CN101492371A

CN101492371A - 一类双取代苯烯丙酰基间苯二酚类化合物及其医药用途

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Publication number: CN101492371A
Application number: CNA2008100625483A
Authority: CN
Inventors: 李校堃; 胡利红; 叶发青; 黄可新; 董建勇; 赵昱; 巫秀美; 瞿佳
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2008-06-24
Filing date: 2008-06-24
Publication date: 2009-07-29

Abstract

本发明涉及具有式(I)所示的一类双取代苯烯丙酰基间苯二酚类化合物及其医药用途，具体而言，本发明涉及式(I)化合物及其可药用盐以及这些化合物的制备方法和药物用途，以及含有该类化合物的药物组合物。本发明的式(I)化合物及其可药用盐、1，3－二－氧－[3－(4－甲氧基苯)烯丙酰]－5－甲基间苯二酚及其可药用盐具有抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的功能；同时对四株人体肿瘤细胞显示出一定细胞毒性。该类化合物可以预期用于制备***病毒感染性疾病以及肿瘤性疾病的药物。

Description

一类双取代苯烯丙酰基间苯二酚类化合物及其医药用途

技术领域

本发明涉及有机化学、药物化学和药理学领域，具体而言，本发明涉及一类双取代苯烯丙酰基-5-甲基间苯二酚类化合物及其可药用盐，以及它们的制备方法和医药用途。该类化合物被发现有抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的功能；同时对四株人体肿瘤细胞显示出确切的细胞毒性，可以预期用于制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病以及肿瘤疾病的药物用途。

背景技术

乙型病毒型肝炎(Hepatitis B)是中国多发和常见重型传染性疾病，其病原体是乙型肝炎病毒(HBV)。全国约1.2亿HBV携带者，每年死于原发性肝癌的15万人中，其大多数与乙型肝炎感染有关。目前，临床上对HBV病患的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)等，它们虽然能有效地控制病情，但一则售价昂贵；二则长期使用均可出现耐药性，以及不同程度的反跳；三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的众所周知的不良作用。所以从民族民间长期使用的药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂有着很大的意义，选择先导化合物主要的判断指标在于该类新颖的非核苷类物质必须具有对乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)和/或乙肝表面抗原(HBsAg)的抑制活性。

天然产物中的绿原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸，quinic acid)组成的一取代的缩酚酸，为众多药材(如金银花、茵陈、杜仲)以及中成药(如复肝宁、双花注射液、粉刺口服液)中抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，同时是某些中药制剂质量控制的重要指标。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经***等作用，尤其是在病毒防治领域有重要用途[赵昱等：“咖啡酰奎尼酸类化合物研究进展”，中国中药杂志，2006，31(11)，869-874]。

奎尼酸的立体结构过于复杂，需要考虑到原材料的成本以及立体定位、保护与脱保护的机制问题等，不易于工业化生产。故而科学家一直致力于用简单的五元环或者六元环环状体系或者进一步将此复杂的六元环再简化。近来，科学家陆续从菊科植物菊苣中发现了新的抗病毒咖啡酰有机酸酯类化合物L-菊苣酸(二咖啡酰酒石酸)[Robinson，W.E.Jr.Infect Med.1998，15，129-137]。此先导化合物对HIV病毒整合酶(IN)具有强效抑制活性，同时无毒范围较大，有利于发展成为抗HIV药物。其间许多的构效关系研究相继开展，制备出多种L-菊苣酸衍生物，其中活性化合物抑制HIV-1整合酶活性的IC₅₀值约为0.8～1.1μM[King，P.J.，Robinson，W.E.Jr.等，J.Med.Chem.1999，42，497-509；Lin，Z.，Bruke，T.R.Jr.，J.Med.Chem.1999，42，1401-1414]。上述研究报道结果还指出：咖啡酰结构中的邻苯二酚部分在整个分子的抑制活性中起着相当重要的作用，然而过多的酚羟基也会带来较大的毒性。考虑到以上因素，以及咖啡酰奎尼酸类和L-菊苣酸化合物的分离较为困难等因素，科学家们又设计合成一系列改变奎尼酸母核、去除环状体系而仍然保持其生物活性的化合物。通过对菊苣酸中连接体的不断简化，得到了一系列的有较高生物活性的菊苣酸类似物，其中包括保留菊苣酸一个羧基的；将两个羧基用烷基或环烷基替代的；将两个羧基直接去掉的以及将两个羟基之间连接链增长的等不同系列，均具有一定的活性。

