CN101454341B

CN101454341B - 表面核仁素的多价合成配体在治疗癌症或发炎中的用途

Info

Publication number: CN101454341B
Application number: CN2007800192705A
Authority: CN
Inventors: J·库尔蒂; A·荷瓦耐森; J·P·白里安; G·吉夏尔; Y·哈马
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2006-04-27
Filing date: 2007-04-22
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2027-04-22
Also published as: EP2540737B1; CN101454341A; AU2007245551A1; EP2013232A2; US8497349B2; EP2013232B1; AU2007245551B2; WO2007125210A3; AU2007245551A2; US20160200783A1; US20140073555A1; FR2900341A1; WO2007125210A8; FR2900341B1; JP5559531B2; CA2650485A1; US9254309B2; WO2007125210A2; JP2009534451A; CA2650485C

Abstract

本发明涉及一种多价合成化合物在制备用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成下调的疾病，优选作为表面核仁素配体，或者治疗炎性疾病的药物中的用途，该化合物包含一个载体，在所述载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物符合通式(I)，其中每个X独立代表任何氨基酸；Y₁和Y₂独立选自具有碱性侧链的氨基酸；Z选自脯氨酸，可选地在≠、-或..被取代；天然的或非天然的N-烷基氨基酸；二烷基氨基酸；环二烷基氨基酸；哌可酸或其衍生物；n和i独立地为0或1；m是0至3的整数；k是大于或等于3的整数；ψ代表经修饰的肽键，其相对于标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。

Description

表面核仁素的多价合成配体在治疗癌症或发炎中的用途

本发明涉及一种多价合成化合物在制备用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成下调的疾病以及优选地作为表面核仁素配体的药物中的用途，该化合物包含或者由一个载体(support)组成，在所述载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物通式(I)为：

其中每个X独立代表任何氨基酸；Y₁和Y₂独立选自具有碱性侧链的氨基酸；Z选自脯氨酸，可选地在γ、β或δ被取代；天然的或非天然的N-烷基氨基酸；二烷基氨基酸；环二烷基氨基酸；哌可酸或其衍生物；n和i独立地为0或1；m是0至3的整数；k是大于或等于3的整数；ψ代表经修饰的肽键，其相对于标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。

细胞***或有丝***是使细胞繁殖从而修复或再生组织和替代死亡细胞的过程。在癌细胞中，这个过程的调节是有缺陷的，这就是为何这些细胞无限制地***从而导致肿瘤。因此，一种有效预防癌症发展的治疗途径在于使用具有抗有丝***特性的分子来阻断癌细胞的***。

但是，目前的抗有丝***分子(例如，紫杉醇(paclitaxel)、更公知为taxol，或秋水仙碱)无细胞特异性地作用于所有的细胞，而没有区别性，因此带来很多不想要的副作用。因此必须发展低有害效应的抗有丝***分子。

每种肿瘤都需要营养物和氧气以生长。这些元素由肿瘤内血管提供，所述血管来自一种称为血管生成的机制。实际上，如果这些血管不存在，肿瘤细胞将进行细胞坏死过程，肿瘤生长会慢下来然后停止。因此另外一种抗癌的治疗途径的例子在于通过阻断控制这个机制的分子来阻断血管生成过程。

现有的抗有丝***分子多数为对一种血管生成因子特异。这种单特异性引起抗性现象。对一种血管生成因子的抑制会通过血管生成补偿机制产生另一种的表达。因此，能得到针对所牵涉因子具有广谱活性的抗有丝***分子是有益的。

但是，抑制血管生成过程本身通常不足以有效阻断肿瘤生长。而且，也不能阻断转移的形成。

因此，能得到新的能够同时抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤中血管生成过程的抗癌分子是非常有用的。实际上，近期一项研究显示，两种治疗分子的组合(一个抗有丝***的，另一个抗血管生成的)产生了协同效应，与只使用一种这些分子的治疗相比，显著增加了总治疗功效。

没有报道过同时具有这两种效应(抗有丝***和抗血管发生)的分子。

此外，现有的抗癌试剂的大部分不是真正特异针对肿瘤细胞，因此也靶向健康细胞，从而导致很多的、有时很严重的副作用。这个问题在一些情况下通过发展靶向一些肿瘤的表面分子的抗体获得解决。但是，使用抗体有其它严重的问题，发展有效的治疗性无毒抗体是长期的、不确定的和昂贵的过程。此外，在严格健康和安全条件下大规模生产抗体是特别困难的。因此，基于特异性抗体的治疗仍很稀少而且及其昂贵。

另外一个与常规抗癌药物例如紫杉醇相关的问题是，这些分子通常为高疏水性的，必须发展复杂的和昂贵的药学制剂以达到可接受的体内生物可利用率。在使用核酸的治疗中体内生物可利用率的问题更加严重，因为它们非常难以有效和特异的方式到达它们的靶细胞。

因此，能得到具有以下特性的新的抗癌分子是非常有用的：

-由于在肿瘤增殖和血管生成上的双抑制作用而具有很大改善的功效，因此它们是单独有效的，不需使用常规化疗或放疗，因此大大限制了与这些治疗相关的副作用；

-针对血管生成因子的相当广谱的活性以防止治疗抗性；

-由于针对肿瘤细胞的更高的特异性，从而副作用很小；

-可容易地适合于工业水平的合成过程；

-容易应用，特别是由于更好的生物可利用率和/或体内更长的半衰期，特别是由于直接针对肿瘤细胞的特异性，在水媒中的高溶解性和改进的针对体内分解过程的抗性。

核仁素(结构见图1A)最初被描述为存在于大多数真核细胞中的核蛋白。最近表明，虽然无跨膜结构域可使其附着到细胞膜，但这个蛋白的另一种分子形式也存在于细胞表面(1-4)。这个表面核仁素与细胞内肌动蛋白微丝紧密相连。这种相连最有可能是通过跨膜伴侣间接发生。

在静止细胞中，核仁素主要被发现于细胞核，但在胞质和细胞表面也有一部分。在细胞增殖被激活后，胞质核仁素通过主动转运的方式(非常规机制，独立于内质网和高尔基体)向膜表面转运(1)。

因此细胞激活后(特别是细胞增殖被激活后)表面核仁素表达度大大增加。因此表面核仁素构成增殖期激活细胞的标志。特别是在靶向于激活细胞的人类免疫缺陷病毒(HIV)的情况下，已经表明表面核仁素可能与HIV引起的细胞感染相关(2，5)。

此外，也已经表明，表面核仁素在肿瘤细胞表面表达，例如源自肝癌的肿瘤细胞(6)、白血病T淋巴细胞(7和8)和子宫癌细胞(7)以及激活的内皮细胞表面(9)，即在血管生成过程中相关的细胞。此外，表面核仁素构成与各种配体具有低亲和性的受体，即几种生长因子例如中期因子(midkine，MK)、肝素亲和调节蛋白(HARP，也称为pleiotrophin，PTN)和乳铁蛋白(lactoferrin)(10-12)。

最近，在专利申请WO 2005/035579中建议，可使用核仁素结合试剂(例如抗核仁素抗体、抗核仁素干扰RNA或反义抗核仁素寡聚核苷酸)来治疗癌症。所呈现的主要结果表明表面核仁素可被认为是癌细胞的标志，其本身不成为一个好的靶标。只有小鼠中的初步结果表明加入抗核仁素抗体可改善紫杉醇带来的肿瘤退化。但是，没有发表的结果证明这样的抗体本身的功效，也没给出与紫杉醇组合得到此种改善所需的剂量。此外，在人体体内使用抗体，如上所述，在使用上具有严重的问题。

抗核仁素试剂可按不同的路径作用。特别是，这样的试剂可通过与核仁素蛋白结合或不结合来作用。对于干扰RNA类的试剂或反义抗核仁素寡聚核苷酸，这些试剂可能在细胞内核酸水平作用而不是结合至核仁素的水平。例如，在美国专利申请US 2005/0026860中描述，反义核仁素寡聚核苷酸在小鼠模型体内肿瘤退化中具有阳性效应。但是，虽然如此，在小鼠中观察到的效应是局部的，具有较小的肿瘤发展，并且未描述或建议其在血管生成上的效应。虽然这些结果建议核仁素可考虑作为癌症治疗的靶标，也建议平均功效不会引起以抗核仁素试剂单独治疗的可能性，而只是简单地作为传统化疗之外的辅助治疗。此外，如上所述，体内使用寡聚核苷酸具有严重的生物可利用率问题。

抗核仁素试剂也可直接结合至核仁素蛋白。各种核仁素配体已经在文献中有描述：

-肽F3(或肿瘤导向蛋白(tumour-homing protein))是对应于HMG2N蛋白(其结合至各种类型肿瘤的血管的激活的内皮细胞)的一个34个氨基酸的片段的肽。最近表明，肽F3与内皮细胞上表达的核仁素结合然后被内化并通过主动过程转运至细胞核。抗核仁素抗体可阻断与核仁素的结合和内化。有报道指出，肽F3结合至核仁素的N-末端区域，该区域含有几个氨基酸富集区(9)。在本申请中，发明人表明肽F3不能抑制生长因子HARP引发的NIH-3T3细胞的细胞增殖(见实施例1.1.1)。因此简单的与表面核仁素结合并内化不足以使这个肽具有抑制肿瘤细胞增殖的能力。

