛋白非共价结合的γ链的I类MHC相关(Martin等人，Mol.Cell 7(2001)，第867-877页)。
Shields等人得出的信息将有助于设计具有改良的与FcγR的结合从而增强效应功能的抗Bst2变异体。抗Bst2半衰期的增加可通过改变其对FcRn的亲和力获得。
1-2-2-2.对抗Bst2抗体进行去海藻糖基化(Defucosylation)以供增强效应功能
改良抗Bst2抗体的效应功能的另一方法可为改变Fc域中Asn297处的糖基化(海藻糖基化或唾液酸化)。
IgG的糖基化为与所有Fcγ受体结合所必需(Jefferis和Lund，Immunol.Lett.82：57，2002)。在人类IgG上，Asn297连接碳水化合物可见于Fc域中。这一复杂碳水化合物包含含有GlcNAc(N-acetylglucosamine，N-乙酰葡糖胺)和甘露糖的核心寡糖。核心也含有连接在一个或两个未端N-乙酰葡糖胺上的诸如半乳糖、海藻糖、GlcNAc和/或半乳糖-唾液酸的各种其它单糖。在这个单一糖基化位点处已检测到超过30种不同的共价连接多糖(Routier等人，J.Immunol.Methods 213：113，1998)。
已展示海藻糖部分存在与否在与FcγR的结合中发挥重要作用。去海藻糖基化单克隆抗体展现显著增加的与FcγR的结合并展示增强的活体外ADCC(Shields等人，J.Biol.Chem.277(2002)，第26733-26740页；Shinkawa等人，J.Biol.Chem.276(2003)，第3466-3473页；Nimmerjahn和Ravetch，Science 310：1510，2005；Niwa等人，Cancer Res.64(2004)，第2127-2133页)。
后来，建立了α-1，6-海藻糖基转移酶被敲除的工程化中国仓鼠卵巢细胞系(Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol.Bioeng.67(2004)，第614-622页)。GlyArt(Zurich)和BioWa(Princeton，NJ)开发了工程化细胞系以制造具有降低的海藻糖基化的抗体的技术。用这一缺乏海藻糖的细胞系产生的抗体和去海藻糖基化抗体展示增强的活体外ADCC(Niwa等人，Cancer Res64：2127，2004)。
1-2-2-3.抗Bst2抗体的Fc唾液酸化(sialylation)改变以供增强效应功能
Fc受体感应IgG上海藻糖与唾液酸残基的存在。最近研究展示Asn297位点处的Fc唾液酸关于抗体活性在决定IgG与Fc受体的相互作用方面起关键作用(Kaneko等人，Science 313：670，2006)，这进一步支持糖基化在免疫反应中的作用。IgG的Asn297连接多糖的唾液酸化使得对FcγR的结合亲和力降低且使得活体内细胞毒性降低。
抗Bst2抗体的唾液酸化改变在改良抗Bst2抗体效力中可为有益的。唾液酸对抗Bst2活性的影响可通过用神经氨酸酶处理的经唾液酸化抗Bst2抗体和含唾液酸抗Bst2抗体执行表面等离子体共振结合分析(BIAcore分析)来研究。富含唾液酸含量的抗Bst2抗体可通过凝集素亲和力色谱法获得。首先应比较唾液酸化和含唾液酸抗Bst2抗体对激活或抑制性FcγR的结合亲和力。这些抗体可展示对FcγR的结合亲和力的差异，而其不会展示任何对Bst2的结合亲和力的差异。然后使用动物模型测试唾液酸化(神经氨酸酶处理)抗Bst2抗体的活体内功效并与唾液酸化抗Bst2抗体或正常的未经处理的抗Bst2抗体的活体内功效加以比较。因为IgG寡糖的序列由糖基转移酶或糖苷酶的含量确定，所以抗Bst2抗体唾液酸化的改变可通过细胞工程化达成。
1-2-2-4使Xencor的Fc变异体与抗Bst2F(ab)连接
使诸如Xencor的新颖Fc变异体与抗Bst2F(ab)连接可增强抗Bst2效力。
Xencor(Monrovia，CA)的Lazar等人使用计算机设计算法和高通量蛋白质筛选的组合改变Fc区中的氨基酸，从而增强或降低免疫***的反应(Lazar等人，PNAS 103：4005，2006)。Xencor已工程化一系列FcγR亲和力和特异性经优化的Fc变异体。当使Xencor的新颖Fc与曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin)；Genentech，S.San Francisco，CA，USA)和利妥昔单抗(rituximab)(美罗华(Rituxan)；Genentech)连接时，其在活体外检定中使抗体的效力改良约500倍；所改变的利妥昔单抗在猴模型中也更有效。
1-2-3.通过消除效应功能改良抗Bst2活性
在不同状况下，视待治疗的疾病而定，抗Bst2抗体的效应功能可能不必要或甚至是有害的。举例来说，靶向T细胞的抗CD3(Xu，M.L.等人，Cell.Immunol.200(2000)，第16-26页；Carpenter等人，J.Immunol.165(2000)，第6205-6213页；Bolt等人，Eur.J.Immunol.23(1993)，第403-411页)和抗CD4(Newman等人，Clin.Immunol.98(2001)，第164-174页)由于单克隆抗体与FcγR携带细胞结合从而影响T细胞消耗或激活而展示有害的副作用。在抗CD3的状况下，FcγR结合降低的工程化变异体缓解这一问题(Herold等人，Diabetes 54(2005)，第1763-1769页；Carpenter等人，Biol.Blood MarrowTransplant.11(2005)，第465-471页)。
1-2-3-1.对于抗Bst2使用IgG4或IgG2
当不能保证抗Bst2的效应功能时，可使用人类IgG2或IgG4，因为这两种亚类补体结合效率低或缺乏补体结合(Presta L G，J Allergy ClinImmunol.2005，116(4)：731)。因为已一贯报导IgG4缺乏补体活化，所以倘若在使用IgG2或IgG4之间选择，那么认为IgG4是较佳选择。然而，特定亚类的抗体在其效应功能功效方面可能不等效(Chan等人，Mol.Immunol.41(2004)，第527-538页)。
1-2-3-2.从抗Bst2抗体去除Asn297连接糖基化
已报导，在一些状况下，缺少连接于Fc的Asn297的碳水化合物导致效应功能下降(Leatherbarrow等人，Mol.Immunol.22(1985)，第407-415页)。此外，1型糖尿病中糖基化抗CD3的第II阶段的临床试验的最新报导(Keymeulen等人，N.Engl.J.Med.352(2005)，第2598-2608页)展示一些前景。
1-2-3-3.使抗Bst2Fc中的残基突变以降低与FcR的结合
使用Shields等人(Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591，2001和其中的参考文献)所揭示的人类IgG1上的结合位点明细图，有可能设计与FcγR或FcRN的结合降低的抗Bst2变异体。
1-2-3-4.效应功能降低的抗Bst2的Fc铰链变异体
当效应功能对抗Bst2抗体来说不是有利的时，可寻求抗Bst2的铰链变异体。交换IgG亚类之间的铰链区展示铰链对FcγR和C1q结合来说很重要。铰链中(Leu235Glu)或铰链外部(Asp265Ala)的特定突变展示与FcγR的结合降低(Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)，第6591-6604页；Lund等人，FASEB J.9(1995)，第115-119页；Morgan等人，Immunology 86(1995)，第318-324页；Clynes等人，Nat.Med.6(2000)，第443-446页)。效应功能削弱的铰链变异型抗CD3单克隆抗体现正处于临床试验中(Herold等人，Diabetes 54(2005)，第1763-1769页；Carpenter等人，Biol.Blood MarrowTransplant.11(2005)，第465-471页)。
1-3.通过产生双特异性抗体改良抗Bst2
靶向Bst2和表达于相同细胞上的发炎性疾病的另一药物标靶的双特异性抗体可更有效地引发ADCC和CDC。所述双特异性Bst2抗体可能比靶向单一抗原的抗体更有效。据报导靶向表皮生长因子受体和***受体的双特异性抗体比靶向单一抗原的抗体更有效(Lu D.J.Biol.Chem.279：2856，2004)。
1-4.通过产生抗体与毒性物质的接合物改良抗Bst2
改良抗体能力的另一方法是使其与毒素或放射性配位体连接。抗体结合细胞上的标靶，内化，传递毒素并杀死细胞。这些毒素通过使用由诸如组织蛋白酶的胞内酶裂解的连接子与抗体连接。药物与连接子的选择很关键。如果连接子在细胞外部裂解，那么毒素在血流中释放。毒素的靶向传递需要在与Bst2结合后内化的抗Bst2抗体。一些抗Bst2抗体可能与Bst2而不是在对内化作用来说最佳的抗原决定基处强烈结合。出于这个原因，需要开发选择最有效内化的抗Bst2抗体的筛选技术。已发展出筛选具有增强的内化作用的抗体的方法(Marks JD，Methods Mol.Biol.248：201，2004；Neve等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.280(2001)，第274-279页；Heitner等人，J.Immunol.Methods 248(2001)，第17-30页)。
1-5.通过FcR的多态现象改良抗Bst2抗体
FcR多态现象似乎在许多疾病中发挥重要作用，这些疾病包括自体免疫疾病、感染性疾病、心血管疾病、动脉粥样硬化和移植生物学(van Sorge等人，Tissue Antigens 61(2003)，第189-202页；Karassa等人，Biomed.Pharmacother.58(2004)，第286-291页；Kastbom等人，Rheumatology 44(2005)，第1294-1298页；van Sorge等人，J.Neuroimmunol.162(2005)，第157-164页；Brouwer等人，J.Infect.Dis.190(2004)，第1192-1198页；Gruel等人，Blood 104(2004)，第2791-2793页；Gavasso等人，Atherosclerosis 180(2005)，第277-282页；van der Meer等人，Thromb.Haemost.92(2004)，第1273-1276页；Pawlik等人，Transplant.Proc.36(2004)，第1311-1313页)。
也已报导患者的FcγR多态形式影响治疗性单克隆抗体的反应，诸如利妥昔单抗(抗CD20)对癌症(Cartron等人，Blood 99(2002)，第754-758页；Carton等人，Blood 104(2004)，第2635-2642页；Treon等人，J.Clin.Oncol.23(2005)，第474-481页；Ghielmini等人，Ann.Oncol.16(2005)，第1675-1682页)、利妥昔单抗对全身性红斑狼疮(Anolik等人，Arthritis Rheum.48(2003)，第455-459页)和阿莱珠单抗(alemtuzumab)(抗CD52)对慢性淋巴细胞白血病(Lin等人，Blood 105(2005)，第289-291页)。
因此，在FcγR多态现象可发挥作用的疾病中，工程化与FcγR的结合增强或降低的抗Bst2抗体可提供新颖类别的治疗性抗Bst2单克隆抗体。
干细胞扩增
也认为Bst2在细胞生长和增生中发挥促进造血细胞生长和分化的作用。作为骨髓基质细胞抗原和粘附蛋白，Bst2可在造血和其它干细胞的中对关键细胞-细胞相互作用发挥重要作用。
许多造血细胞的活体内生长和分化需要与产生多种生长因子的基质细胞直接接触，且在一些***中细胞生长和分化需要基质细胞与造血细胞之间的直接接触(Daniel等人，Haematol.Blood Transfus.32：172，1989)。因此，骨髓基质细胞与骨髓基质细胞抗原是细胞存活和细胞凋亡的重要调控剂。
骨髓含有各种类型的干细胞。尤其是造血干细胞(所有血细胞的前体)和间充质干细胞。间充质干细胞转分化成许多不同细胞类型：骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、腱细胞(tendocyte)、神经细胞和骨髓基质细胞。Bst2也可调控间充质干细胞的分化。
基质细胞在调控增生和细胞凋亡中的重要性在调控包括白血病细胞的癌细胞的细胞存活和细胞凋亡中得到进一步例证。举例来说，当将急性骨髓性白血病(AML)的白血病细胞与骨髓基质细胞一起培育时，展示这些白血病细胞被保护而免于遭受化学治疗诱发的细胞凋亡(Garrido等人，Exp.Hematol 29：448，2001；Konopleva M等人，Leukemia 16：1713，2002)。最近研究证明Bst2直接介导骨髓基质细胞对白血病细胞的调控作用，从而保护白血病细胞免于遭受化学治疗诱发的细胞凋亡(Ge等人，Blood 107：1570，2006)。与Bst2在化学敏感性中的所述作用一致，也已报导Bst2在他莫昔芬抗性乳癌细胞中上调(Becker等人，Mol.Cancer Ther.4：151，2005)，这提示Bst2在不同癌症中的潜在多种功能。所有这些研究提示Bst2是介导多种功能的多效性蛋白质。
Bst2激动剂、Bst2肽模拟剂和Bst2配位体可用于活体外刺激干细胞生长/增生以大量制备干细胞。离体扩增的干细胞可用于移植。举例来说，可使用活体外培养的间充质干细胞通过重建放射性治疗和/或化学治疗后受损伤的骨髓微环境增强造血干细胞移植。
Bst2激动剂、Bst2肽模拟剂和Bst2配位体可用于离体扩增供间充质干细胞以用于基因治疗。认为间充质干细胞有前景作为基因转移和治疗的载体。所培养的间充质细胞在移植后可定植到骨髓中，分化并产生完整蛋白质。
Bst2的小分子量调节剂(Modulators)
本发明的另一方面为提供用于治疗或预防多种免疫/发炎性疾病的Bst2的小分子量(small molecular weight，m.w.)调节剂。Bst2调节剂可影响Bst2在细胞中的功能或活性并调节或影响Bst2-Bst2L相互作用和信号转导。另外，Bst2调节剂在细胞中可影响由Bst2调控或与Bst2相互作用的下游标靶和分子。
对小分子量化合物来说主要因素是Bst2与Bst2L之间的相互作用界面是否足够小以便小分子可足以破坏或增强Bst2/Bst2L相互作用，从而产生具有高亲和力的抑制剂或激活剂。受体与配位体的蛋白质-蛋白质相互作用通常需要大的相互作用界面。然而，在这许多残基中，有可能仅极小区域内的极少数残基可对结合活性有贡献。突变研究提示，在许多状况下，蛋白质-蛋白质相互作用由一小组足迹不比小分子所覆盖的残基显著大的称为“热点(hot spot)”的接触残基驱动(Clackson T，Wells JA.Science.1995；267：383-386；DeLano WL.Curr Opin Struct Biol.2002；12：14-20；WellsJA.Proc Natl Acad Sci USA.1996；93：1-6)。
如果Bst2通过小抗原决定基与Bst2L结合，那么寻找小分子配位体的可能性可能较佳。
Bst2的拮抗剂和激动剂调节剂
Bst2调节剂包括拮抗剂、激动剂、肽模拟剂、抑制剂、配位体和结合因子。拮抗剂包括拮抗、抑制、降低、阻断、抑止、减弱、减小或消除Bst2蛋白在细胞Bst2-Bst2L相互作用和/或Bst2下游信号转导通路中的功能和/或活性的化合物、物质或药物。Bst2的激动剂调节剂包括激动、增强、刺激、增加、增大或扩增Bst2蛋白在细胞Bst2-Bst2L相互作用和/或Bst2下游信号转导通路中的功能和/或活性的化合物或药物。
Bst2调节剂的效用
虽然抗Bst2抗体与Bst2诱饵(Fc)可在免疫/发炎性疾病中具有治疗作用，但具有足以阻断Bst2与Bst2配位体的结合的亲和力的小分子量抑制剂对各种免疫/发炎性疾病的治疗来说也具有治疗价值。
