CN101498729A - 快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸及其制备法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，包括上样垫(1)、含有金标记的msp2抗体的胶体金垫(2)、包被质控线(6)和检测线(5)的硝酸纤维素膜(3)以及吸样垫(4)，在硝酸纤维素膜(3)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，上样垫(1)位于胶体金垫(2)的上表面；检测线(5)为包被在硝酸纤维素膜(3)上的msp2多克隆抗体，质控线(6)为包被在硝酸纤维素膜(3)上的羊抗兔IgG抗体。本发明还同时提供了上述免疫层析试纸的制备方法。该免疫层析试纸适合于现场诊断人粒细胞无形体病。

Description

快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸及其制备法

技术领域

本发明属于快速诊断的免疫层析试纸领域，特别是涉及一种含有金标记的msp2抗体检测人粒细胞无形体病的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)是由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒细胞引起，以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现的蜱传疾病。自1994年美国报告首例人粒细胞无形体病病例以来，近年来美国每年报告的病例约600-800人。2006年，我国在安徽省发现人粒细胞无形体病病例，其他部分省份也有疑似病例发生。目前，已报道有人粒细胞无形体病的国家有美国、斯洛文尼亚、法国、英国、德国、澳大利亚、意大利及韩国等，但仅美国和斯洛文尼亚分离到病原体。根据国外研究，该病与莱姆病的地区分布相似，我国莱姆病流行区亦应关注此病。该病临床症状与某些病毒性疾病相似，容易发生误诊，严重者可导致死亡。

嗜吞噬细胞无形体呈球状多型性，革兰氏染色阴性，主要寄生在粒细胞的胞质空泡内，以膜包裹的包涵体形式繁殖。用Giemsa法染色，嗜吞噬细胞无形体包涵体在胞质内染成紫色，呈桑葚状(图1)。嗜吞噬细胞无形体为专性细胞内寄生菌，缺乏经典糖代谢途径，依赖宿主酶***进行代谢及生长繁殖，主要侵染人中性粒细胞。嗜吞噬细胞无形体的体外分离培养使用人粒细胞白血病细胞系(HL-60)，主要存在于HL-60细胞内与膜结构相连的空泡内，生长繁殖迅速。其感染的空泡内无查菲埃立克体感染所形成的纤维样结构。嗜吞噬细胞无形体早期的形态多为圆形、密度较大的网状体，后期菌体变小且密度增大。嗜吞噬细胞无形体的外膜比查菲埃立克体外膜有更多的皱折(图2)。

动物宿主持续感染是病原体维持自然循环的基本条件。国外报道，嗜吞噬细胞无形体的储存宿主包括白足鼠等野鼠类以及其他动物。在欧洲，红鹿、牛、山羊均可持续感染嗜吞噬细胞无形体。该病全年均有发病，发病高峰为5-10月。嗜吞噬细胞无形体的传播媒介主要是硬蜱属的某些种(如肩突硬蜱、篦子硬蜱等)。我国曾在黑龙江、内蒙古及新疆等地的全沟硬蜱中检测到嗜吞噬细胞无形体核酸。人粒细胞无形体病主要通过蜱叮咬传播。蜱叮咬携带病原体的宿主动物后，再叮咬人时，病原体可随之进入人体引起发病。直接接触危重病人或带菌动物的血液等体液，有可能会导致传播，但具体传播机制尚需进一步研究证实。国外曾有屠宰场工人因接触鹿血经伤口感染该病的报道。