-本发明人所合成和描述的多价化合物HB19(见图2A)也是一种表面核仁素配体(7，8，13，14)，其与RGG结构域相互作用(见图1B)。已经表明：这个化合物可能使抑制HIV激活的细胞感染(13)和其它天然配体与核仁素的结合(10-12)成为可能。但是，尚无报道的结果可以证明其可能的减少和/或抑制肿瘤生长或血管生成的能力。

-专利申请WO 00/61597描述，富含鸟嘌呤的寡聚核苷酸(GRO)结合至可能是核仁素的蛋白，并在大于或等于15μM的剂量在体外抑制肿瘤细胞的增殖(15)。在体内，只提到了一定的伴随常规化疗的协同治疗的存在。没有描述或建议对血管生成的效应。此外，GRO似乎主要与细胞内核仁素结合。

-在注册了专利WO 00/61597的团队所发表的文章中，另一种混合的称为MIX1的寡聚核苷酸(在同义序列中包括碱基G和T例如GRO，但也有碱基A和C)被描述为以GRO相同的效力结合至核仁素但在细胞增殖上没有效应，这再次建议简单的与核仁素结合不足以具有抑制细胞增殖的能力(15)。

-最近，一个团队表明可能通过一个含有抗-核仁素多克隆抗体的制备物来抑制由VEGF诱导的血管生成(16)。但是，虽然抗-核仁素多克隆抗体制备物阻断了内皮细胞形成小管，却不阻断内皮细胞的增殖。而且，只测试了由VEGF诱导的血管生成，而血管生成中涉及很多其它的因子；而且没有描述或建议抑制细胞增殖的结果。

从以上描述中可清楚得知不是所有的核仁素配体表现出抗肿瘤活性，以上所列的文献没有一个建议这些配体中的任何一个可能同时在总体上抑制肿瘤细胞增殖和由各种因子引发的血管生成。

此外，着重需注意的是，所列结果，不管是单一的看还是合起来看，都没有在任何方面建议这些配体可能具有足够的活性来单独使用而不与常规抗癌治疗(放疗或者尤其是，常规化疗例如紫杉醇)组合。

但是，本发明人令人惊奇地表明，五价肽化合物HB19，或其它化合物(具有接枝于载体上的至少三个相同类型的假肽单元)，可能在总体上抑制肿瘤细胞增殖，不管是依赖性地或非依赖性地锚定(经转化细胞特点的增殖)或由各种因子引发的，以及抑制由各种因子引发的血管生成。此外更重要的是，本发明人表明在一个小鼠模型中，五价化合物HB19可在体内同时抑制肿瘤增殖和血管生成，而化合物HB19在肽的通常剂量(5mg/kg)下的抗肿瘤效应比紫杉醇(抗肿瘤治疗中的一种标准分子)在10mg/kg下要大。

因此，以前所描述的其它表面核仁素的配体似乎只具有可引起辅助治疗的局部功效，而化合物HB19在小鼠体内表现出比紫杉醇(标准抗癌分子)更高的功效，这建议单独使用它而不与常规化疗分子组合的可能性。特别的，所使用的紫杉醇的剂量虽然确实能够引起肿瘤退化，但退化不是全部的，因为小鼠死亡后发现并称重了一个肿瘤。相反，使用低2倍剂量的多价配体HB19，在小鼠死后未发现肿瘤，因此证明完全退化。

因此多价化合物HB19似乎是强有力的抗癌试剂。这个效应可能与其双能力相关，所述双能力即本发明人所证明的同时抑制肿瘤细胞的增殖(不论是由几个不同的生长因子引发的或者甚至是锚定点非依赖性的)以及由2个不同的血管生成因子引发的血管生成过程。

而且，本发明人没有发现毒性效应，不论是在化合物HB19存在下体外培养了几周的细胞中还是在以化合物HB19处理的小鼠体内。此外，体内使用后对结合至多价化合物HB19的蛋白的纯化可获得超过90％的表面核仁素，这表明多价化合物HB19和核仁素之间相互作用的高特异性。这极大地限制了副作用发生的可能性。本发明人同时表明虽然肽HB19可在结合至表面核仁素后被内化，但它不到达细胞核，这是解释对健康细胞无毒性的重要因素。

化合物HB19和其衍生物或类似物也可在容易的受控健康安全条件下容易地合成，甚至是在工业水平上。

最后，它对核仁素以及肿瘤细胞和激活的内皮细胞的特异性，它的假肽本性和它在水媒中的高溶解性意味着它在体内具有非常好的生物可利用率。化合物HB19对表面核仁素的特异性不需要任何与靶分子的偶联。此外，在HB19的情况下，所呈现的每个KPR单元的赖氨酸和脯氨酸之间的经修饰的肽键(在化合物19的情况下为还原)使其在体内具有对蛋白酶很好的抗性和超过24小时的体内半衰期，这与体内半衰期不超过半小时的常规肽相反。而且，化合物HB19在水媒中完全可溶，这使其更易于使用，因为不需要特别的药物形式来进行体内的循环和靶向。

因此五价化合物HB19呈现出提供新抗癌化合物所要解决的各种技术问题的所有必要特性：

-由于在肿瘤增殖和血管生成中的双效应，能够具有单独的高抗肿瘤功效，所述功效使设想一种不需与常规化疗分子例如紫杉醇结合的单一治疗成为可能；

-对一种特定类型的癌症不具有特异性，而是针对肿瘤细胞和激活的内皮细胞具有广谱活性；

-相对于健康细胞，对肿瘤细胞和激活的内皮细胞的特异性，因此在体内具有很小的副作用；

-具有可容易地适合于工业水平的合成过程；和

-在体内具有足够的生物可利用率从而不需要研制特别的药物形式。

因此本发明涉及一种多价合成化合物在制备用于治疗涉及细胞增殖和/或血管生成下调的疾病的药物中的用途，该化合物包含或者由一个载体组成，在载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物通式(I)为：

其中每个X独立代表任何氨基酸；

Y₁和Y₂独立选自具有碱性天然侧链的氨基酸；

Z选自：

-脯氨酸，可能在γ、β或δ被羟基、胺、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烯基、C₁-C₁₀炔基、C₅-C₁₂芳基、C₅-C₁₄芳烷基、C₅-C₁₂杂芳基(优选地为C₅杂芳基)基团取代，这些基团本身可能被1至6个选自卤素原子、NO₂、OH、C₁-C₄烷基、NH₂、CN、三卤甲基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄二烷基氨基、胍基基团、硫醇基团的取代基取代；

-天然的或非天然的N-烷基氨基酸；

-二烷基氨基酸；

-环二烷基氨基酸；或

-哌可酸或其衍生物；

n和i独立地为0或1；

m是0至3的整数；

k是大于或等于3的整数；

ψ代表经修饰的肽键，其相对于标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。

优选地，这样的多价合成化合物作为表面核仁素的配体。

在本申请的文本中，术语“载体”是指任何药学上可接受的分子，换一种说法即是无内在毒性，在其上面至少三个通式(I)的假肽单元可被接枝。因此，可接受的载体需具有足够的大小以允许至少三个通式(I)的假肽单元在其上面被接枝，优选为3至8个通式(I)的假肽单元。优选地这种可接受的载体也需要足够大，以允许至少3个，优选为3至8个通式(I)的假肽单元能够在一个或多个核仁素分子的RGG结构域中结合在一起从而相互作用。而且，该载体必须无免疫原性。

这样的载体可选自直链肽或环肽、直链或环形拟肽(peptoid)(N-取代的甘氨酸低聚物)、折叠体(foldamer)(具有强烈的采用紧密趋势的低聚物或多聚物，在溶液中具有非常确定和可预测的构象)、直链多聚物或球形树状聚体(大分子，其由围绕一个多功能核心按照树形过程组合的多聚物组成)、糖或纳米颗粒。优选地，所述载体选自直链或环肽或者直链或环形拟肽。

使用直链肽(见图2A中HB19的结构)使载体可以很容易地合成，本发明人以HB19获得的结果表明这样的载体确实有效解决了本申请中的技术问题。本申请中作为载体的直链肽可优选地含有超过25％比例的赖氨酸。更精确的，当在本发明中使用直链肽时，假肽单元优选为在赖氨酸的ε位置进行接枝。因此，当在本发明中使用直链肽时，优选为包括至少和待接枝的假肽单元同样数目的赖氨酸。

