CN101496915A - 去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架，它取自哺乳动物真皮网状层，具有真皮网状层孔隙较大的天然三维结构；真皮支架去除基底膜，无细胞；真皮支架的厚度为0.2～0.8mm。它是无菌取皮，再去除皮下组织、表皮、基底膜和真皮***层；再依次用蒸馏水浸泡、用胰蛋白酶和EDTA·Na2消化液消化，并持续振荡后用磷酸盐缓冲液洗；再置于Triton X－100溶液中浸泡并持续振荡，再用磷酸盐缓冲液洗而得以制备。它完全地去除了真皮中主要免疫原性物质的来源，降低了免疫原性；将它用于皮肤创面修复、组织工程皮肤构建以及组织填充，营养渗透性强、血管化速度快、存活率高，效果好；它的皮源丰富，制备工艺简单，制作周期短，价格低廉。

Description

去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架及其制备方法

技术领域：

本发明属于医用生物材料，具体涉及用于皮肤创面修复、组织工程皮肤构建以及组织填充的一种异种真皮网状层支架，及其制备方法。

背景技术：

临床上多种伤、病可导致皮肤缺损，特别是大面积烧伤患者，早期切痂、用敷料及时封闭创面是目前修复皮肤最有效、最关键的措施。采用患者的自体皮肤移植有引起供皮区的瘢痕增生和色素沉着的可能；创面愈合后产生不同程度的疤痕增生，严重烧伤患者还存在自体皮源严重不足。因此，寻找一种理想的皮肤创面修复材料成为创伤修复的主要课题。1913年，Loewe证实真皮组织能够增强移植皮肤的韧性、抑制肉芽组织生长和瘢痕形成，降低创面挛缩程度，随后人们就开始关注真皮组织在皮肤移植中的作用。1985年Heck等报道应用异体真皮作为自体表皮的移植载体，复合移植到烧伤创面，取得较好治疗效果。Wainwright(1995)用人体皮肤制成脱细胞真皮，随后又有研究者将自体表皮细胞膜片复合脱细胞真皮基质移植修复全层皮肤缺损获得成功。美国LifeCell公司将这一成果商品化，用新鲜的人尸体制成脱细胞真皮支架，命名为AlloDerm，通过美国FDA的批准进入了医用生物材料市场。国内陈壁等人最早开始对异体真皮脱细胞处理和临床应用研究，目前已有类似Alloderm的异体真皮脱细胞真皮在国内上市。由于人异体皮的来源极其有限，远不能满足临床需要，开发异种脱细胞真皮支架成为解决这一问题的有效途径。

现有研究证明，皮肤基底膜的主要成分与皮肤免疫密切相关，很多皮肤疾病(如***性红斑狼疮、大疱性皮肤病等)与基底膜带的自身抗体有联系；异种脱细胞真皮的基底膜和***层免疫反应最强(Srivastava 2001，DeSagun 2001)；还有人观察到，猪真皮不同层次的抗原性也不尽相同，位于较深部位的真皮网状层其抗原性明显低于较浅部位的真皮***层，表明猪的真皮网状层具有免疫惰性。因而，基底膜和真皮***层是含基底膜异种无细胞真皮的免疫原性的主要来源。

异体脱细胞真皮制作的方法已逐渐趋于成熟，主要有平衡盐溶液法、酶消化—去污剂法和高渗盐—去污剂法三种，但是它们都保留了基底膜，且主要来自真皮***层，如Alloderm。这些方法很难将免疫原性物质清除干净，移植后仍存在不同程度免疫排斥反应。在现有技术中，有一件2003年12月10日公开的CN1460527A，它使用戊二醛作化学交联剂来降低真皮的免疫原性，但因此却改变了真皮纤维的天然结构，使真皮较致密，影响了植入存活率；另有一件于2002年4月10日公开的CN1343523A，它利用了激光打孔的方式增加支架的孔隙和渗透性，然而这种方式所得孔隙并非纤维天然结构，而且激光对孔周的胶原纤维有热变性作用。现有技术的各种异种脱细胞真皮仍存在着下列缺点：(1)细胞洗脱除不彻底，免疫原性较强，局部长期存在炎症免疫反应；(2)脱细胞真皮较致密，对营养的渗透性差，血管化速度慢，导致移植后存活率低。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术异种脱细胞真皮存在的上述缺陷，拟提供一种去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架及其制备方法，使之材料来源丰富；细胞洗脱更彻底，免疫原性更低；保留天然纤维结构，孔隙大，又无化学及激光损伤，营养渗透性强、血管化速度快、存活率高。

