CN101491353B - 一种从虾壳中综合制备生物活性物质的环保方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从虾壳中综合制备生物活性物质的环保方法是以粤东长毛对虾虾壳为原料制备粗脂肪和壳聚糖，常温下脱蛋白质，并对制备过程中的废水中有用成分进行回收利用，从中回收蛋白质和碳酸钙等物质，制备过程中的碱液可进行重复利用，降低了生产成本，达到资源化利用的目的。本发明制备过程中产生的废水COD值比现有未脱脂肪方法产生的废水COD值降低19％左右，进行简单初步的处理后，其COD指标就达到了国家污水综合排放标准的三级标准。

Description

一种从虾壳中综合制备生物活性物质的环保方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种从虾壳中制备生物活性物质的方法。

背景技术

壳聚糖(chitosan)又名几丁聚糖，其化学名为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是甲壳素的N-脱乙酰基产物，也是甲壳素重要的衍生物。甲壳素(chitin)是自然界中含量仅次于纤维素的一种多糖，同时也是地球上数量最大的含氮有机化合物，估计每年再生量高达100亿吨，是一种可再生的绿色资源。在自然界中广泛存在于节肢动物(主要是甲壳纲如虾、蟹等，含甲壳素高达58～85％)、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等中。目前我国甲壳素和壳聚糖年产量约2500t。

不同种类的虾壳所含的粗脂肪、粗蛋白、碳酸钙、甲壳素、壳聚糖等的含量是不同的，选择正确的原料虾壳作为原料，获得高产率的壳聚糖及其他生物活性物质的可能性将大大增强。

我国是水产品资源丰富的国家，对虾是中国重要水产资源，在国内外久负盛名，长毛对虾主要分布于我国东海南部的福建、台湾和粤东，俗称红虾，是广东的重要养殖虾类。

伴随着我国东海南部的福建、台湾、粤东地区海味罐头食品、水产加工工业的发展，长毛对虾的废弃虾壳不断地增多，这些废弃物中尚含有较丰富的营养物质和有用成分，有些组分甚至还有一定的功能特性和生理活性，作为废弃物处理，浪费了巨大的生产甲壳素和壳聚糖的原料，造成非常大的生物资源浪费，同时废弃物还需要巨大的处置费用。目前尚未见利用长毛对虾虾壳制备甲壳素及壳聚糖的相关技术报道。

同时，现有技术中从废弃虾壳中提取甲壳素的同时，壳中还有约5％的脂肪、30％的钙盐、20％的蛋白质未回收利用，既造成资源浪费也造成环境污染。若能对加工的技术方案加以改进，对虾壳进行综合利用，则可变废为宝，创造良好的经济效益。

国内外目前制备壳聚糖的工艺虽然很多，但大多数工艺制备过程中产生的废水中副产物的回收及处理问题的综合处理技术方案尚不够完善，甚至大多数生产厂家的废水处于无处理排放状态，既浪费生物资源，又对环境造成相当严重的污染。针对这些问题也有一些学者做了相关方面的研究。如周安娜等研究了壳聚糖的制备新工艺及生产废水的处理，但其研究没有涉及到蛋白质等副产物的回收问题。申请号为200710168572.0的专利申请中也公开了一种从虾壳中提取甲壳素及其生物活性物质的低能环保方法，但是步骤相对复杂，没有涉及脱脂肪过程及废水的COD降低和处理排放标准。现有制备技术都没有考虑以下几个方面：(1)现有技术中都没有涉及粗脂肪的回收制备。(2)虾壳前处理中对粒度的要求，虾壳粉碎的程度将影响到其浸泡所需的酸碱量，且粉碎得比较小在浸泡时与酸碱接触面积比较大，可缩短浸泡时间，但为了使后续水洗时过滤操作方便，虾壳的粉碎粒度又不能过小；(3)脱蛋白条件的选择，包括脱蛋白的顺序和脱蛋白程度，现有技术中脱蛋白有的采用酶法，但酶法脱蛋白会明显地破坏甲壳素分子链；有的是采用先酸浸后碱浸，反应速度较慢，酸浸时间需2天以上；现有技术通常采用加热的方法脱蛋白，不能保持蛋白质原有活性，也浪费能源。(4)现有技术一般采用高锰酸钾对虾壳进行脱色，再用亚硫酸钠还原方法进行，如果用高锰酸钾脱色会给废水带来Mn²⁺、SO₄ ^2-等的污染，同时高锰酸钾是强氧化剂，其对糖苷键的破坏也很严重，将影响制得产品的质量。

