CN101511386A - 用抗体治疗脑肿瘤的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及治疗患者脑肿瘤的方法，包括全身性施用单克隆抗体。

Description

用抗体治疗脑肿瘤的方法

相关申请的交叉引用

本申请是非临时申请，并且要求2005年6月2日提交的60/687118和2005年12月15日提交的60/751092的优先权，此两者均以其全文引入本文作为通用目的的参考。

政府权利的声明

本申请中所描述的工作由国家卫生研究所(National Institutes ofHealth)的资金号(Grants)1R43CA101283-01A1和RO1 NS32148提供部分资金。美国政府在本发明中拥有一定的权利。

发明领域

本发明涉及用抗体治疗脑肿瘤，更具体地涉及，例如，用结合并中和肝细胞生长因子的单克隆抗体治疗脑肿瘤。

发明背景

人肝细胞生长因子(HGF)是由间充质细胞产生的多功能异二聚体多肽。已显示HGF刺激血管发生，形态发生和移动发生(motogenesis)，以及不同类型细胞的生长和分散(Bussolino等，J.Cell.Biol.119：629，1992；Zarnegar and Michalopoulos，J.Cell.Biol.129：1177，1995；Matsumoto等，Ciba.Found.Symp.212：198，1997；Birchmeier andGherardi，Trends Cell.Biol.8：404，1998；Xin等，Am.J.Pathol.158：1111，2001)。HGF的多效活性通过其受体，即，由原癌基因cMet编码的跨膜酪氨酸激酶介导。除了调节多种正常细胞功能外，HGF及其受体c-Met还显示与肿瘤的引发，侵入和转移有关(Jeffers等，J.Mol.Med.74：505，1996；Comoglio and Trusolino，J.Clin.Invest.109：857，2002)。HGF/cMet在各种人实体肿瘤，包括起源于肺，结肠，直肠，胃，肾，卵巢，皮肤，多发性骨髓瘤和甲状腺组织的肿瘤中共表达，通常为过量表达(Prat等，Int.J.Cancer 49：323，1991；Chan等，Oncogene2：593，1988；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993；Derksen等，Blood 99：1405，2002)。对于这些肿瘤，HGF起到了自分泌(Rong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：4731，1994；Koochekpour等，CancerRes.57：5391，1997)和旁泌生长因子(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993)及抗细胞凋亡调节剂(Gao等，J.Biol.Chem.276：47257，2001)的作用。因此，阻断HGF-cMet途径的拮抗性分子，例如抗体，可能具有广泛抗癌治疗的潜力。

HGF是102kDa的蛋白，其序列和结构与纤溶酶原及其它凝血酶相似(Nakamura等，Nature342：440，1989；Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993，其均引入本文作为参考)。合成作为728个氨基酸前体的人HGF(preproHGF)，其在细胞内裂解成无活性的单链形式(proHGF)(Nakamura等，Nature 342：440，1989；Rosen等，J.Cell.Biol.127：1783，1994)。经胞外分泌后，proHGF裂解产生具有生物活性的由α-亚基和β-亚基组成的以二硫键连接的异二聚体分子(Nakamura等，Nature 342：440，1989；Naldini等，EMBO J.11：4825，1992)。α-亚基含有440个残基(69kDa，糖基化)，由N-末端发夹结构域和4个回环(kringle)结构域组成。B-亚基含有234个残基(34kDa)，并具有缺乏蛋白水解活性的丝氨酸蛋白酶样结构域。HGF裂解是受体活化所必需的，但不是受体结合所必需的(Hartmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11574，1992；Lokker等，J.Biol.Chem.268：17145，1992)。HGF含有4个推定的N-糖基化位点，其中1个在α-亚基中，另外3个在β-亚基中。HGF有2个独特的细胞特异性结合位点：cMet受体的高亲和力(Kd＝2×10-10M)结合位点和硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)的低亲和力(Kd＝10-9M)结合位点，均存在于细胞表面和细胞外基质上(Naldini等，Oncogene6：501，1991；Bardelli等，J.Biotechnol.37：109，1994；Sakata等，J.Biol.Chem.，272：9457，1997)。NK2(包围α-亚基的N-末端和前两个回环(kringle)结构域的蛋白)能满足与cMet结合和激活运动性的信号级联的需要，然而，促有丝***应答却需要全长蛋白(Weidner等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.8：229，1993)。HSPG通过与HGF的N-末端相互作用而结合至HGF(Aoyama，等，Biochem.36：10286，1997；Sakata，等，J.Biol.Chem.272：9457，1997)。HSPG-HGF相互作用的假定作用包括增强HGF的生物利用度，生物活性和寡聚化(Bardelli，等，J.Biotechnol.37：109，1994；Zioncheck等，J.Biol.Chem.270：16871，1995)。

cMet是IV类蛋白酪氨酸激酶受体家族的一员。全长cMet基因已被克隆，并被鉴定为cMet原癌基因(Cooper等，Nature 311：29，1984；Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6379，1987)。最初合成了cMet受体为单链，部分糖基化的前体p170(MET)(图1)(Park等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6379，1987；Giordano等，Nature 339：155，1989；Giordano等，Oncogene 4：1383，1989；Bardelli等，J.Biotechnol.37：109，1994)。经过进一步糖基化后，该蛋白经蛋白水解成由50kDa的α-亚基(残基1-307)和145kDa的β-亚基组成的190kDa的异二聚体成熟蛋白(1385个氨基酸)。β-亚基的细胞质酪氨酸激酶结构域参与信号转导。

已研究了几种不同方法去试图获得HGF/cMET的有效拮抗分子：截短的HGF蛋白，例如NK1(N-末端结构域加回环(kringle)结构域1；Lokker等，J.Biol.Chem.268：17145，1993)，NK2(N-末端结构域加回环(kringle)结构域1和2；Chan等，Science 254：1382，1991)和NK4(N-末端结构域加4个回环(kringle)结构域；Kuba等，Cancer Res.60：6737，2000)，以及抗cMet mAb(Dodge，硕士论文，旧金山州立大学(San Francisco State University)，1998)。