除免疫/发炎性疾病外，Bst2的拮抗剂调节剂对一些类型的癌症的治疗来说也具有价值。如Ge Y等人(Blood 107：1570，2006)的最近研究中所例证，Bst2可能参与骨髓基质细胞与癌细胞(诸如，白血病细胞)之间的相互作用，从而使白血病细胞存活。在诸如***癌或乳癌的一些癌症中，Bst2也可能对有关肿瘤进展和侵入的基质细胞与癌细胞的相互作用起重要作用。
Bst2激动剂、Bst2肽模拟剂和Bst2配位体对具有免疫缺陷的患者(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)患者或免疫受损患者)的治疗来说可具有治疗价值。用D型氨基酸合成的Bst2肽模拟剂将在活体内稳定。与L型模拟剂相比，这些稳定的肽可具有较高治疗潜能。
Bst2激动剂、Bst2肽模拟剂和Bst2配位体也可在贫血或骨疾病(包括骨质疏松症)的治疗中发挥作用。造血***需要从支持性基质环境中获得营养以维持和分化造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)。然而，在不存在细胞因子补充的情况下，仅有限数目的这些基质细胞克隆支持造血。Bst2激动剂、Bst2肽模拟剂和Bst2配位体可适用于促进造血。
Bst2激动剂、Bst2肽模拟剂和Bst2配位体可用于治疗已在放射性治疗和/或化学治疗后损伤的骨髓细胞。通过恢复骨髓微环境，这些Bst2调节剂可适用于治疗处于化学治疗或放射性治疗下的癌症患者。
1.Bst2调节剂的高通量筛选(High throughput screening，HTS)方法
下文基于用于筛选Bst2调节剂的Bst2和/或Bst2L的已知性质设计数种高通量筛选(HTS)方法。由如下文所指示的数种二次检定法进一步评估由HTS法鉴别的化合物样品组。
1-1.通过用荧光热位移检定检测与Bst2的直接结合来高通量筛选Bst2抑制剂
与Bst2结合的大部分小分子归因于结合Bst2上的功能区域或位点、例如对Bst2-Bst2二聚体形成来说重要的Bst2L结合位点或二聚化位点的优先或较高亲和力而可以某种方式调节Bst2活性。可使用热位移检定设计用于鉴别可与Bst2或Bst2肽结合的小分子的筛选和小分子检测检定。关于热位移检定，仅需要纯Bst2蛋白和化学文库。在活体内Bst2配位体仍未知的情况下，基于荧光的热位移检定将尤其适用。
可由诸如本文中二次筛选检定下所述的方法的方法进一步检定这一技术所确定的药物或结合分子以确定这些分子是否影响或调节Bst2的功能或活性。
1-1-1.热位移检定
如Pantoliano等人的美国专利第6,020,141号和第6,036,920号；J.Zimmerman，2000，Gen.Eng.News，20(8)；Pantoliano等人，J.Bioimol Screen6：429，2001；Lo MC等人，Anal Biochem.332：153，2004中所述的基于荧光的热位移检定(3-Dimensional Pharmaceuticals，Inc.，3DP，Exton，Pa.)是从用于化合物文库鉴别标靶蛋白质的抑制剂的一般方法。Pantoliano等人描述用于高通量药物筛选的基于荧光的热位移检定设备。
在这一检定中，使用环境敏感荧光染料监测蛋白质热解折叠(unfolding)，由在化合物存在下所获得的解折叠温度相对于不存在化合物的情况下所获得的解折叠温度的位移(δTm)评定配位体结合亲和力。
为监测蛋白质解折叠，使用荧光染料，诸如宝石橙(Sypro orange)。宝石橙是环境敏感染料。解折叠过程暴露蛋白质的疏水性区域且使得用于监测蛋白质解折叠转变的荧光大量增加。
Pantoliano等人已设计并实施全自动仪器来在微板格式中执行用于高通量筛选化合物文库的基于荧光的微型热位移检定(J.Biomol.Screen 6：429，2001)。
热位移检定也可如Lo等人(Anal Biochem.332：153，2004)所述在最初为PCR设计的iCycler iQ实时检测***(Real Time Detection System)(Bio-Rad，Hercules，CA)中进行。***含有用于精确控制温度的加热/冷却装置和使微板孔中的荧光变化同时成像的电荷耦合装置(charge-coupled device，CCD)检测器。反应含有Bst2(约1μM)、宝石橙、化合物(0、10、50、100μM)和缓冲液。以0.5℃/分钟的加热速率将板从25℃加热到89℃。以Ex/Em：490/530nm测量荧光强度。根据Pantoliano等人(J.Biomol.Screen6：429，2001)所揭示的等式分析荧光成像数据。通过将荧光强度拟合于等式中，获得各孔的转变中点温度Tm。
1-2.通过使用双荧光素酶报导体检定检测Bst2-NFkB通路来高通量筛选Bst2调节剂
Bst2过度表达使得哺乳动物细胞中的NFkB激活(Matsuda等人，Oncogene 22：3307，2003)。虽然仍不知发炎性通路中的Bst2的详细信号转导机制，但Matsuda等人的先前报导提示Bst2过度表达和激活使得通过NFkB应答元件激活NFkB介导的转录。
使用Bst2的这一性质，已设计通过结合Bst2抑制或激活与荧光素酶报导基因转录的调控来筛选Bst2调节剂的高通量双荧光素酶报导体检定(Promega Madison，WI，Paguio等人，Cell Notes 16：22，2006)。
1-2-1.用于HTS双荧光素酶检定的DNA构筑体和稳定细胞系
在这一检定中，构筑第一质粒以表达(例如)萤火虫荧光素酶(与萤火虫荧光素酶上游的串联NFkB应答元件偶合)和选择标记物(诸如潮霉素(hygromycin，Promega))。第二质粒表达Bst2和另一荧光素酶(诸如作为内部对照的海肾荧光素酶)-选择标记物(诸如新霉素(neomycin))融合体(Promega)。双报导体荧光素酶Bst2检定方法具有使用海肾荧光素酶的内置对照。使用海肾荧光素酶活性正规化各样品的萤火虫荧光素酶活性。
随后获得哺乳动物细胞和经报导体构筑体转染的细胞和双重转染的稳定细胞系用于高通量筛选检定。也获得表达空载体的对照稳定细胞系。如Matsuda等人(Oncogene 22：3307，2003)的研究中所报导，与含有海肾荧光素酶-新霉素融合体的空载体的对照稳定细胞相比，表达Bst2的稳定细胞将展示较高荧光素酶活性。
1-2-2.HTS双重报导体荧光素酶Bst2检定
使用各化合物(通常10μM或更高浓度)以384孔格式执行筛选检定。每孔涂铺一万个细胞。孔的一半用化合物刺激，且一半模拟刺激。数小时后收集细胞。使用双重Glo荧光素酶检定***(Promega)测定荧光素酶活性并使用光度计定量。获得NFkB萤火虫荧光素酶/Bst2筛选的样品板的结果。样品组可定义为超过未诱发对照的平均值3至4倍抑制或激活的报导体表达。从对照稳定细胞获得的对照荧光素酶值将指示最高程度的抑制。所有检定均一式四份执行。以平均萤火虫(NFkB)刺激发光单位(LU)/平均模拟刺激相对发光单位(RLU)形式计算诱导或抑制。
1-2-3.验证样品组的滴定实验
在96孔板中以每孔10,000个细胞涂铺双重转染的稳定NFkB应答元件/Bst2细胞系。将各化合物1∶2连续稀释并一式四份添加到孔中。将细胞与拮抗剂或激动剂一起培育数小时，收集并使用双重Glo检定***(Promega)分析。在GloMax 96微板光度计(Promega)上测量荧光素酶活性。
1-3.通过使用双荧光素酶检定监测Bst2启动子/luc的表达来高通量筛选Bst2表达调节剂
存在许多使用含有报导体构筑体的启动子鉴别小分子量治疗剂的先例。举例来说，已使BMP-2、BMP-4和BMP-1的启动子与报导体分子β半乳糖苷酶或荧光素酶融合来筛选可与启动子结合并增加报导体基因的表达的小分子。
由使用微阵列的实验显然可知存在大量治疗上重要的可诱导Bst2的分子(干扰素γ、TNFα、组胺等)。另外，由文献检索显然可知一些其它分子也可具有相同功能。另外，(Blood 107：1570，2006；Matsuda等人，Oncogene22：3307，2003；Goto等人Blood 84：1922，1994)已分析Bst2基因的启动子区。发现许多重要的位点，包括AML、GATA1、STAT和AP1的位点。所有这些研究指示Bst2的转录调控是细胞中Bst2功能或活性的重要调控机制。
可设计HTS检定以鉴别与Bst2基因中的调控序列结合的化合物。使Bst2启动子区(约1,000个碱基对或以上)融合于荧光素酶基因的上游。这一检定后所筛选出的化合物可调节Bst2基因表达量。在二次筛选检定中，关于Bst2的细胞-细胞粘附和发炎性功能筛选化合物的抑制或刺激活性。
1-3-1.DNA构筑体和稳定细胞系
如Ge等人(Blood 107：1570，2006)所报导，使用含有NheI和XhoI限制性酶位点的正向(5′-ttcacgctagccccctttgcagatgaagaaacaggctcaga-3′(SEQID NO：75))和反向(5′-ttcacctcgaggcaggagatgggtgacattgcgacactc-3′(SEQ IDNO：76))引物PCR扩增涵盖翻译起始位点上游759个碱基对和外显子1的211个碱基对的Bst2启动子区。为构筑含有较长Bst2启动子片段的DNA载体，PCR扩增涵盖1,000个碱基对或以上的Bst2启动子区。用NheI和XhoI消化扩增产物且使其连接于表达萤火虫荧光素酶的报导基因载体的相应位点。对于使用荧光素酶检定的高通量筛选使用这一构筑体。
1-3-2.使用Bst2启动子/荧光素酶融合构筑体的HTS双报导体荧光素酶检定
在HTS格式中，向384孔板的各孔中添加哺乳动物细胞，且使用Fugene6试剂(Roche)用Bst2报导基因构筑体和内部对照海肾荧光素酶报导体基因共转染。使用双荧光素酶检定***(Promega)检定荧光素酶活性并正规化。
1-4.通过使用荧光偏振技术检测Bst2-Bst2相互作用来高通量筛选Bst2调节剂
认为Bst2以同源二聚体形式存在于细胞表面上(Ohtomo等人，BiochemBiophys Res Commun.1999，258(3)：583-91)。也认为Bst2需要二聚化以获得其活性。为与此相一致，Bst2诱饵蛋白(Bst2的细胞外域)以二聚体形式表达并分泌(参见图3，B图)。
此外，Bst2的细胞外域含有可在Bst2二聚化中起作用的预测卷曲螺旋区。所有这些结果提示Bst2与Bst2相互作用。
使用Bst2同二聚化的这一性质，如下文所指示设计用于具有阻断Bst2-Bst2相互作用的能力的Bst2调节剂的高通量竞争性Bst2结合检定。
这一筛选方法利用为用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的最灵敏高通量方法中的一种的荧光偏振技术(Roehrl等人，Biochemistry 43：16056，2004)和HyperCyt流式细胞术平台。在这一方法中，由偏振光激发经荧光标记的Bst2、Bst2诱饵、Bst2卷曲螺旋(Bst2coiled coil，Bst2CC)或这些蛋白质的任何片段。可通过结合竞争检定以HTS格式检测在小分子存在下Bst2与荧光标记Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段的解离。
1-4-1.HyperCyt
Hypercyt是常用自动高通量流式细胞术(high-throughput flowcytometry，HTFC)分析平台，通过这一平台从微板孔中快速抽吸细胞样品并将其传递到流式细胞仪(Edwards BS Molecular Pharmacology 68：1301，2005；Young SM等人，(2005)J Biomol Screen 10：374-382；Arnold LA等人Science STKE(2006)2006：第13页)。这种筛选方法允许以对常规荧光板读取器来说将不可行的无洗涤均匀格式执行高通量蛋白质-蛋白质相互作用检定。已展示用于HTFC筛选的HyperCyt平台是筛选主导化合物文库的稳定、灵敏且高度定量的方法(Ramirez等人，(2003)Cytometry 53A：55-65；Kuckuck等人，(2001)Cytometry 44：83-90)。
1-4-2.荧光素标记Bst2试剂、重组Bst2蛋白和稳定细胞系
制备荧光素标记Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段。表达并纯化Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc重组蛋白。产生表达Bst2的稳定细胞系。如果可鉴别在与Bst2结合后不内化的Bst2突变体，那么可使用这一Bst2突变体代替野生型Bst2来产生稳定细胞系以供筛选Bst2调节剂。
1-4-3.通过检测Bst2-Bst2相互作用进行HTS荧光偏振检定
荧光偏振检定测量测试化合物与荧光Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段竞争结合细胞膜Bst2或经纯化Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc的能力。
对于高通量检定，以384孔格式筛选化学文库。对照孔含有未标记Bst2蛋白或仅含有缓冲液。以完全阻断荧光标记Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段的结合的高出100倍的浓度添加未标记Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段。也建立仅含有缓冲液的另一对照。这些阳性与阴性对照的荧光偏振值确定为对Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段的募集抑制0％和100％。
向孔中添加的顺序如下：1)测试化合物和对照试剂(通常10μM或以上)；2)Bst2稳定细胞(107个细胞/毫升)；3)(在4℃下培育后)荧光素标记Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段。再在4℃下培育后，用HyperCyt平台以流式细胞术分析板。
在另一格式中，可使用经纯化Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc执行高通量检定。建立HTS之前，测定Bst2的结合常数和筛选浓度。在使Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc蛋白的连续稀释液与荧光标记Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段结合后，测定Kd值。使用荧光偏振(在485nm下激发，在530nm下发射)用板读取器测量结合。使用诸如SigmaPlot的程序分析数据且测定Kd值。测定Kd值后，向孔中添加测试化合物。添加Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc蛋白，且添加荧光标记Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段。建立具有过量未标记Bst2、Bst2诱饵、Bst2CC或这些蛋白质的任何片段或仅具有缓冲液的阳性与阴性对照。用板读取器测量荧光偏振和荧光强度。
如Edwards BS等人，Molecular Pharmacology 68：1301，2005中所述按100×[1-(MFI测试-MFI阻断)/(MFI未阻断-MFI阻断)](其中MFI为含有测试化合物的孔、阻断对照孔和未阻断对照孔中的细胞中值荧光强度)计算测试化合物对荧光肽结合的抑制。
最初筛选后，使用竞争结合检定的剂量反应分析确定化合物的IC50值。
1-5.通过使用荧光偏振技术检测Bst2-Bst2L相互作用来高通量筛选Bst2调节剂
1-5-1.Bst2L表达细胞
