CN101492661B

CN101492661B - 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备

Info

Publication number: CN101492661B
Application number: CN2009100290554A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈坚; 刘玲玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN101492661A

Abstract

一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成β-葡萄糖苷酶基因(bgl)SEQ ID NO：1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的bgl/pPIC9K转化P.pastoris KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精制，达到较好效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。

Description

一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备

技术领域

本发明涉及一种编码黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07BGL酶的DNA序列及其表达，构建高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母基因工程菌，以及β-葡萄糖苷酶制剂和β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的方法。属于酶基因工程和酶工程领域。

背景技术

龙胆低聚糖是一类由葡萄糖以β-1，6糖苷键结合的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。作为功能性食品配料，龙胆低聚糖除了具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能外，与其他功能性低聚糖相比，它还能更好地促进人体小肠中双歧菌和乳酸菌的繁殖；并且耐热、耐酸，可应用于其他一些低聚糖不适宜使用的保健食品中。虽然龙胆低聚糖具有广阔的应用前景，但目前只有日本的Nihon Shokuhin Kako公司进行工业化生产，主要在日本销售。龙胆低聚糖的制取方法很多。早期采取从植物中提取，因为受到原料的限制，产量不高。目前酶法制取成为最有效地降低成本，大规模生产的途径。工业上采用高浓度的葡萄糖为原料，经β-葡萄糖苷酶转糖苷和缩合，再经分离精制得到不同规格的龙胆低聚糖成品。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21)属于水解酶类，但也具有转糖苷活性，可使低聚糖的非还原末端糖苷键断裂，释放出葡萄糖，并将游离的葡萄糖基以β-1，6糖苷键形式转移到其他糖底物上获得龙胆低聚糖。BGL广泛存在于自然界许多植物和微生物中，但酶活普遍较低，且不易纯化，所以运用基因工程手段构建高效表达BGL的工程菌成为当今研究β-葡萄糖苷酶的热点。

到目前为止，已有上百个微生物β-葡萄糖苷酶基因得到克隆，其中一些获得异源表达。早期主要选用大肠杆菌为宿主，近年来随着真核表达体系的建立与完善，研究表明β-葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大肠杆菌中表达的表达量和酶活性普遍要高些，所以酵母表达***被广泛应用。由于β-葡萄糖苷酶的水解活性在纤维素的完全降解中起到至关重要的作用，目前对于β-葡萄糖苷酶的研究大多集中于其水解活性，转苷活性的报道很少。Heather F.Seidle等人曾研究过黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶转苷活性与pH的关系，虽提到龙胆二糖是转苷产物，但是在其研究过程中以纤维二糖为底物龙胆糖产物量仅有约5.4g/L。国内学者主要致力于克隆表达β-葡萄糖苷酶基因以及研究其水解酶学性质，没有涉及转苷活性。至于利用重组β-葡萄糖苷酶的转苷活性酶法生产龙胆低聚糖未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供包含β-葡萄糖苷酶基因的酵母基因工程菌。本发明的另一个目的是提供本发明基因工程菌生产β-葡萄糖苷酶制剂，本发明的再一个目的是提供以β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制取龙胆低聚糖的生产工艺。

本发明的技术方案：

一种β-葡萄糖苷酶，缩写为BGL酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的β-葡萄糖苷酶的基因，缩写为bgl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达方法，由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成bgl的cDNA SEQ ID NO：1，bgl基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现bgl基因的可溶性表达；黑曲霉WX-07已在【中国酿造2007年第5期】公开。

(1)黑曲霉WX-07总RNA的提取：

黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓冲液清洗菌体一次，加入1mL TRI REAGENT(购于Sigma公司)，用移液枪反复吹吸以裂解细胞；12,000×g、4℃离心10min以移除不溶物；将上清转移到一个干净的离心管，将样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s，在室温下放置10min，12,000×g、4℃离心15min，取上层无色水相于一干净的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，在室温下放置10min，12,000×g，4℃离心10min，弃上清，加入1mL由DEPC-H₂O(购于宝生物工程有限公司)配制的质量浓度75％乙醇，漩涡混匀，然后12,000×g、4℃离心5min，弃上清，让RNA自然干燥10min，加40μLDEPC-H₂O溶解RNA沉淀，为模板RNA，-20℃保存；