例如，一个直链肽载体可具有选自KKKGPKEKGC(SEQ ID NO：1)、KKKKGC(SEQ ID NO：2)、KKKKGPKKKKGA(SEQ ID NO：3)或KKKGPKEKAhxCONH₂(SEQ ID NO：4)的序列，Ahx代表氨基已酸，CONH₂代表酸基团已被胺基团替代，AhxCONH₂代表(2S)-2-氨基己酰胺，或由2-4个单元(KAKPG，SEQ ID NO：12)所组成的直链序列，即AcKAKPGKAKPGKAKPGCONH₂(SEQ ID NO：13，其中Ac代表乙酰基基团CH₃-CO-，CONH₂意味着甘氨酸的酸基团COOH已被酰胺基团CONH₂所替代)。优选地，直链肽载体可以是肽KKKGPKEKAhxCONH₂(见例如图2A中的HB19例子，SEQ ID NO：5，其以这个直链肽作为载体)，或者肽AcKAKPGKAKPGKAKPGCONH₂(SEQ ID NO：4，其中Ac代表乙酰基基团CH₃-CO-，CONH₂意味着甘氨酸的酸基团COOH已被酰胺基团CONH₂所替代，例如图2F中的Nucant7，SEQ ID NO：17，其以这个直链肽作为载体)。

在直链肽中，有一些为已知的采用螺旋面结构。这些直链肽也可被用于本发明中的载体。这种来自螺旋面结构的直链肽载体包含由大于或等于3的整数即3-8 个重复肽单元序列组成的载体，所述序列分别为Aib-Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：6)或Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：7)，其中Aib代表2-氨基-异丁酸。由于这些单元每个均由单一赖氨酸残基(Lys)组成，因此需要与待接枝到通式(I)的假肽单元同样多的这些单元的重复。

例如，为了获得具有5个通式(I)的假肽单元的五价化合物，该载体可以是直链肽，该肽形成以下式的螺旋面结构：

Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly(SEQ ID NO：8)或Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly(SEQ IDNO：9)。优选地，使用一种直链肽，其形成源于SEQ ID NO：8和9的式的螺旋面结构。这个式选自Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH₂(SEQ ID NO：18，其中Ac代表乙酰基基团CH₃-CO-，CONH₂意味着甘氨酸的酸基团COOH已被酰胺基团CONH₂所替代，例如见图2C中的Nucant 2，SEQ ID NO：20，其以这个直链肽作为载体)或Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH₂(SEQ ID NO：19，其中Ac代表乙酰基基团CH₃-CO-，CONH₂意味着甘氨酸的酸基团COOH已被酰胺基团CONH₂所替代，例如见图2D中的Nucant 3，SEQ ID NO：21，其以这个直链肽作为载体)。

或者，为了获得具有6个通式(I)的假肽单元的六价化合物，所用的载体可以是直链肽，该肽形成以下式的螺旋面结构：Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH₂(SEQ ID NO：14，其中Ac代表乙酰基基团CH₃-CO-，CONH₂意味着甘氨酸的酸基团COOH已被酰胺基团CONH₂所替代)或Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2(SEQ ID NO：15，其中Ac代表乙酰基基团CH₃-CO-，CONH₂意味着甘氨酸的酸基团COOH已被酰胺基团CONH₂所替代，例如见图2E中的Nucant 6，SEQ ID NO：17，其以这个直链肽作为载体)。

环形肽或拟肽也可被优选地用作载体。特别的，这使得该结构的弹性被限制。环形肽或拟肽载体可主要选自六-，八-，十-，或十二-环形肽，优选为由交替的L(左旋的)和D(右旋的)构型的氨基酸残基(D，L-环肽)或由N-烷基甘氨酸残基链(环形拟肽)组成。具有这样的载体的化合物的例子为环形六肽，其由交替的D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)组成，具有3个KPR单元，在K和P中间有一个ψ键(ψ＝(CH₂N-))，如图2B(化合物Nucant 01)所示。

优选地，本发明所述的通式(I)的化合物的载体选自由交替的D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)组成的环形六肽，或者具有SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO： 13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19序列的直链肽。

在本发明的文本中，对于假肽单元的术语“接枝”意思是通过共价键的方式被结合至载体，不管是直接的还是通过假肽和载体之间的间隔化合物中间体。结果为，在一个特定实施方式中，在假肽单元和载体之间无间隔化合物，假肽单元直接接枝到载体。在另一个实施方式中，假肽单元通过间隔物中间体被接枝到载体。可接受的间隔物的例子包括乙二醇、哌嗪类化合物，或氨基己酸类或β-丙氨酸类氨基酸。

在载体为直链或环形肽和假肽单元直接接枝到该肽的情况下，肽和假肽单元之间的连接优选在肽载体的赖氨酸残基上进行，位于赖氨酸的α或ε位，优选为ε位(侧链上)的氨基基团。因此，将假肽单元直接接枝到肽载体优选为通过酰胺键进行，该酰胺键位于假肽单元的C末端的氨基酸的COOH酸基团和赖氨酸残基的氨基基团(优选为赖氨酸的ε位(侧链上)的氨基基团)之间。

在本发明所述的化合物中，至少3个假肽单元被接枝到载体上。实际上，本发明人的结果显示出结合至核仁素的RGG结构域对于化合物HB19和其衍生化合物或类似物的不寻常抗肿瘤功效的重要性(见图1)。结合至核仁素的RGG结构域可通过几个假肽单元的多价呈递来实现，例如那些合并在通式(I)中的。对于载体为KKKGPKEKGC，KKKKGC，KKKKGPKKKKGA或KKKGPKEKAhxCONH₂序列的直链肽来说，本发明人表明，少于3个单元(k<3)，与核仁素结合的效力和抗肿瘤功效可能较低。因此本发明所述的化合物包括至少3个接枝到载体上的假肽单元，k为大于或等于3的整数。因此本发明所述的化合物优选为呈现接枝到载体上的3-8个假肽单元(3≤k≤8)。而且，本发明人表明，具有5或6个接枝到载体上的假肽单元时(k＝5)，活性最优，因为与核仁素的结合效力并不随着假肽单元数目的增多而升高。因此优选地，在通式(I)的化合物中，k为介于3至8之间，优选为4至7之间，4至6之间，4至5之间或5至6之间。更优选地，在通式(I)的化合物中，k等于5或更好为6。

在本发明的文本中，术语“任意氨基酸”意思是任何天然的或合成的氨基酸，可能经存在的一个或多个取代基所修饰。更确切地，术语氨基酸意思是具有以下一般结构的α氨化的氨基酸：

其中R代表氨基酸的侧链。因此在本发明的文本中，R代表侧链或非侧链氨基酸的侧链。术语“天然氨基酸”意思是在活的生命体内天然发现的任何氨基酸。因此天然氨基酸包括在翻译中合并到蛋白质中的由mRNA编码的氨基酸，也包括体内天然发现的、代谢过程的产物或副产物的其它氨基酸，例如鸟氨酸，其通过精氨酸酶由L-精氨酸经尿素生产过程产生。因此在本发明中所使用的氨基酸可以是天然的或非天然的。即，天然氨基酸通常具有L构型，但是根据本发明，氨基酸可以是L或D构型。而且，R当然不限于天然氨基酸的侧链，而是可以自由选择。

通式(I)的化合物的假肽单元中，Z可不存在(i＝0)，或者存在(i＝1)则选自：

脯氨酸，可能在γ、β或δ被羟基基团、胺、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烯基、C₁-C₁₀炔基、C₅-C₁₂芳基、C₅-C₁₄芳烷基、C₅-C₁₂杂芳基(优选地为C₅杂芳基)基团取代，这些基团本身可能被1至6个选自卤素原子、NO₂、OH、C₁-C₄烷基、NH₂、CN、三卤甲基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄二烷基氨基、胍基基团、硫醇基团的取代基取代；

-天然的或非天然的N-烷基氨基酸；

-二烷基氨基酸(例如氨基异丁酸)；

-环二烷基氨基酸；或

-哌可酸或其衍生物。

术语“C₁-C_i烷基”意思是直链或支链的式-C_jH2_j+1的饱和烃自由基，其中1≤j≤i。因此，C₁-C₁₀烷基包括C₁烷基(甲基)、C₂(乙基)、C₃(正丙基或异丙基)、C₄(正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)，C₅(例如：正戊基、新戊基、异戊基、叔戊基)以及C₆至C₁₀烷基。术语“C₁-C₁₀烯基”意思是由1-10个碳原子和至少一个C＝C双键组成的直链或支链的不饱和烃自由基。术语“C₁-C₁₀炔基”意思是由1-10个碳原子和至少一个C≡C三键组成的直链或支链的不饱和烃自由基。术语“C₅-C₁₂芳基”意思是具有5-12个碳原子的芳香多环或单环烃自由基。术语“C₅-C₁₄芳烷基”意思是总共具有5-14个碳原子的烷基和芳基的组合。术语“C₅-C₁₂杂芳基”意思是一个芳基基团，在通常具有5-12个碳原子的烃链上至少一个碳原子被另一个选自N、O或S的原子取代。因此术语“C₅杂芳基”意思是一个芳基基团，其烃链上5个碳原子中至少一个被另一个选自N、O或S的原子取代。术语“C₁-C₄烷氧基”意思是具有以下式的基团：-O(O)C-(C₁-C₄烷基)，-O(O)C-(C₄-C₁₂环烷基)，-O(O)C-(C₄-C₁₂芳基)，-O(O)C-(C₄-C₁₂芳烷基)或-O(O)C-(C₄-C₁₂杂芳基)。优选地，通式(I)的化合物中，这样的“C₁-C₄烷氧基”选自式-O(O)C-(C₁-C₄烷基)，-O(O)C-(C₄环烷基)，-O(O)C-(C₄芳基)，-O(O)C-(C₄芳烷基)，或-O(O)C-(C₄杂芳基)。术语“C₁-C₄二烷基氨基”意思是式-N(C₁-C₄烷基)₂的自由基，其中每个烷基相同或不同。