人粒细胞无形体病的病理改变包括多脏器周围血管淋巴组织炎症浸润、坏死性肝炎、脾及***单核吞噬***增生等，主要与免疫损伤有关。嗜吞噬细胞无形体感染中性粒细胞后，可影响宿主细胞基因转录、细胞凋亡，细胞因子产生紊乱、吞噬功能缺陷，进而造成免疫病理损伤。该病潜伏期一般为7-14天(平均9天)。急性起病，主要症状为发热(多为持续性高热，可高达40℃以上)、全身不适、乏力、头痛、肌肉酸痛，以及恶心、呕吐、厌食、腹泻等。部分患者伴有咳嗽、咽痛。少数病人可有浅表***肿大及皮疹。可伴有心、肝、肾等多脏器功能损害，并出现相应的临床表现。重症患者可有间质性肺炎、肺水肿、急性呼吸窘迫综合症以及继发细菌、病毒及真菌等感染。少数病人可因严重的血小板减少及凝血功能异常，出现皮肤、肺、消化道等出血表现，如不及时救治，可因呼吸衰竭、急性肾衰等多脏器功能衰竭以及弥漫性血管内凝血死亡。老年患者、免疫缺陷患者及进行激素治疗者感染本病后病情多较危重。

目前实验室检测主要有以下几种方法：(一)包涵体的检测。(二)血清学检测。常用血清学方法为间接免疫荧光(IFA)法。(三)嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。目前，国际推荐使用16S rRNA基因检测方法，16S rRNA高度保守，是PCR检测最常用的扩增靶基因，与热休克蛋白groEL基因的应用相比，16S rRNA基因的应用更为广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因均具有重要意义。(四)病原体分离培养。多用HL-60进行嗜吞噬细胞无形体的分离培养。

但人粒细胞无形体病与其他许多疾病有相似的临床表现特征，如其他蜱传疾病、立克次体病：人单核细胞埃立克体病(HME)、斑疹伤寒、***、斑点热以及莱姆病等；发热、出血及酶学指标升高的感染性疾病：主要是病毒性出血性疾病，如流行性出血热、登革热等；发热、血白细胞、血小板降低的胃肠道疾病：伤寒、急性胃肠炎、病毒性肝炎；发热及血白细胞、血小板降低或有出血倾向的内科疾病：主要是血液***疾病，如血小板减少性紫癜，粒细胞减少、骨髓异常增生综合征；发热伴多项酶学指标升高的内科疾病鉴别：主要是免疫***疾病，如皮肌炎、***性红斑狼疮、风湿热；其他：如支原体感染、钩端螺旋体病、鼠咬热、药物反应等。又由于无形体病没有特异的临床症状，不为人们所认识，因此人粒细胞无形体病极易产生误诊，轻者可伴有心、肝、肾等多脏器功能损害，重者可因呼吸衰竭、急性肾衰等多脏器功能衰竭以及弥漫性血管内凝血而死亡。

上述实验室的检测方法均需要大量的试剂和仪器设备，费事费力，不适用于现场快速诊断。因此研究开发鉴别诊断人粒细胞无形体病的快速诊断试剂显得非常必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用简便快捷、灵敏度和特异性高、适合于现场诊断的人粒细胞无形体病的免疫层析试纸。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，包括上样垫、含有金标记的msp2抗体的胶体金垫、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜以及吸样垫，在硝酸纤维素膜的上表面分别设置胶体金垫和吸样垫，上样垫位于胶体金垫的上表面；检测线为包被在硝酸纤维素膜上的msp2多克隆抗体，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗兔IgG抗体。

作为本发明的免疫层析试纸的改进：硝酸纤维素膜的下表面与支撑板相连；保护膜覆盖在上样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫之上。

作为本发明的免疫层析试纸的进一步改进：在硝酸纤维素膜上表面靠近质控线并远离检测线处设置吸样垫，在硝酸纤维素膜上表面远离质控线并靠近检测线处设置胶体金垫。

作为本发明的免疫层析试纸的进一步改进：上样垫为玻璃纤维膜，吸样垫为吸水滤纸，支撑板为塑料支撑板。

本发明还同时提供了上述免疫层析试纸的制备方法，胶体金垫中金标记的msp2抗体以及作为检测线包被用的msp2抗体，均为重组表达msp2蛋白后免疫新西兰大白兔所获得的多克隆抗体。

