CN101511997A - 用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于生产具有生物学活性的多肽的方法,包括:(a)在有益于生产所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞包含可操作相连接的编码所述多肽的第一多核苷酸与编码变体信号肽或变体前原肽的第二多核苷酸;和(b)自所述培养液分离所述具有生物学活性的分泌型多肽。
Description
发明领域
本发明涉及用于产生分泌型多肽(secreted polypeptide)的方法。本发明还涉及变体信号肽(variant signal peptide)或变体前原肽(variant prepropeptide),及包含与编码多肽的多核苷酸可操作相连接的所述变体信号肽或变体前原肽编码序列的核酸构建体、载体和宿主细胞。
相关技术的描述
信号肽是以符合读码框的方式(in frame)连接至具有生物学活性的多肽的氨基末端并指导所编码的多肽进入细胞的分泌途径的氨基酸序列。前原肽指位于多肽的氨基末端的氨基酸序列,其中所得多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide),或者在有些情况中称为酶原(zymogen)。多肽原一般是没有活性的,而且可以通过催化性地或自身催化性地自多肽原切割掉前肽(propeptide)而转变成成熟的、有活性的多肽。若多肽的氨基末端存在有信号肽和前肽两个区,则前肽区以符合读码框的方式连接至多肽的氨基末端,而信号肽区以符合读码框的方式连接至前肽区的氨基末端。
特定宿主细胞中感兴趣的重组多肽的分泌可能要求将其天然信号肽替换成与所选择的宿主细胞相容的新信号肽。另外,多肽的前肽序列可能还需要用不同前肽序列替换或缺失,因为前肽序列没有得到宿主细胞的加工或者得到宿主细胞的不正确加工,而前肽序列需要得到宿主细胞的正确加工才能分泌活性多肽。在其它情况中,可以不存在信号肽和/或前肽。
通过突变来修饰与多肽天然相关的天然信号肽或天然前原肽从而改善感兴趣多肽的分泌可以是有可能的。
Belin等,2004,Journal of Molecular Biology 335:437-453描述了改善纤溶酶原激活物抑制物2(PAI-2)信号序列的功能活性的突变。Tsuchiya等,2003,Nucleic Acids Research Supplement No.3,pp.262-262描述了用于在酵母中有效分泌人溶菌酶的信号序列的突变。Nothwehr和Gordon,1990,The Journal ofBiological Chemistry 265:17202-17208描述了人前(Δ原)载脂蛋白A-II信号肽氨基末端区中影响信号肽酶对其切割的位点的结构特征。Ngsee和Smith,1990,Gene 86:251-255描述了酵母中的有效分泌所需的牛促乳素(bovineprolactin)信号肽中的变化。
美国专利No.5,766,912披露了来自细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)的全长野生型脂肪酶的克隆过程和序列,所述脂肪酶包含前原肽序列。美国专利No.5,869,438披露了来自细毛嗜热霉的全长野生型脂肪酶的变体。
本领域需要改进的信号肽和前肽序列用于各种宿主细胞中活性多肽的分泌。
本发明的一个目的是提供使用变体信号肽或变体前原肽在真菌宿主细胞中产生多肽的改进的方法。
发明概述
本发明涉及用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法,其包括:
(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞包含编码所述多肽的第一多核苷酸,所述第一多核苷酸与编码选自下组的变体信号肽或变体前原肽的第二多核苷酸可操作连接:
(i)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的亲本信号肽变体,其中所述变体信号肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;
(ii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置包含缺失的亲本前原肽变体,其中所述变体肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;
(iii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的亲本前原肽变体,其中所述变体前原肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;和
(iv)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失的亲本前原肽变体;并
(b)自所述培养基分离所述具有生物学活性的分泌型多肽。
本发明还涉及编码变体信号肽和变体前原肽的分离的多核苷酸,及包含与编码多肽的多核苷酸可操作相连接的编码所述变体信号肽和所述变体前原肽的多核苷酸的构建体、载体和真菌宿主细胞。
附图简述
图1显示了pBM128a的限制性图谱。
图2显示了pMB1537的限制性图谱。
图3显示了pBM126a的限制性图谱。
图4显示了pMB1539的限制性图谱。
图5显示了pJLin168的限制性图谱。
图6显示了pBM142c的限制性图谱。
图7显示了pBM143b的限制性图谱。
图8显示了pJLin168转化体的平均相对脂肪酶活性。
图9显示了pBM143b转化体的平均相对脂肪酶活性。
图10显示了pMB1682的限制性图谱。
图11显示了pJLin195的限制性图谱。
图12显示了pBM143b和pJLin195转化体的平均相对脂肪酶活性。
图13显示了摇瓶中的pBM143b转化体的平均相对脂肪酶活性。
图14显示了pJLin187的限制性图谱。
图15显示了pBM121b的限制性图谱。
图16显示了pBM120a的限制性图谱。
图17显示了pJMS7的限制性图谱。
图18显示了pJMS6的限制性图谱。
图19显示了pJMS6和pJMS7转化体第3天培养液的相对脂肪酶活性。
图20显示了pJMS6、pJMS7和质粒TB5转化体第3天培养液的相对脂肪酶活性。
图21显示了pJMS6和质粒TB6转化体第4天培养液的相对脂肪酶活性。
定义
全长多肽:术语“全长多肽”在本申请中定义为具有生物学活性的多肽的前体形式,其中所述前体包含信号肽,或者还包含前肽,其中在从细胞分泌时,所述信号肽被切割掉,或者所述前肽也被切割掉,从而产生具有生物学活性的多肽。
信号肽:术语“信号肽”在本申请中定义为以符合读码框的方式连接(融合)至具有生物学活性的多肽的氨基末端且指导所述多肽进入细胞的分泌途径的肽。前肽可以存在于信号肽与多肽氨基末端之间(见下文前原肽定义)。
前肽:术语“前肽”指以符合读码框的方式连接(融合)至多肽的氨基末端的氨基酸序列,其中所得多肽称为酶原或多肽原(或在有些情况中称为酶原(zymogen))。多肽原一般是没有活性的,而且可以通过催化性地或自身催化性地从多肽原切割掉前肽而转变成成熟的、有活性的多肽。
前原肽:术语“前原肽”在本申请中定义为存在于多肽的氨基末端的信号肽和前肽,其中前肽以符合读码框的方式连接(或融合)至多肽的氨基末端,而信号肽区以符合读码框的方式连接(或融合)至前肽区的氨基末端。
信号肽编码序列:术语“信号肽编码序列”在本申请中定义为编码信号肽的多核苷酸。
前肽编码序列:术语“前肽编码序列”在本申请中定义为包含前肽的多核苷酸。
前原肽编码序列:术语“前原肽编码序列”在本申请中定义为编码前原肽的多核苷酸。
野生型信号肽:术语“野生型信号肽”指由天然存在的微生物(如在自然界中找到的酵母或丝状真菌)所表达的信号肽。
亲本信号肽:术语“亲本信号肽”在用于本申请时指将要进行修饰(例如一处或多处取代、一处或多处***、一处或多处缺失和/或一处或多处截短)以生成本发明的信号肽变体的信号肽。该术语还指变体与之进行比较和比对的信号肽。亲本可以是天然存在(野生型)信号肽,或者它甚至可以是其通过任何合适手段制备的变体。例如,亲本信号肽可以是天然存在信号肽的变体,其在氨基酸序列中得到了修饰或改变。亲本信号肽也可以是等位变体,即由占据相同染色体基因座的多核苷酸序列的两种或更多可变形式之任一所编码的信号肽。
野生型前原肽:术语“野生型前原肽”指由天然存在的微生物(如在自然界中找到的酵母或丝状真菌)所表达的前原肽。
亲本前原肽:术语“亲本前原肽”在用于本申请时指将要进行修饰(例如一处或多处取代、一处或多处***、一处或多处缺失和/或一处或多处截短)以产生本发明的前原肽变体的前原肽。该术语还指变体与之进行比较和比对的前原肽。亲本可以是天然存在的(野生型)前原肽,或者它甚至可以是其通过任何合适手段制备的变体。例如,亲本前原肽可以是天然存在的前原肽的变体,其在氨基酸序列中得到了修饰或改变。亲本前原肽也可以是等位变体,即由占据相同染色体基因座的多核苷酸序列的两种或更多可变形式之任一所编码的前原肽。
变体:术语“变体”在本申请中定义为包含一处或多处(几处、数处)改变(如在肽或多肽的一个或多个(几个、数个)特定位置处包含一个或多个(几个、数个)特定氨基酸残基的取代、***、缺失和/或截短)的肽或多肽。
变体信号肽:术语“变体信号肽”在本申请中定义为亲本信号肽的如下信号肽,其中变体信号肽包含一处或多处(几处、数处)改变,如在信号肽的一个或多个(几个、数个)特定位置处包含一个或多个(几个、数个)特定氨基酸残基的取代、***、缺失和/或截短。
变体前原肽:术语“变体前原肽”在本申请中定义为亲本前原肽的如下前原肽,其中变体前原肽包含一处或多处(几处、数处)改变,如在前原肽的一个或多个(几个、数个)特定位置处包含一个或多个(几个、数个)特定氨基酸残基的取代、***、缺失和/或截短。
可操作连接:术语“可操作连接”在本申请中指其中控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置使得控制序列指导多肽编码序列的表达的构造(configuration)。
表达:术语“表达”包括多肽产生中所涉及的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
编码序列:术语“编码序列”在本申请中定义为当置于适当控制序列的控制下时转录成mRNA(该mRNA又翻译成多肽)的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由位于mRNA5′端开放阅读框开始处的起始密码子和位于mRNA开放阅读框3′端的终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA、cDNA、半合成的、合成的和重组的核苷酸序列。
多肽编码序列的5′端可以包含以符合翻译读码框的方式与编码序列中编码多肽的区段天然连接的天然信号肽编码区或天然前原肽编码区。或者,多肽编码序列的5′端可以缺乏天然信号肽编码区或天然前原肽编码区。
成熟多肽:术语“成熟多肽”在本申请中定义为在翻译和任何翻译后修饰(如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后以其最终形式具有生物学活性的多肽。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”在本申请中定义为编码具有生物学活性的成熟多肽的多核苷酸序列。
发明详述
本发明涉及用于产生具有生物学活性的多肽的方法,其包括:(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞包含编码所述多肽的第一多核苷酸,所述第一多核苷酸与编码选自下组的变体信号肽或变体前原肽的第二多核苷酸可操作连接:(i)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的亲本信号肽变体,其中所述变体信号肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;(ii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失的亲本前原肽变体,其中所述变体前原肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;(iii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的亲本前原肽变体,其中所述变体前原肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;和(iv)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失的亲本前原肽变体;和(b)从所述培养基分离所述具有生物学活性的分泌型多肽。
在本发明的产生方法中,使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养所述真菌宿主细胞。例如,可以通过在合适培养基中和在允许所述多肽表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养或者小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料分批的或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的规程在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
可以使用本领域已知的、对于所述多肽是特异性的方法来检测具有生物学活性的多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如,若所述多肽是酶,则可以使用酶测定法(enzyme assay)来测定所述酶的活性。用于测定酶活性的规程,对于许多酶是本领域已知的(参见例如D.Schomburg和M.Salzmann(编),Enzyme Handbook,Springer-Verlag,NewYork,1990)。
在本发明的方法中,在同样的产生条件下培养时,真菌细胞优选相对于包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作连接的天然信号肽编码序列或天然前原肽编码序列的真菌细胞产生多至少约25%、更优选多至少约50%、更优选多至少约75%、更优选多至少约100%、甚至更优选多至少约200%、最优选多至少约300%和甚至最优选多至少约400%的多肽。
所得分泌的且活化的多肽可以通过本领域已知的方法从培养基直接回收。例如,所述多肽可以通过常规方法从营养培养基回收,所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
具有生物学活性的多肽可以通过本领域已知的多种方法来纯化,所述方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备性等电聚焦)、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,编者,VCHPublishers,New York,1989)。
变体的设计规则
在本发明中,信号肽变体和前原肽变体中采用了氨基酸残基位置的特定编号方式。例如,通过比对已知的信号肽或前原肽序列的氨基酸序列,有可能给任何信号肽或前原肽序列中的任何氨基酸残基指定氨基酸位置编号。
例如,使用源自SEQ ID NO:2中披露的脂肪酶氨基酸序列的编号***,并与许多其它脂肪酶或其它酶的氨基酸序列比对,有可能指出信号肽或前原肽区中具有结构同源性的区域中氨基酸残基的位置。
蛋白质序列的多重比对可以使用例如“ClustalW”(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.,1994,CLUSTAL W:Improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting,positions-specific gap penalties and weight matrix choice,Nucleic AcidsResearch 22:4673-4680)来进行。DNA序列的多重比对可以使用蛋白质比对为模板来进行,即用来自DNA序列的相应密码子替换氨基酸。