下文所述的HTS检定需要Bst2L表达细胞或经纯化Bst2L或Bst2L片段。一种Bst2L表达细胞是如我们实验中所示的U937细胞(图6、7和24)。Bst2诱饵抑制U937附着于经干扰素γ处理的HUVEC的观察结果指示Bst2L存在于未经刺激的U937细胞的细胞表面上(图7)。Bst2诱饵抑制激活T细胞(图12)或激活U937细胞(图6)的同型聚集的另一观察结果提示Bst2L可能在激活之前和之后表达于T细胞和/或U937细胞的表面上。为支持这些结果，已展示U937细胞与经纯化Bst2诱饵蛋白的直接结合(图24)。
当鉴别出Bst2L蛋白和核苷酸序列时，可使用经纯化Bst2L或其片段或经Bst2L稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或COS细胞替代U937细胞。
1-5-2.通过检测Bst2-Bst2L相互作用进行的HTS荧光偏振检定
使用经纯化Bst2诱饵(或Bst2)和Bst2L表达U937细胞(或任何Bst2L表达细胞)的相互作用，如下文所指示设计筛选Bst2调节剂的高通量结合竞争检定。
这一HTS检定基于从诸如U937细胞的Bst2L表达细胞上的膜Bst2L置换荧光标记Bst2或Bst2诱饵。荧光偏振检定测量测试化合物与荧光Bst2或Bst2诱饵竞争结合膜Bst2L或经纯化Bst2L(或片段)的能力。
关于高通量检定，向孔中添加的顺序如下：
首先向孔中添加测试化合物，然后添加U937细胞。培育后，添加荧光标记Bst2、Bst2诱饵或其片段。再在4℃下培育后，用HyperCyt平台以流式细胞术分析板。
在另一格式中，可使用经纯化Bst2L或其片段和荧光标记Bst2、Bst2诱饵或其片段执行这一HTS检定。向孔中添加测试化合物，添加Bst2L或Bst2L片段，然后添加荧光标记Bst2、Bst2诱饵或其片段。在检测Bst2-Bst2L相互作用的HTS荧光偏振检定中，如上所述建立阳性与阴性对照。用板读取器测量荧光偏振和荧光强度。
在另一格式中，可使用经纯化Bst2或Bst2诱饵和荧光标记Bst2L肽执行这一高通量检定。向孔中添加测试化合物，添加Bst2或Bst2诱饵，且添加荧光标记Bst2L肽。建立阳性对照和阴性对照。用板读取器测量荧光偏振和荧光强度。
1-6.通过使用荧光偏振技术检测Bst2-Bst2肽模拟剂之间的相互作用来高通量筛选Bst2调节剂
1-6-1.Bst2肽模拟剂(Peptide mimetics)
以高亲和力与Bst2结合的小肽可充当Bst2的肽模拟剂。可如下文所述通过噬菌体呈现鉴别所述肽。设想通过使用荧光偏振技术检测Bst2与Bst2肽模拟剂之间的相互作用进行Bst2调节剂的高通量结合竞争检定。
1-6-2.通过噬菌体呈现分离以高亲和力与Bst2结合的Bst2肽模拟剂
可通过噬菌体呈现筛选以高亲和力与Bst2细胞外域结合的Bst2肽模拟剂。可通过将组合合成的寡核苷酸的复杂混合物克隆于噬菌体呈现载体中建立巨大的肽文库。使所表达的肽呈现为与噬菌体鞘蛋白的融合体的丝状噬菌体呈现***已有效用于发现肽配位体(Devlin等人，Science 249：404，1990；Greenwood等人，J.Mol.Biol.220：821，1991；Scott和Smith Science249：386，1990)。
将噬菌体池与涂有Bst2诱饵蛋白的珠粒或对照珠粒一起培育，且通过磁力分离方法选择阳性池。使用Bst2诱饵珠粒上的噬菌体颗粒群体的亲和力纯化回收具有结合活性的肽。对各捕获噬菌体的DNA的适当区段进行测序提供结合Bst2诱饵的肽的一级序列。在功能性检定中进一步筛选Bst2肽模拟剂以选择具有刺激发炎性反应的活性的模拟剂。
1-6-3.证实Bst2肽模拟剂结合Bst2的能力
在经标记Bst2L表达细胞(诸如U937细胞)与固定Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc蛋白的结合检定中证实所选择的肽是否具有结合Bst2的能力。向这一结合检定中添加不同浓度的Bst2肽模拟剂以测量结合竞争。
在另一格式中，可用固定Bst2L表达细胞(诸如U937细胞)和作为探针的Bst2诱饵Fc或经生物素标记Bst2诱饵建立结合检定。
在另一格式中，当鉴别Bst2L蛋白时，可执行125I标记Bst2L与固定Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc的结合检定。
1-6-4.在生物检定中证实Bst2肽模拟剂活性
可在许多不同检定中评定Bst2肽模拟剂的生物功能。一种所述检定如下：用Bst2的表达载体或空载体转染HUVEC。转染48小时后，用Bst2肽模拟剂或对照肽处理细胞。通过RT-PCR分析发炎性介体和粘附分子的基因表达，且通过免疫印迹法测定这些基因的蛋白质表达。在Bst2表达HUVEC中，Bst2肽模拟剂刺激发炎性反应。
1-6-5.使用Bst2肽模拟剂以荧光偏振技术来高通量筛选Bst2调节剂
以如上所述的类似方式执行HTS检定。简言之，以荧光标记Bst2肽模拟剂。用Bst2的表达载体稳定转染哺乳动物细胞。如果已知在与Bst2结合后不内化的Bst2突变体，那么将这一Bst2突变体转染到哺乳动物细胞中用以筛选Bst2调节剂。
关于HTS检定，向孔中添加测试化合物。添加Bst2表达稳定细胞，然后添加荧光标记Bst2肽模拟剂。如上用板读取器测量荧光偏振和荧光强度。
在另一格式中，可使用经纯化Bst2或Bst2诱饵替代Bst2表达稳定细胞。评定化合物的剂量依赖型反应以验证样品组。
2.高通量筛选后验证样品组的二次检定
在任何药物发现过程中必须使用一系列测评(profiling)检定验证最初样品组。二次检定的样品组验证为确定小分子量化合物的抑制或激活是否具有生物相关性。本文中所述的二次检定仅是可用于验证样品组化合物的可能的替代检定的少数实例。
2-1.通过Bst2-Bst2L结合检定验证样品组
以ELISA格式由与化合物浓度相关的Bst2-Bst2L相互作用测量小分子量化合物的活性。将经生物素标记Bst2诱饵(或Bst2诱饵Fc)固定在抗生蛋白链菌素涂布(或抗Fc抗体涂布)96孔板的孔中。向Bst2L和作为对照的不与Bst2诱饵结合的Bst2L突变体(如果可用)的溶液中添加所选择的主导化合物的连续稀释液，且将其与经固定Bst2诱饵一起培育。从板洗去未结合Bst2L。用经辣根过氧化物酶标记的抗Bst2L抗体，接着用辣根过氧化物酶显色反应测量结合Bst2L。
2-2.通过Bst2-Bst2L结合检定使用Biacore表面等离子体共振技术验证样品组
可以溶液竞争格式用Biacore表面等离子体共振技术分析Bst2-Bst2L结合。将一系列浓度的各化合物与Bst2L一起培育，然后注射在具有捕获重组Bst2诱饵的芯片表面上。在平衡下测量结合，且将其计算为最大值结合的百分率。
2-3.通过谷胱甘肽巯基转移酶钓饵检定(Glutathione S Transferase Pull-down assay)验证样品组
在大肠杆菌中表达GST-Bst2诱饵蛋白并纯化。可通过使用TNT T7转录/翻译***获得放射性标记(35S)-Bst2L。在DMSO中制备样品组化合物的连续稀释液。向试管中添加1微升各浓度的样品组化合物。添加含有GST-Bst2诱饵蛋白的珠粒。然后添加放射性标记Bst2L并培育。按照制造商的说明书执行钓饵检定。
2-4.通过细胞-细胞粘附检定使用荧光标记细胞验证样品组
如Edwards等人(Molecular Pharmacology 68：1301，2005)所述执行细胞粘附检定。用红色荧光Fura-Red(Invitrogen)标记Bst2细胞(表达Bst2的稳定细胞)，且用绿色荧光5，6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺基酯(Invitrogen)标记Bst2L细胞(可使用表达Bst2L的稳定细胞或U937细胞)并维持在冰上直到实验。将300微升Bst2细胞(1×106个细胞/毫升)和300微升Bst2L细胞(3×106个细胞/毫升)在37℃下在存在或不存在测试化合物(最终浓度为100μM)的情况下单独培育5分钟。然后组合细胞并在流式细胞仪中分析，期间将细胞悬浮液在300转/分和37℃下用磁性微搅拌子连续搅拌。搅拌90秒以确定细胞粘附的基础程度后，添加不同浓度的化合物。Bst2细胞在流式细胞仪中被拆分成两部分：均一红色荧光的单态和含有红色/绿色共荧光(co-fluorescence)的接合物(红色荧光Bst2细胞粘附于绿色荧光Bst2L细胞)。在各指定时间点，以100×(接合物的数目)/(接合物的数目+单态数目)形式计算粘附Bst2细胞的百分率。
2-5.通过荧光素酶报导体检定验证样品组
可用荧光素酶报导体检定使用在荧光素酶报导体上游含有多个NFkB位点的质粒(NFkB)n-luc证实Bst2拮抗剂或激动剂活性。用(NFkB)n-luc和Bst2的哺乳动物表达载体转染293T细胞。48小时后，用不同浓度的所选化合物处理细胞。培育6小时后，执行荧光素酶检定且使用光度计测量发光。
2-6.通过转录检定验证样品组
转录检定确定小分子是否在细胞环境中抑制或增强发炎性通路中Bst2介导的信号转导。一种所述检定如下。用Bst2的表达载体或空载体转染HUVEC。转染48小时后，用各种浓度的样品组化合物处理细胞。通过RT-PCR分析发炎性介体和粘附分子的基因表达，且通过免疫印迹法或ELISA测定这些基因的蛋白质表达。
Bst2和血管生成
血管生成是新毛细血管的生长。炎症可促进血管生成，且新血管也增强组织炎症。因此，血管生成和炎症是相互依赖的过程(Jackson等人，FASEBJ 11：457，1997)，同时血管生成和炎症也可彼此独立地发生。尤其，慢性炎症可刺激血管生长。胚胎发生、损伤后组织修复、生长和雌性生殖周期需要血管生成。血管生成也促成癌症和多种慢性发炎性疾病的病理学，这些慢性发炎性疾病包括银屑病、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘和肺纤维化。举例来说，需要血管生成来支持大部分直径超过2-3毫米的实体肿瘤的生长。最近研究展示血管生成抑制剂阻断肿瘤进展。此外，癌症不是血管生成抑制剂的使用可产生影响的唯一疾病。血管生成在年龄相关黄斑变性和糖尿病性视网膜病中发挥重要作用。当血管浸润视网膜、使其模糊并最终破坏视网膜时，这些病状导致视力丧失。实际上，血管阻断剂(抗体、小分子量化合物)是对超过65岁的人的主要致盲病因的年龄相关黄斑变性的最新且最有效的治疗。血管生成抑制剂可降低炎症，且可预期慢性炎症抑制剂抑制血管生成，在此处血管生长的刺激来源于发炎性细胞(Stogard等人，J Clin Invest 103：47，1999)。有可能Bst2诱发血管生成，且Bst2阻断剂可具有抑制新血管生成的抗血管生成活性。
传递
关于传递，除诸如皮下、静脉内、肌肉内和腹膜内注射的常规投药途径外，Bst2阻断剂还可通过经皮贴片和受控释放方法投与。诸如Bst2诱饵或Bst2结合抗体的Bst2阻断试剂的受控释放可通过植入已囊封或与可随时间降解或清空以在比注射长的时间内释放Bst2阻断试剂的固体基质结合的Bst2阻断试剂局部地或全身地实现。Bst2阻断试剂也可以乳膏或软膏形式局部涂覆来治疗皮肤病或损伤。
本发明组合物可以医药有效量投与。如本文中所使用，术语“医药有效量”是指与适于医学治疗的合理益处/风险比相称的足以治疗疾病的量。组合物的有效剂量的量可根据疾病类型、疾病严重程度、患者的年龄和性别、药物活性、药物灵敏性、投药时间、投药途径、药物分泌速率、治疗持续时间、与组合物组合使用的药物和医学领域中已知的其它因素来确定。本发明组合物可以个别治疗剂形式或与其它治疗剂组合投与，且可与常规治疗剂相继或同时投与。这一投药可为单次给药或多次给药。考虑到所有因素，重要的是以能够产生最大作用而无不利作用的最小剂量进行投药，且剂量可由所属领域的技术人员容易地确定。
本发明的范畴不受本文中所述的特定实施例限制。实际上，由前述描述和附图，除本文中所述的修改外，本发明的各种修改形式对所属领域的技术人员来说也将变得显而易见。所述修改形式意欲属于随附权利要求书的范畴。以下实例以说明本发明而不是限制本发明的方式提供。
[0001]实例
实例1-细胞培养
在37℃下在5％CO2气氛下在补充有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco-BRL)、100单位/毫升青霉素(Gibco-BRL)和100微克/毫升链霉素(Gibco-BRL)的RPMI-1640(Gibco-BRL)中悬浮培养人类单核细胞细胞系U937(ATCC，U.S；目录号CRL-1593.2)。
在37℃下在5％CO2气氛下在补充有10％FBS的EGM-2(Cambrex，U.S.)中继代培养人类脐静脉内皮细胞系(Human umbilical vein endotheliumcell line，HUVEC)(Cambrex，U.S.；目录号CC-2517A)。在以下实例中，用0.5％FBS替代10％FBS预处理细胞16小时。根据所给条件，用人类重组干扰素-γ(10纳克/毫升，Calbiochem，U.S.)和PMA(1纳克/毫升，Cambiochem)或培养基预处理细胞一段预定的时间。
根据与人类细胞系相同的方法培养和预处理小鼠单核细胞细胞系WEHI-274.1(ATCC，目录号CRL-1679)和小鼠内皮细胞细胞系SVEC 4-10(ATCC，目录号CRL-2181)。
在37℃下在5％CO2气氛下在补充有10％FBS、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco-BRL)中悬浮培养人类T淋巴细胞系Jurkat(ATCC，TIB152克隆)。
使用CHO-S细胞(Invitrogen，目录号11619-012)进行蛋白质表达和纯化。在37℃下在5％CO2气氛下在补充有10％FBS、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的F12/HAM(Gibco-BRL)培养基中悬浮培养CHO-S细胞。
实例2-人类Bst2基因和小鼠Damp1基因的克隆
如下构筑经组氨酸标签标记的Bst2的表达载体。由OrigeneTechnologies(USA)合成人类Bst2基因的全长cDNA(NM004335)，并使用Pfu ultra HF DNA聚合酶(Stratagene)由PCR以50毫升的体积扩增。使用SalI和NotI将PCR产物克隆于pCMV HA载体(Clontech)中。
如下构筑用于表达Bst2和Damp1的诱饵的载体。图2展示克隆诱饵中所使用的PCR引物的位置。通过PCR获得编码人类Bst2蛋白细胞外区域的DNA片段并在N-末端与组织型纤溶酶原激活剂(tPA，tissue Plasminogenactivator)的信号序列融合以在表达后促进细胞外分泌。也使DNA片段在C-末端与六组氨酸标签融合以有助于测定蛋白质表达量和蛋白质纯化。Bst2诱饵不含C-末端处的11个氨基酸残基而且不含跨膜域和细胞质域。将PCR产物用最终浓度为0.8％的二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；Sigma)处理，用BamHI和XbaI消化，并克隆于pCDNA 3.1载体(Invitrogen)中。在其它实验中，使人类Bst2诱饵的核苷酸序列经密码子优化以用于哺乳动物表达***，且化学合成DNA片段。
由RT-PCR使用从小鼠肝分离的mRNA获得小鼠Damp1基因的全长cDNA(NM 198095)。用BamHI和XbaI消化RT-PCR产物并克隆于pCDNA3.1(Invitrogen)中。通过人类Bst2与小鼠Damp1之间的氨基酸序列同源性分析确定诱饵区。结果，获得表达SEQ ID NO：1的可溶性Bst2片段的载体和表达SEQ ID NO：2的可溶性Damp1片段的另一载体。
实例3-实时定量RT-PCR
由实时定量RT-PCR使用ABI Prism 7900HT(Applied Biosystems，FosterCity，CA)和SYBR-Green检定试剂盒分析特定基因的细胞内表达量。使用引物表达软件(Primer Express software)(Applied Biosystems)设计所使用的引物和探针。