采取以下技术方案来实现本发明的目的。

一种去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架，其特征在于：

1)它取自哺乳动物真皮网状层，具有真皮网状层孔隙较大的天然三维结构；

2)真皮支架去除基底膜，无细胞；

3)真皮支架的厚度为0.2～0.8mm。

上述去基底膜无细胞异种真皮网状层支架，所说的哺乳动物真皮网状层是豚鼠、竹鼠、大鼠、海狸鼠、兔、羊、猪和牛中任选一种动物的真皮网状层。

上述去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架的一种制备方法，其特征是按以下步骤操作：

1)无菌条件下取得哺乳动物的皮肤；

2)先去除皮肤的皮下组织，再去除皮肤的表皮、基底膜和真皮***层；

3)用蒸馏水浸泡0.2小时～3小时；

4)用重量浓度为0.18％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.035％的EDTA·Na2消化液，在37℃下持续振荡2小时～8小时，再用磷酸盐缓冲液至少洗三遍；

5)将上步消化好的真皮支架置于重量浓度0.3％～0.8％的TritonX-100溶液中浸泡并持续振荡24小时～48小时，用磷酸盐缓冲液至少洗三遍；

6)将获取的去基底膜无细胞异种真皮网状层支架浸泡于75％重量乙醇中保存，或冻干密封后钴60照射消毒保存，或冻干后用环氧乙烷消毒保存。

保存的去基底膜无细胞异种真皮网状层支架，用生理盐水浸泡后至少清洗三遍再使用。

按照本发明方法所获得的去基底膜无细胞异种真皮网状层支架，由于取自真皮网状层，不含有基底膜，具有孔隙较大的天然三维结构，结构疏松，孔隙率大(见图2)。这极为有利于营养渗透及血管长入，能在短时间内与创面基底建立有效的血液循环，加快创面修复。

在制备方法上，完全地去除了真皮中主要免疫原性物质的来源(基底膜和真皮***层)，降低了免疫原性；又在常规的酶消化和去垢剂处理的基础上改善了操作工艺，更增加了联合蒸馏水浸泡的低渗处理，使洗脱细胞更加彻底，完全达到无细胞的效果，更进一步降低了免疫原性(见图2、图3、图4)。

在本发明的去基底膜无细胞异种真皮网状层支架表面上接种人角质形成细胞，培养1天，可见多个细胞粘附于真皮支架表面，细胞***，尚未完全铺展(见图5)；培养5天，细胞在支架表面完全铺平且逐渐融合成片(见图6)；培养15天后，将其移植到裸鼠背部，术后20天已形成比较完整的皮肤结构，支架内散在分布有成纤维细胞和新生血管(见图7)。

以猪皮肤为材料来源制备的去基底膜无细胞异种真皮网状层支架，将其与自体微粒皮复合移植到大鼠背部的皮肤缺损创面，可支持微粒皮(扩张比2∶1)存活及上皮化，2周创面愈合；6周时的创面收缩率仅35％～40％，而无支架对照组高达70％～75％；13周未见创面起水疱或溃烂发生，且未见瘢痕增生，大体观察与周围皮肤相似，触摸与周围皮肤无明显界限(见图8)。

本发明去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架，皮源丰富，制备工艺简单，制作周期短，价格低廉。

附图说明

图1为脱细胞处理前的真皮网状层(H.E.100×)

注：未见基底膜，成纤维细胞呈散在分布，纤维结构较致密；可见毛囊和较多的皮脂腺

图2为采用本发明方法制备的无基底膜无细胞异种真皮网状层支架(H.E.100×)

注：本发明方法可完全去除真皮网状层内的细胞成分，且胶原束完整、孔隙增大。

图3为缺低渗法制备的无基底膜无细胞异种真皮网状层支架(H.E.100×)

注：缺低渗处理的方法所制备的真皮网状层支架可见一定细胞碎屑残留

图4为接种细胞前的本发明无基底膜无细胞异种真皮网状层支架(扫描电镜.300×)

注：表面呈不规则的凹凸不平结构，胶原纤维呈现条索状或“方便面样”结构，有许多大小不等的网孔，特别是未见细胞的残留成分。

图5为本发明无基底膜无细胞异种真皮网状层支架接种人角质形成细胞后1天(扫描电镜.3000×)