常用的成对序列比较算法足以检测分歧不超过约20-30%序列同一性这点的蛋白质序列之间的相似性(Doolittle,1992,Protein Sci.1:191-200;Brenner等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6073-6078)。然而,具有相同折叠模式(fold)和相似的生物学功能的真正的同源蛋白分歧常常达到这样的点,即传统的基于序列的比较未能检测出它们的相关性(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)。基于序列的搜索中更大的灵敏度可以使用利用蛋白质家族的概率表现(probabilistic representation)(序型(profile))来搜索数据库的搜索程序来获得。例如,PSI-BLAST程序通过叠代(iterative)数据库搜索方法来生成序型,而且能够检测关系疏远的同源物(remote homolog)(Atschul等,1997,Mucleic Acids Res.25:3389-3402)。若感兴趣蛋白质的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表,则可以实现甚至更大的灵敏度。如GenTHREADER(Jones 1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)的程序利用来自多个来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对序型和溶剂化势(solvationpotential))作为预测查询序列之结构折叠模式的神经网络的输入。类似的,可以使用Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法将结构未知的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型进行比对。这些比对又可用于产生感兴趣蛋白质的同源性模型,而且可以使用就该目的而开发的多种工具来评估此类模型的精确性。
对于结构已知的蛋白质,数个工具和来源可用于获取和生成结构比对。例如,对蛋白质的SCOP超家族进行了结构比对,而且那些比对是可获得的和可下载的。这些比对可用于预测同一结构超家族内的蛋白质中结构上和功能上对应的氨基酸残基。该信息,与由同源性建模和序型搜索得到的信息一起,可用于预测当感兴趣突变自一种蛋白质移至接近的或疏远的同源物时突变哪些残基。
在描述本发明的各种信号肽变体或前原肽变体时,使下文所述命名法适应于方便提及。在所有情况中,采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代,使用如下命名法:初始的氨基酸,位置,取代后的氨基酸。因而,第2位精氨酸取代成赖氨酸表述成“Arg2Lys”或“R2K”。
缺失。对于氨基酸缺失,使用如下命名法:初始氨基酸,位置*。因而,缺失第18位丝氨酸表述成“Ser18*”或“S18*”。
***。对于氨基酸***,使用如下命名法:初始氨基酸,位置,初始氨基酸,新***的氨基酸。因而,在第17位谷氨酸后***赖氨酸表述成“Gly17GlyLys”或“G17GK”。
亲本信号肽和前原肽
在本发明中,亲本信号肽或前原肽可以是分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22具有至少70%同一性的任何信号肽或前原肽;其由包含如下多核苷酸或由如下多核苷酸组成的多核苷酸编码,所述多核苷酸包含分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或它们的互补链具有至少70%同一性的核苷酸序列;或由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成的多核苷酸编码,所述核苷酸序列在严格条件下分别与SEQ IDNO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或它们的互补链发生杂交。
在第一个方面,亲本信号肽或前原肽分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22具有至少约70%、优选至少约75%、更优选至少约80%、更优选至少约85%、甚至更优选至少约90%、最优选至少约95%和甚至最优选至少约96%、97%、98%、或99%同一性程度,其具有指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力(下文“同源肽”)。
在另一个优选的方面,同源亲本信号肽、前肽、或前原肽具有分别与SEQID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22差别为5个氨基酸、优选4个氨基酸、更优选3个氨基酸、甚至更优选2个氨基酸和最优选1个氨基酸的氨基酸序列。就本发明而言,两条氨基酸序列之间的同一性程度通过Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS 5:151-153)来测定,其中使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下多重比对参数:缺口罚分为10,缺口长度罚分为10。配对比对参数为Ktuple(K元组)=1,缺口罚分=3,窗=5,对角线=5。
在另一个优选的方面,亲本信号肽或前原肽分别包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22或它们的片段,其具有指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力。在一个更优选的方面,亲本信号肽或前原肽分别包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22。在另一个优选的方面,亲本信号肽或前原肽分别由SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22或它们的片段组成,其具有指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力。在另一个更优选的方面,亲本信号肽或前原肽分别由SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22组成。
本发明还涵盖包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成的多核苷酸,所述核苷酸序列编码分别具有SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22之氨基酸序列的亲本信号肽或前原肽,由于遗传密码子的简并性,它们分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66有差别。本发明还涉及SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66的子序列,所述子序列分别编码SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22的片段,其具有指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力。
SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66的子序列指由SEQID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66所涵盖的核酸序列,只是一个或多个(几个、数个)核苷酸已经自5′和/或3′端缺失。SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22的片段是自该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个、数个)氨基酸的肽。
在第二个方面,亲本信号肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码,所述核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66具有至少约70%、优选至少约75%、更优选至少约80%、更优选至少约85%、甚至更优选至少约90%、最优选至少约95%和甚至最优选至少约96%、97%、98%、或99%的同一性程度;或SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQID NO:1核苷酸1-66的等位变体和子序列,所述等位变体和子序列编码信号肽或前原肽的片段,其具有指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力。就本发明而言,两条核酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983,Proceedings of the NationalAcademy of Science USA 80:726-730)来测定,其中使用LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下多重比对参数:缺口罚分为10,缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组=1,缺口罚分=3,窗=20。
在第三个方面,亲本信号肽或前原肽由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成的多核苷酸编码,所述核苷酸序列在严格条件下分别与SEQ IDNO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或它们的互补链发生杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
SEQ ID NO:1核苷酸1-66或其子序列、以及SEQ ID NO:2氨基酸1-22或其片段可用于设计核酸探针,用以依照本领域众所周知的方法自不同属或种的菌株鉴定和克隆编码信号肽、前肽、或前原肽的DNA。具体而言,遵循标准的Southern印迹方法,此类探针可用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交,以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可明显短于完整序列,但长度上应为至少15、优选至少30和更优选至少45个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。通常将探针标记以检测相应的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。此类探针涵盖在本发明中。
如此,可以对自此类其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与上文所述探针发生杂交且编码信号肽或前原肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术分离来自此类其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝酸纤维素或其它合适的载体材料并固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ IDNO:1核苷酸1-66或其子序列同源的克隆或DNA,将所述载体材料用在Sounthern印迹中。就本发明而言,杂交表示核酸序列在本申请中所定义的严格条件下与经过标记的核酸探针发生杂交,所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或它们的互补链或其子序列。可使用例如X射线胶片来检测在这些条件下核酸探针与之发生杂交的分子。
在一个优选的方面,核酸探针是包含如下核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22之信号肽或前原肽或其子序列。在另一个优选的方面,核酸探针是SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66。
对于长度为约15个核苷酸至约60个核苷酸的短探针,严格条件定义为遵循标准的Southern印迹方法在比使用依照Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)的算法计算得出的Tm低5℃到10℃的温度在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1X Denhar dt氏溶液,1mM焦磷酸钠,1mM磷酸二氢钠,0.1mMATP,和0.2mg/ml酵母RNA中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤,最佳的是12-24小时。
对于长度为约15个核苷酸至约60个核苷酸的短探针,将载体材料在比计算的Tm低5℃到10℃的温度在6X SCC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟和使用6X SSC洗涤两次各15分钟。
变体信号肽或前原肽
亲本信号肽的或亲本前原肽的变体可以依照本领域众所周知的定点诱变方法来制备。定点诱变是一种在编码亲本信号肽或亲本前原肽的多核苷酸分子中的指定位点处创建一个或多个突变的技术。该技术可以在体外或在体内实施。
定点诱变可以在体外通过涉及使用包含期望突变的寡核苷酸引物的PCR来实现。定点诱变还可以在体外通过涉及限制酶对质粒中的位点处的切割及随后在该多核苷酸中连接含有突变的寡核苷酸的盒式诱变来实施,所述质粒包含编码亲本信号肽或亲本前原肽的多核苷酸。通常,消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的,从而容许质粒和***物的粘末端彼此相连接。参见例如Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955;及Barton等,1990,Nucleic Acids Research 18:7349-4966。
定点诱变可以在体外通过本领域已知的方法来实现。参见例如美国专利申请公开文本2004/0171154;Storici等,2001,Nature Biotechnology 19:773-776;Kren等,1998,Nat.Med.4:285-290;及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。
任何定点诱变方法都可用于本发明。有许多商品化试剂盒可用于制备亲本信号肽的或亲本前原肽的变体。
在本发明中,亲本信号肽的或亲本前原肽的变体在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸18-22的第18、19、20、21和/或22位对应的位置处包含一个或多个(几个、数个)缺失,其中所述变体信号肽或变体前原肽在以符合读码框的方式可操作连接(融合)至多肽时指导多肽进入细胞的分泌途径。在一个优选的方面,变体信号肽或变体前原肽包含分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ ID NO:2氨基酸1-22具有至少70%、优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%和甚至最优选至少96%、97%、98%或99%的同一性程度的氨基酸序列。就本发明而言,两条氨基酸序列之间的同一性程度通过Clustal方法(Higgins,1989,CABIOS 5:151-153)来测定,其中使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)及同一性表和如下多重比对参数:缺口罚分为10,缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组=1,缺口罚分=3,窗=5,对角线=5。
在一个优选的方面,本发明变体中氨基酸取代的数目优选包含1个取代。在另一个优选的方面,本发明变体中氨基酸缺失的数目优选包含1个、更优选2个、甚至更优选3个、最优选4个和甚至最优选5个缺失。在另一个优选的方面,本发明变体中氨基酸取代的数目优选包含1个取代,且本发明变体中氨基酸缺失的数目优选包含1个、更优选2个、甚至更优选3个、最优选4个和甚至最优选5个缺失。
在一个优选的方面,变体信号肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代。
在一个更优选的方面,变体信号肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val进行的取代。
在一个甚至更优选的方面,变体信号肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含Lys作为取代。
在一个最优选的方面,变体信号肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含R2K取代。
在一个甚至最优选的方面,变体信号肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17的R2K取代形式或由其组成。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的缺失。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含多个缺失。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的多个缺失。
在另一个更优选的方面,变体前原肽在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个(几个、数个)缺失。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失。