将10纳克单链cDNA置入反应管中并使其经受使用TaqMan通用PCR母液混合物(TaqMan Universal PCR Master Mix)的多路TaqMan PCR(50微升)。使用比较循环阈值(cycle threshold，CT)方法计算标靶cDNA的相对量。由琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
以与对照样品(未转染细胞)相比的变化形式表示特定基因A的相对含量。相对于经转染细胞中的正规化基因B(人类GAPDH基因)使用2-CT(Ct1-Ct0、Ct1＝Ct1A-Ct1B、Ct0＝Ct0A-Ct0B)计算方法获得所有值。一式三份从各样品获得各值。进行上述实验以量化Bst2基因和白细胞介素-2的表达。
实例4-可溶性Bst2蛋白片段或Damp1蛋白片段的表达和纯化
为表达以上所制备的可溶性Bst2蛋白片段或Damp1蛋白片段，将载体DNA瞬时或永久引入特定动物细胞中。如下通过磷酸钙(calcium phosphate，CaPO4)沉淀执行瞬时转染。转染之前24小时，将7×106个293T细胞(ATCC)接种于150毫米细胞培养板上并培养。转染之前1小时，将培养基换成补充有2％胎牛血清(FBS；Gibco-BRL)的IMDM培养基(Cambrex)。将1.5ml含有75μgDNA和250mM钙的TE缓冲液(1mM Tris，0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8.0)与1.5ml 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(50mM HEPES，140mM氯化钠(NaCl)，1.4mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)，pH 7.05)混合，在室温下培育约1分钟，且应用于预培养细胞。将细胞在37℃下在CO2培育箱中培育6小时。去除DNA/钙溶液后，用无血清培养基再供给细胞并再培养72小时或更长，然后回收培养基。如下使用脂质体转染胺(lipofectamine)和作为可选择标记物的二氢叶酸还原酶单独建立永久细胞系。转染之前48小时，将1.35×106个CHO-DUKX-B11(dhfr-)细胞(ATCC)接种于100mm细胞培养板上并在补充有10％FBS的IMDM培养基中培养。将0.6ml含有18μgDNA的无血清IMDM培养基与0.6ml含有54μl脂质体转染胺2000(Invitrogen)的无血清IMDM培养基混合，并在室温下培育45分钟。向DNA/脂质体转染胺混合物中补充8.8ml无血清IMDM培养基且应用于预培养细胞。将细胞在37℃下在CO2培育箱中培育6小时。将培养基换成选择培养基含有10％透析FBS的培养基。为分析瞬时表达的蛋白质，将细胞再培养72小时或更长时间。然后回收培养基并使其通过0.2μm过滤器(Millipore)。通过免疫印迹法使用抗Bst2多克隆抗体(Roche)或抗组氨酸抗体(Roche)分析所产生的Bst2诱饵蛋白。
为大规模表达和纯化可溶性Bst2蛋白片段或Damp1蛋白片段，如下选择稳定引入Bst2或Damp1表达载体的宿主细胞系作为制备细胞系。用表达载体转染缺失二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因的CHO细胞。因为表达载体带有dhfr基因，所以使用二氢叶酸还原酶作为可选择标记物。48小时后，将经转染CHO细胞以1×103个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板上并在含有20nM甲胺喋呤(methotrexate，MTX)的培养基中培养以扩增DHFR基因。两周后，回收培养基且使其经受使用抗Bst2抗体的ELISA以比较克隆的Bst2诱饵蛋白表达量。选择展现高表达量的克隆且使其暴露于浓度逐渐增加的MTX(至多300nM)中来完成基因扩增。此后，从各克隆收集培养基且使其经受ELISA和免疫印迹法以最终选择展现最高蛋白质表达量的制备细胞系。因为Bst2诱饵蛋白在培养基中在无血清的条件下产生，所以使用添加到C-末端的六组氨酸标签从所收集的培养基中纯化所表达的蛋白质。通过氮川三乙酸(NTA)螯合色谱法使用管柱、NTA螯合琼脂糖CL-6B(Peptron Inc.)执行蛋白质纯化。通过电泳和ELISA分析经纯化蛋白质的纯度，且通过二辛可宁酸(BCA)法(Biorad，USA)和紫外分光光度法测定经纯化蛋白质的量。
以4-20％SDS-PAGE分析如上所述纯化的人类Bst2诱饵和小鼠Damp1诱饵(图3，A图)。1％二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和N-糖苷酶F(Sigma)的处理使得Bst2诱饵成为二聚糖蛋白(图3，B图)。使用所制备的诱饵中的具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的可溶性Bst2蛋白片段和具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的可溶性Damp1蛋白片段获得以下实例的结果。
实例5-评估Bst2蛋白对U937细胞同型聚集的效用
实例5-1-U937细胞聚集期间Bst2表达量的变化
人类U937单核细胞聚集期间检查Bst2蛋白的表达量。用PMA(2ng/ml)和LPS(10μg/ml)处理1×106个U937细胞24小时以诱导U937细胞的同型细胞聚集，并在倒置相差显微镜(Olympus 1X71，state，USA)下观察同型细胞聚集的程度。为测定细胞聚集的程度，使用Adobe的Photoshop软件7.0版本以像素强度测量所形成的聚集体的大小。图式中所绘示的标准偏差值由6个随机选择的聚集体的平均值计算。此后，回收所有所使用的细胞，且分离总RNA并使其经受使用一组SEQ ID NOS：3和4的引物的RT-PCR以评定Bst2表达量。
有义寡聚物：5′-TTTTCTCTTCTCAGTCTC-3′(SEQ ID NO：3)
反义寡聚物：5′-GCATCTACTTCGTATGAC-3′(SEQ ID NO：4)
用PMA和LPS处理U937细胞以诱导同型聚集后1小时，细胞内Bst2表达增加约3倍。这一增加的量维持24小时。这些结果指示U937细胞同型聚集期间Bst2基因表达增加(图4)。
实例5-2-Bst2蛋白对U937细胞同型聚集的作用
为确定Bst2基因表达增加是否为U937细胞同型聚集所必不可少，评定过度表达Bst2蛋白时的细胞聚集。
将1×106个已在上述条件下培养的U937细胞接种于96孔细胞培养板(NUNC)上并用PMA(2ng/ml，Calbiochem)和LPS(10μg/ml，Calbiochem)处理24小时。然后在倒置相差显微镜(Olympus 1X71，state，USA)下观察细胞的同型细胞聚集程度。
Bst2蛋白本身不诱导U937细胞的聚集，而PMA/LPS处理刺激U937细胞同型聚集。Bst2的瞬时过度表达使PMA/LPS刺激的U937细胞的同型聚集增加约四倍(图5)。这些结果指示Bst2表达促进激活单核细胞白细胞的同型聚集。
实例5-3-使用Bst2诱饵抑制U937细胞的同型聚集
为证实Bst2基因表达增加是否为U937细胞同型聚集所必不可少，评定Bst2蛋白的作用受到抑制时的细胞聚集。
将U937细胞用PMA和LPS预处理以诱导细胞聚集，并用含有在CHO-S细胞中瞬时表达的Bst2诱饵的培养基(诱饵培养基)的连续稀释液处理。发现与不表达Bst2诱饵的CHO-S细胞的培养物(对照培养基)相比，Bst2诱饵使PMA和LPS诱导的U937细胞聚集降低50％(图6)。这些结果指示Bst2诱饵抑制U937细胞的同型聚集。
实例6-评估Bst2蛋白对两种不同细胞类型之间的异型聚集的作用
实例6-1-使用Bst2诱饵抑制U937与HUVEC之间的聚集
将HUVEC(1-5×104个细胞/毫升)接种于12孔细胞培养板上。1天后，将培养基换成含有0.5％FBS的低血清培养基，且用干扰素-γ(IFN-γ；Calbiochem)以10ng/mL的最终浓度预处理细胞24小时。然后，在37℃下将预处理HUVEC与U937细胞(2×106个细胞/毫升，500μl)共培养4小时。用磷酸盐缓冲液洗涤共培养物3或4次，且用4％三聚甲醛固定剩余细胞并用显微镜观察。
当向培养物中添加含Bst2诱饵培养基时，U937细胞展示与经IFNγ处理的HUVEC的结合降低。在不含Bst2诱饵的对照培养基中，U937细胞与经IFNγ处理的HUVEC有效结合并形成异型细胞聚集体。对照培养基或白蛋白的处理不影响细胞聚集(图7)。在图7中，未经IFN-γ预处理的“正常培养基”HUVEC不与U937细胞结合。相反，经IFN-γ处理的HUVEC与U937细胞结合并形成异型细胞聚集。经含Bst2诱饵蛋白培养基处理的从经IFN-γ预处理的培养物获得的HUVEC展现与U937细胞的聚集减少。基本培养基或白蛋白的处理不影响细胞聚集(图7)。在图7中，“正常培养基”指示含FBS的一般培养基，且“对照培养基”指示不表达Bst2诱饵蛋白的细胞培养液。另外，异型细胞聚集以依赖于Bst2诱饵浓度的方式受到抑制(图8)。
实例6-2-使用Bst2 siRNA抑制U937与HUVEC之间的聚集
构筑以Bst2特异性方式起作用的各种siRNA分子(QIAGEN)。总计构筑23个对Bst2具有特异性的siRNA分子。
以下测试结果使用由与SEQ ID NO：5序列所编码的Bst2 mRNA互补的反义RNA链和与反义RNA链互补的有义RNA链组成的siRNA获得。
用Bst2的表达载体转染经或未经IFN-γ处理的HUVEC，然后用Bst2siRNA转染。评定这些细胞的U937细胞粘附。
标靶序列：5′-AAGCGTGAGAATCGCGGACAA-3′(SEQ ID NO：5)
有义寡聚物：5′-r(UUGUCCGCGAUUCUCACGC)d(TT)-3′(SEQ IDNO：6)
反义寡聚物：5′-r(GCGTGAGAATCGCGGACAA)d(TT)-3′(SEQ IDNO：7)
外源表达的Bst2促进U937细胞与经或未经INF-γ处理的HUVEC的结合。Bst2 siRNA处理使得U937细胞粘附降低(图9)。结合图29中所绘示的证明Bst2 siRNA对未经转染HUVEC与U937细胞之间的细胞粘附的抑制效应的数据，这些结果提示Bst2在HUVEC-U937粘附中发挥作用。
实例7-评估Bst2蛋白对T淋巴细胞同型聚集和聚集活性的作用
实例7-1-Bst2过度表达对T淋巴细胞同型聚集和IL-2产生的作用如下诱导人类Jurkat T细胞以形成同型细胞聚集且激活。
当将Jurkat细胞(5×105个细胞/毫升)在4℃下与抗CD3单克隆抗体(OKT3：10μg/ml，BD Pharmingen)一起培育20分钟，然后在37℃下与抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗体(25μg/ml，Zymed)一起培育1小时时，发生细胞聚集，且细胞被激活并诱导而产生白细胞介素-2(IL-2)(图10和11)。根据相同方法，当诱导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)过度表达时，不存在作用。相反，当用Bst2过度表达载体转染Jurkat细胞且被诱导而激活时，同型细胞聚集增加(图10，A图)。由实时RT-PCR测量T细胞激活后的IL-2mRNA含量(实例3)。与GFP过度表达相比，在Bst2过度表达下IL-2mRNA表达升高约两倍(图10，B图)。
实例7-2-Bst2诱饵和Bst2siRNA对T淋巴细胞的同型聚集和IL-2产生的作用
激活之前30分钟将Jurkat细胞用Bst2诱饵预处理，使用抗CD3单克隆抗体激活并评估对细胞聚集的抑制。用相对量的含有Bst2诱饵的动物细胞培养液的连续稀释液处理细胞。以与非处理组聚集体的大小的比率表示聚集体的大小。
激活条件下的Bst2诱饵预处理使得Jurkat细胞的聚集显著降低。另外，IL-2的因Jurkat细胞激活而增加3倍的表达经Bst2诱饵处理又降到基础水平(图11和12)。
本文中所呈示的数据指示Bst2对炎症和免疫性来说是重要的。阻断Bst2功能可减少炎症诱发的疾病。在免疫受损个体(诸如艾滋病(AIDS)患者和免疫缺陷患者)中，增加免疫信号转导可对其有益。包含Bst2诱饵和可为蛋白质或化合物的另一分子Y的二价融合蛋白可充当迫使表达Bst2配位体的细胞与表达Y受体的另一细胞之间的相互作用和信号转导的转接器。参见图35。
实例8-评估Bst2诱饵在哮喘小鼠模型中的作用
实例8-1-小鼠中的哮喘诱发
通过用卵白蛋白致敏小鼠(C57B6，8周)制备哮喘小鼠模型。详细来说，最初连续5天通过鼻内注射卵白蛋白致敏小鼠。3周后，再次连续5天用卵白蛋白致敏小鼠。二次致敏后1周，每24小时用卵白蛋白鼻内激发小鼠3次以诱发哮喘。本文中，将Bst2诱饵在卵白蛋白致敏之前30分钟静脉内注射到小鼠中，且在第一次致敏和最后一次卵白蛋白注射之前30分钟注射到小鼠中。最后一次注射后3天，从小鼠收集血清样品、肺组织和其类似物。
实例8-2-Bst2诱饵诱导的沉降免疫细胞的数目的变化
在用卵白蛋白致敏并经Bst2诱饵处理的小鼠中，支气管肺泡灌洗流体中浸润细胞总数和各细胞类型(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)的数目显著减小(图13)。
实例8-3-Bst2诱饵对细胞因子产生的作用
当将Bst2或Damp1诱饵注射到经卵白蛋白致敏和激发诱发的哮喘小鼠模型中时，如下测量细胞因子(白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素-13(IL-13))的表达量。支气管肺泡灌洗后，从小鼠切除肺组织，且从肺组织中分离蛋白质。使用含NP-40的溶解缓冲液分离胞浆蛋白质。以SDS-PAGE凝胶分离经分离蛋白质，并通过湿式转移方法将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将印迹在各数种一级抗体(抗IL-4抗体(Setotec Inc.)、抗IL-5抗体(Santa Cruz Inc.)、抗IL-13抗体(R&D Inc.)和抗肌动蛋白抗体(Sigma Inc.))的1∶1000稀释液中培育。使用ECL试剂用HRP接合二级抗体(抗兔子HRP接合IgG)检测所结合的一级抗体。可见诸如IL-4、IL-5和IL-13的细胞因子的含量在具有经卵白蛋白致敏和激发诱发的哮喘的小鼠的肺组织中增加。同时，当用Bst2诱饵蛋白注射卵白蛋白致敏哮喘小鼠时，细胞因子含量随诱饵蛋白的剂量的增加而减小。这些结果指示Bst2诱饵蛋白对哮喘具有治疗作用(图14)。
实例9-评估人类Bst2蛋白与小鼠Damp1蛋白之间的功能相似性
人类Bst2蛋白与小鼠Damp1蛋白之间存在约35％的氨基酸序列相似性。鉴于此，检查两种蛋白质在活体外细胞-细胞粘附检定和活体内鼠类哮喘模型中是否将展示功能相似性。根据与实例6中相同的方法检查人类Bst2和小鼠Damp1蛋白对经IFN-γ处理的HUVEC与U937细胞之间的粘附性的抑制作用。
实例10-制备抗Bst2多克隆抗体
将经纯化的表达于CHO-S细胞中的Bst2和Damp1诱饵蛋白与Ribi佐剂以1∶1比率混合，并以2周为时间间隔注射到兔子中。免疫期间，收集血样并检查抗体的产生。三次免疫后，从兔子获得血清样品。通过亲和力色谱法使用Bst2蛋白与固定支撑物结合的管柱纯化抗Bst2多克隆抗体。
实例11-制备改良Bst2诱饵代谢的PEG接合形式
实例11-1-制备PEG接合形式