根据文献的报道可以总结出：两个羟基取代基间的中心连接分子的结构与大小都会影响整个分子的生物活性，两羟基之间间隔的碳数越多，活性就会越低。故此我们设计将其改造成为两羟基之间间隔三个碳且中心连接分子为环状化合物的类似物，因此本发明人选择了5-甲基间苯二酚作为替代母核，合成了本发明中的双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚系列化合物。

到目前为止还未有双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚的生理活性的相关报道。仅有一篇文献在描述制备3，5-二羟基甲苯磷酸酯及其他有机酸酯作为辐射防护剂时涉及到本发明中的1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚[王荣先等，中华放射医学与防护杂志，1992，115-117]。

考虑到抗HIV药物和HBV药物的高同源性，本发明对合成出的双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚化合物测试了其对乙肝表面抗原HBsAg的抑制活性，以期寻找更多样的能对乙肝病毒复制产生抑制作用的咖啡酰奎尼酸类似物。

为了探索本发明制备得到的双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物的其他生理活性，我们还采用了MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法对此类化合物针对四种人体肿瘤体外培养细胞株[人子***细胞(Hela)、人慢性髓原细胞白血病细胞(K562)、人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、人结肠腺癌(LS 174T)]进行了生长抑制活性测试，从而完成本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一类用于制备新的抗乙肝病毒和/或细胞毒类抗肿瘤药物的化合物，具体而言，本发明提供了一类式(I)所示结构的双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物及其可药用盐：

其中：芳香取代基R₁和R₂可以相同或不同，分别选自甲氧基取代的苯基，邻位或间位或对位二甲氧基取代的苯基，卤素取代的苯基，或邻位或间位或对位卤素二取代的苯基；其条件是：R₁和R₂不能同时是4-甲氧基苯基。

本发明的又一目的是提供了所述之双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚化合物及其可药用盐用于制备抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)药物的用途。

本发明的再一目的是提供了式(I)化合物及其可药用盐用于制备细胞毒类抗肿瘤药物的用途。

本发明的再一个目的是提供了一种含有式(I)化合物的用于抗乙肝病毒疾病的药物组合物和/或细胞毒类抗肿瘤药物。根据本发明，该药物组合物中可加入各种药用赋形剂、添加剂及载体。

本发明优选的式(I)化合物列举如下：

I-a.1，3-二-氧-[3-(2，4-二氯苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚；

I-b.1，3-二-氧-[3-(4-氯苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚；

I-c.1，3-二-氧-[3-(3，4-二甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚。

本发明还提供了1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚(化合物I-d)用于制备降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表达药物和/或细胞毒类抗肿瘤药物的用途。

具体实施方式：

本发明的式(I)化合物或其可药用盐，以及化合物(I-d)或其可药用盐对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)有一定的抑制作用，其还对四种人体肿瘤体外培养细胞株[人子***细胞(Hela)、人慢性髓原细胞白血病细胞(K562)、人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、人结肠腺癌(LS 174T)]有一定的抑制作用。根据本发明，该类化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到可以用于治疗病毒性乙肝疾病相关的药物组合物和/或细胞毒类抗肿瘤药物。下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了代表性化合物的合成及相关结构鉴定数据。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：化合物I-a即1，3-二-氧-[3-(2，4-二氯苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚的制备

向反应瓶中加入3-(2，4-二氯苯)烯丙酸(87毫克，0.40毫摩尔)，二环己基碳二亚胺(83毫克，0.40毫摩尔)，无水二氯甲烷8毫升，在室温下搅拌20分钟，出现白色混浊后，加入5-甲基间苯二酚(20毫克，0.16毫摩尔)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，4.9毫克，0.04毫摩尔)，整个溶液在室温下反应过夜，抽滤除去不溶物，蒸去溶剂，脱溶得到白色固体，柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10∶1)，分离得到白色固体56毫克，产率为67％。

