CN101454348A - 用于组织工程学和用作活性物质载体的多糖混合物水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明描述制备水凝胶(或3D基体)，其从酸性多糖和例如壳聚糖寡糖衍生物的碱性多糖衍生物的混合物的水溶液所制得。所述溶液适于同化学或物理胶凝因子成凝胶以便封装溶液或悬浮液中所含单独细胞或多细胞团或药物学活性分子于胶囊中，以用在生物医药和制药领域。

Description

用于组织工程学和用作活性物质载体的多糖混合物水凝胶
技术领域：
本发明涉及水凝胶(或3D基体)及其生物医学领域的用途，所述水凝胶通过适于和胶凝因子成为凝胶的酸性多糖和碱性多糖衍生物(例如壳聚糖寡糖衍生物)混合物的水溶液而得。
背景技术：
多糖作为常用生物医学聚合物，被广泛研究并用在生物医学领域用作生物活性物质以及生物体(例如用于组织工程学的细胞)的载体。本领域技术人员已知其封装或微胶囊工艺，即将被运载的生物材料内含在由材料本身的三维聚合物基体组成的***中。使得多糖适于成微胶囊的特性是其已知的在水溶液和特定条件下形成水凝胶(被认为是立体聚合物基体)的能力。特别的，组织工程学领域使用多糖封装细胞仍然是被广泛研究的，也是生物工程研究中最具创新的主题。这一技术源自从替代型移植手术到使用可再生的同一组织细胞的再生型手术的需要，以便于原始组织结构和生理恢复以及移植细胞生成对新组织完全恢复代谢活动并与周围组织生理及功能整合。
一些组织工程学应用领域，对于特定治疗领域这个方法可以依赖于经验的整理(例如人造皮肤)。在生物工程领域技术进步使得组织工程学巨大进步，包括很少探索的领域。这些包括细胞工程学在关节软骨虚弱病的治疗中的应用。
在这个医疗领域，除了已周知在重建手术的软骨球体中生物适用***可以再建细胞成长和繁殖的最佳空间和代谢条件的问题，一个明显的问题是提供体外培养关节软骨细胞的方法，该方法可以使得细胞在自我移植前得以保持和扩展。另外，关节软骨细胞培养是研究在生理条件或病理条件下伴随不同过程和代谢以及功能改变的分子过程的最有效的手段。使用关节软骨细胞培养的主要限制是这些细胞从其基体分离出来后，具有明显去分化成为纤维细胞的趋势。与分化过程相关的因素主要是：附着的培养***，低细胞密度，存在促炎因素(例如细胞因子)，细胞永生化。在这些条件下，几天后，细胞快速损失典型的关节软骨细胞圆形显型并呈现纤维细胞典型的拉长形状。显型的改变伴随特定关节软骨细胞标记(例如胶原质II和胶原质X)表达下调，高分子量蛋白多糖(例如聚蛋白多糖(aggrecan))，同时胶原质I和低分子量蛋白多糖(例如双糖链蛋白多糖(Biglycan)或核心蛋白多糖(Decorin))表达增加。为避免或限制关节软骨细胞分化过程，过去20年已经做了很多努力以建立有效的培养方法。这些方法主要包括3D藻酸盐、琼脂糖或胶原质基体内的培养***(而不是简单地附着上)。尽管这些方法可以改善保持关节软骨细胞显型，这些方法中，细胞显示非常低的生长和繁殖率因而可用但损失大量细胞材料。
最常用的将细胞包埋在微胶囊中的材料是藻酸盐。术语“藻酸盐”描述了一个多糖族，由海藻和细菌制成(Sabra W.等Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001，56，315-25)。其由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸组成，通过设置在多糖链的块结构的1→4键连接在一起。由于存在羧基，藻酸盐和其他具有羧基的多糖一样，在生理pH值是聚阴离子。此外，这种多糖是完全生物相容性的(Uludag H.等Adv.Drug Deliv.Rev.，2000，42，29-64)，而其在工业和生物领域应用最相关的特性是其与含有二价离子(典型的是钙)的溶液接触形成水凝胶的能力。在此方面，用所述离子简单处理浓缩的藻酸盐溶液立即形成水凝胶。正是这一特性用于包埋细胞和组织于水凝胶中。已知细胞微胶囊技术包括将藻酸盐和细胞悬浮液滴加到含钙的浴中，并通过不同的物理方法控制微胶囊直径。凝胶的即时形成使得细胞被包埋其中。在用于修复关节软骨的关节软骨细胞微胶囊这种情况下，使用藻酸盐的限制主要因为细胞进入其中后缺少繁殖能力。
基于这个情况，近来其它多糖显示出可应用于生物材料微胶囊，其为生物相容性的并可如藻酸盐般大量可用。这就是壳聚糖。壳聚糖是一种碱性多糖，其分子量为50-1500kDa，由通过1→4键连接间布N-乙酰基-葡萄糖胺单元残基的D-葡萄糖胺(GlcNH2)组成。其通常在中性和碱性水溶液中不溶；在pH≤5的酸性溶液中游离胺基被质子化使得聚合物可溶。这个聚合物已经广泛应用在医药领域，其显示出低免疫、病理和感染反应(Suh FrancisJ.K.，Matthew H.W.T.Biomaterials，2000，21，2589-2598；Miyazaki S.等Chem.Pharm.Bull.，1981，29，3067-3069)。壳聚糖理化特性使其具有用作生物材料的全部理想特性，这些理化特性例如溶液中高阳离子电荷密度，以及由于其多孔性使得细胞可植入其中而带来的高加工性能。最近的研究集中在提高增加壳聚糖生物效果的方法。特别重要的效果在于增加聚合物阳离子或通过(生物)化学改性来改变其生物利用特性。其衍生物使得壳聚糖具有作为生物材料所需的这些特性。近期研究显示特别是壳聚糖乳糖衍生物是生物相容性的并可诱导关节软骨细胞在原始培养中的聚合以及刺激软骨组织特征标记例如胶原质II和聚蛋白多糖的形成(Donati，I.等Biomaterials26，2005，987-998)。
糖类侧基改性壳聚糖，例如通过还原胺化反应***乳糖单元，是已知的并使得多糖衍生物具有更大水溶性，这是记载在专利US4,424,346(Hall，L.D.和Yalpani，M.)中的。US4,424,346也提到了壳聚糖乳糖衍生物在浓度大于3-5％的水溶液中形成刚性凝胶，但是其在与盐或酸(特别是Ca，Cr，Zn氯化物，K铬酸盐，硼酸)混合和结合即不形成凝胶也不沉淀。引述的专利还提到其它寡糖(纤维二糖)衍生的壳聚糖在水溶液中其自己不形成凝胶，而是在于藻酸盐混合时形成刚性凝胶。这个凝胶的形成是因为的聚阳离子正电荷同聚阴离子的负电荷之间强烈相互作用，使得***凝聚，限制微胶囊的过程。