通过两种类型的PEG：(1)醛类PEG和(2)碳酸琥珀酰亚胺基酯(succinimidyl carbonate)PEG进行PEG接合(图17)。首先如下进行醛类PEG接合。将1mg Bst2诱饵蛋白透析于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，且与30倍摩尔比的(mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2，4-二胺基丁酸)-PEG′-NHS混合，接着在室温下在搅拌下培育2小时。关于碳酸酯PEG接合，单独地，将1mg Bst2诱饵蛋白透析于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 5.0)中，并与20倍摩尔比碳酸琥珀酰亚胺基酯PEG混合，接着在室温下在搅拌下培育2小时。反应完成后，使用尺寸排阻管柱(Superdex-200，Pharmacia)分离和纯化PEG接合Bst2诱饵，且透析于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。
实例11-2-PEG接合形式对Bst2诱饵的活体内稳定性的增强作用
将实例11-1中制备的Bst2诱饵的PEG接合形式以0.4至2mg/kg的剂量注射到7周大雄性Sprague Dawley大鼠的尾静脉中。用等剂量的生理盐水注射阴性对照组。同时，使用等剂量的Bst2诱饵蛋白作为阳性对照。在药物投与之前和药物投与之后2分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时和24小时使用套管从颈静脉收集血样。通过ELISA分析所收集的血样。在4℃下用抗Bst2诱饵抗体(于PBS中100ng/mL)涂布96孔板8小时或更长时间，并在37℃下用于PBS中的白蛋白阻断2小时。在37℃下使板与大鼠血清或Bst2诱饵(标准样品)的适当稀释液反应2小时。然后在37℃下使板与识别添加到Bst2诱饵C-末端的组胺酸标签的单克隆抗体(与辣根过氧化物酶接合的mAb，Roche Inc.)反应2小时。充分洗涤后，用过氧化酶物质处理板，且在450nm下测量吸光度。使用标准样品执行存在于血液中的PEG接合Bst2诱饵的定量(图18)。在图18中，“201B-H”指示人类Bst2诱饵样品，且“201B-HP”指示醛类PEG接合人类Bst2诱饵样品。
实例12-Bst2在炎症相关疾病中的表达和分布
获得具有各种发炎性疾病的患者的组织以研究Bst2的表达和分布。所获得的组织包括：哮喘患者的肺组织、动脉粥样硬化患者的动脉血管、银屑病患者的皮肤病灶、克罗恩氏病患者的肠组织、溃疡患者的肠/结肠组织、慢性活动性胃炎患者的胃组织和急性阑尾炎患者的盲肠组织。选择各组织作为展示典型发炎表型的代表性病变。
关于哮喘，将通过将肺组织固定于10％甲醛并将组织包埋于石蜡中制备的肺组织石蜡块切成1.5μm的厚度并固定在载玻片上。用苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色载玻片以根据过敏原和药物投药研究肺组织的变化。用实例10中制备的多克隆抗体执行组织染色。以类似方式制备其它组织。与正常组织相比，Bst2蛋白在炎症相关疾病中过度表达。在免疫细胞、血管内皮细胞和其它细胞类型中检测到Bst2(图19)。
实例13-细胞培养
如实例1中所述执行细胞培养。
实例14-构筑人类Bst2诱饵和Bst2诱饵Fc融合体的表达载体
基于表达载体pCDNA 3.1或其它市售dhfr载体制备融合构筑体。
图20绘示Bst2诱饵和其它Fc融合体的示意图。这些是可能融合蛋白的示意图。参考图20，图20A绘示Bst2诱饵本身，图20B绘示与IgG重链Fc的铰链-CH2-CH3部分融合的Bst2诱饵，其中独立表达Bst2诱饵以在各融合蛋白的头部形成Bst2诱饵二聚体。图20C绘示Bst2κ融合体与Bst2-IgG Fc融合体相呼应表达以在各通过天然存在的IgG K链-重链双硫键稳定的融合蛋白的头部稳定形成Bst2诱饵二聚体的形式。图20D绘示Bst2诱饵-IgG Fc在无其它Bst2二聚化对应物的情况下表达的形式。在表达IgGFc部分的各状况下，融合体的铰链-CH2-CH3部分的二聚化归因于这些链之间天然存在的双硫键而发生。
图21绘示上述Bst2诱饵-IgG Fc融合蛋白的载体图。说明描绘IgG1和IgG2Fc融合体的表达载体的代表性表达载体。图21A绘示Bst2诱饵(dBst2)。通过PCR克隆具有N末端tPA信号肽和C末端His标签的诱饵蛋白的起始的Xba1位点5′，接着克隆3′末端处的BamH1位点构筑Bst2诱饵表达载体，将这一***物克隆到具有xba1和BamH1的pcDNA3.1片段中。图21B绘示dBst2-IgG1Fc融合体。PCR克隆IgG1重链的铰链-CH2-CH3区并与具有5′Xho1和3′Not1位点的Bst2诱饵的C-末端融合；将这一***物克隆到具有Xho1和Not1的pcDNA3.1片段中。图21C绘示dBST-κ融合体。PCR克隆IgGκ轻链的恒定区并与具有5′Xho1和3′Not1位点的Bst2诱饵的C-末端融合；将这一***物克隆到具有Xho1和Not1的pcDNA3.1片段中。(d)dBST-IgG2HC融合体。PCR克隆IgG2重链的铰链-CH2-CH3区并与具有5′Xho1和3′Not1位点的Bst2诱饵的C-末端融合；将这一***物克隆到具有Xho1和Not1的pcDNA3.1片段中。
实例15-载体构筑
如下构筑经组氨酸标签标记的Bst2诱饵的表达载体。
通过PCR从人类血细胞cDNA文库(Clontech)克隆免疫球蛋白基因片段：人类IgG1重链的Fc区(铰链、CH1和CH2区)(Genbank编号：bc089417，引物1、2)、人类免疫球蛋白κ链(Genbank编号：BC067092，引物3、4)和人类IgG2重链的恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)(Genbank编号：AJ294731，引物5、6)。克隆片段中所使用的PCR引物的序列如下。
序列1
201-H-5′：5′-ctc cca gga cga gcc caa atc ttg-3′(SEQ ID NO：8)
序列2
201-IgG1-3′：5′-ggcggccgc TCA ttt acc cgg gga-3′(SEQ ID NO：9)
序列3
201-L-5′：5′-ctc cca gga ccg tac ggt ggc tgc-3′(SEQ ID NO：10)
序列4
201-κ-3′：5′-ggcggccgc TTA aca ctc tcc cct-3′(SEQ ID NO：11)
序列5
201-H2-5′：5′-ctc cca gga cgc ctc cac caa ggg-3′(SEQ ID NO：12)
序列6
201-IgG2-3′：5′-ggcggccgc TCA ttt acc cag aga-3′(SEQ ID NO：13)
实例16-人类Bst2诱饵-Fc融合构筑体(IgG1、2和4)
将人类Bst2诱饵-Fc融合体的三种不同构筑体克隆到表达载体pCDNA3.1(Invitrogen)中。通过PCR获得编码人类Bst2蛋白的细胞外区的DNA片段并在N-末端与tPA的信号肽序列融合以促进表达后的细胞外分泌。也使BST2细胞外片段在C-末端与IgG1、IgG2和IgG4的IgG1 Fc区或κ链的恒定区融合。用XhoI和NotI消化重叠PCR产物并克隆到载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。通过重叠PCR制造这些融合片段，且引物如下并称为“pcDNA-dBST2-IgG1Fc”、“pcDNA-dBST2-κ”和“pcDNA-dBST-IgG2HC”或pcDNA-dBST2-IgG4Fc。
实例17-PCR克隆和融合策略
PCR克隆和融合策略陈述于图22中。使用以下引物。
序列7
tPAsig_XhoI_Fw：5′-cgctcgagacagccatcATGgatg-3′(SEQ ID NO：14)
序列8
201-H-5′：5′-ctc cca gga cga gcc caa atc ttg-3′(SEQ ID NO：15)
序列9
201-H-3′：5′-ttg ggc tcg tcc tgg gag ctg ggg-3′(SEQ ID NO：16)
序列10
201-IgG1-3′：5′-ggcggccgc TCA ttt acc cgg gga-3′(SEQ ID NO：17)
序列11
201-L-5′：5′-ctc cca gga ccg tac ggt ggc tgc-3′(SEQ ID NO：18)
序列12
201-L-3′：5′-acc gta cgg tcc tgg gag ctg ggg-3′(SEQ ID NO：19)
序列13
201-κ-3′：5′-ggcggccgc TTA aca ctc tcc cct-3′(SEQ ID NO：20)
序列14
201-H2-5′：5′-ctc cca gga cgc ctc cac caa ggg-3′(SEQ ID NO：21)
序列15
201-H2-3′：5′-gtg gag gcg tcc tgg gag ctg ggg-3′(SEQ ID NO：22)
序列16
201-IgG2-3′：5′-ggcggccgc TCA ttt acc cag aga-3′(SEQ ID NO：23)
序列17
201-H4-3′；5′-cat att tgg act cgt cct ggg agc-3′(SEQ ID NO：24)
序列18
201-H4-5′；5′-ctc cca gga cga gtc caa ata tgg tcc c-3′(SEQ ID NO：25)
序列19
201-IgG4-3′；5′-ggc ggc cgc TCA ttt acc cag aga cag g-3′(SEQ ID NO：26)
实例18-表达可溶性诱饵-Fc融合蛋白
如实例4中所述瞬时转染后制备可溶性Bst2诱饵-Fc融合蛋白。如实例4中所述建立表达Bst2诱饵和Bst2诱饵Fc融合蛋白的稳定细胞系。如实例4中所述执行大规模表达和纯化。
实例19-经纯化Bst2诱饵和其它Fc融合体的PAGE
从培养基中纯化Fc融合蛋白。超滤浓缩后，使用两步色谱分离法，包括蛋白质A亲和力色谱法(Amersham Biosciences，MabSelect)和尺寸排阻色谱法(Amersham Biosciences，Superdex 200)。
将Fc融合蛋白加载到预先经PBS缓冲液(1.06mM磷酸二氢钾、155.17mM氯化钠、2.97mM磷酸二钠，pH 7.4)平衡的蛋白质A填充柱上。用过量PBS洗涤管柱以去除污染物。用低pH值缓冲液(诸如50mM甘氨酸盐酸盐)使用步进梯度洗脱所结合的抗体并用等体积1M Tris(pH 8.0)中和。
再使用尺寸排阻色谱步骤去除免疫球蛋白多聚体。将经纯化抗体多聚体混合物加载于预先经PBS(pH 7.4)平衡的Superdex 200管柱上。从50cm/h到150cm/h范围内的速率选择缓冲液的线性流速。
图23绘示描绘亲和力纯化后各种Bst2融合蛋白的经考马斯亮兰(Coomassie)染色的代表性PAGE凝胶(4～12％梯度凝胶，Invitrogen)。图23B绘示高分子量多聚形式可通过适当的尺寸排阻色谱法去除。
实例20-Bst2诱饵与免疫细胞的直接结合
在37℃下用具有碳酸氢钠(100mM，pH 9.5)的Bst2诱饵涂布平底96孔板历时2小时。用PBS(pH 7.4)洗涤板，并在25℃下使其与1％牛血清白蛋白(BSA)一起培育。用含有1mM CaCl2和0.5mM MgCl2的PBS(pH 7.4)冲洗后，向各dBst2涂布孔中添加U937细胞(1×106个/毫升)。在37℃下培育2小时后，通过用RPMI1640培养基(Gibco-BRL)轻柔洗涤两次去除未结合的细胞，且将结合细胞用2％多聚甲醛固定20分钟，洗涤，并用0.5％结晶紫(crystal violet)染色。在25℃下30分钟后，用PBS洗涤板并计数所结合的细胞。
图24绘示Bst2诱饵与U937细胞的直接结合。U937细胞附着于含有Bst2诱饵而不是BSA的孔中。
实例21-Bst2诱饵-Fc融合体的血浆半衰期
图25绘示Bst2诱饵或Fc融合体的血浆半衰期。如由与仅Bst2诱饵相比，两种Bst2诱饵-IgG1融合体代表性药物动力学曲线所指示，与各种稳定IgG Fc区融合的Bst2诱饵蛋白证明增强的血清稳定性。
为测定Bst2诱饵或其它Fc融合体的血浆半衰期，将大鼠(Sprague-Dawley雄性)外科植入静脉内导管。后续期间，使导管与输注泵连接。经1分钟通过用肝素化生理盐水冲洗以降低凝结风险的导管输注蛋白质样品。输注结束时指定为时间0。在多个时间点从导管抽取血样(0.4ml)。通过离心作用分离血浆并将其应用于测定BST2诱饵或其它Fc融合蛋白的血浆浓度的夹层ELISA检定。用(100微升/孔)5μg/ml兔子抗BST2多克隆抗体于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.2)中的溶液涂布96孔板中的孔并用1％BSA/PBS阻断。在25℃下将经稀释到属于标准曲线的线性范围内的各血浆样品培育90分钟。PBS洗涤后，在室温下将孔与辣根过氧化物酶标记山羊抗人类IgG(1∶50,000稀释液，Fc特异性，Sigma，目录号A-0170)一起培育1小时，然后用TMB底物(Pierce)处理。在板读数器中在450nm下读取板，且使用四参数曲线拟合程序分析数据。关于各不同蛋白质的标准曲线，在具有适当浓度的1％BSA、1％大鼠免疫前血清的溶液中使用各经纯化蛋白质标准物。
实例22-Bst2诱饵-Fc融合体对bst2诱饵与细胞之间的结合的抑制
Bst2诱饵-IgG Fc融合蛋白证明对U937细胞与Bst2诱饵涂布细胞培养板结合的浓度依赖性抑制，从而指示Bst2诱饵-IgG Fc融合蛋白具有功能性。
如下测量Fc融合蛋白对BST2诱饵与细胞之间的结合的竞争性抑制。在37℃下用具有碳酸氢钠(100mM，pH 9.5)的Bst2诱饵(50μg/ml)涂布平底96孔板历时2小时。用PBS(pH 7.4)洗涤板，并在25℃下将其与1％牛血清白蛋白(BSA)一起培育。用含有1mM CaCl2和0.5mM MgCl2的PBS(pH 7.4)冲洗后，向各Bst2涂布孔中添加U937细胞(1×106个/毫升)。添加之前，在37℃下将细胞与BST2诱饵-Fc融合蛋白一起预培育2小时。如实例20中所述计数所结合的细胞。
实例23-Bst2诱饵-Fc融合体对哮喘小鼠模型的作用
如实例8-1中所述制备哮喘小鼠模型。
如实例8-2中所述评定Bst2诱饵-Fc融合体对免疫细胞浸润的作用。当用Bst2诱饵处理卵白蛋白致敏小鼠时，浸润细胞总数减小，且尤其在支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)中嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和除巨噬细胞以外的淋巴细胞的数目减小(图27)。
在注射Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc融合蛋白后如实例8-3中所述在鼠类哮喘模型中测量Il-4、IL-5和IL-13的表达。这些细胞因子的含量减少，提示Bst2诱饵蛋白可能对哮喘具有治疗作用(数据未图示)。
实例24-产生人类-小鼠嵌合Bst2小鼠
使用如图28中所例示的构筑体的类型制造人类-小鼠嵌合BST2小鼠。绘示用于在小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)细胞或其它小鼠细胞中同源重组的小鼠BST2(DAMP-1)的细胞外域和C-末端经人类BST2的细胞外域和C-末端置换的靶向载体。适当的同源重组包括所绘示的侧接臂(×)中的同源重组，且具有适当同源重组的细胞将对选择(例如，新霉素或G418或所使用的其它选择标记物)具有抗性。在选择例示性标记物新霉素(G418)后，通过南方印迹法(Southern blotting)或PCR筛选来选择具有适当同源重组的细胞。可使用其它选择标记物。为消除靶向载体中的新霉素或任何其它标记物，可在制造嵌合小鼠之前用Cre重组酶的表达载体转染重组ES细胞，或可使嵌合小鼠与表达Cre重组酶的小鼠交配。可通过产生敲除、敲入或其它类型的转基因小鼠的标准技术使用重组ES细胞产生嵌合小鼠。因为人类-小鼠嵌合BST2的细胞外部分与人类BST2的细胞外域一致，所以在临床前研究中可使用小鼠来测试人类BST2抗体。另一选择为使用此处所述的相同策略用人类BST2基因的编码区(不仅为如这一图中所绘示的细胞外域的编码区)置换小鼠BST2基因的整个编码区。