在另一个最优选的方面,变体前原肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*中一个或多个(几个、数个)缺失。
在另一个甚至最优选的方面,变体前原肽包含SEQ ID NO:2的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失形式或由其组成。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代。
在另一个更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val进行的取代。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代。
在另一个最优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代。
在另一个甚至最优选的方面,变体前原肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代形式或由其组成。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失。
在另一个更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val进行的取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含缺失。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val进行的取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个(几个、数个)缺失。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失。
在另一个甚至更优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失。
在另一个最优选的方面,变体前原肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代形式且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*中的一个或多个(几个、数个)缺失,或由其组成。
在另一个甚至最优选的方面,变体前原肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代形式且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失,或由其组成。
在另一个甚至最优选的方面,变体信号肽是SEQ ID NO:4。在另一个甚至最优选的方面,变体信号肽编码序列是SEQ ID NO:3。在另一个甚至最优选的方面,变体前原肽是SEQ ID NO:6。在另一个甚至最优选的方面,变体前原肽编码序列是SEQ ID NO:5。
本发明的变体可进一步包含氨基酸序列的一个或多个(几个、数个)额外的取代、缺失和/或***。
多核苷酸
本发明还涉及分别编码亲本信号肽和亲本前原肽的变体信号肽和变体前原肽的分离的多核苷酸,其中所述变体信号肽和所述变体前原肽在与SEQID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代和/或在与SEQ ID NO:2氨基酸18-22的第18、19、20、21和/或22位对应的位置处包含一个或多个(几个、数个)缺失,其中所述变体信号肽或变体前原肽当以符合读码框的方式可操作连接(融合)至多肽时指导该多肽进入细胞的分泌途径。
亲本信号肽或前原肽可以是分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ IDNO:2氨基酸1-22具有至少70%同一性的任何信号肽或前原肽;由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成的多核苷酸编码的任何信号肽或前原肽,所述核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或它们的互补链具有至少70%同一性;或者由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列组成的多核苷酸编码的任何信号肽或前原肽,所述核苷酸序列在严格条件下分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或它们的互补链发生杂交,如本文所述。
在一个优选的方面,分离的多核苷酸编码包含如下氨基酸序列的变体信号肽或变体前原肽,所述氨基酸序列分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQID NO:2氨基酸1-22具有至少70%、优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%和甚至最优选至少96%、97%、98%、或99%的同一性程度。
在一个优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的变体信号肽。
在一个更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代的变体信号肽。
在一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含Lys作为取代的变体信号肽。
在一个最优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含R2K取代的变体信号肽。
在一个甚至最优选的方面,分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17的R2K取代形式或由其组成的变体信号肽。
在另一个优选的方面,变体前原肽在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失。
在另一个优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的变体前原肽。
在另一个优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含多个缺失的变体前原肽。
在另一个优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的多个缺失的变体前原肽。
在另一个更优选的方面,分离的多核苷酸编码在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个(几个、数个)缺失的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失的变体前原肽。
在另一个最优选的方面,分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*中的一个或多个(几个、数个)缺失的变体前原肽。
在另一个甚至最优选的方面,分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失形式或由其组成的变体前原肽。
在另一个优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的变体前原肽。
在另一个更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代的变体前原肽。
在另一个最优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代的变体前原肽。
在另一个甚至最优选的方面,分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代或由其组成的变体前原肽。
在另一个优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含缺失的变体前原肽。
在另一个更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含多个缺失的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val的多个缺失的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个(几个、数个)缺失的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含S18*、P19*、I20*、R21*和R22*的一个或多个(几个、数个)缺失的变体前原肽。
在另一个甚至更优选的方面,分离的多核苷酸编码在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失的变体前原肽。
在另一个最优选的方面,分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*中的一个或多个(几个、数个)缺失,或由其组成的变体前原肽。
在另一个甚至最优选的方面,分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失,或由其组成的变体前原肽。
在另一个甚至最优选的方面,分离的多核苷酸编码SEQ ID NO:4之变体信号肽。在另一个甚至最优选的方面,编码SEQ ID NO:4之变体信号肽的分离的多核苷酸是SEQ ID NO:3。在另一个甚至最优选的方面,分离的多核苷酸编码SEQ ID NO:6之变体前原肽。在另一个甚至最优选的方面,编码SEQID NO:6之变体前原肽的分离的多核苷酸是SEQ ID NO:5。
术语“分离的多核苷酸”在用于本申请时指基本上不含其它多核苷酸的多核苷酸,例如根据琼脂糖电泳的测定为至少20%纯、优选至少40%纯、更优选至少60%纯、甚至更优选至少80%纯和最优选至少90%纯的。
本发明还涉及用于获得编码变体信号肽或变体前原肽的多核苷酸的方法,其包括:(a)将与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处的取代和/或与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和/或22位对应的一个或多个(几个、数个)位置处的缺失导入亲本信号肽编码序列或亲本前原肽编码序列,其中所述变体信号肽或变体前原肽当以符合读码框的方式可操作连接至具有生物学活性的多肽时指导该多肽进入细胞的分泌途径;和(b)回收所述多核苷酸。
多肽
多肽对于感兴趣真菌宿主细胞而言可以是天然的或异源的(外来的)。术语“异源多肽”在本申请中定义为对于宿主细胞而言不是天然的多肽;或者为了改变天然多肽已经进行了结构修饰的天然多肽。
多肽可以是具有感兴趣生物学活性的任何多肽。术语“多肽”在本申请中并非意指特定长度的编码产物,因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”还涵盖杂合多肽,其包含自至少两种不同多肽得到的部分的或完整的多肽序列的组合,其中一种或多种(几种、数种)对于真菌细胞而言可以是异源的。多肽进一步包括多肽的天然存在的等位及工程改造的变异形式。
在一个优选的方面,多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂(immunodilator)、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。
在一个更优选的方面,多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。在一个最优选的方面,多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶水解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
在另一个优选的方面,多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白(tropoelastin)、弹性蛋白、或明胶。
在一个优选的方面,多肽是脂肪酶。在一个更优选的方面,多肽是自嗜热霉属(Thermomyces)得到的脂肪酶。在一个甚至更优选的方面,多肽是自细毛嗜热霉得到的野生型脂肪酶。在一个最优选的方面,多肽是包含SEQ IDNO:8之成熟多肽或由其组成的野生型细毛嗜热霉脂肪酶。在一个甚至最优选的方面,SEQ ID NO:8之成熟多肽由SEQ ID NO:7之成熟多肽编码序列编码。在另一个甚至更优选的方面,多肽是自细毛嗜热霉脂肪酶得到的变体脂肪酶。在另一个最优选的方面,多肽是包含SEQ ID NO:10之成熟多肽或由其组成的细毛嗜热霉变体脂肪酶。在另一个甚至最优选的方面,SEQ ID NO:10之成熟多肽由SEQ ID NO:9之成熟多肽编码序列编码。
在一个优选的方面,成熟多肽是SEQ ID NO:8氨基酸23-291。在另一个优选的方面,成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7核苷酸67-918。在另一个优选的方面,成熟多肽是SEQ ID NO:10氨基酸23-291。在另一个优选的方面,成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:9核苷酸67-873。
编码多肽的多核苷酸可以自任何原核的、真核的或其它的来源获得。就本发明而言,术语“自...得到的”或“得自”在本申请中与给定来源一起使用时应意味着该多肽是由所述来源或由其中已经***了来自所述来源的基因的细胞产生的。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的,包括自基因组DNA分离、自cDNA制备、或其组合。自此类基因组DNA克隆核酸序列可以通过例如使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)来实现。参见例如Innis等,1990,PCR Protocols:AGuide to Methods andA pplication,Academic Press,New York。克隆步骤可以涉及切除和分离包含编码多肽的核酸序列的期望核酸片段,将该片段***载体分子,并将该重组载体掺入突变体真菌细胞,其中将会复制多个拷贝或克隆的所述核酸序列。所述核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的,或其任意组合。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体,所述多核苷酸可操作连接至本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列及一个或多个控制序列,所述控制序列指导编码序列在合适宿主细胞中在与控制序列相容的条件下表达。表达应理解为包括产生多肽所涉及的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸构建体”在本申请中定义为自天然存在基因分离的或经修饰而包含以本不存在于自然界中的方式组合和并置的核酸区段的单链或双链核苷酸分子。当核酸构建体包含编码序列和编码序列表达所需要的所有控制序列时,术语核酸构建体与术语表达盒同义。
可以以多种方式进一步操作编码多肽的分离的多核苷酸,从而为多肽表达作准备。取决于表达载体,在将多核苷酸的核苷酸序列***载体前对其进行操作可能是理想的或必要的。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。
在本发明的方法中,多核苷酸可以包含一种或多种天然控制序列,或者可以将一种或多种天然控制序列用对所述多核苷酸而言是外来的一种或多种控制序列替换,从而改进编码序列在宿主细胞中的表达。
术语“控制序列”在本申请中定义为包括对于感兴趣多肽的表达而言是必需的或有益的所有构件(component)。每种控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列、和转录终止子。最低限度,控制序列包括本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列、及转录和翻译终止信号。为了导入特定限制性位点以促进控制序列与编码多肽的多核苷酸序列的编码区的连接,控制序列可以与接头一起提供。
控制序列可以是适当的启动子序列,其受到用于表达多核苷酸的宿主细胞的识别。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,而且可以从编码对于宿主细胞而言是同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子:米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体);和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中,有用的启动子从如下酶的基因获得:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子描述于Romanos等,1992,Yeast8:423-488。