为获得适于结合生物材料或生物活性物质的立体聚合物基体，这些基体优选具有良好水溶性，这样的基体需要在任何情况下在水溶液中具有一定的分散性而没有不溶性沉淀，进而确保适于微胶囊的立体结构。
为克服这一点，不同的***被描述，其包括使用多糖混合物，包括改性的和/或交联的，以改善这些基体的理化特性。
特别是，WO94/25080(Griffith-Cima，L.等)描述使用合并其它多糖(基本上是透明质酸)的藻酸盐的可注射多糖-细胞组合物被用来得到适于封装用于组织工程学的细胞的水凝胶。适于形成移植单个细胞的水凝胶的聚合物是多种多样的，并与交联剂交联，交联剂由离子(优选为2价或3价)pH下和温度下的电荷组成。交联的离子浓度不低于0.005M。水凝胶也可由聚阳离子络合并稳定，聚阳离子选自合成聚胺，例如聚亚乙基胺、聚乙烯胺、聚烯丙胺和聚赖氨酸。
类似的，专利申请WO96/40304(Hubbell，J)描述与交联剂(由离子、pH和温度电荷、自由基引发剂和酶组成)交联的聚合物形成的水凝胶。聚合物包括多糖，多糖选自改性藻酸盐、改性透明质酸、结冷胶(gellan)和卡拉胶。
专利US 6,224,893(Langer，R.S.等)描述了用于药物传输和组织工程学的互穿聚合物网络(IPNs)或半互穿聚合物网络。所述的IPNs由溶液组成，溶液的形式优选为亲水型、离子型或共价型交联聚合物水凝胶，离子交联聚合物包括：透明质酸、右旋糖酐、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、肝素、藻酸盐、结冷胶和拉胶，共价型交联聚合物包括与异硫氰酸盐交联的壳聚糖。IPNs由两个聚合物组分形成，组分是交联的但没有相互交联，而半IPNs包括两个组分，其中只有一个是交联的且组分彼此不交联。优选的，但不是排他的，聚合物交联是通过自由基光引发剂的光活化实现的。在此方面，聚合物组合物可由共价型交联聚合物通过光敏引发剂形成或者共价型和离子型交联聚合物混合物或亲水聚合物形成半IPNs。
专利US 5,620,706(Severian，D.等)报道了酸性和碱性多糖离子络合物特别是壳聚糖和黄原胶的凝聚，黄原胶是一种侧链有负电荷的多糖被用来形成不溶性水凝胶。
WO2005/061611(White，B.J.等)描述制备互穿或半互穿聚合物网络，该网络由组合物组成，所述组合物包括交联的水溶性碱性多糖衍生物和一个非交联的阴离子多糖。特别的，所述IPNs是通过混合透明质酸同交联的N-羧甲基、O-羧甲基、O-羟乙基壳聚糖衍生物，或部分乙酰化的壳聚糖而得。基于该专利，这些壳聚糖衍生物可在溶液中与透明质酸混合，它们在使得链上无任何正电荷的pH条件下可溶，这样可以避免形成离子络合物。由于完全移除或补偿一个聚合物上的电荷避免了聚阴离子凝聚。因此是聚阴离子/中性多糖或聚阴离子/聚两性电解质的溶液。
尽管这样，提供结合细胞并维持细胞显型同时使其生长和繁殖的生物适用***仍然没有解决，正如前述讨论的。
本发明第一目的是建立生物相容性的***用于组织工程学中作为细胞载体，其不仅可以确保细胞存活还维持其生长和繁殖生理特性。
本发明另一目的是通过使用市售多糖得到所述***，无需将多糖进行化学处理，无需络合以制备所述***。
本发明再一目的是提供水凝胶或3D基体形式的生物相容性***，用作细胞载体，在各种用途中很容易使用无需卫生技术人员进一步处理。
本发明还一目的是提供水凝胶或3D基体生物相容性***作为药物载体，其可根据不同需要易于使用。
发明内容：
为实现前述目的，本发明人已经确定适合的碱性多糖衍生物，在适当的条件下，所述多糖水溶液与阴离子多糖物理混合不会产生不溶性凝聚。
混合物水溶液可以通过适当的胶凝因子形成凝胶，得到立体水凝胶或基体，其中结合有被运载的细胞或药物。用于制备本发明的基体的多糖混合物包括阴离子多糖和壳聚糖寡糖衍生物。
令人惊讶的，除了使得所述聚阴离子多糖和聚阳离子多糖衍生物物理混合物组合物可溶于水，所述组合物用适当的可溶性胶凝因子处理时使得水凝胶可微胶囊化细胞并且细胞在其中维持显型并可繁殖。
尽管使用藻酸盐具有很多优点，微胶囊技术可有所有离子型多糖来实施，所述离子型多糖在与离子(溶致)溶液或冷却的溶液(热致)接触时立即形成水凝胶。初始类多糖包括例如果胶、卡拉胶以及藻酸盐。第二类多糖包括例如琼脂糖(部分硫酸盐化)、结冷胶以及卡拉胶。
本发明第一方面是水凝胶组成的组合物，特征在于是由至少一个溶致或热致阴离子多糖与至少一个壳聚糖寡糖衍生物的混合物的水溶液制得，其中所述壳聚糖衍生物的衍生度至少40％，其中所述水溶液的离子强度至少为50mM且不超过175mM，pH至少为7，所述多糖混合物水溶液由试剂处理，该试剂可使得混合物中溶致或热致聚阴离子多糖成凝聚。
本发明的另一方面是制备所述组合物。
本发明进一步方面是所述组合物在组织工程学用细胞微胶囊或活性物质微胶囊中的用途，及其在生物医药领域的用途。
附图说明：
图1：基于例6的二元聚合物溶液所得微胶囊的光学显微镜照片，所述溶液是藻酸盐和壳聚糖乳糖衍生物(下称基察克)在NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4下制备的。总聚合物浓度2％，聚阴离子比聚阳离子的重量比为3:1。微胶囊通过滴加二元溶液到下述溶液中而得，该溶液含有CaCl2 50mM，甘露醇0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。静电珠发生器条件：电压5kV，针头内径0.7mm，凝胶预和针头间距离4cm，二元聚合物溶液流速10mL/min。平均胶囊直径870±20μm。