术语“N-烷基氨基酸”意思是任何氨基酸，其中胺基团中的一个氢原子被C₁-C₁₀烷基链或C₅-C₁₄芳烷基基团、优选为C₅-C₁₀，即可能为C₁₀所取代。N-烷基氨基酸的例子包括N-甲基甘氨酸或肌氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基缬氨酸等。术语“二烷基氨基酸”意思是任意氨基酸，其中2个氢原子(在中心碳原子或胺基团上)被C₁-C₁₀烷基链或C₅-C₁₄芳烷基基团、优选为C₅-C₁₀，即可能为C₁₀所取代。二烷基氨基酸的例子包括2-氨基-异丁酸(Aib)，氨基环丙烷羧酸等。

优选地，Z存在，因此i＝1。同样优选地，当Z存在时(i＝1)则Z为脯氨酸，可在γ、β或ε被取代，如上所述。

在通式(I)的化合物的假肽单元中，Y₁和Y₂选自具有碱性侧链的氨基酸。术语“具有碱性侧链的氨基酸”意思是任何天然或非天然氨基酸，其侧链R具有大于7的pKa值(pKa(R)>7)。因此，任何氨基酸可用于Y₁和Y₂，只要其侧链具有大于7的pKa值，优选为大于7.5，大于8，大于8.5或大于9。特别地，在那些具有大于7的pKa值的侧链的天然氨基酸中，包括赖氨酸(K，pKa(R)≈10.5)，精氨酸(R，pKa(R)≈12.5)，鸟氨酸(赖氨酸的下级同族体(inferior homologue)，pKa(R)≈10.8)，通常被认为是天然的碱性氨基酸。因此，在一个优选的实施方式中，Y₁和Y₂独立地选自精氨酸(R)，赖氨酸(K)或鸟氨酸。更优选地，Y₁是赖氨酸(K)，Y₂是精氨酸(R)。但是，也可使用其它的非天然氨基酸只要它们的侧链的pKa值大于7，优选大于7.5，大于8，大于8.5或大于9。

在本发明的化合物中，与核仁素的RGG结构域结合所必需的假肽单元是式(II)的亚单元：

其中，Y₁和Y₂如上所定义。不过，在此必需的亚单元的一端或另一端存在如上所定义的几个氨基酸不会防止与核仁素的结合。这就是为何此必需的式(II)的亚单元可以在一端和/或另一端包括0至3个任何氨基酸，如在通式(I)中分别由(X)n和(X)m所代表，其中n等于0或1，m是0至3的整数。优选地，在此必需的式(II)的亚单元的一端和/或另一端存在的氨基酸的数目是低的，换句话说，n优选地为0，m优选地0至2的整数，优选为0或1，优选为0。因此，在一个优选的实施方式中，n和m等于0。

在本发明的化合物中，式(II)的亚单元包括经修饰的肽键ψ，其相对于标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。

术语“标准肽键”意思是式(-CONH-)的酰胺键，其通常在天然蛋白质的两个氨基酸之间存在。这样的键对蛋白酶作用敏感。术语“经修饰的肽键ψ”意思是与式(-CONH-)的标准肽键不同的化学式的2个氨基酸之间的化学键。这样的经修饰的肽键ψ相对于式(-CONH-)标准肽键来说，对至少一种蛋白酶具有更显著抗性。术语“蛋白酶”，也称为“肽酶”或“蛋白水解酶”，意思是可以切割蛋白质中的标准肽键的任何酶。这个过程被称为蛋白水解切割。这包括使用水分子，其导致蛋白酶被归类为水解酶。即蛋白酶包括被称为N-肽酶的蛋白酶，其对蛋白质的N-末端进行切割。在肽的体内稳定性方面，没有经修饰的肽键，这些蛋白酶是非常麻烦的。这就是为何通式(I)的化合物的假肽单元在Y₁和Z之间(如果i＝1)或Y₁和Y₂之间(如果i＝0)包括一个经修饰的键ψ，以显著增加式(II)的亚单元对这些N-肽酶的抗性，所述亚单元对与核仁素结合是必需的。因此ψ键应该可能显著增加对至少一种N-肽酶的抗性。这可显著增加通式(I)的化合物的体内和体外半衰期。即，具有经修饰的肽键ψ的化合物HB19在人血清或胎牛血清中在37℃下具有大于24小时的半衰期，而具有标准肽键而不是ψ键的相同化合物在同样条件下只有1个小时的半衰期。

此外，本发明人发现，经修饰的肽键ψ的存在也可显著增加与核仁素结合的效力。这种现象可能是由于可允许化合物HB19与核仁素形成不可逆的复合体。

已知有各种化学键可显著增加对至少一种蛋白酶的抗性。因此，在一个优选的实施方式中，ψ代表还原的键(-CH₂NH-)或(-CH₂N-)(在结合发生于仲胺水平的情况下，如脯氨酸的键的情况)、逆反键(-NHCO-)、氧亚甲基键(-CH₂-O-)、硫亚甲基键(-CH₂-S-)、碳键(-CH₂-CH₂-)、酮亚甲基键(-CO-CH₂-)、羟乙烯基键(-CHOH-CH₂-)、(-N-N-)键、E-烯烃键或(-CH＝CH-)键。即，本发明人表明使用还原的(-CH₂-NH-)可显著增加对至少一种蛋白酶的抗性。因此ψ优选地代表还原的键(-CH₂NH-)。

虽然在通式(I)的化合物中只有ψ在Y₁和Z之间(如果i＝1)或Y₁和Y₂之间(如果i＝0)之间***地存在，假肽单元的其它肽键也可能被修饰，如上所述。特别地，在本发明的文本中，未说明的氨基酸之间的键完全可以是标准肽键或经修饰的ψ键，如上所述。另外的ψ键的存在使进一步增加通式(I)的化合物对蛋白酶的抗性成为可能。不过，由于在Y₁和Z之间(如果i＝1)或Y₁和Y₂之间(如果i＝0)存在的第一个Y键而引起的增加已经是非常显著的，其它ψ键的加入使假肽单元的合成复杂化并因此使通式(I)的化合物的合成复杂化。因此另外的ψ键的存在是可能的，但是是可选的。

本发明中可使用的化合物的例子特别包括化合物(见图2和实施例1，2，3和4)：

-HB19(图2A，SEQ ID NO：5，以SEQ ID NO：4的直链肽作为载体的化合物，其中5个假肽单元κψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至5个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团)，

-Nucant 01(图2B，由交替的D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)组成的环形六肽作为载体的化合物，其中3个假肽单元κψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至3个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团；见图2B)，

-Nucant 2(图2C，SEQ ID NO：20，以具有SEQ ID NO：18的螺旋面结构的直链肽作为载体的化合物，其中5个假肽单元κψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至5个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团)，

-Nucant 3(图2D，SEQ ID NO：21，以具有SEQ ID NO：19的螺旋面结构的直链肽作为载体的化合物，其中5个假肽单元κψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至5个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团)，

-Nucant 6(图2E，SEQ ID NO：16，以具有SEQ ID NO：15的螺旋面结构的直链肽作为载体的化合物，其中6个假肽单元κψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至6个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团)，

-Nucant 7(图2F，SEQ ID NO：17，以SEQ ID NO：13的的直链肽作为载体的化合物，其中6个假肽单元κψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至6个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团)。

以上所描述的化合物用于制备治疗涉及细胞增殖和/或血管生成下调的药物。术语“涉及细胞增殖和/或血管生成下调”在本申请的文本中意思是，任何人类或动物疾病，所述疾病影响一个或多个器官，在所述器官中观察到一个或多个不正常细胞增殖现象，以及细胞或组织的群体，和/或不正常的新血管形成。特别的，这些疾病包括所有类型的癌症，例如腺瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤以及特别是下列的癌症：卵巢、乳、胰腺、***、皮肤、血、肺、脑、肾、肝、鼻咽腔、甲状腺、中枢神经***、***、结肠、直肠、子宫颈、睾丸或膀胱。它们也包括皮肤的非癌疾病，例如表皮或真皮囊肿、牛皮癣、血管瘤，以及眼病，例如与年龄相关的黄斑退化(ARMD)、糖尿病性视网膜病或新生血管性青光眼。神经变性疾病例如多发性硬化(multiple sclerosis)、帕金森病(Parkinson’s)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s)或自身免疫病，例如狼疮或类风湿性多关节炎，以及与动脉硬化症相关的疾病。