最近，Cao等人(Proc.Natl Acad.Sci.USA.98：7443，2001，其引入本文作为参考)报道，3种mAb与HGF的联合施用能抑制小鼠皮下神经胶质瘤异种移植物的生长。WO 2005/017107 A2报道，单用抗HGFmAb处理可以抑制小鼠皮下神经胶质瘤异种移植物的生长，该专利以全文引入本文作为通用目的的参考。然而，这些出版物都没有解决抗HGF或其它mAb的全身性施用是否可以抑制血脑屏障造成障碍的脑中肿瘤的生长的问题(Rich等，Nat.Rev.Drug Discov.3：430，2004)。实际上，先前观察到的抗体全身性治疗对中枢神经***(CNS)肿瘤的无效性已被归因为受限的血管通透性，甚至CNS转移(Bendell等，Cancer 97：2972，2003)。

因此，存在着对通过mAb的全身性施用治疗脑肿瘤的方法的需求。本发明满足这一需求及其它需求。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了通过mAb的全身性施用治疗患者的脑肿瘤的方法。脑肿瘤可以是神经胶质瘤，如星形细胞瘤，例如，成胶质细胞瘤。施用可以通过例如，静脉，肌内或皮下途径进行。在优选实施方案中，mAb是肝细胞生长因子(HGF)的中和mAb，例如，人源化L2G7mAb。在另一个优选实施方案中，mAb，例如，中和抗HGF mAb的全身性施用被用来诱导脑肿瘤的消退。

附图说明

图1.通过ELISA测量的抗HGF mAb的结合和阻断活性。A.对于结合作用，将mAb俘获至包被山羊抗小鼠IgG的ELISA板上，用BSA封闭，并与HGF-Flag(1μg/ml)一起孵育，然后与HRP-M2抗-FlagmAb(Invitrogen)一起孵育。B.对于阻断HGF-Flag与Met-Fc结合，将板以山羊抗人IgG-Fc包被，用BSA封闭，与Met-Fc(2μg/ml)一起孵育，然后与HGF-Flag(1μg/ml)+/-抗HGF mAb一起孵育。用HRP-M2抗Flag mAb检测结合的HGF-Flag。

图2.mAb L2G7对HGF的分散，促有丝***，血管生成和抗细胞凋亡活性的阻断作用。A.如文献(Cao等，Proc.Natl Acad.Sci.USA.98：7443，2001)中描述的那样，用50ng/ml HGF+/-10μg/ml L2G7刺激MDCK细胞(ATCC)2天。将细胞用结晶紫染色后，在100倍的放大倍数下拍照。B.Mv1Lu貂肺上皮细胞(ATCC；5×10⁴个细胞/ml)在含或不含HGF(50ng/ml)的无血清DMEM和L2G7或同种型匹配的对照mAb(mIgG)中孵育24h，加入3H-胸苷，6h测定细胞增殖水平。C.如文献(Xin等，Am.J.Pathol.158，1111，2001)中描述的那样，HUVEC(CAMBREX；10⁴个细胞/100μl/孔)在含或不含HGF(50ng/ml)的EBM-2/0.1％FCS和L2G7或对照mAb中孵育72h，通过加入WST-1，测定增殖水平。D.如文献(Xin等，Am.J.Pathol.158，1111，2001)中描述的那样，HUVEC(6×10⁴个细胞/100μl/孔)在DMEM/胶中用100μl/孔、含或不含200ng/ml HGF+/-20μg/ml L2G7的EMB-2/0.1％FCS/0.1％BSA覆盖。孵育48h后，固定细胞，用甲苯胺蓝染色，并在40倍的放大倍数下拍照。E.如文献(Fan等，Oncogene 24：1749，2005)中描述的那样，在无血清DMEM中的U87肿瘤细胞用或不用HGF(20ng/ml)+/-mAb L2G7(20μg/ml)或同种型对照抗体(mIgG)处理48h，然后用抗Fas mAb CH-11(Upstate Biotechnology，40ng/ml)处理24h，通过加入WST-1，测定细胞存活率。b，c和e中，数值为平均值±s.d。

图3.L2G7对神经胶质瘤异种移植物的抑制或消退。如文献(Kimet al，Nature 362：841，1993)中描述的那样，对NIH III Beige/Nude小鼠皮下移植U118(A)或U87(B)神经胶质瘤细胞，监测肿瘤大小。在肿瘤大小达到约50mm³后，各组小鼠(n＝6或7)按照指示，每周2次腹腔内给予(i.p.)50或100μg L2G7或100μg同种型匹配的对照mAb(mIgG)或PBS；箭头表示处理的第一天。数值为平均肿瘤体积±s.e.m。C.如文献(Abounader等，FASEB J.16，108，2002)中描述的那样向Scid/beige小鼠的尾状核/壳颅内注射U87肿瘤细胞(10⁵个/小鼠)。如箭头所示，分别开始和结束于第5天和第52天，各组小鼠(n＝10)每周2次腹腔内(i.p.)施用100μg L2G7或PBS，监测存活率。存活研究采用Kaplan-Meier曲线进行分析。D.3剂量的用每周2次腹腔内施用100μg L2G7或PBS后，在第21天被处死的代表性小鼠如文献(Abounader等，FASEB J.16，108，2002)中描述的那样制备的脑切片，显示了U87颅内移植物的大小。E.在开始预处理的第18天和用L2G7处理3次后的第29天，个体小鼠的颅内U87肿瘤体积。F.在预处理的第18天和用L2G7或对照mAb处理后的第29天，代表性小鼠的脑切片。

图4.具有U87颅内移植物的小鼠脑切片的组织学分析。用3个每周2次剂量的L2G7或对照处理已建立的肿瘤后，处死小鼠。将灌注固定的冷冻切片用H&E染色，用计算机辅助图像分析法定量确定所示抗体和指标。A.检测增殖细胞的抗Ki67(DAKO)。B.检测血管的抗层粘连蛋白(LifeTechnologies)。C.检测肿瘤细胞凋亡反应的裂解的caspase-3的抗体(Cell Signaling Technology)。