图2：23G针头注射器所得微胶囊，起始于下述二元多糖溶液：A)藻酸盐和基察克，滴入含有CaCl2 50mM的凝胶浴(例2)；B)κ-卡拉胶和基察克，低于含有KCl 100mM的凝胶浴(例4)；C)琼脂糖(部分硫酸盐化)和基察克，滴入水冷却到30℃所得凝胶浴(例5)。在所有这些情况下，总多糖浓度是3％，聚阴离子和基察克重量比为1:1。
图3：1H-NMR质子分析藻酸盐(1.5％)和基察克(0.5％)二元混合物，基于例6，分析是在(A)微胶囊形成之前以及(B)微胶囊形成之后进行，从中可看到基察克存在于所有情况。
图4：藻酸盐溶液(聚合物浓度1.5％，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4)弹性模数(G’＝■)和粘性模数(G”＝□)时间变化图，藻酸盐和基察克二元溶液(总聚合物浓度2％，藻酸盐与基察克重量比3:1，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4)弹性模数和粘性模数(G’＝●；G”＝○)时间变化图。通过原位法用CaCO3 15mM和GDL 30mM得到凝胶(例9)。
图5：测量圆柱型水凝胶抗压模数(E)，该水凝胶通过原位法得到，起始于藻酸盐溶液(1.5％浓度)以及起始于藻酸盐和基察克二元溶液(总聚合物浓度2％，藻酸盐与基察克重量比3:1)(例9)。在所有溶液中NaCl0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。
图6：A)比色法(二甲基亚甲基蓝)测量藻酸盐胶囊和藻酸盐基察克胶囊(例12制备)中培养的关节软骨细胞蛋白聚糖含量。B)通过合并[3H-脯氨酸]测定评估藻酸盐胶囊和藻酸盐基察克胶囊(例12制备)中培养的关节软骨细胞中胶原质合成水平。
图7：RT-PCR分析藻酸盐胶囊和藻酸盐:基察克胶囊(例12制备)中生长的关节软骨细胞中的胶原质I、胶原质II和聚蛋白多糖表达。从关节软骨细胞提取的RNA，图A是封装2天后进行，图B是封装17天后进行的。
图8：[3H-胸苷]繁殖测定。上部曲线显示例12所制备藻酸盐/基察克胶囊中细胞的结果，其显示到培养第15天具有增加的繁殖水平。下部曲线显示藻酸盐胶囊中细胞繁殖能力低。实验数据清楚无疑显示培养第一天以后藻酸盐胶囊中关节软骨细胞阻止繁殖，与之相反，在混合胶囊中观测到细胞繁殖，繁殖期可达培养的头两个星期。
具体实施方案：
定义
术语“水凝胶”或“水凝胶复数”是指高含水半固体结构，其可以保持形态和尺寸而不变形。水凝胶从适当的交联多糖浓缩溶液而得。
术语“3D基体”或“立体基体”是指固体或半固体结构，其可以保持形态和尺寸而不变形。3D基体可通过适当的交联多糖浓缩溶液得到。
相应的，术语“水凝胶”或“3D基体”在本发明的描述中可认为是相同的。
术语“微胶囊化”是指一种在水凝胶中内含物质(可为生物材料或其它)的工艺，通常但非排他的，为微米级球形，是溶致或热致多糖由适当离子(溶致多糖情况下)和冷却溶液(热致多糖情况下)处理所得。
描述
本发明所得的至少成凝胶多糖二元溶液所得立体基体在下述水凝胶的非限制性实施例的详细描述中更容易理解，它们的理化特性与它们同封装于其中的单个细胞的生物相容性/生物特性一同被描述。
为实现目的，一些想法被用来确定和设计用于具有那些特征(称为生理学标记)的细胞封装的生物材料，他们与那些用于发展更有效的细胞培养方法(特别是关节软骨细胞)的细胞外基体的特征非常相似。已经广泛用于组织工程学的特定生物聚合物，即酸性多糖，例如前述藻酸盐和寡糖改性壳聚糖。阴离子多糖和碱性多糖的结合如前述可以导致***凝聚进而失去适于内含生物材料的立体结构。凝聚的形成构成了生物材料或生物活性物质微胶囊的缺陷。对于微胶囊，由于对本领域人员而言通过滴加聚合物溶液到含有适宜交联离子的溶液中诱捕生物材料(例如细胞或不同特性化合物)于水凝胶中是可能的，起始多糖的可溶性形式是非常重要的。如果凝聚存在或形成于聚合物溶液中，当与交联离子溶液接触时会形成纤维沉淀，这就不能包含生物材料了。因此识别二元多糖混合物溶解性窗口的重要性会影响水凝胶的形成，该混合物适于由胶凝因子(含离子溶液或冷却的溶液)处理。
因此，为实现本发明的目的，并与US4,424,346所记载的相反，为得到本发明3D基体所需的多糖组合物，包括至少一种阴离子多糖和一种壳聚糖寡糖衍生物的二元混合物，特征在于在适当的条件下，可溶于水性溶液而不产生不溶性凝聚。在此方面，发明人惊讶地发现包括至少一个阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液，所述壳聚糖衍生物衍生度至少40％，所述水溶液pH值在生理学范围内，特别是7-8，并有适宜的离子强度，特别是至少50mM且不超过175mM，两种多糖没有凝聚都保留在溶液中。在这些条件下直到总聚合物浓度达到3％，阴离子和阳离子多糖在水性环境中不凝聚或沉淀。
本发明的客体载其全部优选方面以及从其衍生的，是描述在未决的意大利专利申请PD2006A000202中，在这里结合该申请作为参考。
立体水凝胶或基体的形成是通过适当的可将聚阴离子多糖成凝胶的胶凝因子处理所述二元溶液得到的。
在此方面，本发明提供组合物，其由至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液所得水凝胶，组成，其中所述壳聚糖衍生物衍生度至少为40％，其中水溶液的离子强度至少为50mM且不超过175mM，pH值至少7，通过混合物中溶致或热致阴离子多糖与胶凝因子成凝胶而得。通过聚阴离子多糖的成凝胶过程，壳聚糖衍生物被封装在水凝胶中，因此至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液成凝胶所得水凝胶是通过封装壳聚糖衍生物的网状溶致或热致阴离子多糖形成的，其中壳聚糖衍生物衍生度至少为40％，所述水溶液离子强度至少50mM且不超过175mM，pH至少7。