综上所述，要从虾壳中获得高产率的壳聚糖及其它生物活性物质，尤其是解决粗脂肪的回收问题，同时考虑对环境的友好性，选择合适的虾壳原料和改良制备工艺是解决问题的关键。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从虾壳中综合制备壳聚糖及生物活性物质的环保方法。本发明以粤东长毛对虾虾壳为原料，采取了比较简易的方法制备了粗脂肪和壳聚糖，并对制备过程产生的废水中有用成分进行回收利用，从中回收蛋白质和碳酸钙等物质，同时将过程中的碱液进行重复利用，降低了生产成本，达到资源化利用的目的。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供一种从虾壳中综合制备生物活性物质的环保方法，包括将清洁烘干的虾壳粉碎后依次脱脂肪、脱蛋白、脱钙和脱乙酰基步骤，所述虾壳为粤东长毛对虾虾壳；所述生物活性物质包括甲壳素、壳聚糖、粗脂肪、蛋白粉或碳酸钙的至少一种。

所述从虾壳中综合制备生物活性物质的环保方法包括以下步骤：

(1)样品的预处理：将长毛对虾虾壳清洗干净晒干，烘干得虾壳；

(2)虾壳浸提于溶剂脱脂肪，除去溶剂，将残留物干燥得粗脂肪；

(3)将脱脂肪后的虾壳脱蛋白和脱钙得甲壳素；甲壳素脱乙酰基得壳聚糖。

所述从虾壳中综合制备生物活性物质的环保方法还可以包括以下步骤：将步骤(3)所述脱蛋白产生的废水用HCl调pH至5～6并加入适量NaCl，洗涤过滤析出的蛋白质，30℃下干燥可得蛋白粉；将所述脱钙产生的废水加入Na₂CO₃溶液，将沉淀干燥制得碳酸钙。

步骤(1)将长毛对虾的虾壳去除残余的肉质和污物后，用清水清洗干净于日光下晒干，综合考虑虾壳粉碎的程度对浸泡其所需的酸碱量、浸泡时间、后续水洗时过滤操作方便，虾壳粉碎至20目(5mm²)～40目左右为宜；所述烘干优选于30℃烘箱中烘干，将其保存于干燥器中备用。

步骤(2)所述浸提是称取一定量的虾壳浸泡于环己烷中脱脂肪，虾壳与环己烷重量比优选1∶10，在80℃下浸提1小时，将浸提液倒出，然后继续浸泡1小时，如此重复两次，即上述操作一共三次，三次操作结束后回收溶剂，加热除去残留溶剂并回收，将残留物干燥可制得粗脂肪。

步骤(3)是称取一定量已脱脂肪的虾壳，用4～6倍(W/V)10％的NaOH在常温下浸泡1天进行脱蛋白，过滤，用水洗涤，洗至中性，干燥，再用2～4倍(W/V)6％的HCl在常温下浸泡4h进行脱钙，过滤，用水洗涤，洗至中性，干燥得甲壳素；用虾壳10～20倍左右(W/V)的45％的NaOH在100℃下浸泡6h进行脱乙酰基，洗涤，干燥可得壳聚糖。本发明脱脂肪、脱蛋白、脱钙和脱乙酰基的顺序进行了优化，脱蛋白是在常温下操作，不需要加热，节约了能源，也便于保持蛋白的活性；整个脱蛋白、脱钙和脱乙酰基的时间大大缩短。将每一步骤所产生的废水统一回收处理。

脱乙酰基步骤使用过的NaOH液可循环使用于脱蛋白步骤。

本发明产生的废水COD值比现有技术未脱脂肪的废水COD值平均降低19％左右，这是本发明的一个显著的有益效果；本发明最终产生的废水用1％硫酸铝进行简单的初步处理，COD去除率可达51％，达到国家污水综合排放标准的三级标准，工艺环保。