发明详述

本发明提供了通过针对HGF的中和mAb或针对其它细胞因子，例如生长因子，或细胞表面蛋白，例如细胞因子受体的抗体的全身性施用治疗脑肿瘤的方法。尽管对机制的了解不是本发明的实施所必需的，但我们认为，本发明的成功至少部分地归因于肿瘤内有缺陷的血脑屏障而使抗体从血液进入了脑肿瘤。

1.抗体

抗体是具有复杂内部结构的非常大的复合分子(分子量约150,000，或含有约1320个氨基酸)。天然抗体分子含有相同的两对多肽链，每对各含有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链依次由两个区域组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区和与免疫***的其它组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链的可变区在三维空间中折叠在一起，形成结合抗原(例如，细胞表面的受体)的可变区。在各轻或重链可变区内，有3个被称为互补决定区(“CDRs”)的短片段(平均长度为10个氨基酸)。抗体可变结构域中的6个CDRs(3个来自轻链，3个来自重链)在三维空间中折叠在一起，形成真实的锁定靶抗原的抗体结合位点。CDRs的位置和长度已经被精确定义过。Kabat，E.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department ofHealth and Human Services，1983，1987.未包含在CDRs中的可变区部分被称为框架，其形成CDRs的环境。

单克隆抗体(mAb)是单一分子种类的抗体，因此不包括通过向动物(例如啮齿动物，兔或山羊)注射抗原和从动物提取血清而产生的多克隆抗体。人源化抗体是基因工程(单克隆)化抗体，其中来自小鼠抗体(“供体抗体”，其也可以是大鼠，仓鼠或其它相似物种)的CDRs被移植到人抗体(“受体抗体”)上。人源化抗体也可以用小鼠抗体的不完整CDRs制备(例如，Pascalis等，J.Immunol.169：3076，2002)。因此，人源化抗体是具有来自供体抗体的CDRs和人抗体的可变区框架及恒定区的抗体。此外，为了保留高结合亲和力，可以采用两个其它结构元件中的至少一个。参见，美国专利No.5,530,101和5,585,089，其均引入本文作为参考，两者为人源化抗体的构建提供了详细指导。

在第一个结构元件中，通过在许多已知人抗体中适当地选择受体抗体，来选择与供体抗体的重链可变区框架具有最大序列同一性(在65％和95％之间)的人源化抗体重链可变区的框架。在第二个结构元件中，在构建人源化抗体时，按照特定规则，用来自供体抗体的相应氨基酸替代所选择的人受体抗体框架(CDRs除外)中的氨基酸。具体而言，框架中被替代的氨基酸的选择以其与CDRs相互作用的能力为依据。例如，当在三维空间中测量时，被替代的氨基酸可以邻近供体抗体序列中的CDR，或者在人源化抗体中CDR的4-6埃内。

嵌合抗体是其中小鼠(或其它啮齿动物)抗体的可变区与人抗体的恒定区结合的抗体；其依靠基因工程进行的构建是公知的。这类抗体在约2/3来源于人的条件下保留了小鼠抗体的结合特异性。小鼠嵌合和人源化抗体中存在的非人序列的比例提示嵌合抗体的免疫原性在小鼠和人源化抗体中间。其它类型的与小鼠抗体相比免疫原性降低的基因工程化抗体包括用噬菌体展示法(Dower等，WO91/17271；McCafferty等，WO92/001047；Winter，WO92/20791；以及Winter，FEBS Lett.23：92，1998，其均引入本文作为参考)或用转基因动物(Lonberg等，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741，其均引入本文作为参考)制备的人抗体。

本文所用术语“人样”抗体是指其中一条或两条链的氨基酸序列的主要部分(例如，约50％或更多)来源于人免疫球蛋白基因的mAb。因此，人样抗体包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体和人抗体。本文用到的“免疫原性降低”的抗体是期望在向人类患者施用时具有显著低于小鼠抗体的免疫原性的抗体。这样的抗体包括嵌合抗体，人源化抗体和人抗体，以及通过替换小鼠抗体中可以决定B或T细胞表位，例如，暴露的残基的特异性氨基酸而制得的抗体(Padlan，Mol.Immunol.28：489，1991)。本文用到的“基因工程化”抗体是在重组DNA技术的帮助下，其基因被构建或置于非自然环境(例如，在小鼠中或噬菌体上的人基因)的抗体，因此不包括，例如，采用传统杂交瘤技术制得的小鼠mAb。

mAb的表位是与mAb结合的其抗原的区域。如果两种抗体均竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则这两种抗体与相同或重叠的表位结合。即，在竞争性结合试验(参见，例如，Junghans等，Cancer Res.50：1495，1990，其引入本文作为参考)中测量时，1倍，5倍，10倍，20倍或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的至少50％，优选75％，90％甚至99％的结合。或者，如果抗原中几乎所有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变都能减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有相同的表位。如果有一些减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有重叠的表位。

2.中和抗HGF抗体

与HGF结合的单克隆抗体(mAb)(即，抗HGF mAb)，如果其部分结合或完全抑制HGF的一种或多种生物活性，则认为其中和HGF，或者是中和的(即，当mAb被用作单一试剂时)。中和抗体能抑制的HGF的生物学特性有HGF与其cMet受体结合，以导致某些细胞系，例如Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞分散；刺激某些细胞，包括肝细胞，4MBr-5猴上皮细胞和各种人肿瘤细胞增殖(即，促有丝***)；或者，例如，通过刺激人血管内皮细胞(HUVEC)增殖或管形成，或通过应用于鸡胚绒毛***(CAM)时对血管的诱导而进行测量时刺激血管发生的能力。本发明中使用的抗体优选与人HGF，即，由登录号为D90334的基因库(GenBank)序列编码的蛋白结合。类似地，针对任何细胞因子或细胞因子受体的中和，即，拮抗性抗体可以抑制细胞因子与受体的结合和/或抑制信号经细胞因子向细胞的传递。如果细胞因子是生长因子，则这样的抗体可以抑制由该细胞因子诱导的细胞增殖。