实例25-活体外组合治疗的实验程序
在转染或不转染Bst2siRNA或对照siRNA 6小时的情况下，在12孔板中培养HUVEC，然后用或不用IFNγ处理24小时。在一些实验中，用含有Bst2诱饵或小鼠抗人类ICAM1抗体的粗培养基处理细胞。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤后，将U937细胞以2×106个细胞/毫升再悬浮于无血清培养基中。通过向HUVEC中添加200μl U937细胞达到1ml的最终体积起始检定。在37℃下4小时后，通过用PBS洗涤板三次去除未结合U937细胞。通过添加4％于PBS中的多聚甲醛来固定结合细胞，且在不同视野下用显微镜检查计数结合细胞。以Excel执行所有统计分析，且用学生t检验(Student′st test)评估统计显著性。在一些实验中，用IFNγ和/或siRNA处理后从HUVEC获得RNA样品，且执行实时聚合酶链反应(RT-PCR)分析。
实例26-结果
图29绘示用IFNγ刺激后内皮细胞(HUVEC)与单核细胞(U937)之间的异型聚集需要内源性Bst2。为展示内源性Bst2的阻断对异型聚集的抑制来说重要，在IFNγ处理(10ng/mL，24小时)之前用Bst2siRNA处理HUVEC以抑制Bst2的内源性表达。图30分别绘示Bst2 siRNA处理或ICAM1 siRNA处理并不影响经IFNγ处理的HUVEC中的ICAM1表达或Bst2表达。执行RT-PCR分析。
如图29和30中所示，虽然认为Bst2与ICAM1在细胞粘附中皆发挥作用，但尚不知这两种蛋白质是否在重叠通路或独立的不相重叠通路中串扰和起作用。关于组合抗粘附治疗，对两种在众多通路中起作用的粘附蛋白质的组合抑制与不相重叠通路中的两种蛋白质相比可能不太有效。当向Bst2 siRNA反应(B+I siRNA)中添加ICAM1 siRNA时，ICAM1 siRNA并不引起Bst2表达进一步降低，这提示Bst2表达不需要ICAM1。类似地，向ICAM1 siRNA介导的反应(I+B siRNA)中添加Bst2 siRNA并不引起ICAM1表达的任何进一步降低，这提示ICAM1表达不需要Bst2。这些数据指示Bst2与ICAM1可通过不相重叠的通路介导细胞粘附。
图31绘示Bst 2siRNA与ICAM1 siRNA的组合治疗在异型粘附检定中展示叠加效应。且图32绘示抗ICAM1或Bst2诱饵在异型粘附检定中的剂量依赖型反应，和抗ICAM1和Bst2诱饵的剂量依赖型反应的定量分析。
基于图31中的siRNA实验，在小鼠抗人类ICAM1抗体或Bst2诱饵存在下执行细胞粘附检定。使用含有Bst2诱饵的条件培养基。通过比较SDS-PAGE后经His标签标记的Bst2诱饵和蛋白质标准物的色带强度粗略估算粗细胞上清液中Bst2诱饵的量。
图33绘示Bst2诱饵与抗ICAM的组合治疗在细胞粘附中展示叠加效应。使用次最佳剂量的Bst2诱饵(100ng/mL)和抗ICAM1(1μg/ml)。当使用Bst2诱饵与抗ICAM1时，细胞粘附被完全抑制到对照水平。
图29-33中所绘示的结果提示Bst2阻断剂与其它免疫发炎性介体的阻断剂的组合治疗可能对治疗许多免疫发炎性病症有益。可与Bst2阻断剂一起使用的这些阻断剂包括CTLA4-Ig或TNFα、IL6、IL1、LFA1、α4整合素、ICAM1或VCAM1的阻断剂。另外，Bst2诱饵-Fc或抗Bst2与抑制免疫发炎性反应的环孢霉素或糖皮质激素的组合治疗可能分别对移植病状或许多需要皮质类固醇治疗的疾病有益。
关于大鼠或小鼠模型中的临床前研究，针对许多以上所列的大鼠或小鼠蛋白质(TNFR、IL6R、IL1R、LFA1、α4整合素、ICAM1、VCAM1)的大鼠或小鼠单克隆抗体(Abcam或其它公司)可购得。CTLA4-Ig可能须自身产生。关于不可获得单克隆抗体的蛋白质标靶或不希望使用单克隆抗体的情况，对于动物模型的组合治疗可使用相应蛋白质标靶的可溶性受体诱饵蛋白质，例如，TNFR-Fc(可溶性TNFR1)。
实例27-Bst2可为其自身配位体的可能性
已知Bst2在激活后形成同型二聚体。与此一致，似乎Bst2诱饵以二聚体或更高多聚体表达。Bst2的这种二聚化性质提示Bst2可在细胞-细胞相互作用中充当其自身配位体的可能性。
为测试这一可能性，将U937细胞与抗Bst2抗体一起培育，且将经抗体处理的U937细胞添加到经干扰素处理后的HUVEC中。在另一实验中，用Bst2 siRNA或对照siRNA处理U937细胞，且将经siRNA处理的U937细胞添加到经干扰素处理后的HUVEC中。
如果细胞-细胞相互作用需要U937细胞上的Bst2，那么经抗Bst2或Bst2siRNA处理的U937细胞不会与HUVEC结合。这些结果指示U937细胞上的Bst2与HUVEC上的Bst2相互作用以供粘附，从而确定Bst2作为一种可能的Bst2L蛋白。
实例28-使用全基因组全长cDNA(Genome Wide Full-Length cDNA，GFC)阵列和荧光分析法鉴别Bst2L
可使用全基因组全长cDNA阵列(GFC阵列)(OriGene Technologies，Rockville，MD)筛选Bst2L。GFC阵列是排列于一次性384孔板中的哺乳动物表达载体pCMVsport6(GIBCO)中的数组转染就绪的质粒。各孔含有62.5ng单一冻干cDNA，浓度经优化以供反向转染到多种细胞中。反向转染的标准方案适于大部分常用的细胞类型。集合含有超过24,000个转染就绪全长人类cDNA克隆。GFC阵列也提供人类基因阵列的子集，诸如跨膜蛋白和可药物化基因(Druggable Gene)(药物可靶向的酶/受体的基因)的阵列。可筛选这两个子集阵列(或整个集合阵列)与Bst2诱饵Fc的结合活性。
简言之，借助于高通量转染方法，将个别基因转染到诸如293T的人类细胞、CHO细胞、COS细胞或任何其它哺乳动物细胞中。向含有62.5ng不同cDNA的384孔板的各孔中添加20μl含有FuGENE 6(Roche)的无血清培养基。将40微升含有293T、CHO细胞、COS细胞或其它哺乳动物细胞的20％FBS DMEM培养基涂铺于各孔中。在37℃下在5％CO2下48小时后，将最佳量的Bst2诱饵Fc添加到各孔中并用经FITC标记的抗Fc抗体标记。使用微板荧光分析法(384孔格式)分析荧光。再测试计分为阳性的各孔的Bst2诱饵Fc与对照Fc。使用GFC阵列筛选后，通过使用特定cDNA质粒的标准转染验证各阳性孔。GFC阵列中的所有cDNA可单独用于OriGene(Rockville，MD)中。
实例29-通过表达克隆分离Bst2L
表达克隆方法需要鉴别大量Bst2L的活体外细胞来源以构筑质粒cDNA表达文库。然后用淘选技术使用Bst2诱饵Fc或经生物素标记Bst2诱饵就Bst2L筛选cDNA表达文库。
实例29-1-鉴别大量Bst2L的活体外细胞来源(源细胞)
使用重组Bst2诱饵-Fc融合蛋白来鉴别将Bst2L丰富地表达于表面上的推定细胞系或初级细胞。筛选各种细胞系和初级造血细胞。Bst2L的可能的细胞来源包括(但不局限于)T细胞、单核细胞/巨噬细胞细胞系，诸如人类U937细胞、小鼠RAW 264.7细胞、初级造血细胞、B细胞、树突状细胞、内皮细胞和成纤维细胞。也分别使用大鼠Bst2诱饵-Fc融合蛋白和小鼠Damp1诱饵-Fc融合蛋白检索小鼠和大鼠细胞系。
因为人类Bst2诱饵和小鼠Damp1诱饵如图15和27中所绘示在细胞粘附检定和活体内卵白蛋白诱发哮喘模型中可互换地起作用，所以在不考虑所使用的细胞系或初级细胞的物种的情况下可通过小鼠Damp1诱饵-Fc与人类Bst2诱饵-Fc融合蛋白两者来筛选源细胞系。
在用经FITC标记的人类Bst2诱饵-Fc或小鼠Damp1诱饵-Fc融合蛋白染色，接着二级抗体(例如用山羊F(ab′)抗人类IgG二级抗体)染色后，通过间接免疫荧光或荧光激活细胞分选仪(FACS)分析就Bst2L的存在筛选细胞系或初级细胞(Smith CA，Gruss HJ，Davis T，Anderson D，等人1993，Cell 73，1349-1360)。随后以FACS分析细胞。
实例29-2-通过使用经FITC标记的Bst2诱饵-Fc的FACS分析验证Bst22L源细胞
如上鉴别出的源细胞系与对照Ig相比应展示显著的与经FITC标记的Bst2诱饵-Fc的特异性结合。仅二级抗体和仅纯化人类IgG Fc不应与源细胞系的表面结合。这些结果指示Bst2诱饵-Fc的结合是归因于Bst2或Damp1诱饵部分而不是探针的Fc部分。为进一步证明结合特异性，结合应受未接合Bst2诱饵而不是无关的对照蛋白质抑制。
实例29-3-通过使用125I-Bst2诱饵(Fc)观测Bst2L验证Bst2L源细胞
关于验证，在存在或不存在过量非放射性Bst2诱饵蛋白的情况下，将源细胞与125I标记-Bst2诱饵或125I标记Bst2诱饵Fc一起培育。已描述通过乳过氧化物酶方法的碘化(Urdal等人，1988，J.Biol.Chem.263：2870-2877)。然后将细胞与交联剂[双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]一起培育。将蛋白质用1％Triton X-100混合物溶解，使其经受SDS-PAGE且通过自动射线摄影术观察。
当发现源细胞系且如所述(实例29-1、29-2和29-3)加以验证时，在多轮大部分亮色染色细胞来源的FACS分析后可能获得表达增加数目的Bst2L的变异细胞系。
实例29-4-从源细胞系构筑质粒cDNA表达文库用于淘选
关于分离Bst2L，从如上鉴别和验证的Bst2L源细胞构筑cDNA表达文库。从源细胞mRNA构筑定向寡聚dT启始质粒cDNA文库并连接到哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。将文库分为具有1000个克隆的池，且获得各池的质粒DNA。根据Seed和Aruffo的方法(Seed B，Arrufo A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，84：3365)和Lacey等人的修改版(Cell，93：165，1988)，将来自个别池的DNA转染到COS7细胞中。约48-72小时后，用人类Bst2诱饵-Fc融合体染色细胞约1小时，洗涤，且随后用固定多聚甲醛或戊二醛固定。用酶联二级抗体(诸如碱性磷酸酶接合山羊抗人类IgG(Fc特异性)抗体处理培养物，且通过检定(例如)碱性磷酸酶活性来检测免疫复合物。选择一个阳性池，制备质粒DNA用于大肠杆菌转化。将大肠杆菌转化株用于下一富集循环中。通过重复这一循环，可高度富集编码Bst2L蛋白的特异性cDNA，从而得到单一cDNA克隆。
然后将所选择的质粒DNA转染到COS7细胞中，且用人类IgG Fc域、人类Bst2诱饵-Fc融合蛋白或无关Fc融合蛋白，接着FITC接合二级抗体免疫染色。在这一阶段，仅人类Bst2-Fc融合蛋白应与源细胞结合。这些结果因此指示这一源细胞(或细胞系)编码Bst2L并将Bst2L呈现于其细胞表面上。
在一替代方法中，用抗人类IgG1Fc多克隆抗体(JacksonImmunoresearch)涂布淘选板，且随后用Bst2诱饵-Fc涂布。可能必需用牛血清白蛋白阻断。然后向板中添加如上所述转染的COS7细胞，且通过用EGTA和EDTA处理使粘附细胞悬浮。淘选方法的其余部分与上述类似。
实例29-5-通过使用经生物素标记Bst2诱饵作为探针的表达克隆和淘选分离Bst2L
在一替代方法中，如果源细胞含有极高含量的Bst2L，那么可按照Harada等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.1990，USA 87：857)使用经生物素标记Bst2诱饵作为探针分离Bst2L。在这一方法中，使经生物素标记Bst2诱饵与表达Bst2L的细胞交联，且通过在抗生物素抗体涂布板上淘选来富集Bst2L表达细胞。据报导交联是必要的，对细胞来说没在交联其不会附着于淘选板上。
如上所述(参见实例29-4)执行cDNA文库的构筑和COS7细胞的瞬时转染。48-72小时后，通过用含有5mM EDTA的PBS培育来剥离细胞。添加经生物素标记Bst2诱饵并使其与细胞交联。向涂布有抗生物素抗体的淘选板中添加交联细胞。从附着于板上的细胞回收质粒DNA并用于转化大肠杆菌。将扩增质粒DNA用于下一富集循环中直到其得到单一克隆。因此经这些克隆中的一种转染的COS7细胞将特异性结合125I标记Bst2诱饵。
实例29-6-淘选后分离Bst2L的全长cDNA
因为在表达克隆中淘选后获得的DNA***物(参见实例29-4和29-5)可能是较短截断cDNA，所以需要全长cDNA克隆。首先使用选自上述程序的短cDNA作为探针检索市售cDNA文库(Clontech)。通过使用短cDNA作为探针从源细胞系筛选cDNA文库获得Bst2L的全长cDNA。对来自源细胞系的mRNA的北方印迹分析将展示Bst2L转录物。也可使用市售北方印迹(Clontech)来观测转录物。
获得全长cDNA后，执行核苷酸测序。检索信号肽、潜在激酶域或任何其它关注域的序列。
如果在核苷酸序列中检测到信号肽，那么测试Bst2L是否释放到培养基中。Bst2L在C-末端处经抗原决定基标签标记(例如，血球凝集素)，且用Bst2L标签(HA)的表达载体转染293T细胞。用抗标签(HA)抗体探测细胞抽提物或条件培养基的西方印迹。如果释放到条件培养基中，那么在条件培养基中检测到比细胞抽提物中观察到的带小的带。可溶性蛋白质的亲和力纯化和可溶性蛋白质的N-末端序列分析揭露裂解位点。
实例30-从大量动物组织来源(或细胞系)直接纯化大鼠Bst2L或Damp1L且同源检索人类Bst2L
如果使用实例29-1中所述的方法鉴别大量人类Bst2L的源细胞系，那么此处所述的直接纯化方法可应用于人类细胞系膜制备。然而，细胞系(或细胞培养物)来源可能不适宜或太贵而不能提供足够的用于生物化学表征和纯化的材料。因此，可探求来自动物的替代组织来源。首先可鉴别动物Bst2L(诸如大鼠、犬、兔子Bst2L或Damp1L)以用于随后的人类同源物检索。在鉴别大鼠、犬、兔子、小鼠或其它动物中的大量组织来源后，可使用直接纯化方法鉴别动物Bst2L。
这一方法的第一步为鉴别大量动物Bst2L的活体内组织来源。虽然可使用任何动物物种，但使用大鼠说明如下所述的方法。
通过125I-Bst2诱饵-BSA或RSA(鼠血清白蛋白)的摄取研究(Yang等人，J.Exp.Med 174：515，1991)检查大鼠组织中Bst2特异性结合活性的分布。用125I-Bst2诱饵-RSA作为结合探针说明以下方法，用于分离晚期糖基化终端产物受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)的方法的修改形式。一旦摄取研究证明Bst2L的主要位点，则使用经溶解并分级分离的膜蛋白质执行包括使用Bst2诱饵-BSA琼脂糖4B管柱的亲和力纯化步骤的直接纯化。通过固相Bst2诱饵结合检定(参见下文)分析所有管柱洗脱份的结合活性。在纯化步骤结束时，切除蛋白质带并电泳洗脱以进行氨基酸测序分析。此后可检索并克隆人类同源物。
实例30-1-Bst2诱饵结合活性的活体内组织分布
可通过测量125I标记Bst2诱饵-RSA(大鼠血清白蛋白)或125I标记Bst2诱饵-BSA(牛血清白蛋白)的螯合作用鉴别Bst2L的活体内动物组织来源。关于组织分布研究，如其它研究(Horiuchi等人，J 261：4962，1986)中所述通过与甲醛一起培育RSA或BSA制备经甲醛修饰的Bst2-RSA或Bst2-BSA。然后将蛋白质放射性碘化。类似地，使正常RSA或BSA碘化到可比比活性。用51Cr标记新鲜抽取的大鼠RBC以允许随后修正血液相关放射性的组织计数。