本发明的有益效果论述如下：

(1)本发明首次利用长毛对虾的虾壳作为原料制备壳聚糖及其它生物活性物质，不仅获得了高产率的壳聚糖和粗脂肪等产品，而且解决了我国东海南部的福建、台湾、粤东等地区长毛对虾虾壳的处置问题；

(2)本发明在制备壳聚糖的过程中，通过制备步骤的优化和条件的确定，对脂肪及废水中副产物进行回收利用，并将所有废水进行混合，提供初步处理的方法，通过比较脱脂肪后废水COD值跟未脱脂肪后废水COD值了解到本发明废水处理效果优良，达到资源化利用的目的，具有综合利用和环保双重意义；

(3)虾壳前处理步骤针对长毛对虾提供了具体的虾壳处理方法，确定了精确的虾壳粉碎的粒度，减少碱浸的用碱量，缩短酸浸时间，同时便于后续过滤操作；

(4)本发明对脱脂肪、脱蛋白和脱钙的方法和工艺顺序进行了改进。传统工艺先酸浸以除去壳体中的碳酸钙，使壳体***，再碱浸以除去残留在壳体内的蛋白质和油脂等，这样虽然也能除去蛋白质、油脂和碳酸钙，但蛋白质是一类两性化合物，既能溶于碱也能溶于酸，在用稀酸浸泡虾壳时，会有一部分的蛋白质溶解出来，这一部分蛋白质损失掉了；同时酸浸时壳体中脂肪的存在形成一道屏障，阻止了稀酸向壳体渗透，所以传统工艺酸浸时间需2天以上；

本发明用环己烷浸提虾壳进行脱脂肪，即可加快蛋白和钙盐的浸出，同时也降低了废水的COD值；然后碱浸脱蛋白后酸浸脱钙，经先用环己烷浸提、碱浸后，虾壳脂肪和蛋白质去除了，酸浸时的屏障消除了，反应速度加快，酸浸时间由原来的48小时以上缩短为8小时以内，效率大大提高了；

(5)现有技术只是为了达到脱掉蛋白质的效果故大都将其煮沸去除，加热浪费了能源，也浪费了蛋白质；本发明中脱蛋白采用常温，不加热，即可保留和保持蛋白质原有活性，又可节约能源，降低成本；本发明通过大量试验进一步总结得到，采用本发明方法将虾壳浸泡4h脱蛋白，蛋白质脱除效果很好，浸泡4h测定虾壳中所含的蛋白质含量是3.01mg/g(浸泡1天测定虾壳中所含的蛋白质含量是0.60mg/g)。确定好浸泡时间，保证了脱乙酰的程度，避免蛋白质阻碍碱的脱乙酰基作用，最终保证壳聚糖的质量；

(6)本发明选择确定了脱蛋白废水处理时等电点的pH值，避免了蛋白质的再溶解而使产品得率降低；

(7)本发明方法中碱液可以重复使用，节约成本。脱乙酰过程耗用的碱液量是比较少的，只需用于形成醋酸钠，本发明将此步脱完乙酰后的碱液洗至脱蛋白需用碱液的浓度10％而用于下一个制备过程的脱蛋白；

(8)本发明通过大量的实验观察脱钙反应进行的程度与脱钙的时间之间关系，总结得到将脱钙时间控制在4h，足以保证完全脱钙，技术方案高效；

(9)本发明采取日光照射脱色的方法，既经济又减少污染，避免了现有技术采用高锰酸钾脱色给废水带来Mn²⁺、SO₄ ^2-等的污染、对糖苷键的严重破坏和对产品质量影响的缺陷；

(10)现有技术未脱脂肪回收利用完后的所有废水混合后测得的COD为1433mg/L，本发明脱脂肪回收利用完后的所有废水混合后测得的COD为1156mg/L，本发明方法产生废水COD值比现有技术产生废水COD值平均降低19％左右，本发明只需要用1％硫酸铝进行废水的初步处理，COD去除率就可达51％，达到国家污水综合排放标准的三级标准，工艺环保；