当通过实施例所述方法或本领域已知方法进行分析时，本发明中使用的中和mAb通常在例如0.01，0.1，0.5，1，2，5，10，20或50μg/ml的浓度下抑制细胞因子，例如，HGF的约至少50％，优选75％，更优选90％或95％甚至99％，最优选约100％(几乎完全)的生物学功能(例如，刺激增殖或血管发生)。抑制程度的测量通常在所用细胞因子的量刚好足够完全刺激生物活性，或者为0.05，0.1，0.5，1，3或10μg/ml时进行。优选至少50％，75％，90％或95％或几乎完全的抑制在抗体与细胞因子的摩尔比为0.5×，1×，2×，3×，5×或10×时达到。优选mAb是中和的，即，用作单一试剂时能抑制生物活性，但是，在一些方法中，一起使用了两种mAb，以产生抑制。最优选mAb不只是中和上文所列生物活性中的一种，而是几种；为此目的，用作单一试剂时中和HGF的所有生物活性的抗HGF mAb被称为“完全中和的”，并且这样的mAb是最优选的。本发明中使用的mAb优选对HGF具有特异性，即，其不与HGF相关蛋白，例如，成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)结合，或者仅以非常低的程度结合。mAb通常具有至少10⁷M^-1，优选10⁸M^-1或更高，最优选10⁹M^-1或更高，甚至10¹⁰M^-1或更高的结合亲和力(Ka)。

本发明中所使用的mAb包括天然四聚体形式的抗体(2条轻链和2条重链)，并且可以是任何已知的同种型IgG，IgA，IgM，IgD和IgE及其亚型，即，人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3。mAb还意味着包括抗体片段，例如Fv，Fab和F(ab′)2；双功能杂交抗体(例如，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17：105，1987)，单链抗体(Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879，1988；Bird等，Science 242：423，1988)；以及恒定区已改变的抗体(例如，美国专利No.5,624,821)。mAb可以是来源于动物(例如，小鼠，大鼠，仓鼠或鸡)，或者可以是基因工程化的产物。啮齿动物mAb通过本领域公知的标准方法制备，所述标准方法包括经腹腔内，静脉内施用或向足垫内施用在适当佐剂中的HGF，进行多重免疫，然后提取脾或***细胞，与适宜的无限增殖化细胞系融合，接着选择产生与HGF结合的抗体的杂交瘤，例如，参见以下的实施例。本发明的优选实施方案中使用了通过上述本领域已知方法制备的嵌合和人源化mAb。通过例如噬菌体展示或转基因小鼠法制得的人抗体也是优选的(参见，例如，上述Dower等，McCafferty等，Winter，Lonberg等，Kucherlapati)。更广泛地说，本文所定义的人样抗体，免疫原性降低的抗体和基因工程化抗体都是优选的。

中和抗HGF mAb L2G7(根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心，ATCC号为PTA-5162)是用于本发明的mAb的优选例子。寄存物将在经授权的保藏单位保藏，并且，在保藏单位收到最近的释放样品的请求后至少5年内，寄存日后至少30年内，或在相关专利的实施期内，以最长的时间为准，如果发生突变，不能存活或破坏，寄存物都将被替换。所有对公众对这些细胞系的可获得性的限制都将在专利申请被公布后不可撤回地取消。具有与L2G7相同或重叠的表位的中和mAb提供了其它例子。L2G7的变体，例如嵌合或人源化形式的L2G7是特别优选的。在本文所述体外或体内分析中与L2G7竞争与HGF结合，并中和HGF的mAb也是优选的。L2G7的其它变体，例如与L2G7在可变区氨基酸序列(例如，通过Kabat编号***进行对比时；Kabat等，上文所引文献)，至少在CDRs上具有90％，95％或99％的同一性，并且保留其功能特征的mAb，或者由于少量功能不相关性氨基酸置换(例如，保守置换)，缺失或***而不同于L2G7的mAb也可以在本发明中使用。其它优选mAb包括本文所定义的人样mAb，免疫原性降低的mAb和基因工程化mAb。

所例示的免疫球蛋白的任何氨基酸置换都优选为保守性氨基酸置换。为了将氨基酸置换分成保守性或不保守性的目的，可以将氨基酸分类如下：I类(疏水侧链)：met，ala，val，leu，ile；II类(中性亲水侧链)：cys，ser，thr；III类(酸性侧链)：asp，glu；IV类(碱性侧链)：asn，gln，his，lys，arg；V类(影响链取向的残基)：gly，pro；以及VI类(芳香族侧链)：trp，tyr，phe。保守置换包括同类氨基酸间的置换。非保守性置换通过某一类氨基酸的成员与另一类氨基酸的成员交换来进行。

其它优选用于本发明的mAb包括US2005/0019327A1或WO2005/017107A2中描述的所有抗-HGF mAb，不管其是通过名称或序列明确描述的，还是通过说明书或与所明确描述的mAb的关系暗示的(为了其关于抗体的公开内容和所有其它目的，将所引用的两篇申请均引入本文作为参考)。特别优选的mAb有由命名为1.24.1，1.29.1，1.60.1，1.61.3，1.74.3，1.75.1，2.4.4，2.12.1，2.40.1和3.10.1的杂交瘤产生的以及分别由WO2005/017107 A2的SEQ ID NO 24-43提供的重和轻链可变区序列限定的mAb；具有与所列任何一种mAb相同的各CDRs的mAb；轻和重链可变区与所列mAb的各可变区具有至少90％，95％或99％的同一性，或者仅因无意义的氨基酸置换，缺失或***而与其有差异的mAb；与和任何所列mAb相同的HGF表位结合的mAb，以及由其中的权利要求1-94所涵盖的所有mAb。序列同一性在免疫球蛋白可变区序列之间采用Kabat编号惯例进行对比确定。

在其它实施方案中，用于本发明，即，用于通过mAb的全身性施用而治疗脑肿瘤的mAb与下列生长因子中的一种或多种结合：血管内皮细胞生长因子(VEGF)；神经营养因子，例如神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)或NT-3；转化生长因子，例如TGF-α或TGF-β(TGF-β1和/或TGF-β2)；血小板源生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；heregulin；表皮调节素；emphiregulin；神经调节素(NRG-1α和/或NRG-1β，NRG-2α和/或NRG-2β，NRG-3或NRG-4)，***(IGF-1和IGF-2)；或在优选实施方案中，成纤维细胞生长因子(FGF)，特别是酸性FGF(FGF-1)，最优选碱性FGF(FGF-2)，或者为FGF-n，其中n是3-23的任何数字。通常，这样的mAb是中和对。在其它实施方案中，用于本发明的mAb与任何一种或多种上述生长因子的细胞受体结合。

