CN101457233A - 构建小球藻表达载体、转化小球藻和破壁小球藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明利用Ubiquitin启动子和Ω增强子为启动元件，利用硝酸还原酶基因NR构建了适于在小球藻硝酸还原酶缺失突变体中表达外源基因的表达载体。以椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶缺失突变体为受体，采用一种经济、简便的小球藻PEG转化的方法将目的基因转入该突变体中。优化了转基因小球藻破壁技术，表达的外源基因具有正常的生物活性，并在无抗生素的培养基中稳定遗传。本发明的结果可应用于采用基因工程技术以椭圆小球藻硝酸还原酶突变体为载体，高效、安全的表达常规的基因工程表达***(如大肠杆菌和酵母)不适合表达的外源基因。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域。具体地，涉及利用椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体高效、安全的表达常规的基因工程表达***(如大肠杆菌和酵母)不适合表达的外源蛋白的体系建立及其应用。
背景技术
小球藻(Chlorella)属于绿藻门小球藻属的一类单细胞真核微藻，具有真核生物基因表达的特点，富含蛋白质、氨基酸、维生素、铁、钙等营养成分，被认为是极有价值的食品和饲料添加剂的来源(Bricknell andDalmo，2005)，且易繁殖培养，适宜于规模化生产。
基于小球藻所具有的上述特点，以小球藻作为生物反应器表达外源基因将具有明显的优点，多个研究小组对此已进行了探索。Dawson etal.，(1997)利用微粒轰击转化的方法将C.vulgaris的硝酸还原酶基因导入到C.sorokiniana硝酸还原酶突变体中，得到了能在含有硝酸盐培养基中生长的藻株，这是关于小球藻中外源基因稳定转化的首例报道。Richard et al.(1999)用PEG转化法将人的生长激素基因转入C.vulgaris C-27和C.sorokiniana ATCC-22521中，研究了随机整合与同源重组对外源基因表达的影响。Kim et al.，(2002)用PEG转化法将比目鱼生长激素基因(fGH)转入到C.ellipsoidea中，投喂试验结果表明转基因小球藻对鱼苗的生长有促进作用，表明转基因小球藻具有较强的实用价值。中国科学院的孙勇如研究小组克隆了椭圆小球藻(C.ellipsoidea)的硝酸还原酶基因及其启动子(Wanget al.，2003，2004)。硝酸还原酶(NR)是氮同化过程中的一个重要的酶，能够将硝酸盐还原为亚硝酸盐，从而使野生型小球藻能够利用硝酸盐作为氮源进行正常的生长发育。小球藻的硝酸还原酶功能缺失突变体则不能利用硝酸盐作为氮源，但可以利用亚硝酸盐作为氮源。因此外源基因转化小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体时，可用硝酸还原酶基因作为筛选标记(Wang et al.，2005；Zhang et al.，2006)。
防御素是广泛存在于动植物及昆虫体内的一类阳离子肽，它是长期进化形成的生物体防御微生物入侵的天然屏障，作为潜在的新一代抗生素药物在临床上具有很好的应用前景。兔防御素NP-1最初从兔嗜中性白细胞分离得到(Ganz，1989)，由33个氨基酸组成，属于α防御素。作为最早发现的防御素之一，人们对其功能也研究得较多，NP-1是目前从生物界分离到的30多种防御素中抗性谱最广的一个。像防御素这样的抗菌肽由于本身对宿主有很强的毒害作用，所以很难用常规的基因工程表达***如大肠杆菌和酵母来生产(Li et al.，2004)。
启动子是影响外源基因的表达的重要因素。Ubiquiti启动子对外源基因在小球藻中的表达调控有较高的效率，Ω序列对外源基因的表达有显著的增强作用(Wang et al.，2001)。Wang et al.，(2004)报道小球藻的硝酸还原酶基因启动子比Ubiquitin启动子对其控制的下游基因有更强的效果。Chenet al.(2001)在椭圆小球藻中以NPTII为筛选标记基因，以Ubiquitin启动子控制NP-1基因，表达了NP-1，但获得的转基因藻株在去掉筛选压力后检测不到NP-1的活性，在以往的小球藻转化研究中，NPTII常被用作筛选标记基因，筛选试剂为G418。但仅利用G418筛选获得的转基因小球藻不够稳定，去掉G418后外源基因易丢失(本实验室未发表数据)，而且在含有G418的培养基中大规模培养转基因小球藻成本比较高。
