CN101497666B - 一种双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE - Google Patents
一种双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE,该融合蛋白由靶向表皮尘长因子受体EGFR和HER2的两个寡肽、力达霉素辅基蛋白以及力达霉素活性发色团四部分组成,研究证明,其在体外能与表达表皮生长因子受体EGFR和HER2的肿瘤细胞特异性结合,对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,体内试验对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤疗效显著,显示了靶向药物的小型化与高效化的特点,具有良好的应用前景。
Description
技术领域:
本发明涉及一种新型抗肿瘤靶向药物及其制备方法和应用。
背景技术:
恶性肿瘤是威胁人类健康的多发病和常见病,已经位居人类疾病中三大主要死亡原因之首。传统的肿瘤化学治疗,由于靶向性不明确、选择性不强、特异性不高和极易产生耐药等,导致其存在杀伤肿瘤细胞的同时损害正常组织细胞,影响疗效和生存期等缺陷。靶向性治疗则可克服传统化疗的不足,提高抗肿瘤治疗的效果。在靶向性治疗中,单克隆抗体发挥了重要的作用,然而单抗存在对实体肿瘤渗透能力差的缺点。因此,采用小分子寡肽配体取代单抗的作用,已成为靶向药物的一个发展方向。
表皮生长因子受体EGFR(或称HER1)、HER2、HER3和HER4都是跨膜受体酪氨酸激酶家族(ErbB)的成员。该家族成员有着相似的结构,均由胞外配体结合结构域、胞内激酶结构域和跨膜结构域组成。当配体与受体结合后,可导致受体发生同二聚化或异二聚化,从而激活受体的酪氨酸激酶活性,进而活化一系列的胞内信号通路,最终促进细胞的生长、增值、分化和迁移。EGF是EGFR的天然配体,以EGF或抗EGFR的单克隆抗体为导向分子构成的融合蛋白,能够通过EGFR介导的内吞作用而进入EGFR表达的肿瘤细胞,从而发挥特异性杀伤作用。EGF由53个氨基酸组成,与受体结合的区段位于其C环。HER2目前还未发现其天然配体,但在发生二聚化时,它是其他受体优先选择的对象。
ErbB受体家族与人类癌症的关系非常密切,尤其是EGFR和HER2。ErbB受体发生改变的肿瘤通常更具有侵袭性,而且病人往往也预后不良。例如:在25-30%的乳腺癌中HER2基因呈高表达,在非小细胞肺癌和头颈部肿瘤中EGFR大量表达或发生突变等,这就使得EGFR和HER2成为很有前景的肿瘤治疗靶点。目前临床使用的靶向ErbB受体的药物主要可分为两类:一类是单克隆抗体,用于结合受体的胞外结构域;另一类是小分子的酪氨酸激酶抑制剂,其机制是竞争性地结合酪氨酸激酶结构域的ATP结合位点。这些药物单独使用或者与其他化疗药物联合应用均获得了较好的疗效,但耐药性问题仍然比较突出。
研究显示,EGFR和HER2是协同发挥作用的,共同导致NIH 3T3细胞的癌变,而单独的任何一个受体都不足以引起细胞的转化。另一些研究也表明,在其他受体配基存在的情况下,靶向于某一ErbB受体的抗肿瘤药物的效果会被抵消。此外,一些临床前的体内外研究也显示,对ErbB受体的双重抑制要比单独靶向一个受体的抗肿瘤效果好。
力达霉素(Lidamycin,LDM)也称C-1027,是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株链霉菌(Streptomyces globisporus,菌种保藏号:CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素,是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物试验表明,LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效,对人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种人移植瘤均有较好疗效[中国抗生素杂志1994,19(2):164-168]。LDM由辅基蛋白(LDP)和烯二炔结构的发色团(AE)两部分组成,发色团是力达霉素分子的活性部分,辅基蛋白对发色团起稳定保护作用。LDM的发色团和辅基蛋白系通过非共价键结合,因而可在体外将其拆分与重建。LDM以其独特的分子结构,成为构建新型导向药物的理想“弹头”[中国医学科学院报2001,23(6):563-567]。
小型化和高效化,是解决当前单抗治疗剂所遇难点的重要途径。本发明的目的,是以靶向EGFR和HER2的两个寡肽Ec、Hr为导向分子,以LDM为“弹头”,制备双特异性强化融合蛋白。该强化融合蛋白在体外对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,体内试验对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤疗效显著。本发明所说的双靶点强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE,迄今为止尚未见有相关报道。