用于本发明的天然mAb可以产生自其杂交瘤。基因工程化mAb，例如，嵌合或人源化mAb可以通过多种本领域已知的方法表达。例如，编码其轻和重链V区的基因可以由重叠的寡核苷酸合成，然后与可用C区一起***提供必需的调节区，例如，启动子，增强子，聚腺苷酸化位点等的表达载体(例如，可购自Invitrogen)。优选使用CMV启动子-增强子。然后表达载体可以用各种公知方法，例如脂质转染法或电穿孔法转染至多种哺乳动物细胞系，例如CHO或非生产性(non-producing)骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0，以及表达通过适当抗生素选择而选定的抗体的细胞。参见，例如，美国专利No.5,530,101。在商业化生物反应器中，可以通过培育细胞产生更大量的抗体。

用于本发明的mAb或其它抗体一旦表达，便可以按照本领域标准程序，例如微滤，超滤，蛋白A或G亲和层析，分子排阻色谱，阴离子交换层析，阳离子交换层析和/或基于有机染料的其它形式的亲和层析等进行纯化。对于药学用途，优选同质性至少约90％或95％的显著纯的抗体，最优选同质性为98％或99％或更高。

3.治疗方法

在优选实施方案中，本发明提供了用包括本文所述mAb的药物制剂治疗的方法。抗体的药物制剂包括冻干或水溶液形式的在药理学上可接受的载体，并任选含有赋形剂或稳定剂中的mAb。可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对受体无毒性，并且包括缓冲液，例如pH通常为5.0-8.0，最常见6.0-7.0的磷酸盐，柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液；盐，例如氯化钠，氯化钾等，以使等渗；抗氧化剂，防腐剂，低分子量多肽，蛋白质，亲水聚合物，例如聚山梨醇酯80，氨基酸，碳水化合物，螯合剂，糖及其它本领域技术人员公知的标准成分(Remington′s Pharmaceutical Science 16th edition，Osol，A.Ed.1980)。mAb通常以1-100mg/ml，例如，10mg/ml的浓度存在。mAb还可以包裹在载体，例如脂质体内。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了通过mAb，例如，中和抗-HGF mAb或针对细胞因子或其受体的抗体的全身性施用治疗脑肿瘤患者的方法。患者优选是人，但也可以是任何哺乳动物。在这里，全身性施用是指施用的途径，通过该途径，mAb可以全面进入循环***，并因此进入机体器官，包括脑部血管。换言之，mAb在血脑屏障外周施用。全身性施用的例子包括静脉输注或快速浓注，或肌内或皮下或腹膜内施用。然而，全身性施用不包括直接向肿瘤或器官，例如脑或其周围的膜或脑脊液中注射。静脉输注可以在短至15min内进行，但更常见的是进行30min或1，2，3个小时甚至4个小时或4个小时以上。所给剂量足以治愈，至少部分缓解或抑制被治疗病症的进一步发展(“有效治疗剂量”)。有效治疗剂量优选导致肿瘤的消退，更优选导致肿瘤的消除。有效治疗剂量通常为0.1-5mg/kg体重，例如，1，2，3或4mg/kg，但也可以高至10mg/kg，甚至15或20mg/kg。还可以给予固定的单位剂量，例如，50，100，200，500或1000mg，或者，剂量可以基于患者的表面积，例如，100mg/m²。以足以治愈，至少部分缓解或抑制被治疗病症的进一步发展的频率施用的有效治疗剂量被称为有效治疗方案。这样的方案优选导致肿瘤的消退，更优选导致肿瘤的消除。通常施用1-8个(例如，1，2，3，4，5，6，7或8次)剂量来治疗癌症，但也可以施用10，20或20个以上的剂量。mAb可以每天一次，每周两次，每周一次，每隔一周一次，每月一次，或者根据例如mAb的半寿期，以1周，2周，4周，8周，3-6个月或更长时间的一些其它间隔施用。重复的治疗过程也是有可能的，这是慢性施用。

本发明的方法，例如，mAb，如抗HGF mAb，特别是L2G7及其变体，包括人源化L2G7的全身性施用可以用来治疗所有脑肿瘤，包括：脑脊膜瘤；神经胶质瘤，包括室管膜瘤，少突神经胶质瘤和所有类型的星形细胞瘤(低度恶性，间变性和多形性成胶质细胞瘤或简单成胶质细胞瘤(simply glioblastoma))；髓质母细胞瘤(medullablastomas)，神经节神经胶质瘤，神经鞘瘤，脊索瘤；以及儿童原发性脑肿瘤，包括原发神经外胚层肿瘤。原发性脑肿瘤(即，起源于脑部)和继发性或转移性脑肿瘤都可以通过本发明的方法治疗。表达Met和/或HGF，特别是水平升高的Met和/或HGF的脑肿瘤尤其适合于通过中和抗HGF抗体，例如L2G7或其变体的全身性施用进行治疗。

在优选实施方案中，mAb与其它抗癌治疗联合施用(即，在其它抗癌治疗之前，期间或之后施用)。例如，mAb，例如抗HGF mAb，如L2G7及其变体可以与任一种或多种肿瘤学领域技术人员已知的化疗药物，例如，烷化剂，如卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺铂，卡铂，oxiplatin，丙卡巴肼和环磷酰胺；抗代谢物，如氟尿嘧啶，氟尿嘧啶脱氧核苷，氟达拉滨，吉西他滨，甲氨喋呤和羟基脲；天然产物，包括植物生物碱和抗生素，如博来霉素，多柔比星，柔红霉素，伊达比星，依托泊苷，丝裂霉素，米托蒽醌，长春碱，长春新碱和Taxol(紫杉醇)或相关化合物，如明确批准用于脑肿瘤的药剂，包括替莫唑胺和含有卡莫司汀的薄片；及其他药物，包括伊立替康和