为制备本发明的水凝胶，壳聚糖可由寡糖衍生，所述寡糖包括1-4个糖苷单元，优选包括2-4个糖苷单元，更优选的选自乳糖、纤维二糖、纤维三糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、壳二糖、壳三糖和蜜二糖组成的组。可用于得到所述寡糖衍生物的壳聚糖平均分子量(下称MW)可达1500kDa，优选为400kDa-1000kDa。另外，出于本发明目的，壳聚糖胺基由所述寡糖取代的取代率超过40-45％(～45％)。优选的，壳聚糖胺基由所述寡糖取代的取代率为50％-80％，更优选为70％。
所述壳聚糖寡糖衍生物制备工艺是已知工艺，包括对壳聚糖在酸性(pH4.5)和甲醇溶液在氰基硼氢化钠存在下用还原糖(例如乳糖)处理。壳聚糖胺基和乳糖醛基之间相互反应导致形成不稳定中间体，已知为西弗碱(Schiffbase)。其在硼氢化物存在下被还原成稳定的仲胺。
关于聚阴离子多糖，本发明的水凝胶可通过多糖混合物而得，所述多糖混合物包括溶致阴离子多糖(在这种情况下优选自卡拉胶、果胶和果胶酸盐、藻酸盐、结冷胶、拉姆珊胶(rhamsan)、韦兰胶(welan)、黄原胶或热致阴离子多糖(在这种情况下优选自部分硫酸盐化的琼脂糖、卡拉胶、硫酸纤维素、结冷胶、拉姆珊胶、韦兰胶、黄原胶。多糖结冷胶、拉姆珊胶、韦兰胶、黄原胶已知同时具有溶致和热致理化特性，而可用的胶凝因子可以是化学剂(例如离子)和物理因子(例如温度)。
聚阴离子平均分子量(MW)可达2000kDa，优选为100kDa-1000kDa，更优选的平均分子量为200kDa。
另一优选方面是多糖混合物中聚合物重量比是1:1-3:1(聚阴离子:壳聚糖衍生物)。
出于本发明的目的，壳聚糖衍生物和聚阴离子二元混合物总聚合物浓度可达3％w/v(g/mL)。优选的，所述总聚合物浓为1.5％w/v(g/mL)-3％w/v(g/mL)，更优选的是2％w/v(g/mL)。
制备本发明水凝胶所需的至少二元多糖溶液pH值在生理值范围，特别是7-8，更优选为pH7.4，渗透压为250-300mM，且离子强度50mM-175mM，该离子强度优选通过添加浓度0.05M-0.15M(更优选0.15M)的NaCl而得。渗透压优选通过非离子溶质例如甘露醇而得。
胶凝因子的选择，基于溶致阴离子多糖选自适当的一价、二价或三价离子，基于热致多糖选自不超过40℃或不低于10℃的温度。
在含有壳聚糖衍生物和致聚阴离子的二元多糖溶液情况下，水凝胶通过浓度基于阴离子多糖的适当碱金属或碱土金属离子或过渡金属或稀土金属处理前述溶液而得。
优选的，当胶凝因子为一价离子则选自钾、铷、铯、铊、银及其混合物组成的组，当为二价离子则选自Ca2+、Ba2+、Sr2+、Cu2+、Pb2+、Mn2+、Zn2+及其混合物组成的组，当为三价离子则选自Al3+、Fe3+、Gd3+、Tb3+、Eu3+及其混合物组成的组。
对于例如藻酸盐和果胶的多糖，所述离子是碱土金属离子(不包括镁)和过渡金属(优选自钙、钡、锶、铅、铜、锰及其混合物组成的组)或稀土金属离子(优选自钆、铽、铕及其混合物组成的组)。
用于二元多糖溶液成凝胶的适宜离子的水溶液的浓度高于10mM，优选为10mM-100mM，更优选为50mM。另外成凝胶溶液可含有离子渗透溶质(例如NaCl)或非离子渗透溶质(例如甘露醇)以使得成凝胶溶液的渗透压达0.3M。优选的，成凝胶溶液含有CaCl2(50mM)和NaCl(0.075M)或非离子渗透溶质(例如甘露醇)(0.15M)。
在卡拉胶情况下，使用碱金属离子并优选自钾、铷和铯，浓度不低于50mM，优选为50mM-100mM，更优选为0.1M。
在含有壳聚糖衍生物和聚阴离子(可得热致水凝胶，例如部分硫酸盐化琼脂糖)的多糖溶液情况下，水凝胶的制备是通过将温度冷却到成凝胶的温度以下而得。特别的，对于热致多糖，当胶凝因子是温度，则温度优选为40℃-10℃。
在热致多糖形成水凝胶的温度以上制备多糖溶液。在这一温度热致多糖不形成水凝胶。制备多糖溶液的温度优选50℃-30℃，更优选37℃。通过将多糖混合物滴加入凝胶浴同时将其冷却到低于凝聚形成的温度而得水凝胶。优选该温度为10℃-40℃，更优选20℃。
在一个优选方面，本发明水凝胶的制备起始于聚阴离子-聚阳离子二元多糖混合物，其中聚阴离子优选为藻酸盐，聚阳离子为壳聚糖寡糖衍生物(优选为壳聚糖乳糖衍生物(基察克))。
出于本发明的目的，被运载的生物材料或活性物质在聚合物水溶液用适当胶凝因子处理成水凝胶之前被加入聚合物水溶液中。
本发明的3D基体或水凝胶通过已知方法得到，特别是包括如下步骤：
a)制备至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物的混合物水溶液，所述壳聚糖衍生物的衍生度至少40％，所述水溶液的离子强度至少50mM且不超过175mM，pH至少7，然后可选地添加细胞和/或活性物质到所制备的多糖溶液中；
b)通过适当方法(例如由针头滴加)将步骤a)制备的溶液滴加到凝胶溶液以得到水凝胶，所述凝胶溶液或者含有交联离子(对溶致阴离子多糖而言)或具有适当的温度(对热致聚阴离子而言)；
c)通过适宜的方法，例如离心法或透析发，移除所形成的水凝胶(可选合并有细胞和/或活性物质)。
在滴加的情况下，滴的尺寸通过不同物理方法控制(例如针头外径的选择、电场的存在或与针头同轴空气流)，决定最终微胶囊型水凝胶尺寸。胶囊被保持(例如在凝胶溶液中)10分钟，然后移走。
通过前述方法所得水凝胶，通过适当的进一步处理可得到不同形式，优选为微胶囊，但也可是圆柱或盘状型。
特别的，起始于二元聚合物溶液形成圆柱体水凝胶的步骤如下：a)添加有将被装入胶囊的细胞和/或活性物质的二元聚合物溶液被转入圆柱或盘状容器且在末端由透析膜封闭；b)这些容器然后被浸没于或含有交联离子或有适当温度的溶液中(凝胶溶液)。圆柱或盘状容器留在凝胶溶液中大约30分钟，然后被移除；c)所得水凝胶胶体圆柱或圆盘在移除透析膜后从容器中得到。
替换的，在藻酸盐情况下，圆柱体可以通过添加交联离子(例如CaCO3或Ca-EDTA络合物)钝性体到多糖溶液中而得。然后添加可缓慢水解钙盐的基质，例如GDL(D-葡萄糖酸-δ-内酯)。悬浊液被转入圆柱或盘状容器并保持其中24小时。水凝胶的胶体圆柱或圆盘然后从容器中移出。这个方法描述为原位钙释放形成圆柱。