控制序列可以是合适的转录终止子序列,其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列可操作连接至编码多肽的多核苷酸序列的3’端。可以将在所选择的宿主细胞中有功能的任何终止子用于本发明。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子描述于Romanos等,1992,见上文。
控制序列还可以是合适的前导序列,即对于宿主细胞进行的翻译而言是重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接至编码多肽的多核苷酸序列的5’端。可以将在所选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列用于本发明。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列,其可操作连接至多核苷酸序列的3’端,而且在转录时,被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选的宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列用于本发明。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology 15:5983-5990。
控制序列还可以是前肽编码区,其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原或多肽原(或在某些情况下为酶原)。多肽原一般是没有活性的,而且可以通过催化性地或自身催化性地自多肽原切割掉前肽而转变成成熟的、有活性的多肽。可以从如下酶的基因获得前肽编码区:酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、细毛嗜热霉脂肪酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)。
若多肽的氨基末端存在有信号肽和前肽两个区,则前肽区以符合读码框的方式连接至多肽的氨基末端,而信号肽区以符合读码框的方式连接至前肽区的氨基末端。
可能还期望添加调节序列,其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节***的例子是那些引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节性化合物的存在)而开启或关闭的***。在酵母中,可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中,可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中,这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因,和以重金属(with heavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中,包含编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸将与调节序列可操作相连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体,其包含本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列、编码感兴趣多肽的多核苷酸序列、及转录和翻译终止信号。上文所述各种核苷酸和控制序列可以结合在一起以产生重组表达载体,其可以包含一个或多个方便的限制性位点以允许在这些位点***或取代启动子和/或编码多肽的多核苷酸序列。或者,可以通过在用于表达的适当载体中***包含变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列和编码多肽的多核苷酸序列或核酸构建体来表达多核苷酸序列。在创建表达载体时,将编码序列置于载体中,使得编码序列与本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列和用于表达的一个或多个适当的控制序列可操作相连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒),其能方便地进行重组DNA步骤,而且能产生多核苷酸序列的表达。载体的选择将通常取决于载体与其中待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状的或闭合环状的质粒。
本发明的载体优选包含一个或几个选择标志,其允许简单选择经转化的细胞。选择标志是其产物提供杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等的基因。对于酵母宿主细胞合适的标志包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)),以及它们的等效物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
载体可以是自主复制载体,即作为染色体外实体(entity)存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)、或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自复制的手段(means)。或者,载体可以是一种当被导入宿主细胞时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单一的载体或质粒或者两个或更多个载体或质粒,其一起含有待导入宿主细胞基因组的总DNA(total DNA),或者可以使用转座子。
本发明的载体优选包含允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
为了整合入宿主细胞基因组,载体可以依赖编码多肽的多核苷酸序列或用于将载体通过同源或非同源重组稳定整合入基因组的任何其它载体元件。或者,载体可以包含额外的核苷酸序列,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞染色体中。所述额外的核苷酸序列使得载体能够在染色体中的精确位置处整合入宿主细胞基因组。为了增加在精确位置处整合的可能性,整合元件应优选包含足够数目的核酸,如100-10,000碱基对、优选400-10,000碱基对和最优选800-10,000碱基对,其与相应的靶序列具有高的同一性程度以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,整合元件可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面,可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点,其使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的、介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本申请中定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米(2micron)复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合和ARS4与CEN6的组合。复制起点可以是具有使其在宿主细胞中以温度敏感性方式发挥功能的突变的复制起点(参见例如Ehrlich,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1433)。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67;Cullen等,1987,Nucleic Acids Research 15:9163-9175;WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体可以依照WO 00/24883中披露的方法来进行。
可以将多于一个拷贝的编码多肽的多核苷酸***宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得:将至少一个额外拷贝的核苷酸序列整合入宿主细胞基因组,或将可扩增的选择标志基因包括在核苷酸序列内,其中可通过在适当选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择标志基因的扩增拷贝并由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上文所述元件以构建本发明的重组表达载体的规程是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及包含可操作连接至编码多肽的多核苷酸的本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列的重组宿主细胞,其有利地用于重组产生所述多肽。将包含可操作连接至编码多肽的多核苷酸的本发明的变体信号肽编码序列或变体前原肽编码序列的载体导入宿主细胞,使得该载体作为染色体成分或作为自复制的染色体外载体得到维持,正如上文所述。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代,其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞有所不同。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是任何可用于本发明方法的真菌细胞。“真菌”在用于本申请时包括以下门:子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义的)、以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上文,第171页中所引用)和所有有丝***孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。
在一个优选的方面,真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”在用于本申请时包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(B1astomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变,就本发明而言,酵母应定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.,编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在一个更优选的方面,酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。
在一个最优选的方面,酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面,酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面,酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
在一个甚至最优选的方面,酵母宿主细胞是酿酒酵母JG169(MAT-α,ura3-52,leu2-3,pep4-1137,his3Δ2,prb1::leu2,Δpre1::his3)(美国专利No.5,770,406)。
在另一个优选的方面,真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门(如Hawksworth等,1995,见上文所定义的)的所有丝状形式。丝状真菌的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养性生长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母如酿酒酵母的营养性生长通过单细胞菌体的出芽(budding)进行,而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个更优选的方面,丝状真菌宿主细胞是如下属的菌种的细胞:包括但不限于枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)。
在一个甚至更优选的方面,丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foeridus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticularum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身已知的方式来转化真菌细胞。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法描述于EP238 023及Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470-1474。用于转化里氏木霉宿主细胞的合适方法描述于Penttila等,1987,Gene 61:155-164及Gruber等,1990,Curr Genet.18(1):71-6。用于转化镰孢属菌种的合适方法描述于Malardier等,1989,Gene 78:147-156及WO96/00787。可以使用由如下文献记载的方法来转化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.,编,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology,卷194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York;Ito等,1983,Journal of Bacteriology 153:163;及Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920。
通过下文实施例来进一步描述本发明,所述实施例不应解释为限制本发明的范围。
实施例
作为缓冲液和底物使用的化学药品是至少试剂等级的商业产品。
DNA测序
使用Applied Biosystems 3130X型遗传分析仪(Model 3130X GeneticAnalyzer)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行DNA测序,其使用染料终止物化学(Giesecke等,1992,Journal of Virol.Methods 38:47-60)。使用phred/phrap/consed(University of Washington,Seattle,WA,USA)及序列特异性引物来装配序列。
菌株
本文实施例中使用酿酒酵母JG169(MAT-α,ura3-52,leu2-3,pep4-1137,his3Δ2,prb1::leu2,Δpre1::his3)(美国专利No.5,770,406)和米曲霉BECh2(Δalp,Δamy,CPA-,KA-,Δnp1)(WO 00/39322)作为宿主菌株。
培养基和溶液
YPD培养基每升由10g酵母提取物、20g Bacto蛋白胨和2%葡萄糖构成。
CUP减ura培养基(CUP minus ura medium)(pH7.0)(“初始培养基”)每升由1ml100mM CuSO4·5H2O,1.7g不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱(yeastnitrogen base,YNB)(BIO101,Carlsbad,CA,USA),0.8g含40mg腺嘌呤的CSM-ura(BIO101,Carlsbad,CA,USA),5g酪蛋白氨基酸(Becton,Dickensonand Company,Sparks,MD,USA),100ml50%葡萄糖,50ml0.5M K2HPO4,和1ml 100mg/ml氨苄青霉素构成。
酵母ura减选择培养基(Yeast ura minus selection medium)每升由6.7g含硫酸铵的酵母氮碱(YNB),5g酪蛋白氨基酸,100ml0.5M琥珀酸pH5,40ml 50%葡萄糖,和2ml 10mg/ml氯霉素构成。
酵母ura减选择板由酵母ura减选择培养基每升补加20g Noble琼脂构成。
MY25培养基每升由25g麦芽糊精,2g MgSO4·7H2O,10g KH2PO4,2g柠檬酸,2g K2SO4,2g脲,10g酵母提取物,和1.5ml AMG痕量金属溶液构成,调至pH6。
AMG痕量金属溶液每升由14.3g ZnSO4·7H2O,2.5g CuSO4·5H2O,0.5gNiCl2·6H2O,13.8g FeSO4·7H2O,8.5g MnSO4·H2O,和3g柠檬酸构成。
