CN101503692A

CN101503692A - 利用dreb2b基因培育耐旱甘蔗品种的方法

Info

Publication number: CN101503692A
Application number: CNA2008100706211A
Authority: CN
Inventors: 张木清; 吴杨; 陈如凯
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2008-02-05
Filing date: 2008-02-05
Publication date: 2009-08-12

Abstract

一种利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，包括含有DREB2B基因的植物表达载体的构建、抗旱转DREB2B基因材料的培育以及抗旱转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。根据上述培育方法，甘蔗在干旱胁迫下诱导抗旱基因的表达，其抗旱性明显优于受体品种，而且不同无性世代间基本保持稳定；在干旱条件下，生长快于受体品种，株高增加20％以上，有效茎数增加30％以上，每公顷蔗茎产量增加 30％，甘蔗糖份(绝对值)提高1.5％以上。

Description

利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法

技术领域

本发明涉及一种运用基因工程技术培育甘蔗品种的方法，特别是利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，属于植物基因工程技术领域。

技术背景

甘蔗是我国乃至全世界最重要的糖料作物，也是理想的可再生能源作物和转基因安全植物。我国甘蔗85％以上种植在丘陵旱地，干旱成为制约我国甘蔗产业发展的主要限制因素。因此抗旱优质高产甘蔗新品种的设计、选育和推广具有广泛的前景。

二十世纪九十年代初，国内外开始从事抗非生物胁迫基因的研究，抗逆转基因的研究取得了很大进展，如将编码胆碱脱氢酶基因BetA转化到烟草和马铃薯中，获得了抗盐和耐低温的转基因材料(Lilius etal，1996)；通过转基因手段增加烟草中甜菜碱的含量，可明显提高烟草对盐和寒冷胁迫的忍耐能力(Nakamura et al.，1997)；将烟草的Mn-SOD基因转入M.saliva中，使M.saliva在干旱胁迫下的产量和存活率都有提高(McKersie et al.，1999)。但植物的抗逆性往往是由多基因控制的数量性状，植物对干早、高盐及低温抗性的强弱往往不取决于某单一基因，而是受许多基因的共同调控。抗旱信号关键因子可以调控许多相关功能基因的表达(刘强，2000)，因此，通过增强某些抗旱信号关键因子的作用可使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良，与导入或改良个别功能基因提高某种抗性的传统方法相比，导入抗旱信号因子基因将是提高作物抗逆性的更为有效的方法和途径。

DREB转录因子(Dehydration responsive element binding protein)是一种特异性的转录因子，当植物在高盐、低温及干旱逆境胁迫下，DREB转录因子被诱导表达，然后与DRE元件特异结合，启动下游与抗逆性相关的功能基因表达，调节植物体内各种生理生化反应，最终使植物对环境胁迫的抗逆性得以提高。DREB转录因子可以激活具有DRE顺式作用元件的一系列抗性基因，如rd29A，corl5a、erdl0、kin1、rd17、rd22等。这些基因的表达产物在植物抗逆反应中发挥着不同的功能，从而使植株的抗逆性获得提高(Jaglo-ottosen等，1998；Liu等，1998；Gilmour等，2000；Jaglo-Ottosen等，2001；Park等，2001；Dubouzet等，2003；Kasuga等，2004)。因此，DREB在植物的逆境应答过程中充当“总开关”的角色：一个转录因子的过量表达可以促使多个功能基因发挥作用，使植株耐逆性得到综合改良。抗逆相关转录因子DREB与细胞发育(Drews，1991)、激素(Ohme，1995)、抗病(Zhou，1997)、抗低温(Kasuga，1999)以及干旱、高盐(Liu，1998)等信号传递有关，在各种基因表达中起重要调控作用。自Stockinger(1997)通过农杆菌转化法把DREB基因导入拟南芥中，现已获得许多抗逆转DREB基因植物。

申请号为200710008719.X的发明专利“利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法”，介绍了一种通过构建含pmi基因的植物表达载体，利用甘露糖作为选择剂、氯酚红法快速检测抗性植株获得转基因植物的方法。

本发明就是针对以上背景技术，通过构建含DREB2B基因的植物表达载体，利用基因枪转导的方法，通过潮霉素(hygromycin)或甘露糖筛选以及快速、高效的转基因检测技术，大幅度提高甘蔗抗旱育种效率，为甘蔗抗旱品种的培育奠定良好技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法。所解决的技术问题是一种利用转基因技术改良甘蔗抗旱的方法。具体地说，利用具有潮霉素或磷酸甘露糖异构酶筛选标记的载体，构建含有DREB2B基因的植物表达载体，利用基因枪转导将其***到甘蔗品种福农95-1702的基因组中，经过转基因筛选体系以及分子检测技术获得抗性转基因甘蔗。