以及WO 2005/017107 A2(其引入本文作为参考)中列出的所有已批准和实验性的抗癌剂一起施用。mAb可以在例如标准化学治疗方案中与1，2，3种或3种以上的这些药剂联合施用。其它可以与抗HGF mAb一起施用的药剂包括生物制品，如单克隆抗体，包括针对HER2抗原的Herceptin^TM，针对VEGF的Avastin^TM，EGF受体的抗体，如

或抗FGF mAb，以及小分子抗血管生成剂或EGF受体拮抗药物，如

和

此外，mAb可以和任一形式的放疗，包括外光束照射，适形调强放射治疗(Intensity Modulated.RadiationTherapy)(IMRT)和任何形式的放射手术，包括伽玛刀，赛勃刀(Cyberknife)，直线加速器(Linac)，以及组织内放射治疗(例如，植入放射性粒子，GliaSite球)一起施用。

尽管在本发明的优选实施方案中，mAb不与任何其它药剂结合或轭合，但在其它实施方案中，mAb可以与放射性同位素，化学治疗药物或前药或毒素轭合。例如，其可以与发射α，β和/或γ射线的放射性同位素，例如，90Y，碘同位素，如131I，或铋同位素，如212Bi或214Bi；植物或细菌蛋白毒素，如蓖麻毒蛋白或假单胞菌外毒素或其片断，如PE40；小分子毒素，如与加利车霉素，auristatin或美登素相关或由其衍生的化合物；化学治疗药物，如阿霉素(doxorubin)或任何上文所列其他化疗药物结合。将这些药剂与mAb结合的方法是本领域技术人员公知的。

mAb，例如，中和抗HGF mAb，如L2G7或其变体的全身性施用，任选地加上其它治疗(例如，化疗或放疗)，与不给予mAb的对照方案相比，可以增加具有某些脑肿瘤(例如，成胶质细胞瘤)的患者的中值无进展存活或总存活时间达至少30％或40％，优选50％，60％-70％，甚至100％或更多。如果抗-HGF mAb的施用伴随着其它治疗，例如化疗或放疗，则对照方案中也包括所述其它治疗。如果抗-HGF mAb的施用未伴随其它治疗，则对照方案是安慰剂或无特定治疗。另外，或者二者选一地，mAb，例如，中和抗HGF mAb，如L2G7或其变体的全身性施用，加上其它治疗(例如，化疗或放疗)，与不施用上文所述mAb的对照方案相比，可以提高具有某些脑肿瘤的患者的完全应答率(肿瘤的完全消退，即，缓解)，部分应答率(患者的部分应答是指肿瘤大小的部分缩小，例如，缩小至少30％或50％)或目标应答率(完全+部分)达至少30％或40％，优选50％，60％-70％，甚至90％或更高。对治疗应答的肿瘤大小的变化可以通过MRI，CT扫描等测定。

类似地，例如，按照下文实施例2中所描述的那样向颅内异种移植人神经胶质瘤的动物(例如，免疫缺陷小鼠，如裸鼠或SCID小鼠)全身性施用时，中和抗HGF mAb或抗FGF mAb或其它mAb将延长动物的中值存活期至少约25或30或40天，优选50，60或70天或更长，并且，这样的延长在统计学上是显著的。这一点甚至在将治疗的开始延迟到肿瘤细胞移植后至少5或18天或更长时间时仍然正确。此外，这样的治疗将使肿瘤平均缩小至少25％，优选50％，甚至75％；并且，用mAb治疗的动物的平均肿瘤体积将小于用对照治疗的动物的平均肿瘤体积的50％，甚至25％或10％。肿瘤大小通常在肿瘤细胞移植后21或29天测量。

通常地，在临床试验(例如，II期，II/III期或III期试验)中，通过mAb，例如，抗HGF mAb的施用进行治疗，并任选地加上其它治疗的患者与接受不含该抗体的对照方案的患者相比，其前述中值无进展存活期和/或应答率的增加在统计学上是显著的，例如，显著水平为p等于0.05或0.01，甚至0.001。完全和部分应答率按照癌症临床试验中常用的客观标准，例如，由美国国家癌症研究所和/或美国食品药品监督管理局列出或承认的客观标准进行测定。

实施例

1.抗HGF mAb的产生和体外特性

美国专利申请出版物No.US 2005/0019327 A1中已经对完全中和的抗HGF mAb L2G7的开发进行了描述，其引入本文作为参考。总之，用重组人HGF经足垫注射广泛免疫Balb/c小鼠，并通过常规方法由其产生杂交瘤。由融合至Flag肽的HGF(HGF-Flag)和融合至人IgG1 Fc区的Met胞外域(Met-Fc)组成的嵌合融合蛋白通过传统重组技术产生，并用于确定抗HGF mAb抑制HGF与其Met受体结合的能力。图1a显示了3种各自识别不同表位的单独的抗HGF mAb在溶液中俘获HGF的能力。尽管通过结合能力判定，IgG2a mAb L2G7对HGF的亲和力介于中间，但它是唯一一个在ELISA中完全阻断HGF-Flag与Met-Fc结合的mAb(图1b)。mAb L2G7对HGF具有特异性，因为其显示不与其它生长因子，如VEGF，FGF或EGF结合。

mAb L2G7阻断HGF与Met结合的能力提示其可能抑制所有由HGF诱导的细胞应答，但是这个推测需要验证，因为HGF的α和β-亚基介导不同的活性(Lokker等，EMBO J.11：2503，1992；Hartmann等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 89：11574，1992)。HGF的一个通过其α-亚基介导，并由此得到其替代名称“分散因子”的重要生物活性是诱导细胞分散的能力。图2a显示，L2G7能完全抑制由HGF诱导的MDCK上皮细胞的分散，一种广泛用于HGF分散活性定量的生物分析。HGF的通过其β-亚基介导的重要生物活性是对某些细胞类型的促有丝***作用。图2b显示，L2G7在mAb与HGF的摩尔比为1:1时完全抑制由HGF诱导的3H-胸苷在Mv 1 Lu貂肺上皮细胞中的掺入。因此，mAbL2G7阻断由HGF诱导的可由α和β-HGF亚基决定的生物活性。