SC ura减培养基每升由7.5g不含氨基酸的酵母氮碱(Fluka,Buchs,Switzerland),11.3g琥珀酸,6.8g氢氧化钠,5.6g酪蛋白氨基酸,和0.1g L-色氨酸构成,并且在高压灭菌后添加100ml 50%果糖无菌溶液和400μl 250mg/ml氨苄青霉素无菌溶液。
SC ura减板由SC ura减培养基(只是使用100ml无菌20%果糖)和20g琼脂(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)构成。
SDMUA培养基每升由1.7g不含氨基酸的酵母氮碱,5.0g酪蛋白氨基酸,0.8g含40mg/l ADE的CMS-Ura(MP Biomedicals,Irvine,CA,USA),10ml的10mM CuSO4·5H2O,和10ml的1M K2HPO4构成,并且在高压灭菌后添加100ml无菌的50%果糖和400μl无菌的250mg/ml氨苄青霉素。
SOC培养基由2%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,10mM NaCl,2.5mM KCl,10mM MgCl2,和10mM MgSO4构成,通过高压灭菌来灭菌,然后添加经过滤除菌的葡萄糖至20mM。
2X YT板每升由16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5g NaCl,和15g细菌用琼脂(bacto agar)构成。
COVE板每升由342g蔗糖,10ml COVE盐溶液,10ml的1M乙酰胺,10ml 1.5M CsCl,和25g Noble琼脂构成。
COVE盐溶液每升由26g KCl,26g MgSO4,76g KH2PO4,和50ml COVE痕量金属溶液构成。
COVE痕量金属溶液每升由0.04g Na2B4O7·10H2O,0.4g CuSO4·5H2O,1.2gFeSO4·7H2O,0.7g MnSO4·H2O,0.8g Na2MoO2·H2O,和10g ZnSO4·7H2O构成。
VNO3RLMT琼脂每升由20ml 50X的含25mM NaNO3的Vogels,273.33g蔗糖,和15g低熔点琼脂糖构成。
50X的含25mM NaNO3的Vogels每升由125g二水合柠檬酸钠,250gKH2PO4,106.25g NaNO3,10g MgSO4·7H2O,5g CaCl2·2H2O,2.5ml生物素溶液,和5ml Vogels痕量元素溶液构成。
生物素溶液由100ml 50%乙醇中的5mg生物素构成。
Vogels痕量元素溶液由5g单水合柠檬酸,5g ZnSO4·7H2O,1gFe(NH4)2(SO4)2·6H2O,0.25g CuSO4·5H2O,0.05g MnSO4·H2O,0.05g H3BO3,和0.05g Na2MoO4·2H2O构成。
实施例1:铜诱导型启动子(CUP1启动子)的PCR扩增
设计了下文所示PCR引物997247和997248用于从质粒pCu426(Labbe和Thiele,1999,Methods in Enzymology 306:145-153)扩增酿酒酵母铜诱导型启动子(CUP1启动子)。引物设计中掺入了限制酶位点AgeI和EcoRI,用于克隆入酿酒酵母表达质粒pMB1537(见实施例2)。
引物997247:
5’-CACCGGTGCATGCCTGCAGGAGCTCCTAGTTAGAAA-3’(SEQ ID NO:11)
Age I
引物997248:
5’-AACTATTCTTGAATGGAATTCTAGTCGATGACTTCT-3’(SEQ ID NO:12)
Eco RI
使用高保真PCR***(Roche,Indianapolis,IN,USA)通过PCR扩增CUP启动子片段。PCR扩增反应混合物含有大约50ng pCu426质粒DNA,1μl引物997247(50pmol/μl),1μl引物997248(50pmol/μl),5μl含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA),1μl dNTP混合物(每种10mM),40.25μl水,和0.75μl(3.5U/μl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用 5333(Eppendorf,Westbury,NY,USA)来扩增片段,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒;15个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒(每个连续的循环递加5秒延伸);72℃ 7分钟的1个循环;及10℃维持。
使用TAE缓冲液(每升4.84gTris碱,1.14ml冰醋酸,和2ml 0.5M EDTApH8.0)通过1.5%琼脂糖凝胶电泳纯化246bp PCR产物,并使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)进一步纯化。使用(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)根据制造商的说明书连接246bp PCR产物。温育后,使用2μl混合物转化ONE TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)。将2μl体积的连接混合物添加至大肠杆菌细胞并在冰上温育5分钟。随后,将细胞在42℃热休克30秒,然后在冰上放置2分钟。将250μl体积的SOC培养基添加至细胞并将混合物在37℃和250rpm温育1小时。温育后,将菌落涂布在每升补充有100μg氨苄青霉素的2X YT板上并在37℃温育过夜,以进行质粒选择。用无菌牙签挑取在板上生长的8个菌落并在装有3ml每ml补充有100μg氨苄青霉素的LB培养基的15ml 管中在37℃,250rpm培养过夜。使用BioRobot 9600(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)分离质粒。
用Eco RI消化4μl体积的所得质粒微量制备物。通过琼脂糖凝胶电泳和UV分析来分析消化反应液,如先前关于PCR反应所述。使用1μl质粒模板,1.6ng M13引物(正向的或反向的)(MWG Biotech,High Point,NC,USA),和补至6μl的水,对包含***物的分离质粒进行测序。将具有正确序列的所得质粒命名为pBM128a(图1)。
实施例2:表达载体pMB1537的构建
表达载体pMB1537包含驱动编码细毛嗜热霉脂肪酶的野生型基因表达的酵母TPI启动子(SEQ ID NO:7是DNA序列,而SEQ ID NO:8是推导的氨基酸序列;美国专利No.5,869,438)、CYC1终止子和作为选择标志的URA3基因。使用长模板PCR***(Roche,Germany)PCR扩增酵母表达质粒pSTED226(WO 05/045018),其中使用pSTED226作为模板和如下两种引物。引物319137:5’-TCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTAG-3’(SEQ ID NO:13)引物19138:5’-GACGCCATGGTGAAGCTTTTCTTTTTAATCGT-3’(SEQ ID NO:14)
PCR扩增反应混合物含有大约50ng pSTED226质粒DNA,1μl引物319137(50pmol/μl),1μl引物19138(50pmol/μl),5μl含15mM MgCl2的10XPCR缓冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA),1μl dNTP混合物(每种10mM),40.25μl水,和0.75μl(3.5U/μl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTC Peltier热循环仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)来扩增片段,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃30秒和72℃ 15秒;15个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒(每个连续的循环递加5秒延伸);72℃ 7分钟的1个循环;和10℃维持。PCR步骤终止后,使用PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒根据制造商的说明书(Amersham Biosciences,United Kingdom)纯化和洗脱5826bp的PCR片段。
引物349699:
5’-CAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGAAAGCTTCACCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCTCTG-3’(SEQ ID NO:15)
引物353031:
5’-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTATCAAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTAC-3’(SEQ IDNO:16)
PCR扩增反应混合物含有大约50ng pENI1298质粒DNA,1μl引物349699(50pmol/μl),1μl引物353031(50pmol/μl),5μl含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA),1μl dNTP混合物(每种10mM),40.25μl水,和0.75μl(3.5U/μl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTC Peltier热循环仪来扩增片段,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒;15个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒(每个连续的循环递加5秒延长);72℃ 7分钟的1个循环;和10℃维持。PCR步骤终止后,使用 PCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒根据制造商的说明书(Amersham Biosciences,United Kingdom)纯化和洗脱927bp PCR片段。
将所得两种片段,5826bp和927bp通过电穿孔转化入酿酒酵母JG169,其中根据制造商的步骤使用设定为1.5千伏(kvolt)的GENE 和脉冲控制仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)及2mm缝隙的电击杯(cuvette)。转化反应液含有混合的100ng PCR扩增的载体DNA及100ng包含脂肪酶基因的PCR产物。将转化反应液涂布到酵母ura减选择板上并在30℃温育5天。
将来自上述步骤的一个酵母克隆在SC ura减板上再划线,并将一个酵母单菌落接种入50ml摇瓶中的10ml SC ura减培养基并在30℃,250rpm温育过夜。使用2ml培养液进行质粒制备,其中使用用于酵母质粒制备的 SpinMiniprep Kit(旋转微量制备试剂盒)(QIAGEN Inc.,Germany)。稍后将质粒测序并验证了预期的DNA序列。将质粒命名为pMB1537(图2)。
实施例3:表达载体pBM126a的构建
用Age I和EcoR I消化质粒pBM128a,用Eco RI和Nde I消化质粒pMB1537,并分别通过使用TAE缓冲液的1.8%和0.7%琼脂糖凝胶电泳联合凝胶提取试剂盒来纯化分别为265bp和661bp的片段。为了创建载体片段,用Age I和Nde I消化pMB1537。通过使用TAE的0.7%琼脂糖凝胶电泳联合凝胶提取试剂盒来纯化所得的5148bD片段。
随后使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,IN,USA)连接所有三种片段。根据制造商的说明书,使用2μl反应液转化大肠杆菌XL 超感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。使用BioRobot9600自大肠杆菌转化体制备质粒DNA。对包含***物的分离的质粒测序,其中使用1μl质粒模板,1.6ng M13引物(正向的或反向的),补至6μl的水。将鉴定出具有正确序列的所得质粒命名为pBM126a(图3)。
实施例4:表达载体pMB1539的构建
构建了质粒pMB1539以包含在TPI启动子控制下的编码细毛嗜热霉脂肪酶变体的基因(SEQ ID NO:9是DNA序列,而SEQ ID NO:10是推导的氨基酸序列)。
使用高保真PCR***通过PCR制备了包含细毛嗜热霉脂肪酶变体基因的基因片段,其中使用作为模板的包含细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因(SEQ ID NO:7)的pENi1298(WO 00/24883)和下文所示引物349699和353031。
引物349699:
5’-CAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATATAAACGATTAAAAGAAAGCTTCACCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCTCTG-3’(SEQ ID NO:17)
引物353031:
5’-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTATCAAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTAC-3’(SEQ IDNO:18)
PCR扩增反应混合物含有大约50ng pENi 1298质粒DNA,1μl引物349699(50pmol/μl),1μl引物353031(50pmol/μl),5μl含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA),1μl dNTP混合物(每种10mM),40.25μl水,和0.75μl(3.5U/μl)DNA聚合物混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier热循环仪来扩增片段,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒;15个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒(每个连续的循环递加5秒延长);72℃ 7分钟的1个循环;和10℃维持。PCR扩增后,使用 PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒纯化993bpDNA片段。将所得片段(100ng)与实施例2中所述pSTED226载体片段(100ng)混合,并通过电穿孔转化入电感受态酿酒酵母JG169细胞,其中根据制造商的步骤使用设定为1.5千伏的GENE 和脉冲控制仪及2mm缝隙的电击杯。然后将经过转化的细胞涂布到酵母ura减选择板上并在30℃温育5天。
将来自上述步骤的一个酵母克隆在SC ura减板上再划线,并用一个酵母单菌落接种50ml摇瓶中的10ml SC ura减培养基并在30℃,250rpm温育过夜。使用来自此培养物的2ml培养液进行质粒制备,其中使用用于酵母质粒制备的旋转微量制备试剂盒。稍后将质粒测序并验证了预期的DNA序列。将质粒命名为pMB1539(图4)。
实施例5:表达载体pJLin168的构建
利用CUP1启动子的细毛嗜热霉脂肪酶变体表达载体的构建是通过将pBM126a(包含在CUP1启动子控制下的细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因)中的细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因用来自pMB1539的细毛嗜热霉脂肪酶变体基因交换而实现的。首先,用Hind III和Mlu I消化pBM126a和pMB1539二者,并使用凝胶提取试剂盒凝胶纯化来自pBM126a的5kb片段和来自pMB1539的1.1kb片段。随后使用快速DNA连接试剂盒连接两片段,其中载体:***物的摩尔比为1:2、1:3和1:4且载体量设定为50ng。命名为pJLin168(图5)的所得质粒包含在CUP1启动子控制下的细毛嗜热霉脂肪酶变体基因。
实施例6:表达载体pBM142c和pBM143b的构建
引物998570:
5’-CTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCGAGGTCTCGCAGGATCTGTTTAAC-3’(SEQ ID NO:19)
引物998571:
5’-TTAAACAGATCCTGCGAGACCTCGGCCAAGGCCGTCCACGCAGAG-3’(SEQ ID NO:20)