作为本发明的免疫层析试纸的制备方法的改进：包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制作方法如下：

用缓冲液将msp2多克隆抗体配制成浓度为0.8～1.2mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜的下表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成检测线；

用缓冲液将羊抗兔IgG抗体配制成0.8～1.2mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜的上表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成质控线；

将划线后的硝酸纤维素膜于20～25℃的温度和小于30％的湿度的条件下干燥8～10小时而得。

作为本发明的免疫层析试纸的制备方法的进一步改进：缓冲液为0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液、0.01M pH7.2Tris盐酸缓冲液或0.01M pH7.2PBS缓冲液。

作为本发明的免疫层析试纸的制备方法的进一步改进：含有金标记的msp2多克隆抗体的胶体金垫的制备方法如下：

将金标记的msp2多克隆抗体溶液采用胶体金稀释液进行稀释，得稀释后溶液；msp2抗体在上述稀释后溶液中的浓度为0.8～1.2mg/100ml，按每1ml稀释后溶液铺22cm²的比例将溶液均匀地铺在玻璃纤维素膜上；然后于20～25℃的温度和小于30％的湿度的条件下干燥2～4小时而得。

作为本发明的免疫层析试纸的制备方法的进一步改进：胶体金垫的制备方法中所使用的稀释后溶液采用如下方法制备：在100ml的pH7.0～9.0直径为30～50nm的胶体金溶液中加入0.8～1.2mg的msp2多克隆抗体，进行标记；标记结束后离心弃上清，用胶体金稀释液复容至100ml，得稀释后溶液；

胶体金稀释液为：48～52mM硼酸盐缓冲液，调节pH8.0，加入与上述硼酸盐缓冲液的质量体积比分别为0.5％、1％、2％和0.1％的牛血清白蛋白、水解酪蛋白、蔗糖和Tween20。

作为本发明的免疫层析试纸的制备方法的进一步改进：在20～25℃温度和小于30％的湿度条件下，将包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜放置在支撑板中部，在硝酸纤维素膜的上表面靠近检测线并远离质控线的一侧搭接胶体金垫，胶体金垫长度的1/2～1/4与硝酸纤维素膜的上表面相接触；在硝酸纤维素膜的上表面另一侧搭接吸样垫，吸样垫长度的1/8～1/12与硝酸纤维素膜的上表面相接触；在胶体金垫的上表面与硝酸纤维素膜不相接触的一侧搭接上样垫，上样垫长度的1/8～1/12与胶体金垫的上表面相接触；在上样垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫之上覆盖保护膜。

在本发明的免疫层析试纸的制备方法中，确定了试纸的最佳标记pH为8.0；msp2抗体的最佳标记量为1mg每100ml胶体金溶液；最佳的胶体金稀释溶液为50mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，含0.5％BSA、1％水解酪蛋白，2％蔗糖，0.1％Tween20；最佳的抗体包被浓度为1mg/ml。检测结果的最佳判定时间为30min以内。

本发明的免疫层析试纸实际使用时，检测方法如下：将被检血清或血浆平衡至室温，将本发明的试纸平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品溶解胶体金并在硝酸纤维素膜上层析，然后用肉眼直接观察在45min内质控线(简称C线)、检测线(简称T线)的出现情况，并判断检测结果。具体检测原理和方法如下：如果样品中含有嗜吞噬细胞无形体，则和胶体金垫上的标记msp2多克隆抗体的胶体金结合，形成复合物，并扩散到硝酸纤维素膜(简称NC膜)上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线的配对抗体时，复合物则又被包被msp2抗体结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线，如果血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合体，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测是均会出现的。因此，可用肉眼直接观察在45min内(最佳时间为30min内)C线、T线的出现情况，并判断检测结果；如果NC膜的下表面出现T线，则样品呈阳性；如果NC膜的下表面没有出现T线，则样品呈阴性。由于是层析，所以如果样品呈阳性，一般半分钟左右NC膜的下表面就会形成清晰的T线；但形成30分钟后，T线就会变得模糊，不利于观察，因此检测结果的最佳判定时间为0.5～30min。