在植物基因工程研究中常会出现外源基因不易整合到染色体基因组，或整合后表达不稳定等现象。人们推测这一现象的发生可能是因为相同的启动子竞争有限的转录因子，引起转录水平降低从而影响到外源基因的翻译水平(Park et al.，1996)。通常该现象是由启动子区域内的一段同源序列引起。已有报道指出，启动子区域内90bp的同源序列就足以抑制两个基因的表达水平(Vaucheret，1993)。我们构建的植物表达载体中，筛选标记硝酸还原酶基因由小球藻的硝酸还原酶基因启动子控制，如果外源基因NP-1也用硝酸还原酶基因启动子控制，再加上小球藻本身也含有硝酸还原酶基因启动子，过多的硝酸还原酶基因启动子可能会造成外源基因启动效率不高，在小球藻中整合不稳定等问题。这在我们以前发表的论文(Zhang et al.，2006)中没有给以足够关注。本研究中我们用Ubiquitin启动子控制NP-1，这也许是获得具有NP-1活性较强的转基因藻株的重要因素之一。
小球藻的转化方法目前大致分为四种：1、PEG转化法(Richard etal.，1999)。2、电穿孔导入基因法(Ladygin and Boutanave，2002；Maruyamaet al.，1994)。3、基因枪法(Boynton et al.，1988；Kindle et al.，1989)。4、玻璃珠搅拌法(Kindle et al.，1991，1990)。利用电击方法和基因枪转化方法进行遗传转化时需要昂贵的仪器设备，玻璃珠搅拌法效率很低。小球藻遗传转化多采用PEG方法，但PEG法因为其操作步骤较多而容易染菌。本研究改进了PEG转化方法，与Richard et al.，(1999)用的PEG方法相比，节省了酶的用量，节约了转化成本，并且减少了操作步骤，进而减少了染菌的几率。
影响NP-1活性检测的重要因素之一是转基因小球藻的破壁。普通小球藻的破壁多采用超声破碎法，但转NP-1小球藻如果超声破碎时间过长则可能导致NP-1二硫键的断裂而影响NP-1的活性。如果超声破碎时间过短则不能完全破碎转基因藻细胞，使得单位藻液NP-1产量过低。本试验经过多次摸索得出湿藻重与玻璃珠的质量比为1:1时超声9s，循环90次破碎时的效果最好。
本研究以椭圆小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体为受体，以NPTII和硝酸还原酶基因为筛选标记，以Ubiquitin启动子控制NP-1，采用经济实用的小球藻PEG转化方法进行转化，在初筛时利用NPTII和硝酸还原酶基因作为双重筛选标记，用G418和硝酸盐进行双重筛选压力筛选(3次固体培养平板筛选和3次液体培养筛选)，然后再仅利用硝酸盐进行筛选，获得了能够在硝酸盐培养基上培养而且具有较强NP-1活性的转基因小球藻，目前尚未见报道到去掉G418筛选压力能够具有较强NP-1活性的NP-1的转基因藻株。
发明内容
本发明在一个方面提供了一种用于小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因的表达载体，其是通过将NR表达框(SEQ ID NO：6)，Ubiquitin启动子(SEQ ID NO：1)和Ω序列(SEQ ID NO：5)依次首尾连接克隆入载体质粒的多克隆位点中而获得，其中所述载体质粒适于在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。
在本发明的一个优选实施方案中，所述载体质粒选自由pBin19，pGreen0029，pCABIA1300，pBin121，pbin221和pBADW组成的组。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述载体质粒是如图1所示的pbin221质粒。
在本发明的一个具体实施方案中，所述表达载体是如图4所示的pbin-NR-UΩ或如图8所示的pGreen-NR-UΩ。
在本发明的一个优选实施方案中，所述外源基因是NP-1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述小球藻藻种为普通或者椭圆小球藻。
在本发明的另一个方面，提供了上述表达载体在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因中的应用。特别地，其中所述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。
在本发明的另一个方面，提供了一种构建在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因的表达载体的方法，包括将NR表达框(SEQ IDNO：6)Ubiquitin启动子(SEQ ID NO：1)和Ω序列(SEQ ID NO：5)依次首尾连接克隆入载体质粒的多克隆位点中的步骤，其中所述载体质粒适于在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。特别地，其中所述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。