发明内容:
本发明提供的双靶点强化融合蛋白,是由分别靶向EGFR和HER2的两个寡肽分子、力达霉素辅基蛋白以及力达霉素活性发色团组成,其中两个导向寡肽分别位于力达霉素辅基蛋白的两侧。为了避免各分子之间空间结构的相互干扰,在导向分子和力达霉素辅基蛋白之间设计了(G4S)2的柔性连接肽;为了使融合蛋白在大肠杆菌中分泌表达,在其N术端还加入了pelB信号肽。靶向EGFR的导向短肽采用了EGF C环(22个氨基酸残基,GenBank序列号:AAS83395),靶向HER2的导向短肽选择了经过分子进化的抗HER2抗体C6.5重链的CDR3区(20个氨基酸残基)[Schier R.等J.Mol.Biol.1996,263(4):551-567]。本发明构建的融合蛋白编码基因全长为612bp,编码204个氨基酸,融合蛋白分子量为19.3kD,其基因编码序列和氨基酸序列如序列表所示。
本发明的技术方案包括以下步骤:
1.重组表达质粒pET-Ec-LDP-Hr的构建:含有力达霉素辅基蛋白的重组质粒pEFL由本实验室构建(菌种保藏号:CGMCC No.0960),pMD18-T载体购于大连宝生物公司,大肠杆菌菌株DH5α购自北京博大泰克公司,pET30a表达载体以及大肠杆菌菌株BL21starTM(DE3)均购自Novagen公司。靶向EGFR和HER2的寡肽Ec和Hr(分别是EGF C环的22个氨基酸残基、抗HER2抗体C6.5重链CDR3区的20个氨基酸残基)、柔性连接肽(G4S)2以及pelB信号肽[Rathore D.等,FEBS Letters,1996,392(3):259-262]均根据其氨基酸序列反推出DNA序列,并参考了大肠杆菌偏爱密码子,人工合成了上述寡肽的基因片段,作为PCR的引物,PCR引物由上海生工公司合成。
采用PCR技术分别克隆得到Ec-LDP基因片段和LDP-Hr基因片段,并在Ec-LDP基因的N末端引入pelB信号肽序列;将Ec-LDP基因与LDP-Hr基因进行重叠拼接PCR,得到Ec-LDP-Hr基因,将此基因片段***到pET30a表达载体中,得到重组表达载体pET-Ec-LDP-Hr。
2.融合蛋白Ec-LDP-Hr在大肠杆菌中的诱导表达:将表达载体pET-Ec-LDP-Hr转化到大肠杆菌宿主菌BL21starTM(DE3)中,得到转化菌株,命名为pET-Ec-LDP-Hr,于2008年12月31日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号:CGMCC No.2846。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导8小时后,按pET***操作手册(Novagen公司)分别制备全细胞组分、培养液上清组分、周质腔组分、细胞质可溶性组分、包涵体组分,然后进行SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的定位情况。结果表明,融合蛋白Ec-LDP-Hr主要以可溶性形式存在于周质腔中。
3.融合蛋白Ec-LDP-Hr的分离纯化:采用渗透压震惊法提取大肠杆菌周质腔中的蛋白。由于pET载体带有六聚组氨酸标签,融合蛋白的纯化采用亲和层析方法,使用GE公司的HisTrap Ni2+柱,按照GE公司的说明书进行操作。
4.融合蛋白Ec-LDP-Hr的生物学活性测定:主要采用ELISA法、流式细胞技术和免疫荧光技术,分析融合蛋白Ec-LDP-Hr对肿瘤细胞的亲和活性。
5.强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制备:融合蛋白Ec-LDP-Hr与力达霉素活性发色团AE以1∶3的比例,在体外进行分子组装,得到强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE
6.强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的生物学活性分析:主要采用MTT法,检测强化融合蛋白对不同肿瘤细胞的杀伤活性以及在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型中,观察强化融合蛋白的体内抗肿瘤活性。
发明效果:
本发明的优点和积极效果在于,所说强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE稳定性好,可以使用基因工程手段进行大规模发酵制备。该强化融合蛋白以两个寡肽作为导向分子,分子量小(仅为19.3KDa)、免疫原性小、穿透性强。体外实验结果显示,其对肿瘤细胞的杀伤能力明显优于LDM以及单特异性的强化融合蛋白Ec-LDP-AE和LDP-Hr-AE;体内试验也显示了良好的抗肿瘤疗效,是一种新型、高效、小型抗肿瘤靶向药物,具有良好的应用前景。