(11)本发明以粤东长毛对虾虾壳为原料，采用本发明方法制备得到的产品中含有粗脂肪3.4％、粗蛋白18.74％、碳酸钙31.81％、甲壳素35.51％和壳聚糖26.43％，且壳聚糖的两项主要性能指标分别为：脱乙酰度为80.94％，分子量为1.44×10⁶。通过对比发现，以长毛对虾虾壳为原料制备的甲壳素与壳聚糖的产率均比现有技术中例如采用原料地产龙虾壳及红螯螯虾壳高。

综上所述，本发明以粤东长毛对虾为原料，采取了比较简易的工艺制备了壳聚糖，并综合制备粗脂肪、蛋白质、碳酸钙，将制备过程中的碱液进行重复利用，降低了生产成本，达到一个资源化利用的目的。对本发明制备过程产生的废水只要进行简单的初步处理，其COD指标就达到了国家污水综合排放标准的三级标准。

本发明从我国尤其是广东省的资源优势出发，将废弃物进行资源化利用，产生较大的环境和经济效益。我国是水产大国，在海产品方面的资源是相当丰富的，本发明对于开发其它的废弃资源是具有重大而深远的参考意义，是一种综合利用的方法，既变废为宝又减少环境污染。

附图说明

图1本发明制备工艺流程图

图2壳聚糖浓度-比浓黏度曲线

图3现有工艺从长毛对虾虾壳中制备活性物质的流程图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1从长毛对虾虾壳中综合制备生物活性物质

(1)工艺流程如附图1所示。

(2)主要化学试剂

盐酸AR(广州化学试剂厂)，氢氧化钠AR(江苏强盛化工有限公司)，环己烷AR(广东光华化学厂)，无水碳酸钠AR(天津市永大化学试剂开发中心)，重铬酸钾GR(中国医药(集团)上海化学试剂公司)，硫酸亚铁铵AR(汕头市光华化学厂)，硫酸AR(广州市东红化工厂)，硫酸亚铁AR(汕头市光华化学厂)，1，10-菲罗啉AR(广东光华化学厂)，硫酸银AR(国营广州市立新化工厂)，硫酸铝AR(天津市永大化学试剂开发中心)。

(3)主要仪器设备

电子自动天平MP120-2(上海天平仪器厂)，电子恒温水浴锅HH-6(苏州威尔实验用品有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱101A-1ET(上海实验仪器厂有限公司)，乌氏黏度计1835(上海建强玻璃仪器有限公司)。

长毛对虾购于广州黄沙水产品交易市场。

试验过程：具体包括以下三个步骤：

步骤(1)：样品的预处理：将长毛对虾虾壳去除残余的肉质和污物后，用清水清洗干净于日光下晒干，粉碎至20～40目左右，于30℃烘箱中烘干，将干虾壳保存于干燥器中备用。

水分的测定方法：按GB5009.3-85食品中水分的测定方法进行测定。

取洁净玻璃制的扁形称量瓶，置于95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热0.5～1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，至恒重。

称取2.00～10.0g磨细的样品，放入已恒重的称量瓶中，样品厚度约为5mm。加盖，精密称量后，置95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入95～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放干燥器内冷却0.5h后再称量。至前后两次质量差不超过2mg，即为恒重。

水分计算方法：

$X_1=\frac{m_1-m_2}{m_1-m_3}\×100\%$

式中X₁-样品中水分的含量，％；

m₁-称量瓶和样品的质量，g；

m₂-称量瓶和样品干燥后的质量，g；

m₃-称量瓶的质量，g。

步骤(2)：虾壳浸提于溶剂脱脂肪，除去溶剂，将残留物干燥得粗脂肪；

称取一定量的干虾壳浸泡于环己烷(料液比1∶10)中脱脂肪，干虾壳与环己烷的料液质量比1∶10，在80℃下浸提1小时，将浸提液倒出后继续用环己烷浸泡1小时，如此重复两次(一共浸提三次，每次料液比为1∶10)，结束后回收溶剂，加热除去烧杯中残留溶剂并回收溶剂，然后置于105℃烘箱，烘至恒重得粗脂肪；

步骤(3)：将脱脂肪后的虾壳脱蛋白和脱钙得甲壳素；甲壳素脱乙酰基得壳聚糖。

称取一定量的经过步骤(2)处理脱去脂肪的干虾壳，用干虾壳的4～6倍(W/V)的、10％的NaOH在常温下浸泡1天进行脱蛋白，过滤，滤液(蛋白质溶液)也可进行后续步骤(4)制备蛋白质；虾壳用水洗涤，洗至中性，干燥后进行脱钙步骤；洗涤后的废水统一回收处理即可。