在50μl终体积中含有73ng pJLin168,1X反应缓冲液(Stratagene,La Jolla,CA,USA),4μl (Stratagene,La Jolla,CA,USA),1μl XL dNTP混合物(Stratagene,La Jolla,CA,USA),和lμl2.5U/μl PfuUltraTM DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA,USA)的PCR反应液中,使用100皮摩尔每种引物。 编程为:95℃1分钟的1个循环;18个循环每个为95℃ 50秒、60℃ 50秒和68℃ 6分钟;和10℃维持。将1μl Dpn I直接添加至扩增反应液并在37℃温育1小时。根据制造商的说明书,使用2μl体积的Dpn I消化反应液转化大肠杆菌超感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。通过DNA测序证实了一个克隆不含对应于SPIRR编码区的15bp,并命名为pBM142c(图6)。
为了避免在pBM142c中产生额外的突变,将来自pBM142c的细毛嗜热霉变体脂肪酶基因的5’区克隆回到pJLin168中。用Hind III和Nde I消化质粒pBM142c,并通过使用TAE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶电泳联合凝胶提取试剂盒来纯化0.6kb片段。用Hind III和NdeI消化质粒pJLin168,并通过使用TAE缓冲液的0.7%琼脂糖凝胶电泳联合凝胶提取试剂盒来纯化所得5.5kb片段。随后使用快速DNA连接试剂盒连接两片段。命名为pBM143b(图7)的所得表达质粒包含驱动细毛嗜热霉变体脂肪酶基因表达的CUP1启动子。如此,22个氨基酸的信号/前肽序列通过消除最后五个氨基酸(SPIRR)变成了17个氨基酸。
实施例7:用pJLin168和pBM143b转化酿酒酵母
使用YEASTMAKERTM酵母转化***(Clonetech,Palo Alto,CA,USA)根据制造商的说明书将质粒pJLin168和pBM143b转化入酿酒酵母菌株JG169。简言之,将一个酿酒酵母JG169菌落接种入50ml YPD培养基并在轨道摇床上以250rpm在30℃温育过夜。在细胞达到600nm吸光度为0.4-0.5时,将细胞以700×g离心5分钟,丢弃上清液,并将沉淀物重悬于30ml去离子水。以700×g离心5分钟后,将细胞沉淀物重悬于1.5ml1.1X TE/醋酸锂溶液(110mM醋酸锂,11mM Tris,pH8,1.1mM EDTA)。在微型离心机中以12,000×g离心15秒后,将细胞沉淀物重悬于600μl 1.1XTE/醋酸锂溶液。添加大约0.5μg载体DNA,250μl PEG/醋酸锂溶液(40%PEG 4000,0.1M醋酸锂,10mMTris-HCl,pH8,1mM EDTA),和5μl10mg/ml变性鲱鱼***载体(HerringTestes Carrier)DNA至50μl感受态细胞后,将混合物以550rpm在30℃摇动30分钟,并通过每10分钟颠倒将细胞混合。将总体积20μl DMSO添加至每份转化混合物,并在42℃温育15分钟,且每5分钟颠倒混合物。将转化混合物在微型离心机中以12,000×g离心15秒,将细胞重悬于1ml YPD PLUSTM液体培养基(YEASTMAKERTM酵母转化***,Clonetech,Palo Alto,CA,USA)并在550rpm和30℃摇动90分钟。以13,000×g离心后,用1ml 0.9%NaCl溶液洗涤细胞并在15%甘油存在下重悬于1ml酵母ura减选择培养基。将50μl每份转化反应液一式两份涂布到酵母ura减选择板上并在30℃温育直至出现菌落。
实施例8:用质粒pJLin168和pBM143b表达细毛嗜热霉脂肪酶变体的评估
在摇瓶中评估自pJLin168和pBM143b表达细毛嗜热霉脂肪酶变体的情况。将来自实施例7的5个含有pJLin168或pBM143b的代表性酿酒酵母JG169转化体一式两份在含有25ml“初始”培养基的摇瓶中培养。在第4、5和7天收获摇瓶样品。在如下测定法中使用对硝基苯基丁酸酯作为底物测量培养物上清液的脂肪酶活性:首先将培养物上清液在0.1M MOPS,4mM CaCl2,0.01%Triton X-100缓冲液,pH7.5(样品缓冲液)中1/15倍稀释,接着系列稀释,自0倍到1/3倍到1/9倍稀释的样品。将LIPOLASETM标准品(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)在样品缓冲液中使用两倍步骤(two-fold steps)稀释,自1.0LU/ml浓度开始,到0.125LU/ml浓度结束。将总共20μl每种稀释液(包括标准品)转移至96孔平底板。将200μl对硝基苯基丁酸酯底物溶液(对硝基苯基丁酸酯对DMSO对0.1M MOPS pH7.5的比例为1:99:400)添加至每个孔,然后在25℃温育15分钟。在温育结束时,对96孔板测量405nm吸光度。由生成的标准曲线通过外推(extrapolation)来测定样品浓度。
对于第4天、第5天和第7天采集的样品,pJLin168转化体的平均相对脂肪酶活性分别为14、26和22(图8)。对于第4天、第5天和第6天采集的样品,pBM143b转化体的平均相对脂肪酶活性分别为69、100和92(图9)。
为了验证脂肪酶活性测定法的结果,对来自样品的上清液实施SDS-PAGE。将来自第5天取样的两份摇瓶样品的20μl培养物上清液与Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)以1:2的比例混合。煮沸2分钟后,将样品以及15μl PRECISION PLUS PROTEINTM标准品(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)加载到10-20% SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)上。在1X Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)中以200V跑胶1小时。然后将凝胶用水漂洗3次,每次5分钟,并用BIO-SAFETM考马斯染料(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)染色1小时,接着用水脱色至少30分钟。
SDS-PAGE结果显示了对于pBM143b转化体观察到的增加的脂肪酶活性对应于增加的蛋白质水平。
实施例9:细毛嗜热霉脂肪酶变体信号序列的诱变
使用包含细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因的质粒pMB1537来构建细毛嗜热霉脂肪酶信号肽的随机诱变文库。通过PCR扩增信号肽编码序列的随机诱变PCR片段和侧翼DNA区,其中使用高保真PCR***和下文所示引物(DNA-Technology,Aarhus,Denmark)。
引物309787:
5’-CTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO:21)
引物373172:
5’-CTGTGCAAAGAGATTGAACTGGTTAAACAGATCCTGCGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGGTGAAGCTTTCTTTTAA-3’(SEQ ID NO:22)
其中:
SEQ ID NO:22第41、50、51、60、64、66、68、70、71、72、74、75、77、80、82、83和87位的N是99%的A和1%的G、C、或T;
SEQ ID NO:22第40、46、47、52、53、56、62、65、67、73、78、84、85、86和88位的N是99%的G和1%的A、C、或T;
SEQ ID NO:22第42、43、45、48、49、54、55、58、59、61、63、69、76、79、81、89、91和92位的N是99%的C和1%的A、G、或T;且
SEQ ID NO:22第44、57、90和93位的N是99%的T和1%的A、C、或G。
遵循如下规则设计了引入多样性的引物:随机化位置处的野生型碱基始终以99%存在,而另三种碱基以1%存在且所有三种同等展现。
使用高保真PCR***通过PCR扩增了信号肽编码序列的诱变片段。PCR扩增反应混合物含有大约50ng pMB1537,1μl引物309787(50pmol/μl),1μl引物373172(50pmol/μl),5μl含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA),1μl dNTP混合物(每种10mM),40.25μl水,和0.75μl(3.5U/μl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTC Peltier热循环仪来扩增片段,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 15秒;15个循环每个为94℃ 15秒、55℃30秒和72℃ 15秒(每个连续的循环递加5秒延长);72℃ 7分钟的1个循环;和10℃维持。
通过在信号肽编码序列内的DNA位置用Sac I消化将质粒pMB1537线性化。使用线性化载体作为酿酒酵母JG169转化中的受体DNA,其中使用信号肽编码序列及侧翼DNA区(与受体质粒的受体DNA 100%同源)的PCR片段作为供体DNA。
具体而言,将大约3μg经Sac I消化的pMB1537与大约1μg 600bp PCR片段一起电穿孔入100μl电感受态酿酒酵母JG169细胞,其中使用设定为1.5千伏的和脉冲控制仪及2mm缝隙的电击杯。电穿孔后,给经过转化的细胞提供1ml的1M山梨醇,并在30℃温育1小时,之后将1.1ml涂布到每ml补充有100μg氨苄青霉素的SC ura减板上。
自每ml补充有100μg氨苄青霉素的SC ura减板挑取总共8400个菌落并转移至96孔聚苯乙烯微孔板,即将挑取的克隆施加至B-H行1-12列的孔,让A行空着,其接种酿酒酵母JG169中的野生型质粒构建体作为野生型参照。所有孔包含每升添加40mg腺嘌呤的SD培养基-URA(称为SDMUA)(遵循制造商的推荐,Qbiogene,Inc.,BIO ***,AH Diagnostics,Aarhus,Denmark)。将板在30℃和250rpm温育5天。5天后,在使用下文所述对硝基苯基戊酸酯测定法测量脂肪酶活性之前将板保持在4℃。
在如下测定法中使用对硝基苯基戊酸酯作为底物测量了培养物上清液的脂肪酶活性。在50mM Tris pH7,10mM CaCl2,0.4%Triton X-100缓冲液(稀释缓冲液)中稀释培养物上清液。将LIPOLASETM标准品(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)在样品缓冲液中使用两倍步骤稀释,自1.0LU/ml浓度开始,到0.125LU/ml浓度结束。在聚苯乙烯微孔板中,将10μl上清液与90μl稀释缓冲液混合。将100μl对硝基苯基戊酸酯底物溶液(117μl对硝基苯基戊酸酯溶解于10ml异丙醇)添加至每个孔,简单混合,然后在3分钟里每12秒测量405nm吸光度。评估测定数据以鉴定活性比酿酒酵母JG169中pMB1539构建体(A行孔中)高的所有样品。
收集活性比参照高的所有克隆作为阳性命中(positive hit)并在相同设置中再次分析,将活性仍比参照高的所有克隆作为接种材料用于微孔板中的新鲜SDMUA培养基。A行再次用于参照菌株。将板如上所述接种,并如上所述分析。
移出活性比参照高的所有克隆并在SC-琼脂板上再划线。收集所有克隆的单菌落用于在微孔板中在200μl SDMUA培养基中和在装有10ml SDMUA培养基的50ml管中在30℃再次培养5天,之后使用上文所述对硝基苯基戊酸酯测定法将产量(yield)与参照菌株的产量进行比较。
在3个邻近的微孔和3个单独的50ml管中培养每个克隆。使用这3个培养实验的平均值来比较活性水平。
最后,将在微孔板和50ml管中都具有最高脂肪酶活性的克隆接种含有10ml SDMUA培养基的摇瓶(带有两个挡板的250ml锥型带挡板摇瓶)并在30℃以250rpm温育5天。使用上文所述对硝基苯基戊酸酯测定法对上清液测定脂肪酶活性。将具有最高脂肪酶活性的克隆进行DNA测序。
将显示出最高活性的克隆命名为MB1665,其在脂肪酶信号肽中具有R2K取代(信号肽的第二个密码子自AGG变成AAG)。
通过使用与实施例4所述相同的原理,将编码此信号肽的DNA转移至编码细毛嗜热霉脂肪酶变体的pMB1539构建体。在这种情况中使用与实施例4所述相同的步骤制备了更小的PCR片段。然而,也根据实施例4但是使用来自MB1539的质粒DNA作为模板制备了更大的片段。如上所述进行了酿酒酵母JG169的GAP修复和转化。此克隆方法产生了具有细毛嗜热霉脂肪酶变体的更高表达的克隆。将此克隆命名为酿酒酵母MB1681。
将来自SC-琼脂板(在30℃培养5天)的酿酒酵母MB1681细胞材料用于接种50ml摇瓶中的10ml SC ura减培养基并在30℃、250rpm温育过夜。使用来自此培养物的2ml培养液进行质粒制备,其中使用用于酵母质粒制备的旋转微量制备试剂盒。根据制造商的说明书,将经过纯化的质粒转化入大肠杆菌Top10F’(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。将经过转化的大肠杆菌细胞涂布到每ml补充有100μg氨苄青霉素的LB板上。分离单菌落,再划线,接种入LB培养基,并在30℃温育过夜。将1ml过夜培养物用于质粒制备,其中使用旋转微量制备试剂盒。最后,将分离的质粒用作DNA测序的模板,验证了变体信号序列(SEQ ID NO:3)和细毛嗜热霉脂肪酶变体编码区(SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10之推导的氨基酸序列)的序列。将所得质粒命名为pMB1682(图10)。质粒pMB1682包含TPI启动子和细毛嗜热霉脂肪酶变体编码区(不含SPIRR、具有R2K变化(without SPIRR with a R2K change))。
实施例10:pJLin195的构建
构建了质粒pJLin195以包含利用酿酒酵母CUP1启动子的细毛嗜热霉脂肪酶变体(具有含R2K变化且不含SPIRR的信号序列)表达载体。
将pMB1682的Hind III-NdeI片段克隆入经过Hind III和Nde I消化的pBM143b,即将第二个氨基酸Arg的编码序列(AGG)替换成Lys的编码序列(AAG)。将pMB1682和pBM143b二者用Hind III和NdeI消化,并用凝胶提取柱凝胶提取来自pMB1682的1kb片段和来自pBM143b的5kb片段。使用快速DNA连接试剂盒根据制造商的说明书将片段连接到一起,其中载体对***物的摩尔比为1:2、1:1和3:1且载体量为50ng。将通过DNA测序验证的所得质粒命名为pJLin195(图11)。
实施例11:用pJLin195和pBM143b转化酿酒酵母
将质粒pBM143b和pJLin195单独转化入酿酒酵母菌株JG169,如实施例7所述,只是使用YPD培养基代替YPD PLUSTM液体培养基。同样,在用0.9%NaCl洗涤后,将ura减培养基中的200μl细胞悬浮液直接涂布于酵母ura选择板。将菌落在酵母ura选择板上划线,培养每种转化体的两个菌落并使用培养液测定脂肪酶活性。
将纯化的包含pBM143b或pJLin195的酿酒酵母JG169转化体(每种构建体至少10个)一式两份接种入96孔板中的180μl ura选择培养基并在30℃、250rpm温育过夜。然后将过夜培养物在180μl CUP减ura培养基中稀释100倍,并在30℃、250rpm培养5天。将相同培养基(只是存在10mM尿苷)中培养的酿酒酵母JG169包括在内作为阴性对照。
如实施例8所述测定脂肪酶活性。pBM143b和pJLin195转化体的相对平均脂肪酶活性分别为51和100(图12)。t检验显示了pJLin195转化体的活性显著不同于pBM143b转化体。结果表明R2K信号序列将细毛嗜热霉脂肪酶变体产量改善了2.1倍。
实施例12:在摇瓶中评估含质粒pJLin195和pBM143b的细毛嗜热霉脂肪酶变体的表达
为了进行摇瓶分析,将代表性的pBM143b和pJLin195转化体接种入2mlura选择培养基并在30℃、250rpm温育过夜。然后将过夜培养物在125ml塑料摇瓶中在25ml CUP减ura培养基中稀释200倍并在30℃、250rpm培养6天。在第5和6天采集样品并在微型离心机中以12,000×g离心10秒。如实施例8所述对上清液测定脂肪酶活性。
结果显示了脂肪酶活性在第5-6天左右达到峰值(图13)。当在摇瓶中培养时第5天的总脂肪酶活性高于96孔样品。平均而言,具有R2K信号序列的细毛嗜热霉脂肪酶变体在第5天显示出2倍高(2-fold higher)的相对脂肪酶活性(野生型细毛嗜热霉脂肪酶变体为1)。因此,25ml摇瓶显示出与在96孔板中培养的培养物相似的结果。具有R2K信号序列的细毛嗜热霉脂肪酶变体在第6天显示出比第5天稍高的活性,所以第6天的改进甚至更高。
为了验证脂肪酶活性测定法的结果,如实施例8所述对来自摇瓶的上清液进行了SDS-PAGE。SDS-PAGE结果显示了来自代表性转化体的细毛嗜热霉脂肪酶变体条带的强度与脂肪酶活性测定法的结果一致。
实施例13:细毛嗜热霉脂肪酶变体的N端序列分析