通过非限制性示范，下面描述的是从至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物制二元多糖溶液备基于本发明的微胶囊型或圆柱体型水凝胶或3D基体，以及合并有单独细胞的微胶囊的制备。
A.从一个阴离子多糖和一个壳聚糖寡糖衍生物溶液制备3D基体。
制备微胶囊
溶致或热致阴离子多糖二元混合物水溶液制备如下：
a-制备一个阴离子多糖(例如藻酸盐(Mw～130,000))溶液，离子强度150mM(通过添加NaCl 0.15M)，Hepes 10mM，pH7.4；
b-制备一个壳聚糖衍生物(例如基察克(Mw～1.5x106))溶液，离子强度150mM(通过添加NaCl 0.15M)，Hepes 10mM，pH7.4；
c-通过磁力搅拌混合两个溶液得到含有藻酸盐和基察克的溶液(例如重量比为1:1，总聚合物浓度2％)。
所得水溶液全透明且无沉淀和/或凝聚。
同样的程序可适用于其它前述提到的具有不同重量比(阴离子多糖:壳聚糖衍生物)和不同总聚合物浓度的溶致或热致多糖和壳聚糖衍生物，没有形成沉淀和/或凝聚。
下述微胶囊特定实施例的制备是基于已知方法，特别是：a)使用简单注射器将一种阴离子多糖和一种壳聚糖寡糖衍生物二元水溶液滴加入适当的凝胶浴；b)使用静电珠发生器(挪威特隆赫姆大学生物技术学院Gudmund
Figure A200780018944D0017192721QIETU
教授研发，描述在Strand等，2002，J.of Microencapsulation 19，615-630)。所述***有一个连接到容纳在树脂玻璃安全笼内的耐高压加热针头的支架的静电发生器组成，该静电发生器电压(可达10kV)并由适当开关可调。通过笼外***，包括由泵调节并连接到内径1mm的橡胶管注射器，藻酸盐溶液被滴加到一个含有凝胶溶液且其中插有电极的结晶器(位于笼内)中。仪器在针尖和凝胶溶液自由表面之间形成恒定电压差，其可调节且范围是0-10kV。电压差导致聚合物小滴(带负电荷)突然从针尖脱离然后得到一个很小尺寸的胶囊(<200μm)。胶囊尺寸可通过一些因素调节，例如针头内径，针头和凝胶溶液表面间距，聚合物流速。
制备圆柱体
下面给出通过将二元多糖溶液注入圆柱或盘状容器制备凝胶圆柱/圆盘的实施例。圆柱或圆盘水凝胶的尺寸依赖于容器的尺寸。圆柱容器典型尺寸为18mm高，内径为16mm，当然其他尺寸(高和内径)也可以。
起始于寡糖改性壳聚糖和溶致或热致聚阴离子多糖二元多糖混合物水凝胶制备实施例如下。
基于下述实施例制备3D基体，使用市售阴离子多糖水溶液和例1所描述的还原胺化反应制得的乳糖衍生壳聚糖水溶液被。
例1：合成汗乳糖壳聚糖衍生物(基察克)
壳聚糖(1.5g，乙酰化度11％)溶于110mL甲醇(55mL)、1％乙酸缓冲液(pH4.5)(55mL)溶液中。向其中再添加60mL甲醇(30mL)、1％乙酸缓冲液(pH4.5)(30mL)含乳糖(2.2g)和氰基硼氢化钠(900mg)的溶液。混合物搅拌24小时，转入透析管(切断：12,000Da)由0.1M NaCl(2次)和去离子水渗析，直到导电率为4μS(4℃)。最后溶液通过微孔(0.45μm)过滤器过滤，冻干。
例2：通过注射器从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备微胶囊
制备二元多糖溶液，其含有基察克(例1，MW～1500kDA)和藻酸盐(MW～130kDa)(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。20mL这个溶液使用装配有23G针头的注射器逐滴加入另一溶液中，该溶液含有50mM CaCl2和0.15M甘露醇(凝胶浴)且保持磁力搅拌。胶囊在搅拌下保持在凝胶浴中10分钟，然后被移出并由去离子水情绪。
例3：通过注射器从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％ w/v(g/mL))制备微胶囊
制备二元多糖溶液，其含有基察克(例1，MW～1500kDA)和藻酸盐(MW～130kDa)(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。20mL这样溶液使用装配有23G针头的注射器逐滴加入另一溶液中，该溶液含有50mM CaCl2和0.075M NaCl(凝胶浴)且保持磁力搅拌。胶囊在搅拌下保持在凝胶浴中10分钟，然后移出并由去离子水清洗。
例4：通过注射器从卡拉胶:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备微胶囊
制备二元多糖溶液，其含有基察克(例1，MW～1500kDA)和卡拉胶(MW～300kDa)(总聚合物浓度2％，卡拉胶:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。20mL这个溶液通过装配有23G针头的注射器逐滴加入一溶液中，该溶液含有100mM KCl(凝胶浴)并保持磁力搅拌。胶囊在搅拌下保留在凝胶浴10分钟，然后被移出并由去离子水清洗。
例5：通过注射器从部分硫酸盐化琼脂糖:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备微胶囊
在60℃左右制备二元多糖溶液，其含有基察克(例1，MW～1500kDA)和部分硫酸盐化琼脂糖(低凝胶点)(总聚合物浓度2％，(部分硫酸盐化)琼脂糖:基察克＝3:1)，NaCl0.15M，Hepes10mM，pH7.4。20mL这个溶液被冷却到大约30℃，通过装配23G针头的注射器逐滴加入到另一含大约4℃去离子水的溶液中。胶囊在搅拌下保持在***液中10分钟，然后被移出并由去离子水清洗。
例6：通过静电珠发生器从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备微胶囊