本发明的有益效果是：运用msp2抗体来制备快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸。该试纸用于人粒细胞无形体病的筛选或临床诊断，具有特异性和敏感性高、操作简便、缩短检测时间、显示结果形象、适合现场检测和经济实惠等优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是人血液中性粒细胞内无形体包涵体(X1000，JS Dumler)图；

图2是电镜下的无形体包涵体(X21960，JS Dumler)图；

图3是本发明的免疫层析试纸的主视结构的***示意图；

图4是图3去除保护膜8后的俯视示意图。

具体实施方式

实施例1、图3～图4给出了一种快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其制备方法选用如下主要材料：

按照《分子克隆书》告知的常规方法自制的msp2多克隆抗体，为重组表达msp2蛋白免疫新西兰大白兔所获得。

羊抗兔IgG抗体(鼎国公司)，氯金酸(Sigma公司)，硝酸纤维素(NC)膜(Millipore公司)，牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司)，聚乙二醇(PEG)20000(Sigma公司)，水解酪蛋白(Sigma公司)，其他常用试剂均为分析纯试剂。

该制备方法具体为依次进行以下步骤：

1)、制备含有金标记的msp2多克隆抗体的胶体金垫2：

①、氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液；

②、取100ml胶体金溶液放在烧杯内，用0.2M的K₂CO₃调至pH8.0；然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，加入1mg的msp2多克隆抗体，室温搅拌2小时；滴加PEG20000至其终体积溶度为0.1％和滴加BSA至其终体积溶度为1％后，封闭20～30min进行标记；

③、标记结束后，12000r/min离心30min，弃上清，所得的沉淀用胶体金稀释液定容至100ml；得稀释后溶液。

该胶体金稀释液由50mM硼酸盐缓冲液，调节pH8.0，加入BSA、水解酪蛋白、蔗糖和Tween20组成；BSA与硼酸盐缓冲液质量体积比为0.5％(即5g/L)，水解酪蛋白与硼酸盐缓冲液的质量体积比为1％，蔗糖与硼酸盐缓冲液质量体积比为2％，Tween20与硼酸盐缓冲液质量体积比为0.1％。

④、将上述稀释后溶液按1ml溶液铺22cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维素膜上，再置干燥间，于20～25℃的温度和小于30％(例如20％)的湿度的条件下干燥2～4小时，制成胶体金垫2，备用。

2)、制备包被有相互分离的检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜3：

①、以0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液将msp2多克隆抗体稀释成1mg/ml的溶液；用喷膜仪在硝酸纤维素膜3的下表面以1ul溶液/cm的参数划线，包被成检测线5。

②、以0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液将羊抗兔IgG抗体稀释成1mg/ml的溶液；用喷膜仪在硝酸纤维素膜3的上表面以1ul溶液/cm的参数划线，包被成质控线6。

此时，检测线5和质控线6从左至右依次排列，且相互之间保持一定的间距。

③、将划线后的硝酸纤维素膜3在干燥间，于20～25℃的温度和小于30％的湿度的条件下干燥8～10小时；备用。

3)、组装：

整个组装在干燥室内进行，调节温度20～25℃，湿度小于30％。

①、取塑料支撑板作为支撑板7，将上述步骤2)所得的硝酸纤维素膜3放置在支撑板7中间，此时硝酸纤维素膜3的下表面与支撑板7相接触。

②、在硝酸纤维素膜3上表面的左侧(即远离质控线6且靠近检测线5)搭接步骤1)所得的胶体金垫2，即胶体金垫2的下表面与硝酸纤维素膜3的上表面相接触；且胶体金垫2右端起的1/3自身长度与硝酸纤维素膜3相接触。