优选地，所述涉及细胞增殖和/或血管生成下调的疾病是癌症，特别是以上所列的其中一种。

本发明还涉及一种同时抑制细胞增殖和血管生成的分子的筛选方法，其包含：

(a)将表达表面核仁素的细胞与测试分子接触；和

(b)确定所述测试分子与核仁素的RGG结构域的结合能力。

可能通过化学合成或使用遗传工程通过核DNA序列的表达来合成核仁素的60个氨基酸的RGG结构域。然后可以通过本领域技术人员已知的各种技术来确定所述测试分子与核仁素的RGG结构域的结合能力。

特别的，这可通过使用表面等离子共振技术，特别是使用

Figure DEST_PATH_RE-GA20178173200780019270501D00021

3000仪器测定其与合成的60个氨基酸的RGG结构域的结合来进行。

Figure DEST_PATH_RE-GA20178173200780019270501D00022

***使用表面等离子共振(SPR)的物理原理的生物感应器。其可对生物特异性表面上的两个分子之间的动力学相互作用常数(Ka和Kd)进行实时的和无特异标记的测定。为此，一个分子(配体)被固定在感应器表面，另一个(被分析物)被注入。SPR检测的原理是对接近表面的折射率的变化进行定量，与生物感应器表面的质量变化(由分子复合物的形成和拆分所引起)联系。当单色的极化光到达具有不同折射率的两种介质的界面时，该界面以金属细层包被，反射光的强度对于一个特定的入射角明显降低。这是由于光的一个电磁成分，衰逝波(evanescent wave)与界面垂直传播，达到1μm。由于位于接近表面的分子重量的作用，共振角变化。因此，循时间而监测SPR角度可能实现对配体和被分析物的结合和拆分的实时观测。所获得的信号被记录下来(sensogram)。以共振单位(RU)定量。1000RU的变化对应于0.1°的角度上的偏移，并等于每mm²上结合1ng的蛋白。因此这个技术不仅可建立测试分子与RGG结构域结合的能力，而且可建立所述分子与核仁素的RGG结构域的结合效力(亲和常数)。

也可以产生一个合成的RGG结构域，以生物素标记或者融合至肽或蛋白例如GST(谷胱甘肽S-转移酶)。生物素或GST存在使得可以通过标记的亲和素/链霉亲和素配体(荧光、发光、放射性等)来检测，不论RGG结构域是生物素化的，和/或RGG结构域是以GST融合的，如果有抗-GST抗体。虽然精确度低，但这些技术可迅速且容易地筛选大量分子的与核仁素RGG结构域结合的能力，然后可使用以上所述的表面等离子共振技术对它们与RGG结构域结合的效力进行更精确的测定。

因此，优选为首先对与核仁素RGG结构域结合的能力进行迅速且容易的筛选。然后，精进分析，即通过表面等离子共振技术确定能够与RGG结构域结合的候选者与RGG结构域结合的能力。但是，在只测定小数目的化合物的情况下，可使用表面等离子共振技术直接测定它们与RGG结构域结合的效力。

本发明进一步涉及如上所定义的化合物，但不包括下述载体为非环肽的化合物：该非环肽包括选自KPG，KGP，KGC或KX₁KX₄KX₁K的氨基酸序列，其中，X₁是可选的，选自赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)，X₄是可选的，选自缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)。

特别的，载体(除了上段所排除的以外)、假肽单元在载体上的接枝方式以及氨基酸X、Y₁和Y₂，n和m，或Y可以是任何前述实施方式中的形式。

本发明也涉及前述的化合物，载体为直链肽的化合物除外。特别的，载体(除了直链肽以外)、假肽单元在载体上的接枝方式以及氨基酸X、Y₁和Y₂，n和m，或Y可以是任何前述实施方式中的形式。

特别的，载体可选自包含氨基酸序列的直链肽，所述氨基酸序列选自Aib-K-Aib-G(SEQ ID NO：6)或K-Aib-G(SEQ ID NO：7)，环肽、直链或环形拟肽、折叠体、直链多聚物或球形树状聚体、糖或纳米颗粒。

在一些优选的情况下，载体可以是由以下氨基酸序列组成的直链肽，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19。

根据本发明所述的化合物可特别地包括，载体为环肽例如Nucant 01(图2B)，或螺旋面结构例如Nucant 2(SEQ ID NO：20和图2C)和Nucant 3(SEQ ID NO：21和图2D)的化合物，如上所述。它们也可包括化合物Nucant 6(SEQ ID NO：16，见实施例4和图2E)。

本发明也涉及化合物Nucant 7(SEQ ID NO：17和图2F)作为化合物。

本发明进一步涉及如上所定义的化合物作为药物的用途，但不包括下述载体为非环肽的化合物：该非环肽包括选自KPG，KGP，KGC或KX₁KX₄KX₁K的氨基酸序列，其中，X₁是可选的，选自赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸 (E)或异亮氨酸(I)，X₄是可选的，选自缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)。

特别的，载体可选自包含氨基酸序列的直链肽、环肽、直链或环形拟肽、折叠体、直链多聚物或球形树状聚体、糖或纳米颗粒，所述直链肽包含选自Aib-K-Aib-G(SEQ ID NO：6)或K-Aib-G(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列。

这些用作药物的化合物可特别地包括，载体为环肽例如Nucant 01(图2B)，或螺旋面结构例如Nucant 2(SEQ ID NO：20和图2C)和Nucant 3(SEQ ID NO：21和图2D)的化合物，如上所述。它们也可包括化合物Nucant 6(SEQ ID NO：16，见实施例4和图2E)。

本发明也涉及化合物Nucant 7(SEQ ID NO：17和图2F)作为药物的用途。

本发明进一步涉及包含化合物的药物组合物，所述化合物如上所定义的化合物，但不包括下述载体为非环肽的化合物：该非环肽包括选自KPG，KGP，KGC或KX₁KX₄KX₁K的氨基酸序列，其中，X₁是可选的，选自赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)，X₄是可选的，选自缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)或异亮氨酸(I)。

本发明也涉及前述的药物组合物，载体为直链肽的化合物除外。特别的，载体(除了直链肽以外)、假肽单元在载体上的接枝方式以及氨基酸X、Y₁和Y₂，n和m，或Y可以是任何前述实施方式中的形式。

根据本发明所述的药物组合物可特别地包括，载体为环肽例如Nucant 01(图2B)，或具有螺旋面结构的直链肽例如Nucant 2(SEQ ID NO：20和图2C)和Nucant 3(SEQ ID NO：21和图2D)的化合物，如上所述。它们也可包括化合物Nucant 6(SEQID NO：16，见实施例4和图2E)。

本发明也涉及含有化合物Nucant 7(SEQ ID NO：17和图2F)的药物组合物。

这样的药物组合物将本发明所述的化合物与药学上可接受的载体组合。

本发明也涉及一种合成多价化合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述化合物包含或者由一个载体组成，在载体上至少三个假肽单元被接枝，该化合物通通式(I)为：

现在已经广泛确定，慢性炎性疾病，即细胞调节的自身免疫病，部分是由细胞因子引发的。由各种实验动物模型获得的结果已经解释出细胞因子在疾病发病机理中所扮演的角色(17)。例如，促炎性细胞因子例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、IL-6、IL-15和IL-18调节类风湿性多关节炎病人的免疫和炎性反应。特别地，TNF-α和IL-1β促进软骨和骨髓的破坏。

此外，在发炎过程中，血管内皮表达不同的趋化因子(chemokine)和黏附分子，它们参与炎性中心的白细胞补充(18)。

IL-8是C-X-C趋化因子，其引发组织(发炎位置)中的白细胞的激活和选择性补充。当高量表达时，IL-8可对机体具有致病性后果。脂多糖(LPS)和促炎性细胞因子例如TNF-α和IL-1引发许多类型的细胞分泌IL-8，特别是内皮细胞(19)。

细胞间黏附分子-1(ICAM-1)是在几种类型的细胞(包括内皮细胞和与免疫反应有关的细胞)表面表达的免疫球蛋白类型的蛋白。它在白细胞黏附和向发炎位置移动上扮演重要角色(20)。

促炎性细胞因子也参与由细菌感染引发的普通炎性反应(感染性休克(Septicshock))。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的外膜上的组成成分。这个免疫刺激分子对引发普通炎性反应(称为感染性休克，其经常伴随革兰氏阴性菌感染)起极大作用。LPS具有刺激淋巴网状内皮细胞产生细胞因子(例如TNF-α、IL-1和IL-6)的生物学特性。这些细胞因子的诱导在败血症状的发展中扮演关键角色，因为单独使用TNF-α可导致败血症和死亡，因为TNF-α可引发体内IL-1和IL-6的产生。此外，在动物模型中，以抗-TNF-α抗体和IL-1受体激动剂预处理可保护动物免于LPS的致命效应(21)。

严重败血病与攻击性炎性反应和器官衰败相关。它经常与高死亡率相联。它可以从细菌、真菌或病毒感染继续下去。这种反应的标志是相继的促炎性细胞因子然后是炎性细胞因子的分泌。TNF-α和IL-1β是众多促炎性细胞因子中的。直至现在，尚未有关于抗-LPS或抗-细胞因子试剂的临床试验获得成功(22，23)。