(2)β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：

以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下PrimeScript RTase、5×PrimeScript Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、OligodT Primer、Random 6mers、Rnase free H₂O均来自于试剂盒“PrimeScript^TM1stStrand cDNA Synthesis Kit”，购于宝生物工程有限公司)，

①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液：

50μM的Oligo dT Primer或Random 6mers 1μL，

10mM的dNTP Mixture 1μL，

总RNA 1μg，

和Rnase free H₂O 添加至总体系10μL；

②65℃保温5min后冰上急冷；

③在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：

步骤①配制的RNA/Primer混合液 10μL，

5×PrimeScript Buffer 4μL，

40U/μL的RNase Inhibitor 0.5μL，

200U/μL的PrimeScript RTase 1μL，

Rnase free H₂O 4.5μL；

④在50℃下保温1小时；

若步骤①中使用Random Primer时，需先在30℃保温10min，然后再在50℃下保温1小时；

⑤70℃保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合成；以cDNA第一条链为模板，以P1，P2为上下游引物扩增出bgl基因：

引物P 1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’

引物P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，模板DNA 2μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

PCR反应条件为：在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

(3)bgl/pPIC 9K质粒的构建：

用于构建重组质粒的表达载体是pPIC 9K，带有α-Factor信号肽，将pPIC9K质粒和扩增的bgl基因进行NotI和EcoRI酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的bgl/pPIC 9K质粒；

(4)毕赤酵母KM71转化和筛选重组菌：

将质粒bgl/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；

在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，电击，转化物中加入1mL 1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的bgl基因的重组菌，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL；

pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；

(5)重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K的PCR鉴定：

选取含1mg/mL G418的YPD/G418上单菌落，以引物P1、P2作引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到bgl全基因；重组毕赤酵母KM71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM71/bgl/pPIC 9K用于后续实验；

(6)重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K的培养：

将鉴定正确的单菌落KM 71/bgl/pPIC 9K接种至5mL YPD培养基，200r/min，30℃培养16h；以10％的接种量接入装50mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃培养24h，离心收集全部菌体；转入50mL BMMY培养基的250mL三角瓶中，30℃，培养120h，在该培养阶段中每24h补加0.5％的甲醇，并取样200μL，用于SDS-PAGE检测；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K培养方法同上；

(7)重组β-葡萄糖苷酶的转苷检测：

步骤(6)所取表达产物样品进行SDS-PAGE检测，表达产物在12kDa应有条带；收集步骤(6)的重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成BGL粗酶液；

检验转苷活性如下：用pH4.5的醋酸缓冲液配制50％的葡萄糖溶液10mL，加入400μL BGL粗酶液，50℃反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成。

所述β-葡萄糖苷酶的应用，用于龙胆低聚糖的制备：

(a)β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化：

底物葡萄糖质量浓度为80％，pH4.5，β-葡萄糖苷酶的加酶量为每克葡萄糖60U，添加1mmol/L的K⁺，转化温度为60℃，转化时间为48h；

(b)龙胆低聚糖的分离精制：

将步骤(b)的酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，然后在30℃下用带有保温夹套的树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02进行分离提纯。

本发明的有益效果：本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成bgl基因SEQ ID NO：1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，真核表达质粒bgl/pPIC9K构建成功后，转化P.pastoris KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精致，达到较好的效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。

附图说明

图1重组BGL酶SDS-PAGE图谱。图中泳道1：重组毕赤酵母KM71/pPIC9K发酵液SDS-PAGE图谱；图中泳道M：蛋白质分子量标准；图中泳道2：重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC9K发酵液SDS-PAGE图谱。