血管发生是实体肿瘤的生长所必需的。HGF是强有效的血管生成因子(Grant等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 90：1937，1993)，HGF的肿瘤水平与人恶性肿瘤，包括神经胶质瘤的血管密度相关(Schmidt等，Int.J.Cancer84：10，1999)。HGF还可以刺激其它血管生成因子，如VEGF的产生，并且可以增强由VEGF诱导的血管发生(Xin等，Am.J.Pathol.158，1111，2001)。与血管发生有关的前两个步骤是内皮细胞增殖和微管形成。因此在三维胶原凝胶中确定了L2G7对HGF诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和血管样微管(vessel-like tubule)形成的影响。L2G7在mAb与HGF的摩尔比为1.5:1时完成抑制了HGF(50ng/ml，72h)对HUVEC增殖的刺激(图2c)。悬浮在三维胶原凝胶中的HUVEC在用HGF(200ng/ml，48h)刺激后形成了相互连接的分支微管网状***，而用HGF加L2G7处理的细胞则显示出很少或者没有这种微管形成(图2d)。因此，L2G7阻断由HGF诱导的血管发生的增殖和形态学方面。

HGF保护肿瘤细胞免于发生由多种形式，包括常用于癌症治疗的DNA损伤剂诱导的凋亡性死亡(Bowers等，Cancer Res.60：4277，2000；Fan等，Oncogene 24：1749，2005)。大多数人恶性神经胶质瘤细胞表达死亡受体FAS，从而使其在体外对由抗FAS抗体诱导的细胞凋亡敏感(Weller等，J.Clin.Invest.94：954，1994)。因此，确定了L2G7对HGF介导的对经凋亡性抗FAS mAb CH-11处理的U87神经胶质瘤细胞的细胞保护作用的影响。U87细胞经CH-11处理(24h)后，存活率下降至未经处理的对照的约45％，该作用通过预先用HGF在无关同种型对照抗体的存在下孵育细胞而被完全逆转，但在L2G7存在下未被HGF逆转(图2e)。

2.抗HGF mAb在神经胶质瘤异种移植瘤模型中的作用

L2G7阻断HGF的多重促肿瘤活性的能力提示该mAb至少对HGF+/Met+人肿瘤具有抗肿瘤活性。大多数神经胶质瘤显示表达Met和HGF(Rosen等，Int.J.Cancer 67：248，1996)。对于神经胶质瘤细胞系U87和U118，已通过流式细胞术分析证实了Met的表达，并且采用HGF特异性的ELISA在7天的铺满旧培养物的上清液中检出了约20-35ng/ml的HGF。确定了L2G7在已建立的U118和U87皮下异种移植物的裸小鼠模型中的抗肿瘤作用。如文献所述(Kim等，Nature362：841，1993，其引入本文作为参考)，在肿瘤大小达到约50mm³后，每周以L2G7腹腔内施用2次。在每次注射100μg(约5mg/kg)的剂量下，L2G7完全抑制了U118肿瘤的生长(图3a)。在U87移植物模型中，每次注射50μg或100μg L2G7不仅抑制了肿瘤生长，而且实际导致了肿瘤消退(图3b)。对照mAb(每次注射100μg)与PBS对照相比仅轻微抑制了肿瘤生长。L2G7对表达Met但不分泌HGF的U251神经胶质瘤异种移植物的生长无作用。这些体内结果证明，作为单一试剂的L2G7通过特异性地阻断HGF活性而阻止肿瘤生长。

随后，在已建立颅内U87神经胶质瘤异种移植物的小鼠中检查了L2G7的效力。通过向右侧尾状核/壳立体定向(stereotactic)注射，给小鼠植入U87人恶性神经胶质瘤细胞(100,000个细胞/动物)。植入后第5天至第52天施用L2G7(100μg/注射，腹腔内施用，每周2次)，显著延长了动物存活期(图3c)。在对照小鼠中，中值存活期为39天，并且到第41天时，所有小鼠均死于进行性(progressive)肿瘤。相比之下，所有经L2G7处理的小鼠都活过了第70天，并且80％的小鼠活过了第90天，停止mAb处理后7周(图3c)。在3次剂量L2G7后第21天处死的小鼠中，对照肿瘤比经L2G7处理的肿瘤大10倍以上(6.6+2.7mm³对0.54+0.17mm³)(图3d)。

为了在更苛刻的条件下测试mAb的效力，在类似的实验中将L2G7处理的开始时间延迟到了第18天。在处理过程的早期处死亚组小鼠(每组n＝5)，通过采用计算机辅助图像分析法通过测量经H&E染色的脑切片的肿瘤横切面积，定量确定肿瘤体积。L2G7诱导了肿瘤的显著消退(图3e，f)。具体而言，处理之前的肿瘤在第18天时的体积为26.7+2.5mm³(范围：19.5-54mm³，中值：27.9mm³)。在第29天，即，3次剂量的L2G7之后，肿瘤体积仅为11.7+5.0mm³(范围：0-26.2mm³，中值7.5mm³)，因此，肿瘤事实上已消退或平均缩小50％或更多。经同种型配对的对照mAb处理的肿瘤第29天时的体积为134.3+22.0mm³(范围：71.2-196.8mm³，中值128mm³)。因此，经对照mAb处理的肿瘤生长了近5倍，平均体积比经L2G7处理的肿瘤大12倍。在未处死的小鼠(每组n＝10)中，对照小鼠的中值存活期是32天，并且到第42天都已死亡，而经L2G7处理的小鼠在第46天之前无一死亡，并且L2G7使中值存活期延迟到了第61天。因此，L2G7诱导了肿瘤负荷很高的小鼠的肿瘤消退。

为研究L2G7的抗肿瘤作用的可能机制，对颅内肿瘤的组织切片进行了更详细的分析(图4)。在3次剂量的L2G7之后，肿瘤细胞增殖(Ki-67指数)和血管发生(血管密度，即，用抗层粘连蛋白染色的肿瘤血管的面积占肿瘤面积的百分比)分别下降了51％和62％，而通过活化型caspase-3阳性细胞的数量定量的肿瘤细胞的凋亡指数增加了6倍。在开始L2G7治疗后不久发生的显著肿瘤消退显示了类似于在用激动剂抗死亡受体4(TRAIL1)mAb处理的人结肠肿瘤Colo 205异种移植物中观察到的细胞死亡反应(Chuntharapai等，J.Immunol.166：4891，2001)。