促炎性细胞因子似乎也在心脏炎或心脏发炎的病人中扮演病理生理学角色，所述心脏发炎表现为心内膜(心内膜炎)或心包膜(心包炎)或心肌(心肌炎)的发炎。例如，在传染性心内膜炎(特别的，可由金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染所引起)的病人中，血清IL-6水平显著升高。同样，血清中高水平的IL-6可暗示传染性心包炎的存在并可作为这种疾病的诊断工具和追踪治疗(24，25)。

考虑到促炎性细胞因子例如TNF-α、IL-1和IL-6在炎性疾病中的重要作用，已经发展了有关抗-TNF-α，抗-IL-1和抗-IL-6试剂的抗炎性细胞因子治疗，来治疗遭受炎性疾病的病人(26)。

各种有关抗炎性细胞因子试剂的临床试验在治疗慢性炎性疾病例如类风湿性关节炎和腹部炎性疾病中已经取得一些成功：依那西普(Etanercept)(TNF受体-P75Fc融合蛋白)、英夫利昔单抗(Infliximab)(嵌合人抗-TNF-α单克隆抗体)、阿达木单抗(Adalimumab)(重组人抗-TNF-α单克隆抗体)和阿那白滞素(Anakinra)(人IL-1β受体拮抗剂的重组形式)(22)。

然而，所有的目前可获得的抗炎性细胞因子试剂都是蛋白，因此具有与蛋白药物相联的缺点，特别是，生产的高成本和大规模生产中具有的问题。

因此，非常需要能够特异性靶向促炎性细胞因子合成途径的低分子量的分子。

令人惊奇的是，本发明人发现通式(I)的化合物，如上所述，具有抗炎性活性；特别的，他们抑制经LPS刺激的各种类型的细胞的TNF-α、IL-6和IL-8的产生，以及ICAM-1的表达。这些化合物是极其有趣的，因为，如上所述的：

-本发明人未发现这些化合物的毒性效应，不论在体外还是在体内；

-这些化合物在容易控制的条件下可容易地合成，甚至是在工业规模上；

-这些化合物本身具有足够的体内生物可利用率，无需发展特别的药物形式；

因此本发明涉及通式(I)的合成多价化合物(如以上所述任何实施方式中所定义)在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。

特别的，在通式(I)中，载体、假肽单元k的数目、假肽单元在载体上的接枝方式氨基酸X、Y₁和Y₂，n和m，或ψ可以是以上描述的任何实施方式中的形式。

术语“炎性疾病”意思是任何疾病，其中炎性反应对有机体具有致病性后果。特别的，本发明文本中的炎性疾病包括自身免疫病(例如狼疮或类风湿性关节炎)、败血病、感染性休克、心脏发炎疾病(心脏炎，特别是心内膜炎、心包炎、心肌炎，特别是有感染源的，例如由金黄色酿脓葡萄球菌所引起的)、移植排斥反应、外伤、关节的炎性疾病(特别的，关节炎的不同形式)、胃肠***炎性疾病(特别的，大肠炎、肠炎、胃炎、肠胃炎和肠的慢性炎性疾病，例如克罗恩病(Crohn’s disease)和出血性直肠结肠炎(HRC))、皮肤的炎性疾病(湿疹、过敏性接触皮炎、牛皮癣、皮肤病)、呼吸***的炎性疾病，特别是慢性阻塞性肺病(COPD)和过敏症。

在一个优选的实施方式中，炎性疾病为自身免疫病，特别是狼疮或类风湿性关节炎。在另一个优选实施方式中，炎性疾病为感染性休克。在另一个优选实施方式中，炎性疾病为心内膜炎，特别是有感染源的心内膜炎，例如由金黄色酿脓葡萄球菌所引起的。

本发明的优点通过以下附图和实施例进行说明。

附图说明

图1.A.核仁素蛋白的结构。人类核仁素由707个氨基酸组成。核仁素可被分解为两个主要部分(3，4)：N-末端(aa 1-308)和C-末端(309-706)。N-末端结构域由4个长的酸性结构域(由谷氨酸和天冬氨酸不间断的重复(A1，A2，A3，A4)组成)组成。C-末端结构域，由交替的疏水和亲水区域(形成4个称为RBD(即RNA结合结构域：I，II，III，IV)的结合至RNA的区域)组成，其末端(aa 644-707)携带高度碱性的包含Arg-Gly-Gly重复的RGG结构域。B.化合物HB19的与核仁素结合结构域(RGG结构域)的鉴定。在一个使用兔网状细胞裂解液的***中，通过体外转录/翻译核仁素获得对应于N-和C-末端区域的核仁素构建体。因此，产生了[³⁵S]Met/Cys标记的全核仁素和N-和C-末端部分(分别含有氨基酸1-707，1-308和309-707)。然后以生物素化的HB19来温育标记的粗产物，复合体在亲和素-琼脂糖柱上纯化。如所期望的，全核仁素与HB19相互作用。另一方面，富含酸性残基的核仁素的N-末端部分根本不与该化合物相互作用，而核仁素的C-末端含有HB19的靶位(14)。鉴定了含有HB19靶位的核仁素的C-末端后，制造了这个区域的各种构建体(N^o1-9)。第一个构建体对应于编码人核仁素(包括4个RBD和RGG结构域)的C-末端部分的cDNA，与GST蛋白(谷胱甘肽S-转移酶)融合以进行用抗-GST抗体的检测。其它的构建体，也是与GST融合，对应于同样的部分但一个或多个较短结构域。所有这些蛋白以E.coli产生。HB19与每个构建体相互作用的能力这样测定：将表达不同的核仁素构建体的细菌粗提物与生物素化的HB19温育，然后固定于亲和素-琼脂糖以进行纯化。然后以聚丙烯酰胺凝胶和GST分析这些样品，使用抗-GST抗体以免疫检测(Western Blot)显示。结果表明RGG结构域的存在对于HB19与核仁素的C-末端部分相互作用是必需的。而且，RGG结构域自身对这种相互作用已足够。

图2.A.化合物HB19的结构。B.三价化合物Nucant 01的结构，所述Nucant01具有环形六肽作为载体，所述环形六肽由交替的D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)组成。3个假肽单元KψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至每个赖氨酸残基(K)的ε氨基基团；C.五价化合物Nucant 2(SEQ ID NO：10)的结构，所述Nucant2具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO：8序列的螺旋面结构，其中5个假肽单元KψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至5个赖氨酸残基中的每个的ε氨基基团， Ac代表CH₃-CO-基团；D.五价化合物Nucant 3(SEQ ID NO：11)的结构，所述Nucant 3具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO：9序列的螺旋面结构，其中5个假肽单元KψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至5个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团，Ac代表CH₃-CO-基团。E.六价化合物Nucant 6(SEQ ID NO：16)的结构，所述Nucant 6具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO：15序列的螺旋面结构，其中5个假肽单元KψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至6个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团，Ac代表CH₃-CO-基团。F.六价化合物Nucant 7(SEQ ID NO：17)的结构，所述Nucant 7具有直链肽作为载体，所述直链肽具有SEQ ID NO：13序列的螺旋面结构，其中6个假肽单元KψPR(ψ＝CH₂-N)共价连接至6个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团，Ac代表CH₃-CO-基团。

图3.A.抗-核仁素(抗Nu)，B.同位型IgG，C.肽F3和D.HB-19在经HARP刺激的NIH-3T3细胞增殖中的效应。在所示浓度的HB19存在或不存在的情况下，不刺激或以4nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经HARP刺激的对照(100％)的百分率给出。MSD(起点)，(^**p<0.01，^***p<0.001)。

图4.以HB19预处理NIH-3T3细胞1个小时在HARP诱导的增殖中的效应。NIH-3T3细胞以HB19处理1个小时，然后洗涤，不刺激或以3.6nM HARP刺激。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经HARP刺激的对照(100％)的百分率给出。MSD(起点)，(^**p<0.01，^***p<0.001)。

图5.HB-19在经0.2nM FGF-2(A)刺激或5％胎牛血清(B)刺激的NIH-3T3细胞增殖中的效应。在所示浓度的HB19存在或不存在的情况下，以FGF-2或5％血清刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经HARP刺激对照(100％)的百分率给出。MSD(起点)，(^**p<0.01，^***p<0.001)。

图6.抗-核仁素(抗Nu)(A)，IgG同位型(B)和HB-19(C)对MDA-MB231在湿琼脂上生长的效应。MDA-MB231细胞在培养基上培养，所述培养基在0.6％琼脂基质上含有0.35％琼脂。培养10天后，直径大于50μM的克隆被计数。每孔5个区域，每个点三次重复(^**p<0.01)。

图7.抗-核仁素(抗Nu)(A)和HB19(B)对B16-BL6在湿琼脂上生长的效应。B16-BL6细胞在培养基上培养，所述培养基在0.6％琼脂基质上含有0.35％琼脂。培养10天后，直径大于50μM的克隆被计数。每孔5个区域，每个点三次重复(^*p<0.05，^**p<0.01)。