图2重组BGL酶转化葡萄糖制取龙胆低聚糖的HPLC图谱。

具体实施方式

实施例1：本实施例说明黑曲霉WX-07总RNA的提取。

实施例2：本实施例说明β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆。

①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液：

50μM的Oligo dT Primer或Random 6mers 1μL，

10mM的dNTP Mixture 1μL，

总RNA 1μg，

和Rnase free H₂O 添加至总体系10μL；

②65℃保温5min后冰上急冷；

③在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：

步骤①配制的RNA/Primer混合液 10μL，

5×PrimeScript Buffer 4μL，

40U/μL的RNase Inhibitor 0.5μL，

200U/μL的PrimeScript RTase 1μL，

Rnase free H₂O 4.5μL；

④在50℃下保温1小时；

若步骤①中使用Random Primer时，需先在30℃保温10min，然后再在50 ℃下保温1小时；

引物P1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’

引物P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’

PCR反应条件为：在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；

实施例3：本实施例说明bgl基因在表达载体上的构建。

用于构建表达载体的质粒是pPIC 9K，带有α-Factor信号肽，将pPIC 9K质粒和扩增的bgl基因进行NotI和EcoRI酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的bgl/pPIC 9K质粒。

实施例4：本实施例说明毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌。

将表达载体bgl/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；

在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mL1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的bgl基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL；

pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照。

实施例5：本实施例说明重组β-葡萄糖苷酶的转苷检测。

SDS-PAGE检测表达产物在12kDa有条带。收集重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，检验转苷活性如下：用pH4.5的醋酸缓冲液配制50％的葡萄糖溶液10mL，400μL粗酶液，50℃反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成；

HPLC条件：示差折光检测器，色谱柱：Hypersil NH2，250mm×4.6mm；柱温：30℃；池温(检测器)：30℃；流动相：76％乙腈；流速：1mL/min；进样量：5μL。

质谱条件：离子方式：ESI-、ESI+，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度：250℃，质量范围：100-800m/z，选择离子：ESI+：365.5Da；ESI-：341.4Da，光电倍增器电压：650Volts，Analyser Vacuum：2.6e-5mBar，Gas Flow：4.2lit/hr。

实施例6

重组β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化龙胆低聚糖的分离精制：

通过对龙胆低聚糖酶法生产的关键条件的考察，确定最佳条件：当底物葡萄糖浓度为80％，反应pH4.5，温度为60℃，加酶量为每克葡萄糖60U，添加1mmol/L的K⁺，转化周期为48h；将酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，用带有保温夹套的16mm×500mm树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02(钙型)进行分离提纯进样量5mL，温度30℃，以水为洗脱剂，洗脱速度1mL/min。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>2523