在具有在线(on-line)毛细管HPLC和液相三氟乙酸(TFA)递送的ProcisecLC蛋白质测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上进行了N端测序。使用10%甲醇中的10mM CAPS(3-[环己基氨基]-1-丙磺酸),pH11.0将蛋白质样品自SDS-PAGE凝胶电印迹到PVDF膜(Invitrogen,San Diego,CA,USA)上,在具有电印迹凝胶装置的 XCell II(Invitrogen,San Diego,CA,USA)上以25伏运行2小时或者在配备有转移室的疑胶装置(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)上以100伏运行2小时。将PVDF膜用40%甲醇/1%乙酸中的0.1%考马斯蓝R-250染色20秒,并在50%甲醇中脱色以观察蛋白质条带。切下染色的蛋白质条带并测序。乙内酰苯硫脲(phenylthiohydantoin)-氨基酸的检测是通过在线毛细管HPLC来完成的,其中使用500ml在水中含有3.5%四氢呋喃的缓冲液A及9ml含有乙酸、乙酸钠和己磺酸钠(sodium hexanesulfonate)的Premixa浓缩液(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)和含有乙腈/2-丙醇的溶剂B2。使用APPLIED 610数据分析软件2.1a版在G4处理器上收集和分析数据。序列测定通过对着光源显现层析图来进行。
N端测序分析显示了对携带R2K变体信号序列的细毛嗜热霉脂肪酶变体的正确加工。pJLin195转化体测定的N端序列为EVSQDLFNQFN(SEQ ID NO:10氨基酸1-11)。
实施例14:pJLin187的构建
通过在来自pJLin168的脂肪酶基因中引入L269I变化并通过将该脂肪酶片段亚克隆入米曲霉表达载体pBM120a,构建了质粒pJLin187。使用下文所示基因特异性正向和反向引物来进行PCR扩增。
正向引物:
5’-ACACAACTGGCCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3’(SEQ IDNO:23)
反向引物:
5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTATCAAATACATGTCCCAA-3’(SEQ IDNO:24)
粗体字母代表编码序列,而斜体字母代表添加至细毛嗜热霉脂肪酶变体基因3’端的PacI位点。反向引物中加下划线的AAT指示脂肪酶基因中用以获得L269I的核苷酸变化。剩余序列与pBM120a***位点侧翼的区域同源。使用高保真PCR***根据制造商的说明书进行PCR扩增。每份PCR反应液含有1μl pJLin168,200μM dNTPs,1μM正向和反向引物,1X反应缓冲液,和2.6个单位高保真酶混合物。将反应液使用 进行扩增,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、58.3℃ 30秒和72℃ 1分15秒;15个循环每个为94℃ 15秒、58.3℃ 30秒和72℃ 1分15秒(每个连续的循环递加5秒延长);和72℃ 7分钟的1个循环。使用 PCR纯化试剂盒纯化0.9kb PCR产物,然后使用克隆试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)克隆入pBM120a。克隆反应物由1X 缓冲液(BDBiosciences,Palo Alto,CA,USA),1X BSA(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA),1μl 酶(1:10稀释的),100ng用Nco I和Pac I消化的pBM120a,和50ng纯化的包含脂肪酶基因的PCR产物组成,总体积50μl。将反应液在室温温育30分钟。
使用2μl反应液转化大肠杆菌 Gold超感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。将通过限制性消化和测序分析验证的包含期望脂肪酶序列的pBM120a质粒之一命名为pJLin187(图14)。
实施例15:pBM120表达载体的构建
构建了质粒pBM120a以获得包含双NA2启动子(NA2-NA2-tpi)用于在曲霉属物种中驱动基因表达且包含氨苄青霉素抗性基因用于在大肠杆菌中选择的质粒。
设计了引物用于自pJaL721(WO 03/008575)中PCR扩增双NA2启动子。添加了限制酶位点Sal I和Nco I(加下划线)用于将双启动子克隆入曲霉表达质粒pAlLo1(WO 2005/067531)。
5’-GTCGACATGGTGTTTTGATCATTTTA-3’(SEQ ID NO:25)
5’-CCATGGCCAGTTGTGTATATAGAGGA-3’(SEQ ID NO:26)
使用高保真PCR***通过PCR扩增感兴趣片段。PCR扩增反应混合物含有1μl 0.09μg/μl的pJaL721,1μl每种引物(50pmol/μl),5μl含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液,1μl dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物(每种10mM),37.25μl水,和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)。为了扩增片段,将 编程为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1.25分钟;15个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1.25分钟(每个连续的循环递加5秒延长);和72℃7分钟的1个循环;和10℃维持。将10μl此PCR反应液与1μl 10X DNA加样染料(25%甘油,10mM Tris pH7.0,10mM EDTA,0.025%溴酚蓝,0.025%二甲苯蓝)混合并使用TAE缓冲液在1.0%(w/v)琼脂糖凝胶上运行。在凝胶显现***(Nucleotech,San Mateo,CA,USA)上用紫外光观察1128bp PCR产物。根据制造商的说明书,将PCR产物直接连接入pCR2.1-将1μl体积的新鲜PCR产物,3μl双蒸水,和1μl克隆载体用移液器尖头(pipette)混合并在室温温育5分钟。
温育后,使用2μl混合物转化 TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)。将2μl体积的连接混合物添加至大肠杆菌细胞并在冰上温育5分钟。随后,将细胞在42℃热休克30秒,然后在冰上放置2分钟。将250μl体积的SOC培养基添加至细胞并将混合物在37℃和250rpm温育1小时。温育后,将菌落涂布在每ml补充有100μg氨苄青霉素的2XYT板上并在37℃温育过夜,用于选择质粒。用无菌牙签挑取8个在板上生长的菌落并在含有3ml每ml补充有100μg氨苄青霉素的LB培养基的15ml管中在37℃、250rpm培养过夜。使用BioRobot 9600分离质粒。
用Eco RI消化4μl体积的所得质粒微量制备物。如先前关于PCR反应所述通过琼脂糖凝胶电泳和UV分析来分析消化反应。将分离的包含***物的质粒测序,其中使用1μl质粒模板,1.6ng的M13引物(正向的或反向的),和补至6μl的水。将所得质粒命名为pBM121b(图15)。
用Sal I和Nco I消化5μl体积的pBM121b。如上所述通过琼脂糖凝胶电泳分析消化反应,并连接至先前用Sal I和Nco I消化的载体pAlLo1。将所得表达质粒命名为pBM120a(图16)。
实施例16:包含疏棉状嗜热霉(Thermomyces lanuginosa)脂肪酶变体基因的米曲霉载体的构建
自pJLin187 PCR扩增细毛嗜热霉脂肪酶变体基因,pJLin187是携带脂肪酶变体基因的曲霉属表达载体。pJLin187中的脂肪酶基因包含编码氨基酸变化L269I的突变,这在PCR过程中得到了纠正。使用下文所示基因特异性引物使用高保真PCR***PCR扩增基因。
正向引物:
5’-ACACAACTGGCCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3’(SEQ IDNO:27)
反向引物:
5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTATCAAAgACATGTCCCAATTAACCC-3’(SEQ ID NO:28)
粗体字母代表编码序列,加下划线的部分表示所引入的Pac I位点,小写字母为预期的变化,而剩余序列是与pBM120中的***点同源的侧翼区。
PCR反应液含有100ng pJLin187,200μM dNTPs,300nM每种引物,1X高保真缓冲液(含MgCl2的),和2.6个单位高保真酶混合物。使用 进行扩增,程序为94℃ 2分钟的1个循环;10个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟;和15个循环每个为94℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟,然后是15个循环的每一个之后72℃延长步骤额外增加5秒。
使用TAE缓冲液在1%琼脂糖凝胶上运行PCR反应混合物并切下与913bp***物对应的条带。通过琼脂糖提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)根据制造商的方案自样品提取DNA片段。
使用克隆试剂盒将PCR产物直接克隆入表达载体pBM120,而不需要进行限制性消化和连接。克隆反应液由反应缓冲液,1X BSA,100ng用Pac I和Nco I消化的pBM120,108.4ng经纯化的PCR***物,和1μl酶(1:10稀释的)构成。将反应液在室温温育30分钟并根据制造商的规程用1μl转化Gold超感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。DNA测序鉴定了一个正确克隆,产生了细毛嗜热霉脂肪酶变体基因表达载体。将所得质粒命名为pJMS7(图17)。
实施例17:具有R2K信号肽并缺失SPIRR的米曲霉载体的构建
从携带疏棉状嗜热霉脂肪酶变体基因之基因的pJLin195中PCR扩增具有信号肽序列变化R2K和SPIRR缺失的细毛嗜热霉脂肪酶变体基因。使用如下引物PCR扩增基因。
正向引物:
5’-CTCTATATACACAACTGGCCATGAAGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3’(SEQ ID NO:29)
反向引物:
5’-CAGGTGTCAGTCACCTCTAGTTATCAAAGACATGTCCCAATTAACCC-3’(SEQ ID NO:30)
粗体序列对应于疏棉状嗜热霉脂肪酶变体编码区而剩余序列为与pBM120中的***点同源的侧翼区。PCR反应和热循环条件与实施例16中用于细毛嗜热霉脂肪酶变体基因的那些相同。如实施例16所述使用TAE缓冲液在1%琼脂糖凝胶上运行PCR反应液并切下DNA片段。
使用克隆试剂盒将PCR产物直接克隆入表达载体pBM120。反应液与实施例16中的相同,只是使用64ng经纯化的PCR***物。使用制造商建议的规程用1μl反应液转化Gold超感受态细胞。DNA测序证实了PCR没有引入错误。将所得质粒命名为pJMS6(图18)。
实施例18:具有R2K信号肽突变的米曲霉载体的构建
使用II XL定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA,USA)来突变质粒pJMS7,其通过将细毛嗜热霉脂肪酶变体基因的信号肽序列中的R变成K进行。诱变反应由三个步骤组成:使用下文所示诱变引物进行的突变链合成,模板的Dpn I消化,和转化。
正向引物:5’-CACAACTGGCCATGaagAGCTCCCTTGTG-3’(SEQ ID NO:31)
反向引物:5’-CACAAGGGAGCTcttCATGGCCAGTTGTG-3’SEQ ID NO:32)
小写密码子指示信号序列中的变化。
突变链合成反应液由5μl 10X反应缓冲液(Stratagene,La Jolla,CA,USA),10ng pJMS7,125ng每种引物,1μl dNTP混合物,3μl (Stratagene,La Jolla,CA,USA),和2.5个单位Pfu Ultra HF DNA聚合酶构成。使用 进行扩增,程序为95℃ 1分钟的1个循环;18个循环每个为95℃ 50秒、60℃ 50秒和68℃ 7分钟;和68℃ 7分钟的1个循环。然后将1μl DpnI限制酶(10U/μl)添加至反应液。温和而彻底的混匀后,将反应混合物以13,000×g离心1分钟并立即在37℃温育1小时以消化亲本超螺旋dsDNA。遵循制造商的说明书,将2μl用Dpn I处理的样品反应液转化入45μl大肠杆菌XL10-Gold超感受态细胞(Stratagene,La Jolla,CA,USA)。16小时后,挑取菌落并进行质粒制备和序列分析。下文所示测序引物位于NA2-tpi启动子区中且以细毛嗜热霉脂肪酶变体基因的正向读取。5’-ATACTGGCAAGGGATGCCATGCTTGG-3’(SEQ ID NO:33)
鉴定出了在信号序列中具有R2K突变的正确克隆。将所得质粒命名为质粒TB5。
实施例19:缺失SPIRR的米曲霉载体的构建
正向引物:
5’-CACAACTGGCCATGaggAGCTCCCTTGTG-3’(SEQ ID NO:34)
反向引物:
5’-CACAAGGGAGCTcctCATGGCCAGTTGTG-3’(SEQ ID NO:35)
小写密码子是预期的变化。
通过使用SEQ ID NO:33之引物的DNA测序鉴定出了在前肽序列中具有SPIRR缺失的正确克隆。将所得质粒命名为质粒TB6。
实施例20:自pJMS6、pJMS7、质粒TB5和质粒TB6表达细毛嗜热霉脂肪酶变体
根据标准规程来进行米曲霉BeCh2的原生质体制备和转化,例如Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422。在每个转化反应中使用约5μg每种表达载体。将转化混合物涂布到COVE板上并在37℃温育7天。挑取转化体并转移至新鲜COVE板并在34℃培养,等待孢子纯化(spore purification)和三丁酸甘油酯测定法(tributyrin assay)。
通过将10%(v/v)三丁酸甘油酯与VNO3RLMT琼脂的50ml混合物(熔化并在无菌搅拌器中混合)倾倒到150mm圆盘中并使其干燥来制备三丁酸甘油酯板。使用无菌牙签切出孢子的1cm x 1cm柱状样本(plug)并转移至三丁酸甘油酯板。每块板可容纳多至9个柱状样本。将板在34℃温育3-4天并通过清除柱状样本周围的晕圈(halo of clearing around the plugs)来鉴定阳性转化体。
用pJMS6、pJMS7、质粒TB5和质粒TB6转化米曲霉Bech2产生了许多在三丁酸甘油酯板上为脂肪酶活性阳性的转化体(见下表)。
表1:脂肪酶活性为阳性的转化体的数目
实验编号(实例#) | pJMS7细毛嗜热霉脂肪酶变体(实施例16) | pJMS6SPIRR缺失且R2K突变(实施例17) | 质粒TB5R2K突变具有SPIRR(实施例18) | 质粒TB6SPIRR缺失且具有野生型信号肽(实施例19) |
1 | 13 | 19 | N/A | N/A |
2 | 26 | 32 | N/A | N/A |
3 | 17 | 23 | 15 | N/A |
4 | 39 | N/A | N/A | 43 |
将阳性转化体在新鲜COVE板上划线并在34℃培养1-2天。自每个划线板挑取2个单孢子并转移至分开的COVE板。将这些孢子在34℃培养约7天。进行了另一次三丁酸甘油酯筛选,以在摇瓶分析前验证脂肪酶活性。
在大约5ml 0.01%Tween-20中收集来自阳性转化体的孢子。然后用200μl孢子悬浮液接种125聚碳酸酯Erlenmeyer烧瓶中的25ml MY25培养基。为了检验烧瓶间的变异,每种孢子纯化转化体接种一式两份。将培养物在34℃在台式摇床上以200rpm培养5天。在第3、4和5天,通过以13,000×g离心10分钟以除去菌丝体来收集培养物上清液并保存于-20℃用于自动化脂肪酶活性测定法。
为了测定培养物上清液中的脂肪酶活性,使用一种自动化测定法,其使用 3000(Beckman Coulter,Inc,Fullerton,CA,USA)。将培养物上清液在0.1M MOPS,4mM CaCl2,0.01% Triton X-100缓冲液pH7.5(摇瓶缓冲液)中大致(1/10、1/50和/或1/100)稀释(以防止蛋白质粘到板上),然后是稀释样品的系列稀释,自0倍到1/3倍到1/9倍。将LIPOLASETM标准品(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)在样品缓冲液中使用2-倍步骤稀释,自1.0LU/ml浓度开始,到0.125LU/ml浓度结束。将总共20μl每种稀释液(包括标准品)转移至96孔平底板。将200μl对硝基苯基丁酸酯底物溶液(对硝基苯基丁酸酯对DMSO对0.1M MOPS pH7.5的比例为1:99:400)添加至每个孔,然后在环境温度温育6.5分钟。在温育过程中,在405nm测量反应速率。通过所生成标准曲线的外推来测定样品浓度。