附图说明:
图1:重组质粒pMD-Ec-LDP-Hr的构建示意图
图2:重组质粒pET-Ec-LDP-Hr的限制性内切酶分析
其中:1.DNAMarker DL15000;2.pET30a质粒;
3.pET-Ec-LDP-Hr质粒;4.pET30a/NdeI+XhoI;
5.pET-Ec-LDP-Hr/NdeI+XhoI;6.DNA Marker DL2000。
图3:融合蛋白Ec-LDP-Hr表达产物的SDS-PAGE分析
其中:1.分子量标准(kDa);2.IPTG诱导后E.coli总蛋白;
3.IPTG诱导前E.coli总蛋白;4.诱导后培养液上清组分;
5.诱导前培养液上清组分;6.诱导后E.coli周质腔组分;
7.诱导前E.coli周质腔组分;8.诱导后E.coli细胞质可溶组分;
9.诱导前E.coli细胞质可溶组分;10.诱导后E.coli细胞质包涵体组分;
11.诱导前E.coli细胞质包涵体组分。
图4:融合蛋白Ec-LDP-Hr经Ni2+亲和层析纯化的SDS-PAGE分析
其中:1.分子量标准(kDa);2.未上柱的周质腔总蛋白;
3.样品上柱后未与Ni2+柱结合的杂蛋白;4.用结合缓冲液洗脱下的杂蛋白;
5.用洗涤缓冲液洗脱下的杂蛋白;6-13.用洗脱缓冲液洗脱下的目的蛋白。
图5:经Ni2+亲和层析纯化的融合蛋白Ec-LDP-Hr的HPLC纯度分析
图6:融合蛋白Ec-LDP-Hr对不同肿瘤细胞的免疫结合活性分析
图7:融合蛋白Ec-LDP-Hr对SK-BR-3乳腺癌细胞的免疫荧光化学分析
图8a:融合蛋白Ec-LDP-Hr与SK-BR-3细胞EGFR受体结合特异性分析
其中:1.PBS对照; 2.融合蛋白与抗EGFR抗体混合物;
3.抗EGFR抗体。
图8b:融合蛋白Ec-LDP-Hr与SK-BR-3细胞HER2受体结合特异性分析
其中:1.PBS对照; 2.融合蛋白与抗HER2抗体混合物;
3.抗HER2抗体。
图9:强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE体外组装的HPLC分析
图10a:强化融合蛋白Ec-LDP-HR-AE对SK-OV-3细胞的体外细胞毒作用
图10b:强化融合蛋白Ec-LDP-HR-AE对SK-BR-3细胞的体外细胞毒作用
图10c:强化融合蛋白对A431细胞的体外细胞毒作用
图10d:强化融合蛋白对MCF-7细胞的体外细胞毒作用
图10e:强化融合蛋白对NIH 3T3细胞的体外细胞毒作用
图11:强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用
具体实施方式:
以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>重组表达质粒pET-Ec-LDP-Hr的构建:
PCR反应引物:
P1:5’ggt gga ggc ggt tca ggt gga ggt tca gcg ccc gcc ttc tcc gtc agt 3’
(1-27bp为(G4S)2连接肽序列,28-48bp与力达霉素辅基蛋白1-21bp配对)
P2:5’tga acc gcc tcc acc tga acc gcc tcc acc gcc gaa ggt cag agc cac gtg 3’
(1-30bp为(G4S)2连接肽序列,31-51bp与力达霉素辅基蛋白639-660bp配对)
P3:5’aac tgt gtg gtg ggc tat att ggc gaa cgc tgt cag tat cgc gat ctg aaa tgg tgg gaa ctgcgc ggt gga ggc ggt tca ggt 3’
(1-66bp为寡肽Ec片段序列,67-84bp与(G4S)2连接肽1-18bp配对)
P4:5’gc ctc gag cac gcc cag cca ttc cgg cca ttt cgc aca gct gcg atc ggt aca ata gcc cacatc atg tga acc gcc tcc acc tga 3’
(下划线部分为XhoI酶切位点,9-60bp为寡肽Hr序列,61-86bp与(G4S)2连接肽1-18配对)
P5:5’gc cat atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct gcc cag ccg gcgatg gcc atg gcc aac tgt gtg gtg ggc tat att 3’
(下划线部分为NdeI酶切位点,9-66bp为pelB信号肽序列,67-95bp与寡肽Ec的1-21bp配对)
P6:5’gc cat atg aaa tac ctg ctg ccg acc 3’
(下划线部分为NdeI酶切位点,与pelB信号肽序列1-18bp配对)