通过125I-Bst2-BSA(RSA)的摄取研究检查大鼠组织中的Bst2特异性结合活性的分布。将125I-Bst2-RSA(BSA)或125I-正常RSA(BSA)与51Cr标记RBC(红血细胞)一起静脉内注射到大鼠中。在数个时间间隔时抽取血液等分试样，且去除多个器官并计数放射性。通过在投与标记Bst2之前用过量未标记Bst2-RSA(BSA)注射动物评定器官中Bst2配位体摄取的特异性。用水溶解RBC，且用20％TCA使蛋白质沉淀。由如Williamson等人，Diabetes 36：813(1987)中所述的方程式计算组织与血液的同位素比。就血液相关计数修正整个器官的读数。
Bst2-RSA(BSA)的组织积累不应受先前过量未标记Bst2-RSA(BSA)的注射影响，而用过量未标记Bst2-RSA(BSA)预处理大鼠应减少Bst2-RSA(BSA)在这个器官中的积累。在有或无未标记竞争物的情况下，Bst2-RSA(BSA)的摄取在所有其它主要器官中都应保持较低。当符合这些标准时，器官代表用于分离Bst2结合蛋白的潜在富集来源。
实例30-2-通过固相结合检定和配位体印迹检定证实Bst2L的活体内组织来源
一旦摄取研究证明Bst2诱饵蛋白螯合作用的主要位点和Bst2L的潜在组织来源，就根据对组织或器官来说特定的标准方案制备组织的膜蛋白质。组织提取液的结合活性可由如下所述的使用125I-Bst2诱饵的固相结合检定和配位体印迹检定证明。这些检定证实并验证Bst2L的活体内组织来源。
固相结合检定
需要固相结合检定促进从组织中分离Bst2L。将清洁剂溶解膜蛋白质固定于硝化纤维上并用125I-Bst2诱饵-RSA或125I-Bst2诱饵-Fc探测配位体特异性结合活性。配位体应以可饱和且剂量依赖性方式与125I-Bst2诱饵结合，且结合应被针对Bst2的抗体和/或未标记Bst2诱饵-Fc或Bst2诱饵阻断。Bst2L在转染细胞中的表达也应使细胞以可饱和且剂量依赖性的方式结合125I-Bst2诱饵。使用来自其它器官的类似清洁剂溶解膜制剂，可执行相同固相Bst2结合检定来证实Bst2L的活体内来源。
观测来自所鉴别的组织来源的Bst2L的配位体印迹检定
进行观测来自所鉴别的组织来源的Bst2L色带的配位体印迹检定。在SDS-PAGE上电泳分离获自Bst2L的所鉴别组织来源的蛋白质并在硝化纤维膜上形成印迹，与125I-BST2-BSA(或Bst2诱饵Fc)一起培育，且由自动射线摄影术评估配位体结合。
实例30-3-直接纯化来自活体内组织来源的溶解膜制剂的Bst2L
如上所述鉴别并证实Bst2L的活体内组织来源后，可使用作为监测Bst2L活性的方法的固相Bst2诱饵结合检定(参见实例30-2)执行Bst2L的直接纯化。使用来自动物组织(实例30-1)或Bst2L源细胞系(人类或其它物种)(实例29-1)的膜制剂。
可使用包含管柱色谱法和亲和力色谱法的数种纯化步骤。希望在一或两个诸如DEAE管柱或Sephadex管柱的粗纯化步骤后使用Bst2(Bst2诱饵)-BSA琼脂糖4B管柱亲和力纯化。洗脱与亲和力管柱结合的蛋白质，浓缩并分析125I-Bst2(Bst2诱饵)-BSA结合活性。然后执行制备型电泳。切除蛋白质色带并电泳洗脱以进行N-末端氨基酸测序分析。
可基于大鼠、犬或兔子Bst2L序列或小鼠Damp1L序列鉴别人类同源物。
实例31-通过酵母双杂交***分离Bst2L
使用依赖于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中重构GAL4转录激活子的酵母双杂交***分离Bst2L(Fields S和Song OK，1989，Nature340：245-246)。举例来说，可使用市售酵母双杂交试剂盒用含有Bst2细胞外域的饵筛选获自激活人类T细胞(Clontech)的市售文库。
实例32-通过活体外结合检定验证经分离的Bst2L
如上分离的Bst2L(实例28-31)应活体外特异性结合Bst2(Bst2诱饵)。可在许多不同检定中测定Bst2(Bst2诱饵)-Bst2L相互作用，且所述检定的数个实例描述如下。
在一个方面中，用含有全长cDNA的表达载体转染COS7细胞，且在存在或不存在过量的未标记Bst2诱饵(Bst2诱饵-Fc)或无关蛋白质(无关蛋白质-Fc)的情况下与各种浓度的125I标记Bst2诱饵-Fc一起培育。未标记Bst2诱饵(Bst2诱饵Fc)应完全阻断放射性标记Bst2诱饵-Fc的结合。这些结果将指示Bst2L特异性结合生物学活性Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc。然后如(Munson PJ，Rodbard D，1980，Anal.Biochem.l 107：220-239)所述分析结合数据以确定每个细胞的亲和力和位点数。
在另一方面中，可由FACS分析测定Bst2-Bst2L相互作用。用Bst2L瞬时转染293细胞、CHO细胞或COS细胞。24-48小时后，随后将细胞与重组生物素标记Bst2诱饵Fc一起培育1小时。将细胞与藻红蛋白接合抗生蛋白链菌素(Gibco BRL)一起再培育30分钟，然后由荧光激活细胞分选(FACS)分析。
在另一方面中，可由共免疫沉淀检定测定Bst2-Bst2L相互作用。将经纯化Bst2L与Bst2诱饵Fc一起培育且用蛋白质A琼脂糖免疫沉淀。通过SDS-PAGE解析沉淀并通过使用抗Bst2L的免疫印迹观测。
在另一方面中，(例如)在大肠杆菌中制造重组Bst2L，且将125I-标记Bst2L暴露于Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc的野生型、缺失突变体中，且在非还原性SDS-PAGE后将对照蛋白质固定于尼龙滤器上。125I标记Bst2L应识别Bst2蛋白。这一检定证实Bst2-Bst2L的活体外直接结合。当使用Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵Fc蛋白的各种缺失突变体时，也可确定与Bst2L结合的Bst2的结合域。
实例33-经分离Bst2L的活体外功能
经重组Bst2L处理的细胞可引发发炎性反应。用重组Bst2L、发炎性细胞因子(诸如干扰素γ)或Bst2L与细胞因子的组合处理包括HUVECS的细胞。测量这些细胞的细胞因子产生和与这些细胞的U937粘附。预期仅Bst2或与发炎性细胞因子的组合将增强发炎性反应和细胞-细胞粘附。Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc应活体外阻断这些作用。类似地，可使用T细胞激活和增殖检定测试Bst2L的活体外功能。这些数据指示Bst2L直接介导细胞-细胞相互作用且Bst2和Bst2L是免疫发炎性反应的关键调节剂。可使用大鼠或小鼠细胞重复这些检定以检查人类Bst2L是否在大鼠或小鼠***中起作用。这些数据指示Bst2L直接介导细胞-细胞相互作用且Bst2和Bst2L是免疫-发炎性反应的关键调节剂。
实例34-经分离Bst2L的活体内功能
用重组Bst2L、Damp1L或大鼠Bst2L注射小鼠或大鼠。注射后，评定诸如细胞因子释放的活体内发炎性参数。预期Bst2L(Damp1L)注射将产生促发炎性反应。这些发炎性反应将因注射Bst2(Damp1)诱饵Fc或抗Bst2(Damp1)抗体而被阻断。在另一方法中，抗Bst2L抗体也将展示消炎作用。因此可使用所述抗Bst2L抗体作为阻断Bst2-Bst2L相互作用的另一治疗剂。
实例35-Bst2配位体的生物化学和生物学表征
所分离的Bst2L应符合以下生物标准。
测量全长Bst2L蛋白的结合性质。用含有全长cDNA的表达载体转染COS7细胞，且与各种浓度的125I标记Bst2诱饵-Fc一起培育并测量细胞结合的放射性。与过量未标记Bst2或Bst2诱饵-Fc而不是无关蛋白质或无关蛋白质-Fc竞争应完全阻断放射性标记Bst2诱饵-Fc的结合。这些结果指示Bst2L特异性结合生物学活性Bst2、Bst2诱饵或Bst2诱饵-Fc。如Munson PJ，Rodbard D，1980，Anal.Biochem.l 107：220-239中所述分析结合数据以测定每个细胞的亲和力和位点数。
使用125I标记Bst2L作为探针确定Bst2的配位体结合域。(例如)在大肠杆菌中制造重组Bst2L，且如Chen等人(Chen等人，1995；J.Biol.Chem.270：2874-2878)的研究中所述，将125I标记Bst2L暴露于Bst2或Bst2诱饵-Fc的野生型或缺失突变体中，且在非还原性SDS-PAGE后将对照蛋白质固定于尼龙滤器上。
实例36-构筑Bst2/Damp1定向Fab文库
通过注射适量的佐剂(瑞比氏(RIBI′s)或弗氏(Freund′s)不完全/完全)将表达于CHO细胞中的人类Bst2-诱饵或小鼠Damp1-诱饵蛋白免疫到兔子(新西兰白兔(New Zealand White))中直到对Bst2/Damp1抗原具有特异性的抗体效价饱和。由酶联免疫吸附检定(ELISA)使用识别诱饵蛋白C-末端处的His标签的辣根过氧化物酶(HRP)接合抗His抗体测定免疫兔子的抗体效价。
关于制备Fab呈现噬菌体文库，使用TRI试剂从免疫兔子的骨髓和脾制备总RNA。通过使用Superscript II第一链合成***由寡聚(dT)引物(Invitrogen)合成第一链cDNA。
使用高保真度扩增PCR***(Expand High Fidelity PCR System)(Roche Molecular System)使来自各兔子的第一链cDNA经受第一轮PCR，且使用用于扩增兔子VL编码序列的10个引物的组合和用于扩增兔子VH编码序列的4个引物的组合。从Fab扩增人类Cκ和CH1编码序列。反义引物由为兔子VL和VH编码序列与人类Cκ和CH1编码序列的融合体设计的杂交兔子/人类序列组成。在第二轮PCR中，使第一轮可变区兔子VH与人类恒定CH1重叠，且使第一轮可变区兔子VL与人类恒定Cκ重叠。在第三轮PCR中，通过重叠扩增PCR使嵌合轻链产物与嵌合重链片段联接。
实例36-1-第一轮PCR引物组
*Vκ5′正向引物
RSCVK15′ggg ccc agg cgg ccg agc tcg tgm tga ccc aga ctc ca 3′(SEQ ID NO：27)
RSCVK25′ggg ccc agg cgg ccg agc tcg atm tga ccc aga ctc ca 3′(SEQ ID NO：28)
RSCVK35′ggg ccc agg cgg ccg agc tcg tga tga ccc aga ctg aa 3′(SEQ ID NO：29)
*Vκ3′反向引物
RHybK1-B    5′aga tgg tgc agc cac agt tcg ttt gat ttc cac att ggt gcc 3′(SEQ ID NO：30)
RHybK2-B    5′aga tgg tgc agc cac agt tcg tag gat ctc cag ctc ggt ccc 3′(SEQ ID NO：31)
RHybK3-B    5′aga tgg tgc agc cac agt tcg ttt gac sac cac ctc ggt ccc 3′(SEQ ID NO：32)
*Vλ5′正向引物
RSCL1       5′ggg ccc agg cgg ccg agc tcg tgc tga ctc agt cgc cct c 3′(SEQ ID NO：33)
*Vλ3′反向引物
RHybL-B     5′aga tgg tgc agc cac agt tcg gcc tgt gac ggt cag ctg ggtccc 3′(SEQ ID NO：34)
*VH 5′正向引物
RHyVH1      5′gct gcc caa cca gcc atg gcc cag tcg gtg gag gag tcc rgg 3′(SEQ ID NO：35)
RHyVH2      5′gct gcc caa caa gcc atg gcc cag tcg gtg aag gag tcc gag 3′(SEQ ID NO：36)
RHyVH3      5′gct gcc caa cca gcc atg gcc cag tcg ytg gag gag tcc ggg3′(SEQ ID NO：37)
RHyVH4      5′gct gcc caa cca gcc atg gcc cag sag cag ctg rtg gag tccgg 3′(SEQ ID NO：38)
*VH 3′反向引物
RHyIgGCH1-B 5′cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga rga gay ggt gac cag ggtgcc 3′(SEQ ID NO：39)
*用于扩增人类Cκ区的引物和来自克隆人类Fab的pelB前导序列
HKC-F(正向) 5′cga act gtg gct gca cca tct gtc 3′(SEQ IDNO：40)
Lead-B(反向)5′ggc cat ggc tgg ttg ggc agc 3′(SEQ IDNO：41)
*用于扩增来自克隆人类Fab的人类CH1链的引物
HIgGCH1-F(正向)5′aga agc gta gtc cgg aac gtc 3′(SEQ IDNO：42)
dpseq(反向)5′aga agc gta gtc cgg aac gtc 3′(SEQ ID NO：42)
实例36-2-第二轮PCR引物组
*用于PCR装配兔子VL序列与人类CK PCR产物的引物
RSC-F(正向)5′gag gag gag gag gag gag gcg ggg ccc agg cggccg agc tc 3′(SEQ ID NO：44)
Lead-B(反向)5′ggc cat ggc tgg ttg ggc agc 3′(SEQ IDNO：41)
*用于PCR装配兔子VH序列与人类CH1PCR产物的引物
前导VH(正向)5′gct gcc caa cca gcc atg gcc 3′(SEQ IDNO：45)
dpseq(反向)5′aga agc gta gtc cgg aac gtc 3′(SEQ ID NO：46)
实例36-3-第三轮PCR引物组
*用于PCR装配嵌合轻链序列与嵌合重链(Fd)序列的引物
RSC-F(正向)5′gag gag gag gag gag gag gcg ggg ccc agg cggccg agc tc 3′(SEQ ID NO：44)
dp-EX(反向)5′gag gag gag gag gag gag aga agc gta gtc cgg aac gtc 3′(SEQ ID NO：47)
将经SfiI消化的所得PCR产物连接到噬粒载体pComb3X(GenbankAF268281)中并转化到XL1-Blue/F′中。吸收辅助噬菌体VSCM13，接着添加PEG和NaCl后，从整夜培养基中获得噬菌体文库。
实例37-淘选抗Bst2或抗Damp1抗体的Fab文库
执行总计四轮淘选。关于Bst2和Damp1的高亲和力抗体克隆，使用利用所获得的嵌合Fab噬菌体文库的dynalbead(DYNAL，目录号143.01)淘选方法。
在37℃下用Bst2诱饵、Damp1诱饵或牛血清白蛋白(BSA)涂布Dynalbeads M270Epoxy历时16-24小时。用PBS(1.06mM磷酸二氢钾，155.17mM氯化钠，2.97mM磷酸二钠，pH 7.4)和0.5％于PBS中的吐温20(tween 20)洗涤Bst2诱饵涂布微珠，且然后悬浮于0.5％于PBS中的BSA中。关于去除非特异性结合，将Bst2噬菌体文库与BSA涂布微珠一起预培育。在室温下将预清除的噬菌体池与Bst2微珠一起培育2小时，并用0.5％于PBS中的吐温20由磁力分离方法洗涤数次以去除非特异性结合噬菌体。通过0.1M柠檬酸钠(pH 3.0，0.45ml)培育10分钟两次洗脱特异性结合噬菌体并通过添加1M Tris-HCl(pH 9.5，0.1ml)中和。感染所洗脱的噬菌体至对数性生长XL1-Blue F′并由辅助噬菌体VSCM13扩增整夜。通过用4％PEG和3％NaCl(w/v)沉淀制备噬菌体，随后用于PBS缓冲液中的1％BSA和0.02％NaN3悬浮。使用抗HA辣根过氧化物酶(Roche，目录号2013819)由噬菌体ELISA监测各轮的输出噬菌体池。以与上述Bst2特异性噬菌体池相同的方案选择Damp1诱饵特异性噬菌体池。