本发明利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法，包括含有DREB2B基因的植物表达载体的构建、抗旱转DREB2B基因材料的培育以及抗旱转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于包括以下步骤：

1、构建植物表达载体，所述植物表达载体为pRD29A-DREB-Hyg和pRD29A-DREB-pmi；所述的pRD29A-DREB-Hyg是以DREB2B为目的基因，RD29A为启动子，Nos-PolyA为终止子，Hyg为筛选标记基因的植物表达载体；所述的pRD29A-DREB-pmi是以DREB2B为目的基因，RD29A为启动子，Nos-PolyA为终止子，pmi为筛选标记基因的植物表达载体；

2、通过基因枪转导的方法把上述的含有pRD29A-DREB-Hyg和pRD29A-DREB-pmi的载体转入甘蔗外植体中；

3、经过在含潮霉素或甘露糖的培养基中继代、分化、生根获得抗性植株；所述含有潮霉素或甘露糖的培养基，即分别在继代培养基、分化培养基和生根培养基中添加10～50g·L^-1潮霉素，或者添加20～70％(w/v)的甘露糖替代蔗糖；所述继代培养基成分为：MS+2，4-D 2.0mg·L^-1，调节pH5.8；所述分化培养基成分为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1+KT2.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1，调节pH5.8；所述促根培养基成分为：1/2MS+NAA 3.0mg·L^-1+6-BA 0.1mg·L^-1+蔗糖40g·L^-1，调节pH5.8。

4、通过PCR、southern dot-blotting检测获得转DREB2B基因的甘蔗植株。

根据上述培育方法获得的转DREB2B基因抗旱品种，其抗旱性、光合能力、产量、糖份都优于甘蔗受体品种福农95—1702及其组培后代。已获得的转DREB2B基因甘蔗品种分别为DR₄、DR₁₃、DR₁₅和DR₄₄。

本发明的转基因甘蔗品种具有以下优点：甘蔗在干旱胁迫下诱导抗旱基因的表达，其抗旱性明显优于受体品种，而且不同无性世代间基本保持稳定；在干旱条件下，生长快于受体品种，株高增加20％以上，有效茎数增加30％以上，每公顷蔗茎产量增加30％，甘蔗糖份(绝对值)提高1.5％以上。

具体实施方式

实施例是为了更详细地解释本发明利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，但本发明不局限于此。

本发明所用的主要仪器设备：

(1)AB204N电子分析天平：瑞士梅特勒公司；

(2)EPS 301电泳仪：安发玛西亚公司；

(3)Ultrospec 2100型核酸蛋白测定仪：瑞典APBiotech公司；

(4)生物安全柜：上海力新有限公司；

(5)基因枪(PDS-1000He)：美国Bio-Rad公司；

(6)Master Cyclergradient 96 PCR仪：德国Eppendorf公司；

(7)BIO-PROFIL凝胶成像及分析***：法国VL公司；

(8)Model 400型杂交箱：美国的Robbin公司；

(9)UVC500紫外交联仪：美国Hoefer公司；

(10)5810R型台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；

(11)RC-5C PLUS落地式高速冷冻离心机：美国Kendro公司；

(12)真空离心浓缩***：德国Eppendorf公司。

常用内切酶和试剂盒：

限制性内切酶、Access RT-PCR System试剂盒购自Promega公司；

M-MLV逆转录酶、Trizol试剂盒购自Gibico-BRL公司；

Southern杂交试剂盒购自Clontech公司；

PCR片段回收试剂盒、Ex Tag DNA聚合酶购自宝生物(大连)公司；

引物、测序工作由上海生物生工工程有限公司完成。

常用化学试剂：

尼龙膜购自Millipore公司；

RNaseA购自北京华美生物工程公司；

CaCl₂·2H₂O(C-7902)、亚精胺(S-0266)购自Sigma公司

IPTG、X-Gal、等购自宝生物工程(大连)有限公司；

潮霉素、甘露糖等抗生素购自北京欣经科生物技术有限公司；

DNA Marker、dNTPs混合物、DEPC购自上海生物工程有限公司；

其它试剂购自上海生工生物工程有限公司或国产分析纯试剂。

实施例：一种利用DREB2B基因培育耐旱甘蔗品种的方法，包括以下步骤：

一、抗旱转DREB2B基因植物表达载体的构建

用NcoI和SphI双酶切PC-hyg，将切下的nos终止子***到用NcoI和SphI双酶切的TDREB载体中，得到TDREB-NOS中间载体。用EcoRI和SacI双酶切pGreen-hyg，将切下的35s-hyg-polyA结构单元***到用EcoRI和SacI双酶切的T-Prd29a质粒中，得到rd29a-hyg中间载体。然后用PstI和SphI双酶切TDREB-NOS中间载体，将切下的DREB-Nos***到用PstI和SphI双酶切的rd29a-hyg中间载体中，得到rd29a-dreb-hyg植物表达载体，用PstI和SphI单双酶切鉴定该重组体。操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定为分子生物学的常规方法。