化合物I-a：白色固体，熔点：160～162℃(氯仿)；R_f(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)：0.51；核磁共振氢谱(400MHz，氘代甲醇)：δ2.41(3H，单峰，CH₃)，6.59(2H，双峰，J＝16.4Hz，H-2′，2″)，6.91(3H，单峰，H-2，4，6)，7.33(2H，双峰，J＝2.0Hz，H-8′，8″)，7.48(2H，双峰，J＝2.0Hz，H-9′，9″)，7.63(2H，单峰，H-6′，6″)，8.19(2H，双峰，J＝16.0Hz，H-3′，3″)；电喷雾质谱ESI-MS m/z：423.16([M+H₂O]⁺)。

根据实施例1相同的方法制备得到表一所示实施例2-5化合物：

表一

下面列出表一中各化合物的理化数据：

化合物I-b：白色固体，R_f(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)：0.4；核磁共振氢谱(400MHz，氘代甲醇)：δ2.40(3H，单峰，CH₃)，6.38(2H，双峰，J＝16.4Hz，H-2′，2″)，6.88(3H，单峰，H-2，4，6)，7.23(4H，双峰，J＝8.0Hz，H-6′，6″；H-8′，8″)，7.26(4H，双峰，J＝8.0Hz，H-5′，5″；H-9′，9″)，7.68(2H，双峰，J＝16.0Hz，H-3′，3″)。

化合物I-c：白色固体，R_f(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)：0.36；核磁共振氢谱(400MHz，氘代甲醇)：δ2.43(3H，单峰，CH₃)，3.91(6H，单峰，OCH₃)，3.92(6H，单峰，OCH₃)，6.32(2H，双峰，J＝16.4Hz，H-2′，2″)，6.92(3H，单峰，H-2，4，6)，6.86(2H，双峰，J＝8.0Hz，H-8′，8″)，7.05(2H，单峰，H-5′，5″)，7.13(2H，双峰，J＝8.0Hz，H-9′，9″)，7.67(2H，双峰，J＝16.0Hz，H-3′，3″)。

化合物I-d：白色固体，R_f(石油醚/乙酸乙酯＝3∶1)：0.54；核磁共振氢谱(400MHz，氘代甲醇)：δ2.18(3H，单峰，CH₃)，3.85(6H，单峰，OCH₃)，6.47(2H，双峰，J＝16.0Hz，H-2′，2″)，6.88(3H，单峰，H-2，4，6)，6.90(4H，双峰，J＝8.8Hz，H-6′，8′，6″8″)，7.54(4H，双峰，J＝8.8Hz，H-5′，9′，5″，9″)，7.81(2H，双峰，J＝16.0Hz，H-3′，3″)；电喷雾质谱ESI-MS m/z：462.09([M+H₂O]⁺)。

本发明的式(I)化合物或其可药用盐，以及化合物(I-d)(即1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚)或其可药用盐具有抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的功能；可以用于制备治疗相关的乙肝病毒感染性疾病的药物。该药物可以与药学上常用的辅料或载体结合，用制药领域中的常规技术制备得到具有抗乙肝病毒活性从而可以用于防治乙肝病毒引起的疾病的药物组合物。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以利用现有公知技术制备成其控释、缓释剂型及纳米制剂，还可以应用靶向药物制剂技术制备成相应药物剂型和给药方式。

本发明的式(I)化合物或其可药用盐，以及1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚(化合物I-d)或其可药用盐可以与现已上市的治疗乙型病毒性肝炎药物如拉米呋啶(lamivuding)、阿德福韦及其二匹伏酯(adevovir/adevovir dipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)、恩曲他滨(emtricitabine)、克来福定(clevudine)、泛昔络韦(famciclovir)、洛布卡韦(lobucavir)、干扰素(IFN)等联合使用，制备得到具有治疗乙型病毒性肝炎的药物。上述各类药物组合物均可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以利用现有公知技术制备成其控释、缓释剂型及纳米制剂，还可以应用靶向药物制剂技术制备成相应药物剂型和给药方式。

此外，本发明所制备的式(I)化合物或其可药用盐，以及1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚(化合物I-d)或其可药用盐对于四种人体肿瘤体外培养细胞株[人子***细胞(Hela)、人慢性髓原细胞白血病细胞(K562)、人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、人结肠腺癌(LS 174T)]具有一定的生长抑制活性，可期待作为防治相关肿瘤性疾病药物用途。