用干虾壳的2～4倍(W/V)的、6％的HCl在常温下浸泡4h进行脱钙，过滤得到的溶液可进行后续步骤(4)制备碳酸钙；沉淀用水洗涤，洗至中性，干燥得甲壳素，用干虾壳的10～20倍左右(W/V)45％的NaOH在100℃下浸泡6h进行脱乙酰基，洗涤，干燥可得壳聚糖。碱液可以在脱蛋白步骤循环利用。洗涤后的废水统一回收处理即可。

本发明还包括以下处理步骤(4)：

将脱蛋白步骤产生的废水用HCl调pH至5～6并加入适量NaCl，此时蛋白质析出，洗涤过滤，在30℃下干燥可得蛋白粉；

可将脱钙步骤产生的滤液进行处理，向其中加入过量的Na₂CO₃溶液，产生CaCO₃沉淀，将沉淀过滤干燥可得碳酸钙。

CaCO₃的测定方法：

准确称取0.35～0.40g样品于250mL烧杯中，先用少量水润湿，盖上表面皿，缓慢加(1+1)HCl 10～20mL，加热溶解。溶解后将溶液转入到250mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

用移液管移取25.00mLCa²⁺溶液于250mL锥形瓶中，加入20mLpH＝10的氨缓冲液和2～3滴铬黑T指示剂，用EDTA溶液滴定至溶液由***变为蓝色，即为终点。根据滴定用去的EDTA体积可计算出其中Ca²⁺的含量。

CaCO₃含量计算方法：

式中V₁-取样的体积；

V₂-样品定容的体积。

脱乙酰度(D.D.)的测定方法：碱量法

准确称取0.1～0.2g壳聚糖样品，置于250mL锥形瓶中，加入0.1000mol/L标准盐酸溶液30mL，搅拌，放置至完全溶解。加入2～3滴甲基橙-苯胺蓝(1∶2)指示剂，用0.1000mol/LNaOH标准溶液滴定过量盐酸至终点(***→蓝绿色)。平行测定3份，取平均值。另取一份样品置于95℃～105℃烘至恒重，测定样品水分含量。

脱乙酰度计算方法：

$\mathrm{DD}(\%)=\frac{203\×(C_1{V}_1-C_2{V}_2)}{42\×(C_1{V}_1-C_2{V}_2)+m(1-\mathrm{\ω})}\×100\%$

式中DD-样品的脱乙酰度(％)；

C₁-标准盐酸溶液浓度(mol/L)；

V₁-标准盐酸溶液体积(mL)；

C₂-NaOH标准溶液浓度(mol/L)；

V₂-消耗NaOH标准溶液体积(mL)；

m-样品质量(g)；

w-样品水分含量(％)；

203-甲壳素的分子量；

42-乙酰基的分子量。

分子量的测定方法：黏度法

精确称取一定量壳聚糖，用0.1mol/L 乙酸-0.2mol/L氯化钠溶剂配成50mL样品溶液，此样品溶液的浓度为C₁，精密量取中间部分滤液10mL待用。

将10mL滤液移入乌式黏度计的侧管(粗管)，并将黏度计垂直固定于恒温水浴中保温10min以上，使管内溶液的温度与水浴温度达到平衡。

在乌式黏度计的另外两支管口各接1根乳胶管，将侧管上面的乳胶管用夹子夹住，用吸球自中间乳胶管口吸气，使样品溶液渐渐上升，直到上端刻度以上，此时先放开夹子，再移走吸球，使样品溶液在毛细管内自然下落，用秒表准确测量并记录溶液下降时通过上刻度和下刻度之间的时间(T₁)；然后精确量取5mL溶剂小心加入到黏度计中，将样品溶液摇匀稀释，此时的溶液浓度为C₂，用同样的方法测定其流经两刻度之间的时间(T₂)。再依次精确量取溶剂5mL、5mL、5mL，分别依次加入到黏度计中稀释，浓度分别为C₃、C₄和C₅，并分别测定T₃、T₄和T₅。