制备二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸盐(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。20mL该溶液被逐滴加入含有CaCl2 50mM和甘露醇0.15M(凝胶浴)的溶液中。液滴尺寸由静电珠发生器控制。典型使用条件：电压5kV，针头内径0.7mm，凝胶浴与针头间距4cm，二元聚合物溶液流速10mL/min。胶囊在搅拌下保持在凝胶溶液中10分钟，然后被移出并由去离子水清洗。
例7：通过静电珠发生器从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备微胶囊
制备二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸盐(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。20mL该溶液被滴加到含CaCl2 50mM和NaCl 0.075M(凝胶浴)溶液中。胶囊尺寸依前述由静电珠发生器控制。胶囊中搅拌下保持在凝胶溶液中10分钟，然后被移出并由去离子水清洗。
例8：通过透析从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备水凝胶圆柱体
制备二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸盐(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。20mL该溶液转入塑料圆柱体
Figure A200780018944D0020193244QIETU
中并在底端和顶端由透析膜封闭(切断：～12,000)。含有二元多糖溶液的圆柱体被浸没于1L含有CaCl2 50mM和NaCl0.15M的溶液中30分钟，然后从凝胶溶液中移出。
例9：通过原位钙释放从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))制备水凝胶
制备二元多糖溶液，其含有基察克和藻酸盐(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes 10mM，pH7.4。CaCO3(最终浓度15mM)和GDL(D-葡萄糖酸-δ-内酯)(最终浓度30mM)被添加入20mL该溶液中。混合物被转入塑料圆柱体中
Figure A200780018944D0020193303QIETU
。混合物中室温下24小时，然后凝胶被移出。
例10：关节软骨细胞封装入从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))所得微胶囊
提取自猪关节软骨的关节软骨细胞以5 x 105细胞/mL密度悬浮在1.5％藻酸盐和0.5％基察克混合物中，该混合物是在0.15 NaCl，10mM Hepes，pH7.4缓冲液中制备的。细胞悬浮液被轻轻搅拌并从静电珠发生器滴加入凝胶溶液(CaCl2 50mM，甘露醇0.15M，Hepes 10mM，pH7.4)。胶囊在轻微搅拌下放置10分钟以便凝胶完全，然后被收集并培养在DMEM培养液中(杜氏(Dulbecco)改良鹰培养液)并在逐次时间间隔被拿出以进行不同生化测定。
例11：关节软骨细胞封装入从藻酸盐∶基察克(3∶1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))所得的微胶囊中
提取自猪关节软骨的关节软骨细胞以5 x 105细胞/mL密度悬浮在1.5％藻酸盐和0.5％基察克混合物中，该混合物是在0.15 NaCl，10mM Hepes，pH7.4缓冲液中制得。细胞悬浮液被轻微搅拌并从静电珠发生器滴加入凝胶溶液(CaCl2 50mM，甘露醇0.15M，Hepes 10mM，pH7.4)。胶囊这轻微搅拌下放置10分钟以便凝胶完全，然后被收集并培养在DMEM培养液。
例12：通过注射器将关节软骨细胞封装入从藻酸盐:基察克(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))所得胶囊
提取自猪关节软骨的关节软骨细胞以5 x 105细胞/mL密度悬浮在1.5％藻酸盐和0.5％基察克混合物中，该混合物是在缓冲液(0.15 NaCl，10mM，Hepes，pH7.4)中制备的。细胞悬浮液被轻微搅拌并从23G注射器滴加入凝胶溶液(CaCl2 50mM，甘露醇，0.15M，Hepes 10mM，pH7.4)。胶囊在轻微搅拌下放置10分钟以便凝胶完全，然后被收集并培养在DMEM培养液。
例13：制备藻酸盐-罗丹明:基察克-荧光素(3:1w/w)二元多糖溶液(2％w/v(g/mL))微胶囊
制备二元多糖溶液，其含有荧光素标记的基察克和罗丹明(rhodamine)标记的藻酸盐(总聚合物浓度2％，藻酸盐:基察克＝3:1)，NaCl 0.15M，Hepes10mM，pH7.4。20mL该溶液被逐滴加入含CaCl2 50mM和甘露醇0.15M(凝胶浴)的溶液中。胶囊尺寸通过使用静电珠发生器控制。典型使用条件：电压5kV,针头内径0.7mm，凝胶浴和针头间距4cm，二元多糖溶液流速10mL/min。胶囊在凝胶溶液中搅拌10分钟，然后被移出并由去离子水清洗。
B.表征源自阴离子多糖和壳聚糖寡糖衍生物溶液的水凝胶。
胶囊/圆柱体尺寸明确依赖于其制备工艺。图1显示使用静电珠发生器制得的微胶囊的光学显微镜照片，而图2显示的大尺寸胶囊是从聚阴离子/聚阳离子二元多糖混合物水溶液通过简单注射器和逐滴加入溶液到适宜凝胶浴而得。圆柱体制备如前述实施例，尺寸为
Figure A200780018944D0021193424QIETU
。