二、用于遗传转化受体的获得

供试品种为福建农林大学甘蔗研究所培育的甘蔗新品种福农95-1702。首先进行消毒处理，选取生长旺盛的福农95-1702梢部30cm，去其叶片及顶端5cm。用70％酒精表面消毒2～3min后，超净工作台上剥去其最外层，再用70％酒精表面消毒1～2min后剥去次外层，然后小心切取直径为0.4～0.8cm，厚为1～2mm的新叶，接种于诱导培养基上，于暗室中培养，培养温度为(25±1℃)。每15天在继代培养基中继代一次。选取生长良好，富有光泽，颜色鲜黄，组织块颗粒致密的胚性愈伤为遗传转化的受体材料。

三、抗旱转DREB2B基因材料的培育

(1)受体材料预处理：在基因枪轰击前先将受体材料转入继代培养基中预培养2d，然后转入含渗透剂0.2mol·L^-1甘露醇和0.2mol·L^-1山梨醇的继代培养基中预处理4～6h。

(2)基因枪轰击：将预先准备好的装有愈伤组织的小培养皿放入基因枪室的托盘上，关闭基因枪门，利用气压1100psi和射击距离6cm直接轰击甘蔗胚性愈伤组织。

(3)过渡培养：轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基(MS+2，4-D2mg·L^-1+Sorbitol 0.2mol·L^-1+Mannitol 0.2mol·L^-1)上继续处理18h，其后接入MS+2，4-D 2mg·L^-1的培养基上25℃暗恢复培养5～8d。

(4)筛选继代培养：恢复后的愈伤组织转移至继代培养基中继代筛选，15d继代一次。继代筛选培养基成分为：培养基MS+2，4-D 2.0mg·L^-1+50mg·L^-1潮霉素或40％甘露糖替代蔗糖的培养基，调节pH5.8。

(5)筛选分化培养：选择继代二次后仍存活的愈伤组织，转接入含有潮霉素(35g·L^-1)或30％甘露糖替代蔗糖的分化培养基进行筛选分化。筛选分化培养基成分为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1+KT 2.0mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂7g·L^-1+35mg·L^-1潮霉素(35g·L^-1)或30％的甘露糖替代蔗糖，调节pH5.8。

(6)筛选促根培养：抗性苗长到2-4cm后，转入含有潮霉素(30g·L^-1)或30％甘露糖替代蔗糖的生根培养基上筛选和生根培养。生根培养基的成分为：1/2MS+NAA 3.0mg·L^-1+6-BA 0.1mg·L^-1+蔗糖40g·L^-1+潮霉素30g·L^-1或30％的甘露糖替代蔗糖，调节pH5.8。

(7)炼苗和移栽：当幼苗的根长至2.5cm长时，移到室外炼苗2d，然后将小苗取出，用流水洗净附着的培养基，移栽到小花盆中(草木灰:砂子:耕作土＝1:1:1，混合后高压灭菌)定时喷浇稀释10倍的MS无机盐液。

(8)转基因植株的分子检测：根据所转导的启动子RD29A基因和DREB2B基因分别设计上下游特异引物，分别进行PCR、Southern，对转基因植株进行目的基因分子检测。Southern杂交采用Roche公司DIG HighPrimer DNA Labeling and Detection Starter Kit I的试剂盒，操作过程严格按照试剂盒提供的指南方法。

四、抗旱高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定

根据国家转基因安全管理条例，将获得的转基因植株及相应的对照(空载体轰击获得的植株以及受体品种福农95—1702)分别在盆栽水分胁迫和大田生长条件下进行抗旱性和生长、产量和糖份的筛选鉴定，结合抗旱、增产的生理生化指标，筛选评价转基因无性系。在转基因中间试验阶段，进行温室盆栽和大田进行人工干旱胁迫鉴定；在环境释放试验阶段进行工农艺性状的评价；在生产试验示范阶段进行较大面积的田间鉴定和工农艺性状的评价，筛选抗旱转基因甘蔗新种质材料。

(1)抗旱性评价

●株高伤害率检测

采用田间鉴定方法，试验区设3次重复，小区面积不小于33.3m²。根据各地常年的降水分布和旱情，当旱季开始时，每5天调查10株甘蔗的茎、叶生长速度，连续调查一个月。当土壤含水量下降到临界萎蔫点，或蔗叶整天处于萎蔫状态、清晨无吐水时，试验区二个重复继续干旱胁迫，一个重复浇水灌溉，以保持正常生长。