实例38-就对Bst2与Damp1具有特异性的抗体筛选Fab文库
关于选择对Bst2与Damp1具有反应性的克隆，将单一噬菌体克隆接种于含有30μg/ml四环素、50μg/ml羧苄西林(carbenicillin)和1％葡萄糖的2xYT肉汤中，并在37℃下培养整夜。将培养物上清液在96深孔板上在含有30μg/ml四环素、50μg/ml羧苄西林的2xYT肉汤中亚培养并使用辅助噬菌体VSCM13和卡那霉素(kanamycin)扩增。培养整夜后，通过在3000rpm下离心30分钟获得噬菌体上清液且用于呈ELISA格式的Bst2/damp1结合检定中。
在4℃下用1μgBst2诱饵或Damp1诱饵涂布96孔maxi-sorp板(Nunc)上的各孔整夜且通过在37℃下用于5％于TBS中的BSA(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)培育2小时来阻断。随后，在37℃下接着添加100μl噬菌体上清液历时1小时。用0.05％于TBS(7.4pH)中的吐温20洗涤各孔，并在37℃下添加100μl辣根过氧化物酶接合抗HA抗体历时1小时。如上洗涤后，添加200μl OPD(邻苯二胺二盐酸盐，0.4mg/ml，Sigma)溶液，接着添加50μl 3M硫酸(50μl)作为终止溶液。结果绘示于图36中。
实例39-所选抗体的表达
通过DNA测序分析如上获得的阳性噬菌体克隆且基于序列比对加以选择。参见图37。
关于以完整IgG1形式的表达，将各噬菌体Fab DNA片段克隆到来源于pCDNA 3.1(Invitrogen)的表达载体pCDH和pCDK中。
pCDH是用于表达全长IgG重链的中间克隆载体。从为用于表达全长IgG重链的中间克隆载体的完整pCDH来PCR扩增IgG重链的CH1-CH2-CH3域。从全血细胞cDNA文库(Clontech)使用EcoR1和Not1限制性消化后克隆到pcDNA3.1的EcoR1、Not1位点中的引物R1-CH1和CH3-Not1来PCR扩增IgG重链的CH1-CH2-CH3域。通过首先用来自如上所使用的文库的引物R1-tPA5和tPA3对tPA信号肽进行PCR和用重链CH1Rev和对可变区(Ra_Hv_Fw1到Ra_Hv_Fw9)具有特异性的引物对来自用于表达Fab片段的噬粒的可变区和CH1进行PCR进行重叠PCR克隆使tPA5′分泌信号与重链可变区融合来重构可分泌全长IgG重链；随后通过使用引物R1-tPA5和重链_CH1_Rev的重叠PCR反应使这两个PCR片段融合，用EcoR1和Age1消化并克隆到经相同酶消化的pCDH中。
pCDK是通过用引物H3-轻链和轻链-Xba1对轻链进行PCR克隆，用HindIII和XbaI消化PCR产物并克隆到经相同酶消化的pcDNA3.1中制成的用于表达lgG轻链的中间载体。通过首先用来自如上所使用的文库的引物H3-tPA5和tPA3对tPA信号肽进行PCR和用对可变区(Ra_Kp_F1到6和Ra_Kp_Rva到d)具有特异性的引物对对来自用于表达Fab片段的噬粒的可变区和CK进行PCR来进行重叠PCR克隆使tPA5′分泌信号与轻链可变区融合来重构可分泌全长IgG轻链；随后通过使用引物H3-tPA5和特异性轻链3′引物的重叠PCR反应使这两个PCR片段融合，用HinDIII和BsiWI消化并克隆到经相同酶消化的pCDK中。
R1-CH1   5′cgcgaattcgcctccaccaagggcccatcg 3′(SEQ ID NO：48)
CH3-Not1 5′ggcggccgctcatttacccgggga  3′(SEQ  IDNO：49)
R1-tPA5  5′cgcgaattcaggacctcaccatgggatgg 3′(SEQ ID NO：50)
tPA35′ggagtggacacctgtagct 3′(SEQ ID NO：51)
Heavy_CH1_Rev    5′ccacgctgctgagggagtagagtc  3′(SEQ  IDNO：52)
Ra_Hv_F1：5′gcaacagctacaggtgtccactcc cagcagcagctgatggag 3′(SEQ IDNO：53)42mer
Ra_Hv_F2：5′gcaacagctacaggtgtccactcc caggagcagctgatggagt3′(SEQ IDNO：54)43mer
Ra_Hv_F3：5′gcaacagctacaggtgtccactcc caggagcagctggtggagt 3′(SEQ IDNO：55)43mer
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H3-轻链：5′gcgaagcttcgaactgtggctgcaccatct 3′(SEQ ID NO：62)
轻链-Xba1：5′gcgtctagattaacactctcccct 3′(SEQ ID NO：63)
H3-tPA5：5′gcgaagcttaggacctcaccatgggatgg 3′(SEQ ID NO：64)
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Ra_Kp_Rvd：5′cgccgtacg taggatctccagctcggtccc 3′(SEQ ID NO：72)30mer
关于以完整IgG1形式表达，将各噬菌体Fab DNA片段克隆到表达载体pCDNA 3.1(Invitrogen)中。
为表达如上所选择的单克隆抗体(mAb，IgG1)，将载体DNA瞬时或稳定地引入哺乳动物细胞中。如下通过磷酸钙(CaPO4)沉淀执行瞬时转染。转染前1天，将7×106个293T细胞(ATCC)接种于150mm细胞培养板上并培养。转染前1小时，将培养基换成补充有2％胎牛血清(GIBCO-BRL)的IMDM培养基(Cambrex)。将1.5ml体积的含有75μg DNA和250mM钙的TE缓冲液(1mM Tris，0.1mM EDTA，pH 8.0)与等体积的HEPES缓冲液(50mM HEPES，140mM NaCl，1.4mM Na2HPO4，pH 7.05)混合。将混合物在室温下培育约1分钟并应用于预培养细胞。将细胞在37℃下在CO2培育箱中培育6小时。去除DNA/钙溶液后，向细胞中添加无血清培养基且进一步培养72小时或更长时间，且随后收集培养基。使用蛋白质A亲和力色谱法(amersham Biosciences，MabSelect)从培养基中纯化各mAb。将培养基加载到预先经PBS缓冲液(1.06mM磷酸二氢钾、155.17mM氯化钠、2.97mM磷酸二钠，pH 7.4)平衡的蛋白质A填充柱上。用PBS缓冲液洗涤管柱以去除约20管柱体积的污染物。用低pH值缓冲液(诸如50mM甘氨酸盐酸盐)使用步进梯度洗脱结合抗体并用等体积1M Tris(pH8.0)中和。使经纯化蛋白质样品在4-20％天然PAGE(4-20％天然PAGE，Invitrogen)中经受凝胶电泳。关于凝胶中的经纯化蛋白质，参见图38。
实例40-竞争性结合检定(活体外)
如实例22中所述测量对Bst2或Damp1具有特异性的mAb在Bst2诱饵与细胞之间的结合中的竞争性抑制。
实例41-mAb对哮喘小鼠模型的作用
如实例8-1中所述制备哮喘小鼠模型。如实例8-2中所述评定抗Bst2/Damp1抗体对免疫细胞浸润的作用。在经卵白蛋白致敏并用各mAb处理的小鼠中，经一些抗Bst2/Damp1抗体处理后，支气管肺泡灌洗液(BAL)中浸润细胞的总数减少(图39)。抗Damp1抗体2-15并不显著阻断免疫细胞浸润。一种可能性为2-15单克隆抗体可与Damp1诱饵强有力结合，但可能不精确覆盖潜在Damp1L结合位点。
实例42-测量发炎性状态的诊断方法
在发炎性病状中Bst2 mRNA表达增加。用定量PCR、实时PCR或北方印迹测量从个体分离的细胞和组织中的Bst2 mRNA含量可得到关于那些细胞和组织的炎症状态的有用信息。通过用对Bst2具有特异性的抗体进行免疫印迹法或使用能够与细胞膜上的Bst2结合的荧光标记抗体的免疫荧光显微术和荧光激活细胞分选仪(FACS)测量Bst2蛋白含量也可得到关于那些细胞的炎症状态的信息。经常可使诸如Bst2的膜蛋白质裂解来制造在体内循环的可溶性Bst2片段。可使用常用方法(诸如放射性免疫检定(radioimmunological assay，RIA)和ELISA)用对循环Bst2片段具有特异性的抗体量化在体液(诸如血清和尿)中循环的Bst2。对循环Bst2片段的量化可反映宿主的炎症状态且可适用于诊断和治疗目的。
本文中所引用的所有参考文献整体以引用的方式并入本文中。
仅仅使用常规实验，所属领域的技术人员将认识到或能够探知本文中具体描述的本发明的特定实施例的许多等价物。所述等价物意欲涵盖在权利要求书的范畴内。

Claims (26)

1.一种阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其包含使所述免疫细胞和/或所述其它细胞与包含骨髓基质抗原-2拮抗剂的组合物接触。
2.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述其它细胞为免疫细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、脑细胞、脊髓细胞、周围神经细胞、心脏细胞、骨骼肌细胞、肺细胞、肝细胞、肾细胞、血管细胞、胰腺细胞、大肠和小肠细胞、胃细胞、食道细胞、鼻咽细胞、膜细胞或***细胞。
3.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述骨髓基质抗原-2拮抗剂为骨髓基质抗原-2诱饵。
4.根据权利要求3所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述骨髓基质抗原-2诱饵为与所述骨髓基质抗原-2蛋白相比对另一分子或蛋白质具有类似或改良的结合的骨髓基质抗原-2片段或其变异体。
5.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述骨髓基质抗原-2拮抗剂为与稳定蛋白质融合的骨髓基质抗原-2诱饵、骨髓基质抗原-2诱饵-Fc嵌合或融合构筑体、骨髓基质抗原-2诱饵-白蛋白嵌合或融合构筑体或聚乙二醇化骨髓基质抗原-2诱饵，或与其它稳定蛋白质融合的骨髓基质抗原-2诱饵。
6.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述骨髓基质抗原-2拮抗剂为与骨髓基质抗原-2和/或小鼠Damp1蛋白特异性结合的单克隆抗体或抗体样蛋白质域。
7.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述骨髓基质抗原-2拮抗剂为化学化合物。
8.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述免疫细胞和其它细胞位于发炎部位或位于远离发炎但可传输发炎性和免疫细胞因子或其它发炎性信号到发炎部位的部位。
9.根据权利要求1所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述组合物进一步包含细胞粘附和信号传输抑制化合物或免疫抑制化合物。
10.根据权利要求9所述阻止免疫细胞与其它细胞结合的方法，其特征在于所述细胞粘附抑制化合物为细胞间粘附分子-1拮抗剂或淋巴细胞功能相关抗原拮抗剂。
11.一种具有消炎活性的骨髓基质抗原-2诱饵。
12.一种骨髓基质抗原-2诱饵-免疫球蛋白Fc嵌合体。
13.根据权利要求11所述具有消炎活性的Bst2诱饵，其特征在于骨髓基质抗原-2诱饵-Fc融合体的所述诱饵融合于免疫球蛋白的任何域。
14.一种单克隆抗体，其对骨髓基质抗原-2和/或骨髓基质抗原-2同源物具有特异性。
15.根据权利要求14所述的单克隆抗体，其包含两个臂，其特征在于一个臂对除骨髓基质抗原-2或其同源物以外的蛋白质具有特异性。
16.根据权利要求14所述的单克隆抗体，其特征在于所述同源物为小鼠Damp1蛋白。
17.根据权利要求14所述的单克隆抗体，其特征在于表达所述单克隆抗体所结合的骨髓基质抗原-2的细胞阻止骨髓基质抗原-2配位体-骨髓基质抗原-2相互作用或骨髓基质抗原-2-骨髓基质抗原-2相互作用。
18.一种分离骨髓基质抗原-2配位体的方法，其包含：
(i)获得与骨髓基质抗原-2结合的细胞；
(ii)从所述表达所述配位体的细胞中筛选与骨髓基质抗原-2结合的配位体，从而分离所述骨髓基质抗原-2配位体。
19.一种转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包含功能上受破坏的Damp或骨髓基质抗原-2基因，其特征在于所述受破坏基因在胚胎期时被引入所述小鼠或所述小鼠的祖先中，而在所述受破坏基因纯合的情况下显示炎症相关病症。
20.一种转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞包含完全或部分经骨髓基质抗原-2基因置换的Damp基因，其特征在于所述骨髓基质抗原-2基因在胚胎期时被引入所述小鼠或所述小鼠的祖先中。
21.一种减轻个体中炎症的方法，其包含向发炎部位投与包含骨髓基质抗原-2拮抗剂的组合物。
22.一种治疗具有与炎症相关的疾病的症状的个体的方法，其包含向所述有需要的个体投与包含骨髓基质抗原-2拮抗剂的组合物。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述组合物包含另一消炎化合物。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述疾病选自：动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、哮喘、脓毒症、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、白内障、多发性硬化症、急性心肌梗塞、心脏病发作、银屑病、接触性皮炎、骨关节炎、鼻炎、克罗恩氏病、自体免疫疾病、恶病质、急性胰腺炎、自体免疫血管炎、自体免疫和病毒性肝炎、延迟型超敏反应、充血、冠状动脉再狭窄、肾小球肾炎、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、与角膜移植相关的发炎性眼病、由外伤所致的脑损伤、癫痫症、出血、中风、镰刀形红细胞贫血症、II型糖尿病、肥胖症、年龄相关黄斑变性、湿疹、皮炎、学习/认知障碍、神经退化性疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、溃疡性结肠炎、辐射诱发的损伤、灼烧或电诱发的损伤、引起组织死亡和免疫细胞浸润的中毒、药物诱发的损伤、吸入诱发的损伤、辐射、抽吸诱发的肺损伤、由化学治疗或放射性治疗引起的炎症、自体免疫疾病、狼疮、舍格伦病、包括多发性硬化症的脱髓鞘疾病、包括多发性肌炎的发炎性肌病、硬皮病、结节性多动脉炎、肉状瘤病、局部和全身骨化性肌炎、包括阿尔茨海默病的淀粉样相关疾病、椎间盘突出、脊髓和神经损伤、雷意氏综合征、细菌性和病毒性脑炎和脑膜炎、朊病毒相关疾病、古立安-白瑞综合征、狂犬病、脊髓灰质炎、大脑出血、颅内出血相关损伤、慢性疲劳综合征、血栓静脉炎、痛风、肉芽肿病、包括肾小球肾炎和间质性肾炎的肾炎、昆虫刺过敏、过敏性反应、再生障碍性贫血、骨髓衰竭、多发性器官衰竭、甲状腺炎、胰岛炎、肝硬化(慢性和急性肝炎)、肺栓塞、毒素和药物诱发的肝病、胰腺炎、缺血性肠病、急性呼吸窘迫综合征和心包炎。
25.一种检定有效抑制骨髓基质抗原-2介导的细胞-细胞结合的化合物的方法，其包含测定与骨髓基质抗原-2结合的化合物。
26.一种制造骨髓基质抗原-2诱饵的方法，其包含在宿主细胞中重组表达所述骨髓基质抗原-2诱饵。
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