按上法测定溶剂的黏度，用量为10mL，测得时间为T₀。

稀释后溶液的浓度分别为：

C₂＝2/3C₁  C₃＝1/2C₁  C₄＝2/5C₁  C₅＝1/3C₁

各溶液对应的相对黏度[ηr]为：

η_r1＝T₁/T₀  η_r2＝T₂/T₀  η_r3＝T₃/T₀  η_r4＝T₄/T₀

η_r5＝T₅/T₀

增比黏度η_spn＝η_rn-1  比浓黏度η＝η_sp/C

依次计算可得到5个比浓黏度，并以此对浓度作曲线图，可得一条直线，将此直线外推至与纵坐标相交，此截距为[η].将[η]、K、和α)代入下式即可求得壳聚糖的相对分子量。

分子量的计算方法：

$\left[\mathrm{\η}\right]={\mathrm{KM}}^{\∂}$

式中K＝1.81×10^-3；

α＝0.93。

分子量测定过程中，壳聚糖溶液应随用随配，不应放置过久。

加入溶剂稀释后，样品溶剂达到恒温进行测定。

读取每个浓度的流出时间T₁、T₂、T₃、T₄，重复一次，两次的读数偏差不得超过0.2s。

脱乙酰度和黏度(可反映平均相对分子质量)，是壳聚糖的两项主要的性能指标。本发明采用酸碱滴定法测定制备得的壳聚糖的脱乙酰度，并测定了其特性黏度，然后以浓度为横坐标、比浓黏度为纵坐标作曲线，如附图2所示，通过计算得到了其分子量。表1是重复6次制备所得到壳聚糖的性能指标，表2是我国水产行业壳聚糖脱乙酰度含量常用规格。

附图2中Y＝634449X+991.52，r＝0.9990。

表1壳聚糖的性能指标

表2脱乙酰度规格

由表1可知壳聚糖的脱乙酰度为80.94％，根据表2所示我国水产行业的标准可知其属于中脱乙酰度壳聚糖。因为目前尚未有关于壳聚糖产品的国家标准或部颁标准，因此只能用一些地方或企业标准来衡量，根据福建省壳聚糖的质量指标Q/FCTS中脱乙酰度的要求，已达到食品级标准，而根据山东省及浙江省某公司的企业标准则达到工业级标准。

目前我国尚无关于分子量的标准，且分子量的大小因生物合成过程受控因素不同而不同。唐振兴等用乌氏黏度计测得脱乙酰度为87.52％的壳聚糖的分子量大约为30万。而本发明制得脱乙酰度为80.94％的壳聚糖产品的分子量为144万，故本发明制得的壳聚糖的分子量较高，适合于用做水处理的絮凝剂。壳聚糖黏度越高，絮凝效果越好，即分子量大的壳聚糖处理效果较好，且用量少。壳聚糖在水处理中的应用近年来在国外已逐渐普及。有报道显示，日本每年用于废(污)水处理方面的壳聚糖的量占其生产总量的80％以上。近年来国内外对其作水处理剂的研究和应用取得了很大进展。但相对于国外来说，我国用壳聚糖作水处理剂还是比较少的，随着壳聚糖应用范围的扩大，对高分子量的壳聚糖的需求也将越来越大。本发明制备得到的高分子量的壳聚糖应用前景良好。

产品产率

以相对虾壳干重为计，由粤东长毛对虾制备得的粗蛋白、碳酸钙及用EDTA测得的实际碳酸钙、甲壳素、壳聚糖的产率计算结果如表3所示。

表3虾壳加工产品的产率

注：上表产率均以相对虾壳干重而计。

碳酸钙₁是粗产品碳酸钙的产率，而碳酸钙₂则是实际纯碳酸盐的产率。本发明脱钙废液中回收到的碳酸钙并非都是纯的碳酸钙，因为虾壳中含有的无机盐不只有碳酸钙，还有少量的碳酸镁，采用EDTA法测定纯碳酸盐的含量，得到碳酸钙₂的产率值。