3D基体形成过程是当二元聚合物溶液与凝胶溶液开始接触(对于溶致聚阴离子是适当的离子浓度，对于热致聚阴离子是冷却的溶液)即时发生的。例如，当含有多糖(特别是藻酸盐和基察克)二元聚合物溶液开始接触含有适当浓度钙离子的凝胶溶液立刻形成水凝胶。而不构成水凝胶结构部分的改性壳聚糖(即基察克)仍然陷在其中。这一点通过罗丹明标记藻酸盐和荧光素标记基察克二元多糖混合物制得胶囊(例13)的共焦显微镜分析证实。胶囊中具有所有荧光团，意味着两个多糖都在最终产品中。此外，二元多糖溶液形成微胶囊质子(例6)前和后的NMR分析清楚显示基察克在两种情况中都存在(图3)。
从二元多糖溶液(含多糖，特别是基察克和藻酸盐)所得的水凝胶的机械性能分析是通过原位技术所得圆柱型基体(例9)进行的。流变学研究是针对凝胶形成动力学及其弹性特性。特别的，图4显示从基察克和藻酸盐二元水溶液所得的以及只从藻酸盐水溶液所得的水凝胶的弹性模数(G’)和粘性模数(G”)随时间变化。需要注意，改性壳聚糖(即基察克)的存在不改变水凝胶形成动力学，因为G’的增长率在两种情况下是相似的，然而，需要注意的是基察克和藻酸盐二元溶液所得水凝胶的G’最大值更高。这意味聚合物混合物所得水凝胶与仅含有成凝胶聚合物(例如藻酸盐)溶液所得的水凝胶相比具有更好机械特性。
这一点通过比较原位形成技术(例9)、基察克和藻酸盐二元溶液以及单独藻酸盐溶液所得的水凝胶圆柱体所测得的抗压模数值得到证实。相似的，基察克和藻酸盐二元混合物水溶液所得水凝胶与仅含藻酸盐溶液所得凝胶相比G’、抗压模数值更大(图5)。
C.含关节软骨细胞胶囊(藻酸盐(1.5％)/基察克(0.5％))生物测试
例12所得微胶囊被培养在DMEM培养液中，并在逐次时间间隔被拿出以测量其生存能力，测量使用细胞毒素试剂盒(活/死细胞毒素试剂盒)并基于两种荧光染色(
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 10和DEAD红TM)的活细胞和死细胞的不同渗透性。清楚观测到在培养10天后在藻酸盐:基察克胶囊中超过90％细胞存活。
在混合胶囊中和作为对照的仅由藻酸盐制得胶囊中的细胞外基体的高分子组分特性通过RT-PCR和生化测定来评估的。其显示出关节软骨细胞主动合成基体，也呈现出II型胶原质构成的培养物中不同时间段胶原质组分，而蛋白多糖以聚蛋白多糖为代表(均为软骨特定标记)(图6、7)。
为进一步证实在基察克含糖聚合物存在下这些细胞的繁殖能力，细胞中结合的[3H]-胸苷被测量。关节软骨细胞成长于藻酸盐胶囊和藻酸盐∶基察克胶囊(例12)中；[3H]-胸苷的1μCi以相应间隔(1天、5天、10天和15天)被导入培养基。这样所结合的放射性在24小时后被测量。结果显示在培养第一天，在藻酸盐胶囊中关节软骨细胞的复制被抑制，然而混合(藻酸盐∶基察克)胶囊中观测到的软骨细胞快速复制延续在培养的头两个星期(图8)。
对例12中封装的并通过两个着色程序染色(一个是甲苯胺蓝，一个是镀银着色)的细胞的光学显微镜分析结果再次证实这些结果。甲苯胺蓝是一种碱性染料，其即与糖胺多糖(GAGs)反应(因为其带负电荷)以指示细胞结构，同时突出它们在细胞外基体中的存在。由于负电荷聚合物的基线信号藻酸盐胶囊的图像具有更强烈的颜色。镀银染色使得细胞基体中的胶原质被识别。光学显微镜照片显示环绕与胶原质相应的细胞的黑晕，以及环绕与糖胺多糖相应的细胞的紫色晕，显示这些细胞延续到合成的基体。
从组织工程学角度看，实验结果提供与起始于阴离子多糖和改性阳离子多糖(例如壳聚糖寡糖衍生物)二元水溶液的生物相容性立体基体的设计和制备相关的数据。在优选实施例中，分别是藻酸盐和壳聚糖乳糖衍生物。前者是一种生物相容性聚合物，具有少量或没有形成生物响应的能力，但是可在适当条件形成凝胶，后者是生物活性聚合物，其自身不能形成立体凝胶但可以刺激繁殖且同时保持细胞外基体的综合能力。同时这个混合组合物的立体支架***是用于培养关节软骨细胞的方法，其确保显型被保持而同时使其快速扩张。
实验结果证实本发明的3D基体实现其目的并可用于生物医药领域，特别是用于细胞微胶囊，即含有可用于组织工程学细胞的3D基体。事实上，结果可延伸到用于组织工程学的各种细胞类型(无论是单个还是成团)微胶囊的3D基体，所述细胞例如非限制性实施例中的关节软骨细胞、肝细胞、胰腺β细胞和胰岛、间充质干细胞、内皮细胞、造骨细胞、角化细胞。
所述结果还可延伸到药物或药学活性分子的封装，以便延迟或控制所述物质的释放。在这个情形下，制备工艺与前述细胞或多细胞团队封装一致，只需将细胞悬浮液替换为溶解或悬浮在聚合物溶液中的药学活性分子。

Claims (42)

1.水凝胶组成的组合物，特征在于其通过化学剂或物理因子处理至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物的水溶液而得，其中所述壳聚糖衍生物衍生度至少为40％，其中所述多糖混合物水溶液的离子强度至少为50mM且不超过175mM，并且pH至少为7，所述化学剂或物理因子可使得混合物中所含溶致或热致聚阴离子多糖成凝胶。
2.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中壳聚糖寡糖衍生物衍生度为50％-80％。
3.如权利要求2所述水凝胶组合物，其中壳聚糖寡糖衍生物衍生度为70％。
4.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中壳聚糖寡糖衍生物由含1-4个糖苷单元的寡糖衍生壳聚糖而得。
5.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中壳聚糖寡糖衍生物由含2-4个糖苷单元的寡糖衍生壳聚糖而得。
6.如权利要求5所述水凝胶组合物，其中寡糖选自乳糖、纤维二糖、纤维三糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、壳二糖、壳三糖和蜜二糖组成的组。
7.如权利要求6所述水凝胶组合物，其中寡糖是乳糖。
8.如权利要求4-7所述水凝胶组合物，其中壳聚糖平均分子量达到1500kDa。
9.如权利要求8所述水凝胶组合物，其中壳聚糖平均分子量为400kDa-1000kDa。