图19显示了自含有pJMS7(细毛嗜热霉脂肪酶变体)和pJMS6(SPIRR缺失及R2K变化)的转化体获得的产量(相对LU/ml)的比较。结果显示了SPIRR缺失与R2K变化的组合与野生型基因相比改进了表达。两个群体的t检验得到了小于0.007的p值。
图20显示了自含有pJMS7(细毛嗜热霉脂肪酶变体)、pJMS6(SPIRR缺失及R2K变化)和质粒TB5(R2K变化)的转化体获得的产量(相对LU/ml)的比较。结果显示了单独的R2K变化不导致相对于野生型基因的产量增加,而且事实上可能导致略微降低。比较pJMS7和质粒TB5群体的t检验得到了0.047的p值。
图21显示了自含有pJMS7(细毛嗜热霉脂肪酶变体)和质粒TB6(SPIRR缺失)的转化体获得的产量(相对LU/ml)的比较。结果显示了单独的SPIRR缺失导致相对于野生型基因产量增加。比较pJMS7和质粒TB6群体的t检验得到了小于7.7X10-7的p值。
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本文引用了多篇参考文献,其公开的内容通过引用以其整体并入。
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Claims (30)
1.一种用于产生具有生物学活性的分泌型多肽的方法,其包括:
(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞,其中所述真菌宿主细胞包含编码所述多肽的第一多核苷酸,所述第一多核苷酸与编码选自下组的变体信号肽或变体前原肽的第二多核苷酸可操作连接:
(i)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的亲本信号肽变体,其中所述变体信号肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;
(ii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的亲本前原肽变体,其中所述变体肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;
(iii)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的亲本前原肽变体,其中所述变体前原肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;和
(iv)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的亲本前原肽变体,其中所述变体肽以符合读码框的方式连接至所述多肽的氨基末端;和
(b)自所述培养基分离所述具有生物学活性的分泌型多肽。
2.权利要求1的方法,其中所述亲本信号肽或前原肽选自下组:
(a)所述亲本信号肽或前原肽分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-17或SEQ IDNO:2氨基酸1-22具有优选至少70%同一性、更优选至少75%同一性、更优选至少80%同一性、甚至更优选至少85%同一性、最优选至少90%同一性和甚至最优选至少95%同一性;
(b)所述亲本信号肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码,所述核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66具有优选至少70%同一性、更优选至少75%同一性、更优选至少80%同一性、甚至更优选至少85%同一性、最优选至少90%同一性;和
(c)所述亲本信号肽或前原肽由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码,所述核苷酸序列在严格条件下分别与SEQ ID NO:1核苷酸1-51或SEQ ID NO:1核苷酸1-66或者它们的互补链发生杂交,其中所述严格条件定义为在比计算的Tm低5℃到10℃的温度在0.9M NaCl,0.09MTris-HCl pH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1X Denhardt氏溶液,1mM焦磷酸钠,1mM磷酸二氢钠,0.1mMATP,和0.2mg/ml酵母RNA中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤,并在比计算的Tm低5℃到10℃的温度在6X SCC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟和使用6X SSC洗涤两次各15分钟。
3.权利要求1的方法,其中所述亲本信号肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17或其保留指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力的肽片段,或者由它们组成;且其中所述亲本前原肽包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22或其保留指导多肽进入细胞的分泌途径以分泌具有生物学活性的多肽的能力的肽片段,或者由它们组成。
4.权利要求1的方法,其中在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的所述亲本信号肽变体选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代的变体信号肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含Lys作为取代的变体信号肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代R2K的变体信号肽;和
(d)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17的取代R2K或由其组成的变体信号肽。
5.权利要求1的方法,其中在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的所述亲本前原肽变体选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含缺失的变体前原肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的变体前原肽;
(d)在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个缺失的变体前原肽;
(e)在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失的变体前原肽;
(f)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22中S18*、P19*、I20*、R21*和R22*的一个或多个缺失的变体前原肽;和
(g)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*的缺失或由其组成的变体前原肽。
6.权利要求1的方法,其中在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的所述亲本前原肽变体选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys取代的变体前原肽;
(c)在与前原肽SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代的变体;
(d)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代或由其组成的变体前原肽。7.权利要求1的方法,其中在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的所述亲本前原肽变体选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val缺失的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含缺失的变体前原肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的变体前原肽;
(d)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个缺失的变体前原肽;
(e)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失的变体前原肽;
(f)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失的变体前原肽;
(g)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*中一个或多个缺失的变体前原肽;
(h)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失或由其组成的变体前原肽。
8.权利要求1的方法,其中所述变体信号肽是SEQ ID NO:4或所述变体前原肽是SEQ ID NO:6。
9.权利要求1的方法,其中所述多肽是激素或激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道物。
10.权利要求1的方法,其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌或酵母细胞。
11.权利要求1的方法,其中所述第一多核苷酸编码包含SEQ ID NO:8之成熟多肽的多肽。
12.权利要求1的方法,其中所述第一多核苷酸是SEQ ID NO:7之成熟多肽编码序列。
13.权利要求1的方法,其中所述第一多核苷酸编码包含SEQ ID NO:10之成熟多肽的多肽。
14.权利要求1的方法,其中所述第一多核苷酸是SEQ ID NO:9之成熟多肽编码序列。
15.一种分泌型多肽,其是通过权利要求1-14任一项的方法获得的。
16.权利要求15的分泌型多肽,其包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10之成熟多肽。
17.在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含取代的亲本信号肽变体,其选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的变体信号肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含Lys作为取代的变体信号肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-17的第2位对应的位置处包含R2K取代的变体信号肽;和
(d)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-17的R2K取代或由其组成的变体信号肽。
18.一种亲本信号前原肽变体,其中所述变体选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的变体前原肽;和
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的变体前原肽。
19.在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的权利要求18的变体前原肽,其选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含缺失的变体前原肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的变体前原肽;
(d)在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg中一个或多个缺失的变体前原肽;
(e)在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失的变体前原肽;
(f)分别在SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22处包含S18*、P19*、I20*、R21*和R22*的一个或多个缺失的变体前原肽;和
(g)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失或由其组成的变体前原肽。
20.在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代的权利要求18的变体前原肽,其选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代的变体前原肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代的变体前原肽;和
(d)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代或由其组成的变体前原肽。
21.在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含缺失的权利要求18的变体前原肽,其选自下组:
(a)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的一个或多个位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的变体前原肽;
(b)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含缺失的变体前原肽;
(c)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代且在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val缺失的变体前原肽;
(d)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg的一个或多个缺失的变体前原肽;
(e)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含Lys作为取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含Ser、Pro、Ile、Arg和Arg缺失的变体前原肽;
(f)在与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第2位对应的位置处包含R2K取代且在分别与SEQ ID NO:2氨基酸1-22的第18、19、20、21和22位对应的位置处包含S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失的变体前原肽;
(g)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*中一个或多个缺失的变体前原肽;和
(h)包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的R2K取代且包含SEQ ID NO:2氨基酸1-22的S18*、P19*、I20*、R21*和R22*缺失或由其组成的变体前原肽。
22.一种信号肽,其包含SEQ ID NO:4之氨基酸序列或由其组成。
23.一种分离的多核苷酸,其编码权利要求22的信号肽。
24.一种前原肽,其包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列或由其组成。
25.一种分离的多核苷酸,其编码权利要求24的前原肽。
26.一种核酸构建体,其包含权利要求23或25的多核苷酸。
27.权利要求26的核酸构建体,其中所述编码信号肽或前原肽的多核苷酸与编码多肽的第二多核苷酸可操作连接,其中所述信号肽多核苷酸或所述前原肽多核苷酸的3′端紧挨着位于所述第二多核苷酸的起始密码子的上游。
28.一种重组表达载体,其包含权利要求27的核酸构建体。
29.一种重组宿主细胞,其包含权利要求27的核酸构建体。
30.一种分离的分泌型多肽,其具有由编码包含SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10之成熟多肽序列的多肽的多核苷酸编码的脂肪酶活性,所述多核苷酸与编码权利要求17或22的变体信号肽的信号肽编码序列可操作连接,其中由所述信号肽编码序列编码的所述变体信号肽在所述多肽分泌时自全长多肽上切割下来。
31.一种分离的分泌型多肽,其具有由编码包含SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10之成熟多肽序列的多肽的多核苷酸编码的脂肪酶活性,所述多核苷酸与权利要求18-21和24中任一项的前原肽编码序列可操作连接,其中由所述前原肽编码序列编码的所述变体前原肽在所述多肽分泌时自全长多肽上切割下来。
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