由表3可知各产品产率的RSD均较小，可见本发明工艺稳定性及重现性好。而由统计分析结果：粗脂肪：P＝0.239；粗蛋白：P＝0.8699；碳酸钙：P₁＝0.4788，P₂＝0.3904；甲壳素：P＝0.3036；壳聚糖：P＝0.9957知各产品产率P值均大于0.05，在α＝0.05水平上不拒绝H₀，各产品产率的两组数据之间没有显著性差异，本发明方法制备壳聚糖及副产物回收的稳定性好，产品各产率的相对标准偏差都较小，通过本发明也实现了资源化利用的目的。

实施例2工艺对比实验

以长毛对虾为原料，采用现有的工艺制备生物活性物质，进行对比实验。

收集长毛对虾虾壳，用清水洗净后置于日光下晒干，粉碎至40目左右，于60℃烘箱中烘干，测定原料水分，将其保存于干燥器中备用。

按照附图3所示的流程进行操作，具体步骤如下：

(1)称取一定量的虾壳；

(2)2倍于虾壳重量的6～8％HCl，再稀释2倍，常温下浸泡1h，不时搅拌，进行酸处理；

(3)过滤，水洗至中性，甩干；

(4)4倍于虾壳重量的6～10％NaOH，100℃水浴下蒸煮2h，不时搅拌，脱蛋白质；

(5)过滤，水洗至中性，甩干；

(6)3倍于虾壳重量的6～8％HCl，常温下浸泡2～4h，脱钙。

(7)过滤，水洗至中性，甩干；

(8)EDTA饱和溶液(pH＝7～8)，常温浸泡24h；

(9)过滤，水洗至中性，甩干；50～60℃干燥；得甲壳素；

长毛对虾壳在经过上述一系列反应后得到平均产率为28.15％的甲壳素。试验证明，采用上述方法，甲壳素的得率不到30％，同样是以长毛对虾作为原料，采用本发明方法，甲壳素的得率是35.51％。

实施例3原料选择的对比实验

以基围虾虾壳为原料综合制备生物活性物质作为原料选择的一个对比，工艺方法和流程同实施例1完全相同。所述基围虾虾壳，购于广州黄沙水产品交易市场。

以相对虾壳干重计算，6次试验结果如表4、5所示。

表4虾壳加工产品的产率

表5壳聚糖的性能指标

对比结果：由基围虾虾壳所制得的各产品的产率分别为：粗脂肪1.30％，粗蛋白13.24％、碳酸钙27.40％、甲壳素30.54％、壳聚糖24.41％，且壳聚糖的两项主要性能指标分别是：脱乙酰度为79％，分子量为7.85×10⁵。

同时，从公开的现有文献中可以了解到，范国枝等进行了红螯螯虾虾壳制备壳聚糖的研究，郑铁生等研究了地产龙虾壳甲壳素及壳聚糖的制备，现将这几种虾壳所制得的主产品与本工艺制得的主产品的产率及性能指标进行比较，见表6所示。

表6不同种类虾壳制备产品产率及性能指标的比较

由表6可知长毛对虾虾壳中所制备得的甲壳素和壳聚糖的产率均比地产龙虾壳、红螯螯虾壳、基围虾壳所制得的产品高；同时本发明同样达到了80％以上的脱乙酰度，但本发明脱乙酰方法的相对简单易行。

实施例4本发明方法产生的废水COD测定

取50mL废水，将其调至pH为6.0～7.0，加入20mL1％的硫酸铝溶液，搅拌速率120r/min，絮凝时间为半小时，此时出现絮凝物，将其过滤除去后，将废水按下述测定废水COD的重铬酸钾法测定废水中的COD：

将经处理回收活性物质后的所有废水收集到1800mL的大烧杯中，使其充分混匀。

(1)吸取20.00mL混合均匀的水样(或适量水样稀释至20.00mL)置于250mL磨口的回流锥形瓶中，准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数粒防暴沸玻珠，摇匀。

将锥形瓶接到回流装置冷凝管下端，接通冷凝水。从冷凝管上端缓慢加入30mLAg₂SO₄-H₂SO₄试剂，以防止低沸点有机物的逸出，不断旋动锥形瓶使之混合均匀。加热回流2h(从开始沸腾时计时)。