在本发明的另一个方面，提供了一种小球藻PEG转化方法，其包括将小球藻细胞用酶解液(山梨醇0.6M，CaCl2·12H2O 50mM，R-10纤维素酶(1U/mg)3％一6％，R-10果胶酶(1U/mg)1％—4％，Y-23果胶酶(1U/mg)0.1‰—1.5‰)悬浮后置于25℃，遮光培养，其中所述百分比为质量/体积。
在本发明的一个优选实施方案中，所述R-10纤维素酶(1U/mg)含量为4％，R-10果胶酶(1U/mg)含量为2％，Y-23果胶酶(1U/mg)含量为1‰。
在本发明的另一个方面，提供了一种高效的转基因小球藻破壁方法，其特征在于利用超声破碎的方法，按小球藻湿重(g)：玻璃珠(g)：水(ml)＝1：1：1的比例加入玻璃珠和水。
在本发明的一个优选实施方案中，所述超声波破碎的条件是超声破碎7-12s，间隔2-6s，破碎次数70-90次。
由本发明的内容可知，本发明的表达载体安全、高效，不用抗生素筛选，利用该表达载体转化的藻株可在无抗生素存在的条件下高效表达外源基因。
同时本发明的小球藻PEG转化方法降低了现有技术中PEG转化的成本和步骤，使该转化体系更加有利于小球藻和其他单细胞藻类细胞转化的应用。
本发明提供的转基因小球藻高效破壁技术，大大提高了转基因小球藻的破壁率，提高了表达产物的得率。
附图说明
图1.pbin221质粒结构图。
图2.pbinUGUS质粒结构图。
图3.pbinUΩGUS质粒结构图。
图4.pbin-NR-UΩ质粒结构图。
图5.pGreen0029质粒的结构图。
图6.pGreen0029nos质粒结构图。
图7.pGreenUΩNos质粒结构图。
图8.pGreen-NR-UΩ质粒结构图。
图9.pbin-NR-UΩ-NP-1质粒结构图。
图10.PEG融合方法转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体得到的抗G418的藻落。
图11.NPTII基因PCR检测结果。1-7，转化藻株1-7；8，未转化藻株nrm-4；9，阳性质粒。
图12.NP-1基因PCR检测结果。1，阳性质粒；2，未转化藻株nrm-4；3-9，转化藻株1-7。
图13.转基因小球藻粗蛋白提取液在液体培养基中对大肠杆菌的抑菌效果。上图：Ck，LB培养基；1/2～1/64，分别为转基因nrm-4粗蛋白提取液用LB培养基稀释的比例(V/V)；下图：Ck，LB培养基；1/2～1/64，分别为nrm-4粗蛋白提取液用LB培养基稀释的比例(V/V)。
图14.转基因小球藻粗蛋白提取液在固体培养基上对大肠杆菌的抑菌效果。1，3：分别为nrm-4可溶性蛋白提取液和无菌水；2，4：转基因藻株可溶性蛋白提取液。
具体实施方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6×Loading Buffer)购自TaKaRa公司；普通Taq酶，plus 2000 Maker，DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒购于Qiagen公司，反转录试剂盒购于TOYOBO公司；纤维素酶(Onozuka R-10)，果胶酶(Onozuka R-10)，果胶酶Y-23购自鼎国公司；玻璃珠购于Sigma公司。
实施例1.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体构建方法
根据Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：1)设计引物，上游引物：5’CCGGAAGCTTGTGCAGCGTGACCCG3’(SEQ ID NO：2)；下游引物：5’GCCCGGATCCCTGCAGAAGT3’(SEQ ID NO：3)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点，用PCR方法从玉米基因组中得到Ubiquitin启动子，测序结果显示为Ubiquitin启动子序列(SEQ IDNO：4，其在SEQ ID NO；1的5’端及3’端分别添加了Hind III酶切位点和BamH I酶切位点)。将PCR产物用HindIII和BamHI内切酶双酶切，质粒pBI221(Clontech)(图1)也经Hind III和BamH I内切酶双酶切16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行酶切鉴定，能够得到1987bp大小片段(即Ubiquitin启动子)的质粒即命名为pbinUGUS(图2)。