10.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中溶致阴离子多糖选自卡拉胶、果胶及果胶酸盐、藻酸盐、结冷胶、拉姆珊胶、韦兰胶和黄原胶组成的组。
11.如权利要求10所述水凝胶组合物，其中溶致阴离子多糖是藻酸盐。
12.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中热致阴离子多糖选自部分硫酸盐化的琼脂糖、卡拉胶、硫酸纤维素、结冷胶、拉姆珊胶、韦兰胶和黄原胶组成的组。
13.如权利要求10-12所述水凝胶组合物，其中阴离子多糖平均分子量达到2000kDa。
14.如权利要求13所述水凝胶组合物，其中阴离子多糖平均分子量为100kDa-1000kDa。
15.如权利要求14所述水凝胶组合物，其中阴离子多糖平均分子量为200kDa。
16.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物包括阴离子多糖和壳聚糖寡糖衍生物且阴离子多糖和壳聚糖寡糖衍生物重量比为3:1-1:1。
17.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的聚合物浓度达到3％w/v。
18.如权利要求17所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的聚合物浓度为1.5％-3％w/v。
19.如权利要求18所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的聚合物浓度为2％w/v。
20.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液pH值为7-8。
21.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液的离子强度为150mM。
22.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中所述多糖水溶液离子强度通过添加NaCl而得，其中NaCl在所述水溶液中浓度为0.05M-0.175M。
23.如权利要求21所述水凝胶组合物，其中所述多糖水溶液离子强度通过添加NaCl而得，其中NaCl在所述水溶液中浓度为0.15M。
24.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液通过进一步添加非离子溶质使得渗透压为250mM-350mM。
25.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中可使溶致阴离子多糖成凝胶的化学剂是浓度为10mM的一价、二价或三价离子水溶液。
26.如权利要求25所述水凝胶组合物，其中当胶凝因子为一价离子水溶液时，选自钾、铷、铯、铊、银及其混合物组成的组。
27.如权利要求25所述水凝胶组合物，其中当胶凝因子为二价离子水溶液时，选自钙、钡、锶、铜、铅、镁、锰、锌及其混合物组成的组，并且当阴离子多糖是藻酸盐或果胶时二价阳离子不能是镁。
28.如权利要求25所述水凝胶组合物，其中当胶凝因子为三价离子水溶液时，选自铝、铁、钆、铽、铕及其混合物组成的组。
29.如权利要求25所述水凝胶组合物，其中一价、二价或三价离子水溶液的浓度为10mM-100mM。
30.如权利要求29所述水凝胶组合物，其中一价、二价或三价离子水溶液浓度为50mM或100mM。
31.如权利要求25-30所述水凝胶组合物，其中通过进一步添加离子渗透溶质或非离子渗透溶质使得一价、二价或三价离子水溶液的渗透压达到0.3M。
32.如权利要求1所述水凝胶组合物，其中使得热致阴离子多糖成凝胶的物理因子是不超过40℃且不低于10℃的温度。
33.如权利要求32所述水凝胶组合物，其中使得热致阴离子多糖成凝胶的物理因子是20℃的温度。
34.如权利要求1-33中任一所述水凝胶组合物进一步结合有细胞和/或活性物质。
35.水凝胶组合物制备工艺包括至少如下步骤：
a)制备至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物的水溶液，所述壳聚糖衍生物的衍生度至少为40％，水溶液的离子强度至少为50mM且不超过175mM，pH至少为7，然后可选添加细胞和/或活性物质到所制备的多糖溶液中；
b)通过适当方法将步骤a)所得溶液添加到凝胶溶液以得到所需水凝胶，对于溶致阴离子多糖所述凝胶溶液含有交联离子，或者对于热致阴离子多糖所述凝胶溶液具有适当温度；
c)由适当方法移出所形成的水凝胶，所述水凝胶可选地结合有细胞和/或活性物质。
36.如权利要求2-34中任一所述水凝胶组合物，其中所述水凝胶由权利要求35所述工艺制得。
37.制备水凝胶的工艺，包括至少如下步骤：
a)制备至少一个溶致或热致阴离子多糖和至少一个壳聚糖寡糖衍生物混合物水溶液，所述壳聚糖衍生物的衍生度至少为40％，水溶液的离子强度至少为50mM且不超过175mM，pH至少为7，然后可选添加细胞和/或活性物质到所得多糖溶液中；
b)通过适当方法将步骤a)所得溶液添加到凝胶溶液中以得到所需水凝胶，对于溶致阴离子多糖所述凝胶溶液含有交联离子，或者对于热致阴离子多糖所述凝胶溶液具有适当温度；
c)由适当方法移出所形成的水凝胶，所述水凝胶可选地结合有细胞和/或活性物质。
38.如权利要求37所述工艺用于制备权利要求2-34所述水凝胶。
39.如权利要求38所述水凝胶制备工艺，其中水凝胶为微胶囊、圆柱或盘状型。
40.如权利要求1-36中任一所述水凝胶在人类和非人类生物医药领域的应用。
41.如权利要求40所述水凝胶结合细胞在组织工程学中的用途。
42.如权利要求40所述水凝胶结合活性物质在延迟或控制所述物质释放的用途。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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