本发明所制备的式(I)化合物或其可药用盐，以及化合物(I-d)或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有抗肿瘤用途的药物组合物。上述药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊、贴片、皮下植埋剂等剂型，或其他采用公知理论和技术制备的控释、缓释剂型以及纳米制剂。

本发明的式(I)化合物或其可药用盐，以及化合物(I-d)或其可药用盐可以与现已上市的抗肿瘤药物如铂类药物顺铂(DDP)、喜树碱类药物伊立替康(Irinatecan，CPT-11)、长春花碱类药物失碳长春花碱(Vinorebine，NVB诺维本)、脱氧胞昔类药物吉西他滨(Gemcitabine，Gemzar，健择)、足叶乙甙(Etoposide)、紫杉醇(Paclitaxel)等联合使用，制备得到具有肿瘤生长抑制活性的细胞毒性的药物组合物，可用于制备治疗多种肿瘤疾病的药物。

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用药理实施例的形式简述式(I)化合物或其可药用盐，以及1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚(化合物I-d)或其可药用盐对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)抑制试验以及四株人体体外培养肿瘤细胞株的生长抑制之药理实验结果，说明其在抗病毒药物和抗肿瘤药物开发领域中的用途。药理实施例给出了式(I)化合物或其可药用盐，以及化合物(I-d)或其可药用盐的部分活性数据。同样必须说明，本发明的药理实施例仍是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

药理实施例1：化合物I-a对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抑制作用

1.1细胞培养：

将HepG2.2.15细胞培养于含10％灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37℃，5％二氧化碳CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养。

1.2采用MTT法测定化合物I-a对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用：

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-a，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升，和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入5毫克/毫升MTT试剂(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。实验重复三次。

抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。

1.3测定化合物I-a对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用：

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在100％相对湿度的5％CO₂培养箱中37℃培养24小时后加入用培养基稀释的化合物I-a，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37℃，5％CO₂，100％相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混匀，作为待测样品。用酶联反应ELISA试剂盒测定培养基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。

1.4实验结果：

实验结果如表二所示，化合物I-a有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其对HepG2.2.15细胞的生长无明显抑制作用，但对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。

表二化合物I-a对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原抑制率(％)

^a表示无抑制活性。

1.5结果说明：

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率是判断乙型肝炎病毒感染重要标志，有效抑制HBsAg分泌并使HBsAg反应转阴是治疗乙型肝炎的目标之一。化合物I-a在第八天对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作用，说明此类双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。

药理实施例2：化合物I-d对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抑制作用

2.1细胞培养：同药理实施例1。

2.2采用MTT法测定化合物I-d对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用：取对数生长期的HepG2.2.15细胞，方法同药理实施例1。

2.3测定化合物I-d对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用，以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。具体方法同药理实施例1。

2.4实验结果

实验结果如表三所示，化合物I-d有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的作用。其对HepG2.2.15细胞的生长无明显抑制作用，但对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。

表三化合物I-d对HepG2.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原抑制率(％)

2.5结果说明：

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率是判断乙型肝炎病毒感染重要标志，有效抑制HBsAg分泌并使HBsAg反应转阴是治疗乙型肝炎的目标之一。化合物I-d在第八天对HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有一定的抑制作用，说明该类双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。

药理实施例3：化合物I-a和I-d对人子***细胞的细胞毒活性

3.1人子***(Hela)细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔1×10⁴个密度接种到96孔板中，在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。

3.2细胞存活率的测定方法：用改良MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法。细胞经24小时的孵育后，分别将新配的化合物I-a和I-d的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最终浓度分别为100微克/毫升、50微克/毫升、25微克/毫升、5微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，再继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲(formazan)，所形成的甲

用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品OD值对于对照OD值的比值计算。其中化合物对Hela细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。实验结果显示各测试化合物的IC₅₀如表四所示。本试验以抗肿瘤一线用药顺铂(DDP)作为阳性对照，阳性对照顺铂对Hela细胞的IC₅₀为19.6μM。

表四测试化合物I-a和I-d对Hela细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)(微克/毫升)

化合物 I-a I-d

抑制活性IC₅₀ 64.4 55.8

3.3结果说明：化合物I-a和I-d对Hela细胞的生长具有明确的抑制作用，说明该类双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物有望发展为细胞毒类治疗人子***的药物。