根据Ω序列(SEQ ID NO：5)，人工合成该基因，并在其上游加入BamHI酶切位点，在下游加入SmaI酶切位点。将合成基因用Sma I和BamH I内切酶双酶切，质粒pbinUGUS也经Sma I和BamH I内切酶双酶切16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落测序鉴定为Ω序列，则将上述连接产物命名为pbinUΩGUS(图3)。
将pbinUΩGUS用Hind III内切酶酶切，用同样的酶切pSK-NR质粒(含有硝酸还原酶表达框NR序列，小球藻NR基因序列已提交到GenBank，接收号为AY275834，NR表达框序列如SEQ ID NO：6所示，涉及pSK-NR质粒及NR表达框的专利公开号：CN1676597)，回收NR表达框，然后与酶切的pbinUΩGUS质粒载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提质粒酶切鉴定，能够得到4kb左右大小片段(NR表达框)的质粒即为所要构建的双选择标记的植物表达载体，命名为pbin-NR-UΩGUS(图4)。
实施例2.利用pGreen0029框架来构建表达载体。
根据Nos终止子序列(SEQ ID NO：7)设计引物，上游引物：5’ATAAGAATGCGGCCGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC3’(SEQ ID NO：8)下游引物：5’CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA3’(SEQ ID NO：9)其中在上游引物中加入Not I酶切位点，在下游引物中加入Sac I酶切位点，用PCR的方法从pBI221(Clontech)中获得了Nos终止子将PCR产物用NotI和Sac I内切酶双酶切，质粒pGreen0029(BBSRC)(图5)也经NotI和Sac I内切酶双酶切16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行酶切鉴定，能够得到200bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreenNos(图6)。
根据Ubiquitin启动子序列(SEQ ID NO：1)和Ω序列(SEQ ID NO：5)设计引物，上游引物：5’GGCCGGATCCGTGCAGCGTGACCCGGTC3’(SEQ IDNO：10)；下游引物：5’GGCCGCGGCCGCTGTAATTGTAAATAGTAAT3’(SEQ IDNO：11)，其中在上游引物中加入BamHI酶切位点，下游引物中加入Not I酶切位点，用PCR方法从pbinUΩGUS中得到Ubiquitin启动子+Ω序列，将PCR产物用BamH I和Not I内切酶双酶切，质粒pGreenNos也经BamH I和Not I内切酶双酶切16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行酶切鉴定，能够得到2075bp大小片段(即Ubiquitin启动子+Ω序列)的质粒即命名为pGreenUΩNos(图7)。
将pGreenUΩNos用Hind III内切酶酶切，用同样的酶切pSK-NR质粒(其序列如SEQ ID NO：6所示)，回收4kb左右的NR表达框，然后与酶切的pGreenUΩNos质粒载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提质粒酶切鉴定，能够得到4kb左右大小片段(NR表达框)的质粒即为所要构建的双选择标记的植物表达载体，命名为pGreen-NR-UΩ(图8)。
实施例3.椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的表达载体pbin-NR-UΩ-NP1的构建
按照常规技术，将pbin-NR-UΩGUS质粒上的GUS基因用BamH I和SacI部分双酶切，回收载体。目的基因NP-1(其序列如SEQ ID NO：12)两端酶切位点也为BamH I和Sac I，酶切回收200bp左右的NP-1基因，然后与上述回收的载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提质粒酶切鉴定，能够得到200bp左右大小片段(NP-1基因)则构建成椭圆小球藻硝酸还原酶突变体的NP-1植物表达载体pbin-NR-UΩ-NP1(图9)。