P7:5’gc ctc gag cac gcc cag cca ttc cgg 3’
(下划线部分为XhoI酶切位点,与寡肽Hr序列42-60bp配对)
R1:5’gcc gaa ggt cag agc cac gtg 3’
(与力达霉素辅基蛋白639-660bp配对)
R2:5’gcg ccc gcc ttc tcc gtc agt c 3’
(与力达霉素辅基蛋白1-22bp配对)
R3:5’gc ctc gag gcc gaa ggt cag agc cac gtg 3’
(下划线部分为XhoI酶切位点,与力达霉素辅基蛋白639-660bp配对)
(1)以质粒pEFL(含有力达霉素辅基蛋白基因)为模板,引物1和引物R1以及引物4和引物R2分别进行第一轮常规PCR反应,产物进行琼脂糖凝胶电泳回收360bp的片段,克隆至pMD18-T载体,分别命名为pMD1和pMD2,挑选出阳性克隆进行测序。序列正确的质粒作为下一轮PCR反应的模板;
(2)以质粒pMD1和pMD2为模板,引物2和引物R1以及引物5和引物R2进行第二轮PCR反应,产物分别进行琼脂糖凝胶电泳回收426bp以及420bp的片段,克隆至pMD18-T载体,分别命名为pMD3和pMD4,挑选出阳性克隆进行测序。序列正确的质粒作为下一轮PCR反应的模板;
(3)以质粒pMD3为模板,引物3和引物R3进行第三轮PCR反应,产物进行琼脂糖凝胶电泳回收500bp的片段,克隆至pMD18-T载体,命名为pMD5,转化大肠杆菌DH 5α,挑选出阳性克隆进行测序。序列正确的质粒作为下一轮PCR反应的模板;
(4)以质粒pMD5为模板,引物6与引物R1进行第四轮PCR反应;同时以质粒pMD4为模板,引物5和引物R2进行PCR反应,产物分别进行琼脂糖凝胶电泳,回收500bp以及420bp的片段;
(5)以回收的两个片段混合作为模板,引物6和引物7进行第五轮重叠拼接PCR反应,产物进行琼脂糖凝胶电泳回收600bp的片段,克隆至pMD18-T载体,命名为pMD-Ec-LDP-Hr。重组质粒pMD-Ec-LDP-Hr的构建见(图1),挑选出阳性克隆进行测序;
(6)测序验证正确的质粒用NdeI和XhoI双酶切,酶切得到的小片段与经过相同双酶切的pET30a载体连接,得到重组表达载体pET-Ec-LDP-Hr(图2)。
经过五轮PCR构建的融合蛋白基因全长612bp,编码204个氨基酸,其中pelB信号肽长72bp,编码24个氨基酸,融合蛋白分泌至周质腔中时信号肽被周质腔中的信号肽酶切除,只留下两个氨基酸:甲硫氨酸和丙氨酸;EGF C环长66bp,编码22个氨基酸,之后依次是(G4S)2连接肽(10个氨基酸)、力达霉素辅基蛋白(110个氨基酸)、(G4S)2连接肽(10个氨基酸)、抗HER2抗体重链CDR3区(20个氨基酸)、XhoI酶切位点(2个氨基酸)以及组氨酸标签(6个氨基酸),因此,最后得到的融合蛋白含有182个氨基酸残基,测序结果和预期一致,表明载体构建成功。其基因序列和氨基酸序列见序列表。
<实施例2>融合蛋白Ec-LDP-Hr在大肠杆菌中的诱导表达
将表达载体pET-Ec-LDP-Hr转化大肠杆菌BL21starTM(DE3)感受态细胞。从平板上挑取一个单克隆接种至10ml LB培养基(含有卡那霉素50μg/ml)中,37℃摇床振荡培养过夜。次日将10ml菌液转接至1L LB培养基(含有卡那霉素50μg/ml)中,37℃摇床继续振荡培养至OD600=2。菌液在无菌条件下于4℃、5,000g离心10分钟,菌体沉淀用1L新鲜的LB培养基(含有卡那霉素50μg/ml)重悬,加入IPTG至终浓度为0.1mM,37℃摇床振荡培养8小时。按照pET***操作手册中的步骤,分别制备全细胞组分、培养液上清组分、周质腔组分、细胞质可溶性组分和包涵体组分,15%SDS-PAGE分析结果表明,在周质腔中经诱导的菌体在18kD处有目的条带表达,而未经诱导的菌体则无此带(图3)。对影响表达产量的各个条件:温度、菌体起始密度、IPTG浓度和诱导时间分别进行了优化,最终确定表达条件为:温度37℃、菌体起始密度OD600=2、IPTG浓度为0.1mM、诱导时间8小时。
<实施例3>融合蛋白Ec-LDP-Hr的分离纯化
(1)将诱导好的菌液于4℃、10,000g离心10分钟,收集菌体,融合蛋白主要定位于大肠杆菌的周质腔,周质腔蛋白的提取采用渗透压震惊法;
(2)将菌体重悬于100ml高渗溶液(30mM Tris-Cl,1mM EDTA,20%蔗糖,pH8.0)中,用磁力搅拌器于室温缓慢搅拌10分钟;
(3)于4℃、10,000g离心10分钟,收集菌体,弃去上清液;
(4)用90ml预冷的蒸馏水(低渗溶液)重悬菌体,用磁力搅拌器于4℃缓慢搅拌10分钟;
(5)于4℃、10,000g离心10分钟,收集上清液;
(6)上清液中加入10ml 10×结合缓冲液(200mM磷酸缓冲液,5M NaCl,200mM咪唑),使磷酸缓冲液、NaCl、咪唑的终浓度分别为20mM、0.5M和20mM;