(2)冷却后，用20～30mL水自冷凝管上端冲洗冷凝管后，取下锥形瓶，再用水稀释至140mL左右。

(3)溶液冷却至室温后，加入3滴1，10-菲罗啉亚铁指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色变为红褐色(暗红色)即为终点。记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。

(4)测定水样的同时作空白试验，以20.00mL蒸馏水，按同样操作步骤做空白试验。记录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。

(5)计算：

$\mathrm{CODcr}(O;\mathrm{mg}/L)=\frac{(V_0-V_1)C\×8\×1000}{V}$

式中C-硫酸亚铁铵标准溶液的浓度，mol/L；

V₀-滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量，mL；

V₁-滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的用量，mL；

V-水样的体积，mL；

8-氧(1/20)的摩尔质量，g/mol。

混合废水的COD_Cr值测定：

测定结果如表7所示，表8是国家污水综合排放标准的COD值指标。

表7混合废水的COD_Cr

注：COD_Cr1是未脱脂肪混合后的废水，COD_Cr2则是经脱脂肪混合后的废水，COD_Cr3是经初步处理的废水。

表8污水综合排放标准

由表7及换算可知1g虾壳所耗水量约为180mL左右，总废水量约为250mL左右，由表7可知将废水中的蛋白质、碳酸钙等物质回收后混合的废水的COD值在1433mg/L，比本领域现有技术方法产生的废水的COD值都低(例如，邢佶勇等人研究的壳聚糖生产废液中提到稀碱脱蛋白阶段时，提取粗蛋白后单独的废水上清液的COD含量在4500mg/L左右)。可见本发明废水经回收副产品后，将其酸碱废液混合后的COD值是比单独废液的COD值低3倍左右，降低了对环境产生的污染，且脱脂肪后的废水COD值比未脱脂肪的废水COD值平均降低19％左右，用1％的硫酸铝进行初步处理后，COD去除率可达51％，经处理后废水的COD值在569mg/L左右，由表8的污水综合排放标准可知其达到国家污水排放标准的三级标准。

Claims (4)

1.一种从虾壳中综合制备生物活性物质的方法，包括将清洁烘干的虾壳粉碎后依次脱脂肪、脱蛋白、脱钙和脱乙酰基步骤，其特征在于所述虾壳为粤东长毛对虾虾壳；所述生物活性物质包括粗脂肪、甲壳素、壳聚糖、蛋白粉和碳酸钙；所述方法包括以下步骤：

(1)样品的预处理：将长毛对虾虾壳清洗干净晒干，烘干得虾壳，将虾壳粉碎至20～40目；

(2)虾壳浸提于溶剂脱脂肪，除去溶剂，将残留物干燥得粗脂肪；

所述浸提是将虾壳用环己烷在80℃下浸提1小时，将浸提液倒出后继续浸泡1小时，重复操作浸提；所述虾壳与环己烷的料液比为1∶10；

(3)将脱脂肪后的虾壳脱蛋白和脱钙得甲壳素；甲壳素脱乙酰基得壳聚糖；

所述脱蛋白是将虾壳用10％的NaOH溶液常温下浸泡1天；NaOH溶液用量为虾壳的4～6倍(W/V)；

所述脱钙是将脱蛋白后的虾壳用6％的HCl溶液在常温下浸泡4h；HCl溶液的用量为虾壳的2～4倍(W/V)；

所述脱乙酰基是将脱钙后的虾壳用45％的NaOH溶液在100℃下浸泡6h；NaOH溶液的用量为虾壳的10～20倍(W/V)；

(4)将步骤(3)所述脱蛋白产生的废水调pH值加入氯化钠制备得到蛋白粉；将步骤(3)所述脱钙产生的废水加入Na₂CO₃溶液产生沉淀，将沉淀干燥制得碳酸钙。

2.根据权利要求1所述从虾壳中综合制备生物活性物质的方法，其特征在于步骤(1)所述烘干是于30℃烘箱中烘干。

3.根据权利要求1所述从虾壳中综合制备生物活性物质的方法，其特征在于所述脱乙酰基步骤使用过的NaOH液循环使用于脱蛋白步骤。

4.根据权利要求1所述从虾壳中综合制备生物活性物质的方法，其特征在于步骤(4)所述脱蛋白产生的废水调节pH值为5～6。

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