实施例4.小球藻PEG转化
小球藻E4液体培养基：葡萄糖5g/L；KH2PO40.075g/L；Na2NO20.69g/L；MgSO4·7H2O 0.175g/L；CaCl225mg/L；FeCl3·6H2O 5mg/L；NaCl 25mg/L；FeCl3·6H2O 0.81mg/L；EDTA 20mg/L微量元素母液1mL/L。
微量元素母液配方为：H3BO31.43g，ZnSO4·7H2O 0.11g，MnCl2·4H2O 0.905g，Na2MoO4·2H2O 0.0185g，CuSO4·5H2O 0.0395g，水1L。
小球藻固体培养基：液体培养基+7％琼脂PH5.4～6.0。
小球藻筛选培养基：E4液体培养基中的Na2NO20.69g/L替换为10mmol/L NO3 -。
取50ml对数生长期的硝酸还原酶突变体小球藻nrm—4(公开号：CN1676597A)，50g，离心10min离心收集藻细胞(Refrigerated CentrifugeCR 20B2，HIACHI)，用5ml酶解液(山梨醇0.6M，CaCl2·12H2O 50mM，R-10纤维素酶4％，R-10果胶酶2％，Y-23果胶酶1‰)悬浮后置于25℃，遮光轻柔振荡16h。50g离心10min，去上清，沉淀用1ml含0.6M甘露醇，50mM CaCl2·12H2O的1/2E4培养基洗涤沉淀两次。取400μl悬浮液加入5μg的质粒(pbin-NR-UΩ-NP1)和25μg的鲑精DNA室温温育15min，接着加入200μl PNC(山梨醇0.6M，CaCl2·12H2O50mM，1/2无葡萄糖和酵母提取物的E4培养基，PEG400040％)轻柔混合30min，后缓慢滴入600μl的细胞壁再生培养液(山梨醇0.6M，无葡萄糖和酵母提取物的E4培养基50ml，葡萄糖1％，酵母提取物1％)，25℃温浴16h后将藻细胞涂于含30mg/L G418和10mmol/L NO3 -的固体培养基中培养，25℃，光照2500lux培养，约3-4周后检测平板上长出的藻落(图10)。
实施例5.转基因小球藻的筛选及转基因藻株的分子检测
a.转基因小球藻总DNA的提取
挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25℃，光照2500lux，120rpm)。2周后(浓度达到约为1×108个/mL)，1600g离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al.，(2001)的方法提取小球藻总DNA，提取的DNA存于-20℃备用。
b.转基因小球藻的PCR检测
以转基因藻基因组DNA为模板，分别进行NPTII基因(载体质粒pbin221中的卡那抗性基因，序列为SEQ ID NO：13)和NP-1基因的PCR扩增。检测NPTII基因的PCR引物为：正向引物NPTIIf，5’GGCGATACCGTAAAGCACGA3’(SEQ ID NO：14)；反向引物NPTIIr，5′TCCGGTGCCCTGAATGAACT3’(SEQ ID NO：15)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min 30s，30个循环，最后循环结束72℃延伸10min。可以扩增出约580bp的片段。NP-1基因的PCR引物为：正向引物NPf，5’AAGCTTATGGTGGTCTGTGCGTGCAGACG3’(SEQ ID NO：16)；反向引物NPr，5’GGGAGAGCTCAGTAGTCCAAACATGT3’(SEQ ID NO：17)。PCR反应条件为：94℃预变性3s，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环，最后循环结束72℃延伸10min。可以扩增出约200bp的DNA片段，即NP-1基因。
共对7个藻株进行了检测，检测结果见图11，12。在转化藻株3、4、5和6中，能够扩增出外源NPTII基因，在转化藻株1、4、5和6中能够扩增出外源NP-1基因，在转化藻株4、5和6中NPTII和NP-1都能够扩增出来。初步证明NPTII和NP-1PCR均为阳性的藻株为转基因藻株，选取这些藻株继代培养检测NP-1抑菌活性。
c.转基因小球藻总RNA的提取
取2ml对数生长的藻细胞1200g离心10min，收集藻细胞之后用RNA提取试剂盒(Qiagen)提取小球藻总RNA。
实施例6.转基因小球藻可溶性蛋白的提取