(7)由于融合蛋白带有六聚组氨酸标签,因此其纯化方法主要采用Ni2+亲和层析技术,亲和层析柱HisTrap HP购于GE公司;
(8)HisTrap亲和层析柱先用蒸馏水冲洗5个柱体积,再用1×结合缓冲液(20mM磷酸缓冲液,0.5M NaCl,20mM咪唑)平衡5个柱体积;
(9)将上述提取的周质腔蛋白溶液上柱,控制流速为1ml/min,收集流出液以备分析;
(10)洗涤缓冲液I(20mM磷酸缓冲液,0.5M NaCl,50mM咪唑)冲洗柱子5体积,控制流速为1ml/min,收集流出液以备分析;
(11)洗涤缓冲液II(20mM磷酸缓冲液,0.5M NaCl,70mM咪唑)冲洗柱子5体积,控制流速为1ml/min,收集流出液以备分析;
(12)洗脱缓冲液(20mM磷酸缓冲液,0.5M NaCl,500mM咪唑)洗脱蛋白,洗5-8个柱体积,流速控制为1ml/min,分管收集流出液以备分析;
(13)将各部分的流出液各取50μl进行SDS-PAGE电泳(图4)分析,收集含目的蛋白的洗脱液;
(14)将含目的蛋白的洗脱液用10K的超滤管(Millipore公司)浓缩至所需浓度,蛋白溶液于-80℃保存备用。纯化的融合蛋白产量为每升发酵液9mg活性蛋白,经HPLC检测纯度为95.3%。(图5)。
<实施例4>融合蛋白Ec-LDP-Hr对肿瘤细胞的免疫活性分析
1.ELISA法分析融合蛋白对各种肿瘤细胞的免疫反应性
(1)人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、人卵巢癌细胞SK-OV-3,人表皮癌细胞A431、小鼠成纤维细胞NIH 3T3以1×104个细胞/井的密度接种于96孔板(不同细胞的大小以及生长速度有差异,本数量是以MCF-7细胞为例,其他的细胞以24小时长满96孔板为准),37℃培养24小时后用PBS洗3次(3分钟/次),加入4℃预冷的0.05%戊二醛50μl/井,于4℃固定细胞15分钟;
(2)固定好的细胞用PBS洗3次后,用1%BSA/PBS溶液以200μl/井于4℃封闭过夜;
(3)用PBST缓冲液(PBS中含有0.05%的Tween-20)洗3次;
(4)将融合蛋白倍比稀释加入到96孔板中,50μl/井,每个浓度设3个平行井,37℃温育2小时;
(5)用PBST洗3次后,加入抗His-tag单抗(1∶2000)稀释,50μl/井,37℃温育2小时;
(6)用PBST洗板3次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶2500)稀释,50μl/井,37℃温育2小时;
(7)用PBST洗板5次,加入辣根过氧化物的底物反应液(邻苯二胺∶0.1M柠檬酸∶H2O2=4mg∶10ml∶15μl),100μl/井,室温避光反应10分钟。以2M的硫酸100μl/井终止反应,立即在酶标仪上测定492nm的吸光值。
结果表明,融合蛋白Ec-LDP-Hr对高表达EGFR和HER2的肿瘤细胞,如SK-OV-3、A431、SK-BR-3和MCF-7都有较强的免疫结合活性,而对不表达EGFR和HER2的小鼠成纤维细胞NIH 3T3则没有免疫结合活性,且结合活性的强弱与EGFR和HER2的表达水平存在一定的相关性,如SK-OV-3细胞EGFR和HER2表达水平均较高,因此,融合蛋白与该细胞的亲和活性最强(图6)。
2.细胞免疫荧光法分析融合蛋白Ec-LDP-Hr与SK-BR-3乳腺癌细胞结合活性将SK-BR-3细胞(EGFR和HER2均表达)以4×104的密度接种到放有盖玻片的六孔板中,37℃培养24小时后用PBS洗3次,加入甲醇于室温固定10分钟,吸弃甲醇,再次加入甲醇置于-20℃固定10分钟,PBS洗3次;加入融合蛋白Ec-LDP-HR(50μg/ml),于室温孵育2小时或于4℃过夜,然后PBS洗3次;加入1∶500稀释的抗His-tag抗体,室温反应2小时,PBS洗3次;加入1∶100稀释的FITC(中文?)标记羊抗鼠IgG,室温避光反应1小时,PBS洗3次,荧光显微镜下观察并照相。结果表明,融合蛋白Ec-LDP-Hr可与SK-BR-3乳腺癌细胞发生特异性结合(图7)。
3.竞争性免疫荧光试验,分析融合蛋白Ec-LDP-HR与EGFR和HER2结合的特异性
取对数生长期的SK-BR-3细胞,用胰酶消化后计数,取5个离心管,每管中加入5×105个细胞,PBS洗3次后用4%多聚甲醛室温固定20分钟,PBS洗3次;在5个离心管中分别加入PBS、Ec-LDP-Hr蛋白(100μM)和抗EGFR抗体(5μg)混合物、抗EGFR抗体(5μg)、Ec-LDP-Hr(100μM)蛋白和抗HER2抗体(5μg)混合物、抗HER2抗体(5μg),反应体积均为100μl,4℃反应过夜;离心去上清,PBS洗3次后加入FITC标记羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(1∶100稀释),室温反应1小时;离心去上清,PBS洗3次后重悬于1ml PBS中,流式细胞仪测定荧光强度。结果表明,融合蛋白可以竞争性地抑制抗EGFR抗体和抗HER2抗体与SK-BR-3细胞的结合(图8a和8b)。