在胶体金垫2的上表面的左侧搭接上样垫1，上样垫1选用玻璃纤维膜；上样垫1右端起的1/10自身长度与胶体金垫2相接触。

在硝酸纤维素膜3上表面的右侧(即靠近质控线6且远离检测线5)搭接吸样垫4，吸样垫4选用吸水滤纸，吸样垫4左端起的1/10自身长度与硝酸纤维素膜3相接触。

③、一层保护膜8将上样垫1、胶体金垫2、硝酸纤维素膜3和吸样垫4覆盖在自身(保护膜8)之下，保护膜8的作用是防止免疫层析试纸受潮。

④、最后用裁剪机将上述组装物切成3mm或4mm宽的试纸条，此试纸条即为快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸。

当然，也可以将上述试纸条再装入塑料卡内，形成人粒细胞无形体病的快速诊断卡。

实验1、对实施例1所得的免疫层析试纸进行性能分析：

1)、测试结果准确性的实验：

以20份阳性血清和20份阴性血清作为待测样品，上述所有的阳性血清和阴性血清已经嗜粒细胞无形体16S rRNA PCR检测法测定确为相应的人粒细胞无形体病阳性血清和阴性血清。

检测方法如下：将被检血清平衡至室温，将免疫层析试纸平放，在上样垫1上加入50-100ul被检样品，然后用肉眼直接观察在1～30min内C、T线的出现情况，并判断检测结果。

结果为：20份阳性血清均出现T线，而20份阴性血清均没有出现T线；准确率达到100％。

2)、灵敏度实验

取嗜吞噬细胞无形体参考品强阳性血清和弱阳性血清分别作1：10；1：100；1：1000；1：10000倍比稀释，用本试纸进行检测。

结果为：当强阳性血清倍比稀释大于1：1000时，本试纸条能出现清楚的T线。当弱阳性血清倍比稀释大于1：10时，本试纸条能出现清楚的T线。

3)、特异性实验

以高血脂血清、溶血血清、黄疸血清、斑疹伤寒病血清、含不同抗凝剂肝素血浆、EDTA血浆、枸橼酸钠血浆作为样品进行检测；

检测结果均为没有出现T线。这说明本发明的免疫层析试纸对上述常见干扰物没有非特异性反应。

4)、稳定性试验

将本试纸在室温条件下保存，在1、3、6、9个月取出部分试纸，以用嗜吞噬细胞无形体参考品作为标准品进行检测；检测结果均出现T线，且结果无显著性差异。

将本试纸置于37℃、50℃条件下，每隔7天取出部分试纸，以用嗜吞噬细胞无形体参考品作为标准品进行检测；检测结果为37℃保存6周的试纸和50℃保存3周的试纸仍能出现T线，即显示正确的检测结果，试纸性能无明显下降。

根据上述加速破坏性试验结果，试纸的稳定性在室温条件下应该能保存18个月以上。

实施例2、一种快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其制备方法为：

将步骤1)的②中：将调至pH8.0改成调至pH9.0；将加入1mg的msp2多克隆抗体，改成加入0.8mg的msp2多克隆抗体。

其余均同实施例1。

实施例3、一种快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其制备方法为：

将步骤1)的②中：将调至pH8.0改成调至pH7.0；将加入1mg的msp2多克隆抗体，改成加入1.2mg的msp2多克隆抗体。

其余均同实施例1。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1、一种快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其特征是：包括上样垫(1)、含有金标记的msp2抗体的胶体金垫(2)、包被质控线(6)和检测线(5)的硝酸纤维素膜(3)以及吸样垫(4)，在硝酸纤维素膜(3)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，所述上样垫(1)位于胶体金垫(2)的上表面；所述检测线(5)为包被在硝酸纤维素膜(3)上的msp2多克隆抗体，质控线(6)为包被在硝酸纤维素膜(3)上的羊抗兔IgG抗体。