药理实施例4：化合物I-a和I-d对人慢性髓原细胞白血病细胞的细胞毒活性

4.1人慢性髓原细胞白血病(K562)细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素。细胞以每孔1×10⁴个密度接种到96孔板中，在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。

4.2细胞存活率的测定方法：用改良MTT法。细胞经24小时的孵育后，分别将新配的化合物I-a和I-d的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最终浓度分别为100微克/毫升、50微克/毫升、25微克/毫升、5微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的生理盐水溶液，再继续在37℃，5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养3小时，每孔中加入150微升二甲亚砜，振荡溶解生成的MTT晶体甲

(formazan)，所形成的甲

用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品OD值对于对照OD值的比值计算。其中化合物I-a和I-d对K562细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。实验结果显示各测试化合物的IC₅₀如表五所示，本试验以抗肿瘤一线用药顺铂(DDP)作为阳性对照，阳性对照顺铂对K562细胞的IC₅₀为12.9μM。

表五各测试化合物对K562细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)(微克/毫升)

4.3结果说明：化合物I-a和I-d对K562细胞的生长具有明确的抑制作用，说明该类双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物有望发展为细胞毒类治疗人慢性髓原细胞白血病的药物。

药理实施例5：化合物I-a和I-d对人原髓细胞白血病细胞的细胞毒活性

5.1人原髓细胞白血病(HL-60)细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔5×10³的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。

5.2细胞存活率的测定：用改良MTT法，具体方法如药理实施例1。其中化合物I-a和I-d对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。实验结果显示各测试化合物的IC₅₀如表六所示。DDP对HL-60细胞的半抑制浓度IC₅₀为7.6μM。

表六化合物I-a和I-d对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)(微克/毫升)

5.3结果说明：化合物I-a和I-d对HL-60细胞的生长具有明确的抑制作用，说明该类双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物有望发展为细胞毒类治疗人原髓细胞白血病的药物。

药理实施例6：化合物I-a和I-d对人结肠腺癌细胞的细胞毒活性

6.1人结肠腺癌(LS 174T)细胞用RPMI 1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔5×10³的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。

6.2细胞存活率的测定：用改良MTT法，具体方法如药理实施例1。其中化合物对LS 174T细胞半抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。实验结果显示各测试化合物的IC₅₀如表七所示。阳性对照顺铂对LS 174T细胞的IC₅₀为4.43μM。

表七化合物I-a和I-d对LS 174T细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)(微克/毫升)

6.3结果说明：化合物I-a和I-d对LS 174T细胞的生长具有明确的抑制作用，说明该类双取代苯丙烯酰-5-甲基间苯二酚类化合物有望发展为细胞毒类治疗人结肠腺癌的药物。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims

1.一种具有式(I)所示结构的双取代苯烯丙酰基-5-甲基间苯二酚类化合物及其可药用盐：

式(I)

2.根据权利要求1的式(I)化合物，其特征是所述化合物是选自下列化合物：

I-a.1，3-二-氧-[3-(2，4-二氯苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚；

I-b.1，3-二-氧-[3-(4-氯苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚；

I-c.1，3-二-氧-[3-(3，4-二甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚。

3.根据权利要求1～2任一所述之双取代苯烯丙酰基-5-甲基间苯二酚类化合物及其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病毒表面抗原的药物用途。

4.根据权利要求1～2任一所述之双取代苯烯丙酰基-5-甲基间苯二酚类化合物及其可药用盐用于制备细胞毒类抗肿瘤药物的用途。

5.化合物1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚及其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病毒表面抗原的药物用途。

6.化合物1，3-二-氧-[3-(4-甲氧基苯)烯丙酰]-5-甲基间苯二酚及其可药用盐用于制备细胞毒类抗肿瘤药物的用途。

7.一种用于降低乙型肝炎表面抗原的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的根据权利要求1、2、5任一所述的化合物和/或它们的混合物以及它们的可药用盐和可药用辅料。

8.一种用于抗肿瘤的细胞毒类药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的根据权利要求1、2、6任一所述的化合物和/或它们的混合物以及它们的可药用盐和可药用辅料。

9.根据权利要求7～8任一所述的药物和药物组合物，其剂型是注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。