用E4培养基培养转基因藻，离心收集对数生长期(浓度约为1×108个/mL)的细胞，约3g湿藻重，然后按湿藻重：无菌水：玻璃珠＝1:1:1进行混合。超声破碎9s，间隔4s，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，沸水煮10min使大分子量蛋白质变性沉淀。4℃过夜后7500g离心10min，测定上清液的抑菌活性。
实施例7.转基因小球藻可溶性蛋白的抑菌活性检测
液体培养法：采用试管二倍稀释法(Balous et al.，1991)，以液体LB培养基加入待测样品作等体积的稀释，将待测样品稀释为1/2、1/4-1/64浓度后加入适量菌液OD600＝0.02-0.04(大肠杆菌ATCC 25922在37℃培养16h后稀释到10-4)，定量测定相应的最低抑菌浓度。37℃恒温摇床培养16h。
固体培养法：将10μl菌液(OD600＝0.02-0.04)涂布于LB固体培养基上，将0.6cm的滤纸平放在培养基上，在滤纸上加小球藻蛋白提取液200μl，37℃温箱中培养过夜，观察有无抑菌圈生成。
上述两种测定转基因小球藻可溶性蛋白的抑菌活性实验所用对照均为未转化的nrm-4小球藻可溶性蛋白。转基因小球藻可溶性蛋白提取液在稀释1/2-1/16倍后，与大肠杆菌ATCC 25922混合培养16h后，培养液仍然澄清，而对照浑浊(图13)，表明转基因小球藻可溶性蛋白提取液在稀释16倍后，仍然具有抑菌活性。平板抑菌试验表明，添加转基因小球藻可溶性蛋白提取液能形成明显的抑菌圈(图14)。上述研究结果表明：NP-1基因不但已经稳定整合到小球藻基因组中而且能够正确表达，赋予了转基因小球藻对大肠杆菌的抑制作用。
参考文献：
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<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
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Claims (12)
1.一种用于小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因的表达载体，其是通过将SEQ ID NO：6的NR基因，SEQ ID NO：1的Ubiquitin启动子和SEQ ID NO：5的Ω序列依次首尾连接克隆入载体质粒的多克隆位点中而获得，其中所述载体质粒适于在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。
2.权利要求1的表达载体，其中所述载体质粒选自由pBin19，pGreen0029，pCABIA1300，pBin121，pbin221和pBADW组成的组。
3.权利要求1的表达载体，其中所述载体质粒是如图1所示的pbin221质粒。
4.权利要求1的表达载体，其中所述表达载体是如图4所示的pbin-NR-UΩ或如图8所示的pGreen-NR-UΩ。
5.权利要求1的表达载体，其中所述外源基因是NP-1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列。
6.权利要求1—5任一项的表达载体，其中所述小球藻藻种为普通或者椭圆小球藻。
7.权利要求1—6任一项的表达载体在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因中的应用。
8.一种构建在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因的表达载体的方法，包括将SEQ ID NO：6的NR表达框(NRpro-NR-nosT)，SEQ ID NO：1的Ubiquitin启动子和SEQ ID NO：5的Ω序列依次首尾连接克隆入载体质粒的多克隆位点中的步骤，其中所述载体质粒适于在小球藻硝酸还原酶基因缺失突变体中表达外源基因。
9.一种小球藻PEG转化方法，其包括将小球藻细胞用酶解液悬浮后置于25℃，遮光培养，所述酶解液包含山梨醇0.6M，CaCl2·12H2O 50mM，R-10纤维素酶(1U/mg)3％—6％，R-10果胶酶(1U/mg)1％—4％，Y-23果胶酶(1U/mg)0.1‰—1.5‰，其中所述百分比为质量/体积。
10.权利要求9的方法，其中所述R-10纤维素酶(1U/mg)含量为4％，R-10果胶酶(1U/mg)含量为2％，Y-23果胶酶(1U/mg)含量为1‰。
11.一种高效的转基因小球藻破壁方法，其特征在于利用超声破碎的方法，按小球藻湿重(g)：玻璃珠(g)：水(ml)＝1：1：1的比例加入玻璃珠和水。
12.权利要求11的方法，其中所述超声波破碎的条件是超声破碎7-12s，间隔2-6s，破碎次数70-90次。
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