2、根据权利要求1所述的快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其特征是：所述硝酸纤维素膜(3)的下表面与支撑板(7)相连；保护膜(8)覆盖在上样垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸样垫(4)之上。

3、根据权利要求1或2所述的快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其特征是：在硝酸纤维素膜(3)上表面靠近质控线(6)并远离检测线(5)处设置吸样垫(4)，在硝酸纤维素膜(3)上表面远离质控线(6)并靠近检测线(5)处设置胶体金垫(2)。

4、根据权利要求3所述的快速诊断人粒细胞无形体病的免疫层析试纸，其特征是：所述上样垫(1)为玻璃纤维膜，吸样垫(4)为吸水滤纸，支撑板(7)为塑料支撑板。

5、如权利要求1～4中任意一种免疫层析试纸的制备方法，其特征是：胶体金垫(2)中金标记的msp2抗体以及作为检测线(5)包被用的msp2抗体，均为重组表达msp2蛋白后免疫新西兰大白兔所获得的多克隆抗体。

6、根据权利要求5所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征是：所述包被检测线(5)和质控线(6)的硝酸纤维素膜(3)的制作方法如下：

用缓冲液将msp2多克隆抗体配制成浓度为0.8～1.2mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(3)的下表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成检测线(5)；

用缓冲液将羊抗兔IgG抗体配制成0.8～1.2mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(3)的上表面以0.8～1.2ul/cm的参数划线，包被成质控线(6)；

将划线后的硝酸纤维素膜(3)于20～25℃的温度和小于30％的湿度的条件下干燥8～10小时而得。

7、根据权利要求6所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征是：所述缓冲液为0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液、0.01M pH7.2Tris盐酸缓冲液或0.01M pH7.2PBS缓冲液。

8、根据权利要求6或7所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征是：所述含有金标记的msp2多克隆抗体的胶体金垫(2)的制备方法如下：

将金标记的msp2多克隆抗体溶液采用胶体金稀释液进行稀释，得稀释后溶液；msp2抗体在上述稀释后溶液中的浓度为0.8～1.2mg/100ml，按每1ml稀释后溶液铺22cm²的比例将溶液均匀地铺在玻璃纤维素膜上；然后于20～25℃的温度和小于30％的湿度的条件下干燥2～4小时而得。

9、根据权利要求8所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征是：胶体金垫(2)的制备方法中所使用的稀释后溶液采用如下方法制备：在100ml的pH7.0～9.0直径为30～50nm的胶体金溶液中加入0.8～1.2mg的msp2多克隆抗体，进行标记；标记结束后离心弃上清，用胶体金稀释液复容至100ml，得稀释后溶液；

所述胶体金稀释液为：48～52mM硼酸盐缓冲液，调节pH8.0，加入与上述硼酸盐缓冲液的质量体积比分别为0.5％、1％、2％和0.1％的牛血清白蛋白、水解酪蛋白、蔗糖和Tween20。

10、根据权利要求9所述的免疫层析试纸的制备方法，其特征是：在20～25℃温度和小于30％的湿度条件下，将包被质控线(6)和检测线(5)的硝酸纤维素膜(3)放置在支撑板(7)中部，在硝酸纤维素膜(3)的上表面靠近检测线(5)并远离质控线(6)的一侧搭接胶体金垫(2)，胶体金垫(2)长度的1/2～1/4与硝酸纤维素膜(3)的上表面相接触；在硝酸纤维素膜(3)的上表面的另一侧搭接吸样垫(4)，吸样垫(4)长度的1/8～1/12与硝酸纤维素膜(3)的上表面相接触；在胶体金垫(2)的上表面与硝酸纤维素膜(3)不相接触的一侧搭接上样垫(1)，上样垫(1)长度的1/8～1/12与胶体金垫(2)的上表面相接触；在上样垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸样垫(4)之上覆盖保护膜(8)。

Images