<实施例5>强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE的制备
取高活性的力达霉素纯品(专利号:00121527.2),经C4柱分离活性发色团,流动相为水∶乙腈∶三氟乙酸(78%∶22%∶0.05%),检测350nm处的吸光值,收集发色团。将融合蛋白与发色团按照1∶3的分子比混合,置于摇床上缓慢晃动,室温避光反应12-16小时,将二者的混合液经Sephadex G-75柱除去未包装上的发色团。经HPLC检测发现,融合蛋白与发色团已成功组装,得到了强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE(图9)。
<实施例6>MTT法检测强化融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性
取对数生长期的MCF-7、SK-BR-3、SK-OV-3、A431、NIH 3T3细胞,用胰酶消化后计数,以4000个细胞/孔接种于96孔板中(本数量是以MCF-7细胞为例,不同细胞的生长速度不同,接种量也不相同,以未加药的细胞72小时长满96孔板为原则),37℃培养24小时后吸弃培养液,加入以培养液稀释的不同浓度的力达霉素或强化融合蛋白200μl/孔,每个药物浓度设三个平行孔,继续培养72小时后,每孔加入以PBS溶解的MTT(5mg/ml)20μl,37℃继续培养4小时后,吸弃上清,每孔加入150μl二甲基亚砜,室温摇床振荡10分钟,酶标仪上测定570nm处的吸光值。每次实验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔,按下面公式计算细胞的存活率及强化融合蛋白的IC50值:
细胞存活率=(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%
结果表明,强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对SK-OV-3、SK-BR-3、A431和MCF-7等肿瘤细胞均有强烈的杀伤作用(图10a、10b、10c、10d、10e),其IC50值低于LDM和单特异性的强化融合蛋白,而对不表达EGFR和HER2的小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞,其IC50值则与LDM相当(表1)。由此可以看出,强化融合蛋白与LDM和单特异性的强化融合蛋白相比,其对高表达EGFR和HER2的肿瘤细胞具有更强的杀伤能力,而对正常细胞的毒性则略有下降,这表明强化融合蛋白的作用具有特异性。
表1.LDM和强化融合蛋白对各种细胞的IC50值
<实施例7>强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的治疗作用
取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠2只,将人卵巢癌细胞SK-OV-3接种于裸鼠腋窝皮下,每只接种1×107个细胞。待瘤块长至足够大小时,将其在无菌生理盐水中剪成2×2×2mm3的小块,用套管针将肿瘤分别移植到36只体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠右腋窝皮下,用火胶棉将切口粘住。待瘤块长至100mm3大小时,将裸鼠按照瘤块大小、体重分6组,使每组瘤块大小平均值为100mm3,且各组体重平均值接近,每组6只裸鼠。瘤块接种后第12天和第19天尾静脉注射给药。LDM剂量为0.05mg/kg,;融合蛋白Ec-LDP-Hr剂量为1mg/kg,强化融合蛋白3个剂量组,分别为0.3mg/kg,0.4mg/kg,0.5mg/kg,均为尾静脉注射给药。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重,根据公式V=ab2/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径,b:肿瘤短径),绘制肿瘤生长曲线(图11),计算抑瘤率,观察体重变化(表2)。实验第30天处死动物,分离肿瘤并称重。实验结果表明,强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对人卵巢癌移植瘤有显著疗效,其中强化融合蛋白0.5mg/kg、0.4mg/kg和0.3mg/kg剂量组第30天的抑瘤率分别为80.3%、70.3%、65.8%,0.5mg/kg和0.4mg/kg剂量组明显优于LDM治疗组(抑瘤率为65%)。
表2.强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE对人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用