注：多个细胞粘附于真皮支架表面，细胞***，尚未完全铺展。

图6为本发明无基底膜无细胞异种真皮网状层支架接种人角质形成细胞后5天(扫描电镜.1500×)

注：培养五天后，细胞在支架表面完全完全铺平且逐渐融合成片。

图7为裸鼠移植人角质形成细胞复合无基底膜无细胞异种真皮网状层术后20天(H.E.40×)

注：创面组织切片显示实已形成比较完整的皮肤结构，支架内散在分布有成纤维细胞和新生血管。

图8为猪无基底膜无细胞真皮网状层支架复合移植大鼠自体微粒皮创面术后6周

具体实施方式

下面用具体制备实例进一步说明本发明去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架制备方法。

实施例1：

以大鼠作为材料来源，具体制备过程步骤如下：

1、无菌切取大鼠背部皮肤和皮下组织；

2、置于0.1％新洁尔灭溶液浸泡20分钟；

3、用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗三遍；

4、用无菌取皮机去除皮下组织，获得厚度0.5mm的全层皮肤；

5、再用无菌取皮机将表皮、基底膜和真皮***层一并去除，获得厚度0.3mm的真皮网状层(见图1)；

6、用低渗的蒸馏水浸泡所获的真皮网状层并持续振荡130次/分钟1小时；

7、用重量浓度为0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA·Na2的消化液，在37℃下持续振荡3小时；

8、更换消化液为磷酸盐缓冲液，持续振荡10分钟，反复洗三遍；

9、将消化好的真皮支架置于重量浓度0.5％TritonX-100溶液中浸泡，并持续振荡130次/分钟48小时，同步骤8洗三遍；

10、再将真皮支架于冻干机内在—69℃下冻干；

11、密封后钴60照射消毒保存。

实施例2：

以兔作为材料来源，具体制备过程步骤如下：

1、无菌切取兔背部皮肤和皮下组织；

2、置于0.1％新洁尔灭溶液浸泡20分钟；

3、用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗三遍；

4、用无菌取皮机去除皮下组织，获得厚度0.4cm的全层皮肤；

5、再用无菌取皮机将表皮、基底膜和真皮***层一并去除，获得厚度0.2mm的真皮网状层；

6、用低渗的蒸馏水浸泡所获的真皮网状层并持续振荡130次/分钟1.5小时；

7、用重量浓度为0.2％的胰蛋白酶和0.015％的EDTA·Na2的消化液在37℃下，持续振荡3小时；

8、更换消化液为磷酸盐缓冲液，持续振荡10分钟，反复洗三遍；

9、将消化好的真皮支架置于重量浓度0.3％TritonX-100溶液中浸泡，并持续振荡130次/分钟24小时。同步骤8洗三遍；

10、再将真皮支架于冻干机内在—69℃下冻干；

11、密封后钴60照射消毒保存。

Claims (3)

1、一种去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架，其特征在于：

1)它取自哺乳动物真皮网状层，具有真皮网状层孔隙较大的天然三维结构；

2)真皮支架去除基底膜，无细胞；

3)真皮支架的厚度为0.2～0.8mm。

2、按照权利要求1所述去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架，其特征在于所说的哺乳动物真皮网状层是豚鼠、竹鼠、大鼠、海狸鼠、兔、羊、猪和牛中任选一种动物的真皮网状层。

3、如权利要求1去基底膜无细胞的异种真皮网状层支架的一种制备方法，其特征是按以下步骤操作：

1)无菌条件下取得哺乳动物的皮肤；

2)先去除皮肤的皮下组织，再去除皮肤的表皮、基底膜和真皮***层；

3)用蒸馏水浸泡0.2小时～3小时；

4)用重量浓度为0.18％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.035％的EDTA·Na2消化液，在37℃下持续振荡2小时～8小时，再用磷酸盐缓冲液至少洗三遍；

5)将上步消化好的真皮支架置于重量浓度为0.3％～0.8％的TritonX-100溶液中浸泡并持续振荡24小时～48小时，用磷酸盐缓冲液至少洗三遍；

6)将获取的去基底膜无细胞异种真皮网状层支架浸泡于75％重量乙醇中保存，或冻干密封后钴60照射消毒保存，或冻干后用环氧乙烷消毒保存。

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