图8.HB-19在血管生成中的效应。A.HB-19在HUVEC细胞体外增殖中的效应。20000个HUVEC细胞在孔中培养，每天加入不同浓度的化合物HB19。处理6天后对细胞计数。B.也测定了HB19(1μM)在HUVEC细胞分化中的效应，所述HUVEC细胞在HARP血管生成因子(1nM)；VEGF(1nM)和FGF-2(3nM)存在下以三维胶原凝胶培养。结果以任意单位表现。C.体内血管生成模型(matrigel***检测)(matrigel plug assay)中，HB-19在HARP或FGF-2引发的血管生成中的效应。将含有所示浓度的分子的matrigel(300μl)经皮下注射入小鼠。1周后杀死小鼠，除去matrigel。进行8μm厚的切片。染色后，通过图像分析估计内皮细胞的数目。对于每个matrigel，每个实验点分析5个切片和4只小鼠。

图9.MDA-MB231异种移植模型中，HB-19在肿瘤生长中的效应。人乳腺癌MDA-MB231细胞经皮下注射入无胸腺小鼠(裸)。当肿瘤达到200mm³的体积时，以图A中所示的皮下途径处理小鼠。B.在第40天杀死的小鼠中肿瘤的观测和测量。C.在第40天杀死的小鼠的肿瘤重量。

图10.MDA-MB231异种移植模型中，HB-19在肿瘤生长中的效应。肿瘤生长的变化。腹腔内(IP)或皮下(SC)注射。

图11.MDA-MB231异种移植模型中，HB-19在转移的肿瘤细胞中的效应。使用抗HLA-DR抗体，以流式细胞仪(FACS)研究经HB-19处理或未处理的异种移植小鼠血液中的MDA-MB231细胞。HLA-DR⁺被环绕，标明了HLA-DR⁺细胞在血细胞中的百分率。A.没有MDA-MB231异种移植的小鼠的血液，未处理，HLA-DR⁺细胞在外周血细胞中的百分率：0.36％。B.没有MDA-MB231异种移植的小鼠的血液，未处理，HLA-DR⁺细胞在外周血细胞中的百分率：22.2％。C.具有MDA-MB231异种移植的小鼠的血液，以HB19经皮下途径处理，HLA-DR⁺细胞在外周血细胞中的百分率：0.1％。D.具有MDA-MB231异种移植的小鼠的血液，以HB19经皮下途径处理，HLA-DR⁺细胞在外周血细胞中的百分率：0.31％。

图12.HB-19和Nucant01在经HARP刺激的NIH-3T3细胞生长中的效应。在所示浓度的HB19或Nucant01存在的情况下，不刺激或以4nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果(3个点的平均值)以相对于对照的细胞增殖百分率给出，所述对照在无HB19和Nucant 01存在下经HARP刺激(100％细胞增殖)。

图13.HB19、Nucant 2和Nucant 3在经HARP刺激的NIH-3T3细胞生长中的效应。在所示浓度(0.1，0.25和0.5≥M)的HB19、Nucant 2或Nucant 3存在的情况下，不刺激或以4nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果(3个点的平均值)以相对于经HARP刺激的对照的百分率(100％细胞增殖)给出。同时给出了IC50浓度(相对于经HARP刺激的对照，导致细胞增殖抑制50％的浓度)。

图14.NUCANT 3，6和7在经5％FCS刺激的NIH-3T3细胞增殖中的效应。在浓度范围为0.125至2μM的NUCANT 3，6和7存在或不存在的情况下，以5％FCS刺激NIH-3T3细胞。所述NIH-3T3细胞经血清剥夺而成为静止的。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞增殖。结果以相对于经5％FCS刺激的对照细胞的百分率给出。ID₅₀以点线表示。

图15.Nucant 6和Nucant 7比HB19表现出更好的抗表面核仁素活性。ID₅₀：抑制表面核仁素50％的浓度，以μM表示；ID₉₅：抑制表面核仁素95％的浓度，以μM表示。

图16.HB-19、Nucant 3、Nucant 6和Nucant 7对MDA-MB231细胞表达核仁素的抑制效应。MDA-MB231细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中在75cm²培养。培养2天后，以10μM的HB-19(线1)、Nucant 3(线2)、Nucant 6(线3)或Nucant 7(线4)处理分汇合(subconfluent)细胞(每瓶约3 x 10⁶个细胞)24或48个小时。线C代表未经处理的细胞。处理24或48小时后，以PBS洗涤细胞，以10ml含有1％胎牛血清和生物素化的HB-19(5μM)的DMEM在室温下温育45分钟。以含有1mMEDTA的PBS(PBS-EDTA)彻底洗涤后，用含有20mM Tris HCl，pH7.6，150mMNaCl，5mM MgCl₂，0.2mM苯甲基磺酰氟化物，5mMβ-巯基乙醇，抑肽酶(1000U/ml)和0.5％Triton X-100的裂解缓冲液制备胞质提取物。使用PBS-EDTA中的亲和素-琼脂糖(100μl；ImmunoPure Immobilized Avidin，Pierce Chemical Company，USA)从纯化提取物分离表面核仁素和生物素化的HB-19之间形成的复合体。在4℃温育2小时后，亲和素-琼脂糖样品以PBS-EDTA彻底洗涤。这些含有纯化的表面核仁素的样品(A；对应于2 x 10⁶个细胞的材料)和细胞粗提物(B和C；对应于4 x 10⁵个细胞的材料)在含有SDS的电泳缓冲液中变性，通过SDS-PAGE分析。表面核仁素的存在使用D3单克隆抗体(A和B)以免疫杂交显示。C中显示了考马斯蓝染色后的电泳分析。线M对应于分子重量标记物。

图17.体外CAM模型中血管生成的抑制。含有或不含有(对照)HB-19(10μM；0.6μg)或Nucant7(10μM；0.8μg)的20μl水沉淀至CAM表面。温育48小时后进行血管的观测。

图18.HB-19对经各种LPS制备物刺激的人初级外周单核细胞(PBMC)产生TNF-α的抑制。使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬于含有1％人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19不存在(0)或存在(1和5μM)的情况下，以100ng/ml的来自大肠杆菌(Escherichia coli)型0111：B4和055：B5的LPS以及来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型Re 595的LPS刺激浓度为10⁶个细胞/0.5ml的细胞。同样的PBMC以20ng/ml：1μM的PMA：伊屋诺霉素(Ionomycin)(佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯：伊屋诺霉素)刺激。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培养物上清，以ELISA测定TNF-α的水平。

图19.HB-19对经各种LPS制备物刺激的鼠腹膜初级巨噬细胞产生TNF-α和IL-6的抑制。在4μM HB-19不存在(-)或存在(+)的情况下，不刺激(B40)或以浓度为100ng/ml(B4 100)和1000ng/ml(B4 1000)的来自大肠杆菌(Escherichia coli)型0111：B4的LPS刺激鼠腹膜巨噬细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定TNF-α(A)和IL-6(B)的水平。

图20.Nucant 7对经各种LPS刺激的鼠腹膜初级巨噬细胞产生TNF-α和IL-6的抑制。在10μM Nucant 7不存在(-)或存在(+)的情况下，不刺激(-)或以浓度为10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml的来自大肠杆菌(Escherichia coli)型0111：B4的LPS刺激(+)鼠腹膜巨噬细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定TNF-α(A)和IL-6(B)的水平。

图21.HB-19对经LPS刺激的人脐带血管内皮细胞(HUVEC)产生IL-8和表达ICAM-1的抑制。HUVEC细胞以10000个细胞/cm²在96孔板中以含有2％胎牛血清的EBM-2培养液进行培养。在5μM HB-19不存在或存在的情况下，以100ng/ml的大肠杆菌(Escherichia coli)血清型055：B5刺激细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定IL-8和ICAM-1蛋白水平。在5μMHB-19存在或不存在的情况下，HUVEC细胞用作对照，作为基础水平。

图22.HB-19对经热灭活的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(HKSA，热杀死的金黄色酿脓葡萄球菌)刺激的人初级外周单核细胞(PBMC)产生TNF-α和IL-6的抑制。使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬于含有1％人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19、Nucant 3、Nucant 6或Nucant 7(10μM)或***(Dexamethasone)(Dex.1μg/ml)不存在(对照)或存在的情况下，以10⁸个HKSA/ml的颗粒(InvivoGen，San Diego，USA)刺激浓度为10⁶个细胞/0.5ml的细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培养物上清，以ELISA测定TNF-α(A)和IL-6(B)的水平。

实施例

实施例1 五价化合物HB19的抗肿瘤活性

1.1五价化合物HB19对体外肿瘤生长的效应

1.1.1表面核仁素在锚定依赖性细胞增殖中的作用和HB-19对这种增殖的抑制效应

在一系列实验中研究了核仁素在HARP分子的生物活性中的作用：在特异性识别核仁素的单克隆抗体存在或不存在的情况下评估HARP的有丝***活性，所述有丝***活性通过测定NIH 3T3细胞的氚化胸苷的引入而进行测试。结果表明，这个抗体通过剂量依赖性方式在NIH 3T3细胞中抑制HARP的有丝***活性(图3A)。