*与对照相比,P<0.05,**与对照相比,P<0.01
^与LDM相比,P<0.05,^^与LDM相比,P<0.01
序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所
<120>一种双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE
<160>2
<210>1
<211>612
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)...(72)
<223>
<400>1
atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggccatgg cgaactgtgt ggtgggctat attggcgaac gctgtcagta tcgcgatctg 120
aaatggtggg aactgcgcgg tggaggtggt tcaggtggag gcggttcagc gcccgccttc 180
tccgtcagtc ccgcctcggg tctgagtgac ggacagagcg tgtcggtgtc ggtcagcggt 240
gccgccgccg gcgagaccta ctacatcgcc cagtgcgctc cggtcggtggc caggacgcg 300
tgcaacccgg cgaccgcgac gtccttcacc acggacgcgt ccggagcggc gtcgttcagc 360
ttcgtcgtgc gcaagtcgta cacgggctcc acgcccgaag gcacgccggt cggcagcgtc 420
gactgcgcca cggccgcctg taacctcggc gccggcaact ccgggctcga cctcggccac 480
gtggctctga ccttcggcgg tggaggcggt tcaggtggag gcggttcaca tgatgtgggc 540
tattgtaccg atcgcagctg tgcgaaatgg ccggaatggc tgggcgtgct cgagcaccac 600
caccaccacc ac 612
<210>2
<211>182
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Ala Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Glu Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly
35 40 45
Leu Ser Asp Gly Gln Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly
65 70 75
Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp
80 85 90
Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr
95 100 105
Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys
110 115 120
Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp
125 130 135
Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
140 145 150
Gly Gly Gly Ser His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Ser Cys
155 160 165
Ala Lys Trp Pro Glu Trp Leu Gly Val Leu Glu His His His His
170 175 180
His His
182
Claims (3)
1.一种双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr,其序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的强化融合蛋白Ec-LDP-Hr,其特征是,靶向EGFR的寡肽Ec基因为66bp,编码EGF C环的22个氨基酸残基;力达霉素辅基蛋白LDP基因330bp,编码110个氨基酸;靶向HER2的寡肽Hr基因长60bp,编码抗HER2抗体C6.5重链CDR3区的20个氨基酸。
3.权利要求1所述强化融合蛋白Ec-LDP-Hr在制备抗肿瘤导向药物中的应用。
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