●丙二醛含量的检测

采用人工水分胁迫试验。试验分水分胁迫处理组和正常供水对照组，每组每份品系种植20株，定量供水以保持土壤水分的一致性。甘蔗伸长初期时，除正常供水对照组继续供水外，水分胁迫处理组开始停止供水处理，停水后当全国统一对照种(ROC10)蔗叶相对含水量下降10～20％或蔗叶整天处于萎蔫状态，清晨无“吐水”时，每隔2天测定分析丙二醛含量，共四次。

从蔗株上取+1叶5片，迅速带回实验室，用自来水漂洗叶片以除去表面沾污物，再用去离子水冲洗一次，用干净纱布轻轻吸干表面的水分。称取甘蔗叶片0.5g，加入5mL 10％ TCA(三氯醋酸)溶液研磨成匀浆，3000rpm离心10min，取上清夜2mL，加入等体积0.67％ TBA(硫代巴比妥酸)，沸水浴中反应20min，冷却后离心，上清液分别在532nm和600nm处测定吸光值。

式中：ε＝155L/mmoL·cm；b为比色杯光程；v1为加入提取液的体积；v2为吸取上清夜的体积。

●相对质膜透性的检测

从上述干旱胁迫的蔗株上取+1叶5片，迅速带回实验室，用自来水漂洗叶片以除去表面沾污物，再用去离子水冲洗一次，用干净纱布轻轻吸干表面的水分。用孔径为1cm的钻孔器打取圆片(避开中脉)；每个处理分甲乙两组，每组重复3次，每份1.0g；放入编号的玻璃小烧杯中，用带+字头的小玻璃棒把材料轻轻压住，立即加入20mL去离子水，使样品完全浸没于水中。甲组样品集中放置于真空干燥器中，用真空泵反复抽气，真空压强为0.04～0.05MPa，放气3～4次，除去水与叶片表面之间的空气，使叶片与水接触紧密而电解质易于渗出。减压浸渗30min后可恢复常压，在26～30℃间保温2h；烧杯中的乙组样品盖上玻璃球后直接置沸水浴上加温15min，杀死组织。甲组样品保温后和乙组样品杀死冷却后，把组织外渗液分别倾入洁净的小烧杯中，用电导率仪测定电导率(μΩ/cm)。

●抗旱性评价：

抗旱品种在水分胁迫30天或盆栽中度水分胁迫下要求丙二醛含量低于7.0μmol·g^-1FW，质膜透性低于30％，株高伤害率低于30％

●结果：转基因甘蔗的抗旱性明显高于受体品种，其在中度水分胁迫下，叶片丙二醛(MDA)含量在3.5～5.5μmol·g^-1FW，质膜透性在5～24％，株高伤害率都小于30％。

(2)生长和工农艺性状筛选：

田间甘蔗出苗率达到50％以后，开始调查出苗率，每周调查一次，直至稳定；甘蔗生长速度调查分蘖结束后开始，每30天调查一次直到11月份。在甘蔗工艺成熟期，测量其锤度、株高、茎径并计算有效径数；糖份分析在11月中旬开始，每隔15天采样分析蔗糖份、蔗汁纯度、锤度、纤维分等。

Claims

1、一种利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法，包括含有DREB2B基因植物表达载体的构建、抗旱转DREB2B基因材料的培育以及抗旱转基因甘蔗新材料的筛选鉴定，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建植物表达载体，所述植物表达载体为pRD29A-DREB-Hyg和pRD29A-DREB-pmi；

(2)通过基因枪转导的方法把pRD29A-DREB-Hyg和pRD29A-DREB-pmi转入甘蔗外植体中；

(3)经过在含潮霉素或甘露糖培养基中继代、分化、生根获得抗性植株；

(4)通过PCR、southern dot-blotting检测获得转DREB2B基因的甘蔗植株。

2、根据权利要求1所述的一种利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法，其特征在于所述的pRD29A-DREB-Hyg是以DREB2B为目的基因，RD29A为启动子，Nos-PolyA为终止子，Hyg为筛选标记基因的植物表达载体；所述的pRD29A-DREB-pmi是以DREB2B为目的基因，RD29A为启动子，Nos-PolyA为终止子，pmi为筛选标记基因的植物表达载体。

3、根据权利要求1或2所述的一种利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法，其特征在于所述的含潮霉素培养基是分别在继代培养基、分化培养基和生根培养基中添加10～50g·L^-1潮霉素。

4、根据权利要求1或2所述的一种利用DREB2B基因培育抗旱甘蔗品种的方法，其特征在于所述的含甘露糖培养基是分别在继代培养基、分化培养基和生根培养基中添加20～70％的甘露糖替代蔗糖。