<212>DNA

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07

<400>1

gatgaattgg cctactcccc accgtattac ccatcccctt gggccaatgg ccagggcgac 60

tgggcgcagg cataccagcg cgctgttgat attgtctcgc aaatgacatt ggatgagaag 120

gtcaatctga ccacaggaac tggatgggaa ttggaactat gtgttggtca gactggcggt 180

gttccccgat tgggagttcc gggaatgtgt ttacaggata gccctctggg cgttcgcgac 240

tccgactaca actctgcttt ccctgccggc atgaacgtgg ctgcgacctg ggacaagaat 300

ctggcatacc ttcgcggcaa ggctatgggt caggaattta gtgacaaggg tgccgatatc 360

caattgggtc cagctgccgg ccctctcggt agaagtcccg acggtggtcg taactgggag 420

ggcttctccc cagaccctgc cctaagtggt gtgctctttg ccgagaccat caagggtatc 480

caagatgctg gtgtggttgc gacggctaag cactacattg cttacgagca agagcatttc 540

cgtcaggcgc ctgaagccca aggttttgga tttaatattt ccgagagtgg aagtgcgaac 600

ctcgatgata agactatgca cgagctgtac ctctggccct tcgcggatgc catccgtgca 660

ggtgctggcg ctgtgatgtg ctcctacaac cagatcaaca acagttatgg ctgccagaac 720

agctacactc tgaacaagct gctcaaggcc gagctgggct tccagggctt tgtcatgagt 780

gattgggctg ctcaccatgc tggtgtgagt ggtgctttgg caggattgga tatgtctatg 840

ccaggagacg tcgactacga cagtggtacg tcttactggg gtacaaactt gaccattagc 900

gtgctcaacg gaacggtgcc ccaatggcgt gttgatgaca tggctgtccg catcatggcc 960

gcctactaca aggtcggccg tgaccgtctg tggactcctc ccaacttcag ctcatggacc 1020

agagatgaat acggctacaa gtactactac gtgtcggagg gaccgtacga gaaggtcaac 1080

cagtacgtga atgtgcaacg caaccacagc gaactgattc gccgcattgg agcggacagc 1140

acggtgctcc tcaagaacga cggcgctctg cctttgactg gtaaggagcg cctggtcgcg 1200

cttatcggag aagatgcggg ctccaaccct tatggtgcca acggctgcag tgaccgtgga 1260

tgcgacaatg gaacattggc gatgggctgg ggaagtggta ctgccaactt cccatacctg 1320

gtgacccccg agcaggccat ctcaaacgag gtgcttaagc acaagaatgg tgtattcacc 1380

gccaccgata actgggctat cgatcagatt gaggcgcttg ctaagaccgc cagtgtctct 1440

cttgtctttg tcaacgccga ctctggtgag ggttacatca atgtggacgg aaacctgggt 1500

gaccgcagga acctgaccct gtggaggaac ggcgataatg tgatcaaggc tgctgctagc 1560

aactgcaaca acacaatcgt tgtcattcac tctgtcggac cagtcttggt taacgagtgg 1620

tacgacaacc ccaatgttac cgctatcctc tggggtggtt tgcccggtca ggagtctggc 1680

aactctcttg ccgacgtcct ctatggccgt gtcaaccccg gtgccaagtc gccctttacc 1740

tggggcaaga ctcgtgaggc ctaccaagac tacttggtca ccgagcccaa caacggcaac 1800

ggagcccctc aggaagactt tgtcgagggc gtcttcattg actaccgtgg atttgacaag 1860

cgcaacgaga ccccgatcta cgagttcggc tatggtctga gctacaccac tttcaactac 1920

tcgaaccttg aggtgcaggt gctgagcgcc cctgcatacg agcctgcttc gggtgagacc 1980

gaggcagcgc caaccttcgg agaggttgga aatgcgtcgg attacctcta ccccagcgga 2040

ttgctgagaa ttaccaagtt catctacccc tggctcaacg gtaccgatct cgaggcatct 2100

tccggggatg ctagctacgg gcaggactcc tccgactatc ttcccgaggg agccaccgat 2160

ggctctgcgc aaccgatcct gcctgccggt ggcggtcctg gcggcaaccc tcgcctgtac 2220

gacgagctca tccgcgtgtc agtgaccatc aagaacaccg gcaaggttgc tggtgatgaa 2280

gttccccaac tgtatgtttc ccttggcggt cccaatgagc ccaagatcgt gctgcgtcaa 2340

ttcgagcgca tcacgctgca gccgtcggag gagacgaagt ggagcacgac tctgacgcgc 2400

cgtgaccttg caaactggaa tgttgagaag caggactggg agattacgtc gtatcccaag 2460

atggtgtttg tcggaagctc ctcgcggaag ctgccgctcc gggcgtctct gcctattgtt 2520

cac 2523

<210>SEQ ID NO：2

<211>841

<212>PRT

<213>黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07

<400>2

Asp Glu Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Tyr Tyr Pro Ser Pro Trp Ala

5 10 15

Asn Gly Gln Gly Asp Trp Ala Gln Ala Tyr Gln Arg Ala Val Asp

20 25 30

Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Asp Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr

35 40 45

Gly Thr Gly Trp Glu Leu Glu Leu Cys Val Gly Gln Thr Gly Gly

50 55 60

Val Pro Arg Leu Gly Val Pro Gly Met Cys Leu Gln Asp Ser Pro

65 70 75

Leu Gly Val Arg Asp Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly

80 85 90

Met Asn Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg

95 100 105

Gly Lys Ala Met Gly Gln Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ala Asp Ile