本文报道的结果是脑肿瘤对未结合毒素或放射性核素的mAb反应的显著例子。作为比较，在皮下异种移植模型中，与mAb L2G7几乎完全抑制U87和U118神经胶质瘤的生长相比，抗VEGF鼠mAb A4.6.1仅抑制约50-60％的G55人神经胶质瘤的生长(Kim等，Nature362：841，1993)，所述A4.6.1后来经人源化产生了药物Avastin。在颅内同位肿瘤模型中，与G55神经胶质瘤细胞移植同时进行的抗VEGF mAb的全身性施用仅使动物存活期延长了2-3周(Rubenstein等，Neoplasia2：306，2000)。类似地，EGF受体变体的mAb的全身性施用大体上适度地延长了颅内移植有转染EGF受体变体的神经胶质瘤细胞的小鼠的中值存活期(从13天延长到21天，或从13天延长到19天，但有一例从19天延长到58天；Mishima等，Cancer Res.61：4349，2001)。然而，这些适度的作用在mAb的施用与异种移植同时开始，或在异种移植后不久开始的情况下达到，因此很可能至少部分地由延迟异种移植物血管化作用的开始而导致，所述延迟异种移植物血管化作用的开始在已存在脑肿瘤的患者中是不可能靶向的事件。相比之下，抗HGF mAbL2G7的全身性施用，甚至在移植后第5天，甚至第18天，肿瘤已很好地建立时施用的情况下仍延迟了存活期，并导致了肿瘤消退，因此符合人类患者的情况。

mAb L2G7的显著抗肿瘤作用很可能是由于其分子靶点HGF的独特的多功能特性，即，促有丝***，血管生成和细胞保护特性(Birchmeier等，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4：915，2003；Trusolino等，Nat.Rev.Cancer4：289，2002)。L2G7诱导神经胶质瘤消退的能力暗示了可能因Fas介导的细胞凋亡或灭活HGF诱导的细胞保护途径引起的细胞死亡反应，所述细胞凋亡通过HGF结合至Met阻断，所述细胞保护途径涉及磷脂酰肌醇-3激酶，Akt和NF-kappaB中间体(Fan等，Oncogene 24：1749，2005)。L2G7阻断HGF的细胞保护和血管生成作用的能力预示全身性递送的L2G7加强了目前用于治疗恶性脑肿瘤的细胞毒形式，如γ射线和化疗。

尽管已参考本申请优选的实施方案对本发明进行了描述，但应了解的是，可以在不背离本发明的条件下进行各种修饰。

为了通用目的，所引用的所有出版物，专利和专利申请都以其全文，以似乎单个出版物，专利和专利申请具体并单独为了通用目的引入本文作为参考一样的程度引入本文作为参考。

Claims (23)

1.治疗患者脑肿瘤的方法，包括向脑肿瘤患者全身性施用单克隆抗体(mAb)，并由此治疗脑肿瘤。

2.权利要求1的方法，其中的mAb是嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。

3.权利要求1的方法，其中的mAb是中和抗HGF mAb。

4.权利要求2的方法，其中的mAb是人源化L2G7 mAb。

5.权利要求1的方法，其中的mAb经静脉内施用。

6.权利要求1的方法，其中的脑肿瘤是神经胶质瘤。

7.权利要求6的方法，其中的脑肿瘤是成胶质细胞瘤。

8.权利要求1的方法，其中的患者是人。

9.权利要求1的方法，其中的患者还经放射疗法治疗。

10.权利要求1的方法，其中的mAb与一种或多种其它活性抗癌药物一起施用。

11.权利要求1的方法，其中的mAb与选自如下的生长因子结合：血管内皮细胞生长因子(VEGF)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，NT-3，转化生长因子(TGF)-α(TGF-α)，TGF-β1，TGF-β2，血小板源生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，heregulin，表皮调节素，emphiregulin，神经调节素(NRG)-1α(NRG-1α)，NRG-1β，NRG-2α，NRG-2β，NRG-3，NRG-4，***(IGF)-1(IGF-1)，IGF-2，酸性成纤维细胞生长因子(FGF)(FGF-1)，碱性FGF(FGF-2)和FGF-n，其中n是3-23的任一数字。

12.引起患者脑肿瘤消退的方法，包括向脑肿瘤患者全身性施用单克隆抗体(mAb)，并由此引起脑肿瘤消退。

13.权利要求12的方法，其中的mAb是嵌合抗体，人源化抗体或人抗体。

14.权利要求12的方法，其中的mAb是中和抗HGF mAb。

15.权利要求13的方法，其中的mAb是人源化L2G7 mAb。

16.权利要求12的方法，其中的mAb经静脉内施用。

17.权利要求12的方法，其中的脑肿瘤是星形细胞瘤。

18.权利要求17的方法，其中的脑肿瘤是成胶质细胞瘤。

19.权利要求12的方法，其中的消退是完全消退。

20.权利要求12的方法，还包括用放射疗法治疗患者。

21.权利要求12的方法，其中的mAb与一种或多种其它活性抗癌药物一起施用。

22.权利要求12的方法，其中的mAb与选自如下的生长因子结合：血管内皮细胞生长因子(VEGF)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，NT-3，转化生长因子(TGF)-α(TGF-α)，TGF-β1，TGF-β2，血小板源生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，heregulin，表皮调节素，emphiregulin，神经调节素(NRG)-1α(NRG-1α)，NRG-1β，NRG-2α，NRG-2β，NRG-3，NRG-4，***(IGF)-1(IGF-1)，IGF-2，酸性成纤维细胞生长因子(FGF)(FGF-1)，碱性FGF(FGF-2)和FGF-n，其中n是3-23的任一数字。

23.中性抗HGF抗体在制备用于通过全身性施用治疗脑肿瘤的药物中的应用。

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