110 115 120

Gln Leu Gly Pro Ala Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly

125 130 135

Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Ser Gly

140 145 150

Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val

155 160 165

Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Ala Tyr Glu Gln Glu His Phe

170 175 180

Arg Gln Ala Pro Glu Ala Gln Gly Phe Gly Phe Asn Ile Ser Glu

185 190 195

Ser Gly Ser Ala Asn Leu Asp Asp Lys Thr Met His Glu Leu Tyr

200 205 210

Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ala Val

215 220 225

Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Gln Asn

230 235 240

Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln

245 250 255

Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ala Ala His His Ala Gly Val Ser

260 265 270

Gly Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Asp

275 280 285

Tyr Asp Ser Gly Thr Ser Tyr Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ser

290 295 300

Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala

305 310 315

Val Arg Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu

320 325 330

Trp Thr Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly

335 340 345

Tyr Lys Tyr Tyr Tyr Val Ser Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn

350 355 360

Gln Tyr Val Asn Val Gln Arg Asn His Ser Glu Leu Ile Arg Arg

365 370 375

Ile Gly Ala Asp Ser Thr Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ala Leu

380 385 390

Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg Leu Val Ala Leu Ile Gly Glu Asp

395 400 405

Ala Gly Ser Asn Pro Tyr Gly Ala Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly

410 415 420

Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Gly Trp Gly Ser Gly Thr Ala

425 430 435

Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Ser Asn Glu

440 445 450

Val Leu Lys His Lys Asn Gly Val Phe Thr Ala Thr Asp Asn Trp

455 460 465

Ala Ile Asp Gln Ile Glu Ala Leu Ala Lys Thr Ala Ser Val Ser

470 475 480

Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val

485 490 495

Asp Gly Asn Leu Gly Asp Arg Arg Asn Leu Thr Leu Trp Arg Asn

500 505 510

Gly Asp Asn Val Ile Lys Ala Ala Ala Ser Asn Cys Asn Asn Thr

515 520 525

Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asn Glu Trp

530 535 540

Tyr Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Gly Gly Leu Pro

545 550 555

Gly Gln Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg

560 565 570

Val Asn Pro Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg

575 580 585

Glu Ala Tyr Gln Asp Tyr Leu Val Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn

590 595 600

Gly Ala Pro Gln Glu Asp Phe Val Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr

605 610 615

Arg Gly Phe Asp Lys Arg Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly

620 625 630

Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asn Tyr Ser Asn Leu Glu Val

635 640 645

Gln Val Leu Ser Ala Pro Ala Tyr Glu Pro Ala Ser Gly Glu Thr

650 655 660

Glu Ala Ala Pro Thr Phe Gly Glu Val Gly Asn Ala Ser Asp Tyr

665 670 675

Leu Tyr Pro Ser Gly Leu Leu Arg Ile Thr Lys Phe Ile Tyr Pro

680 685 690

Trp Leu Asn Gly Thr Asp Leu Glu Ala Ser Ser Gly Asp Ala Ser

695 700 705

Tyr Gly Gln Asp Ser Ser Asp Tyr Leu Pro Glu Gly Ala Thr Asp

710 715 720

Gly Ser Ala Gln Pro Ile Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro Gly Gly

725 730 735

Asn Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Ser Val Thr Ile

740 745 750

Lys Asn Thr Gly Lys Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr

755 760 765

Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Ile Val Leu Arg Gln

770 775 780

Phe Glu Arg Ile Thr Leu Gln Pro Ser Glu Glu Thr Lys Trp Ser

785 790 795

Thr Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asn Val Glu Lys

800 805 810

Gln Asp Trp Glu Ile Thr Ser Tyr Pro Lys Met Val Phe Val Gly

815 820 825

Ser Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ile Val

830 835 840

His

841

<210>SEQ ID NO：3

<400>3

P1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’

P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’

Claims

1.一种β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于将SEQ ID NO：2氨基酸序列编码的β-葡萄糖苷酶用于龙胆低聚糖的制备：

(a)β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化：

底物葡萄糖质量浓度为80％，pH 4.5，β-葡萄糖苷酶的加酶量为每克葡萄糖60U，添加1mmol/L的K⁺，转化温度为60℃，转化时间为48h；

(b)龙胆低聚糖的分离精制：

将步骤(a)的酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，然后在30℃下用带有保温夹套的树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02进行分离提纯。