加入50nM的抗-核仁素抗体完全抑制了来自4nM HARP的有丝***活性，而针对相同同位型的核仁素的非特异性抗体对HARP诱导的增殖没有效应。无论所用的免疫球蛋白浓度如何，总是这样，因此证明了所观测到的抑制的特异性(图3B)。

肽F3和化合物HB19是核仁素的两个配体。肽F3结合至核仁素的N-末端部分(包含酸性氨基酸区域(9))，相反，化合物19结合至位于核仁素的C-末端部分的 RGG结构域(见图1)。也表明了化合物HB19特异性结合至细胞表面不受肽F3存在的影响(本发明人以FACS进行的实验)。

本发明人研究了肽F3和五价化合物HB19是否能够抑制生长因子HARP引发的NIH-3T3细胞的细胞增殖。因此在相同系列实验中，测定了化合物HB19和肽F3的效应(特异性结合至表面核仁素)。

肽F3的结果在图3C中给出，毫不含糊地表明：像IgG抗体一样，肽F3不引起对HARP引发的NIH 3T3增殖的抑制。

HB19的结果在图3D中给出，表明：HB-19引起对HARP引发的NIH 3T3增殖的剂量依赖性抑制。加入0.5μM的HB-19引起对4nM的HARP引发的效应的81％的抑制。这清楚地表明：一个能够内化而带来增殖抑制的核仁素配体是不够的；暗示了：为了有效，核仁素配体必须是多价的并可结合至一个或多个核仁素分子的C-末端结构域的一个或多个RGG单元。

此外，有趣的是，注意到当细胞以各种浓度的HB-19预处理1小时、洗涤然后以HARP刺激时，可观测到水平相当的抑制(图4)。这个结果表明HB-19结合至NIH 3T3上存在的表面核仁素，因此在一个小时后抑制由HARP引发的细胞增殖。

为了研究HB-19对抑制细胞增殖的效应是不是对给定的生长因子例如HARP是特异性的，进行了两个系列实验，其在于：研究HB-19对NIH 3T3细胞的效应，所述NIH 3T3细胞由以下刺激：

-FGF-2，另一个生长因子，或

-含有各种生长因子的混合物的5％胎牛血清。

这些实验的结果表示在图5中，其表明：HB-19在浓度为0.5μM时能够抑制FGF-2(A)或胎牛血清(B)引发的细胞增殖。

因此，结果表明，总的来说，HB-19能够体外抑制肿瘤细胞的增殖。不管所用来引发细胞增殖的试剂是什么，情况都是这样。

1.1.2核仁素在锚定依赖性细胞增殖中的作用和HB-19对这种增殖的抑制效应

与细胞增殖的研究相平行，使用人类乳腺癌细胞系MDA-MB231和鼠黑素瘤细胞系B16-BL6在湿琼脂上以一个生长模型测定了核仁素在锚定非依赖性细胞生长中的作用，和转化细胞的表型特征。

在这些实验中，在各种浓度的对照抗-核仁素抗体、对照免疫球蛋白或化合物HB-19存在或不存在的情况下，在琼脂凝胶上培养细胞。在37℃下温育10天后，对每个培养板上存在的克隆数目计数。如图6所示，以0.1μM抗-核仁素(A)处理的培养物的克隆数目下降60％，而以相同的同位型免疫球蛋白处理的培养物中未发现有效应(B)。

更特别的，相对于对照，也发现了以HB-19处理的培养物中克隆数目的抑制，其为剂量依赖性方式。在以1 μM HB-19处理的培养物中观测到克隆数目减少 59％(图6C)。

使用鼠黑素瘤例如B16-BL6作为靶细胞得到了类似的结果。结果显示于图7。对结果的分析表明：抗-核仁素抗体(A)和HB-19分子(B)都以剂量依赖性方式抑制湿琼脂上B16-BL6的生长。在1μM的HB-19存在下，观测到超过50％的克隆数目的抑制。

这套结果证明：化合物HB-19对锚定非依赖性细胞生长具有抑制效应。这对两个细胞模型，人乳腺癌和鼠黑素瘤都是正确的。

1.2五价化合物HB19对血管生成因子引发的血管生成的效应

鉴于表面核仁素存在于激活的内皮细胞表面(9)，测定了HB-19对内皮细胞分化的效应。

首先，在内皮细胞的体外增殖中测试了这种效应(HUVEC：人脐带血管内皮细胞)。培养每孔20000个HUVEC细胞并在每天加入不同浓度的化合物HB19。处理6天后对细胞计数。结果在图8A中给出，其表明：与Huang等人的文章(16)中所用的抗-核仁素多克隆抗体制备物相反，HB19引起内皮细胞增殖的抑制。

也测定了HB19(1μM)的存在对HUVEC细胞分化的效应，所述HUVEC细胞在HARP血管新生因子(angiogens)(1nM)、VEGF(1nM)和FGF-2(3nM)存在下在三维胶原凝胶培养。4天后，对管网结构计数。结果以任意单位表示于图8B，其表明，HB19也抑制血管生成因子存在下在三维胶原凝胶培养的HUVEC细胞的分化。

最后，在体内血管生成模型中测定了HB-19对内皮细胞分化的效应。这个测试模拟引起血管形成的过程的第一个时期。

这个血管生成实验模型在于，以含有待分析其血管生成刺激或抑制特性物质的matrigel经皮下注射小鼠。1周后除去matrigel，进行组织切片，在免疫组化后以图像分析对内皮细胞(CD31+，因子VIII+)的数目进行定量。如图8中所示，HB-19自身对matrigel中内皮细胞的补充无效应。另一方面，它抑制HARP或FGF-2引发的血管生成。

对结果的分析表明：HB-19能够抑制促血管生成因子例如FGF-2或HARP引发的血管生成。这显示了HB-19(特异性靶向血管生成中相关的内皮细胞)的一般的血管生成效应。

因此，化合物HB19彻底地抑制HARP、VEGF和FGF-2引发的HUVEC细胞的增殖和分化。因此它具有比黄等人的文章(16)所用的抗-核仁素单克隆抗体更加显著的效应。

使用内皮细胞作为抗癌靶细胞具有几个优点。与肿瘤细胞所呈现的遗传不稳定相反，内皮细胞在遗传上是极其稳定的，因此限制了抗性机制。而且，由于分子靶标是表面核仁素，HB-19主要靶向激活的内皮细胞从而靶向那些己进入新血管生成期的。应该注意，肿瘤内皮细胞比正常内皮细胞***快70倍，这就是为何肿瘤内皮细胞是主要的靶点，从而限制了潜在的副作用。

1.3 五价化合物HB19的体内抗肿瘤效应

在无胸腺小鼠的肿瘤生长模型中测试了五价化合物HB-19在体内对肿瘤生长的效应。在本实验中，靶细胞起源自人乳腺癌：MDA-MB231。

以2x10⁶个细胞在腰窝处注射每组4只无胸腺(裸/裸)小鼠。当肿瘤体体积达到至少200mm³时，每两天以100μl的PBS溶液(对照组)或HB-19溶液(5mg/kg)或一种广泛使用的临床试剂它莫西芬(tamoxifen，10mg/kg)注射肿瘤(癌周的或皮下途径)来处理小鼠，或者不处理小鼠。在第7、14、21、28、34和40天以卡钳测量肿瘤体积。

结果在图8中显示，其表明：相对于未处理的对照小鼠(具有7倍大的肿瘤体积)，以5mg/kg的剂量使用肽HB-19引起肿瘤生长的抑制。

此外，尽管经它莫西芬处理的小鼠其肿瘤体积从处理开始没有显著性变化，但是以HB-19处理的小鼠的肿瘤在处理21天后已检测不到(图9A)。虽然它莫西芬在10mg/kg只是引起肿瘤体积的稳定或部分退化，五价化合物HB-19在5mg/kg实际上引起明显的总肿瘤退化。

为了对照这些结果，在处理40天后杀死小鼠，除去肿瘤并称重。未处理的小鼠的平均肿瘤重量为0.22g(分布于0.083-0.34g)，经10mg/kg它莫西芬处理的为0.06g(分布于0.006-0.22g)，以HB-19处理的小鼠中未发现肿瘤(图9B和C)，因此确定了经体外测量大小来估计的肿瘤体积。

在另一个实验中，经腹腔内(IP)途径和癌周(SC)途径使用HB19(5mg/kg)(图10)。结果表明，通过腹腔内(IP)途径和癌周(SC)途径，HB-19的抗癌作用是同样有效的，不仅证明了五价化合物HB-19的末预料到的功效，而且证明了其在体内肿瘤位置的生物可利用率，包括全身使用的情况。

也应该注意，在HB-19处理的过程中，在经处理的小鼠中没有观测到不正常的生理或行为迹象。而且，在实验末尾对器官的解剖学检验没有揭示任何的组织毒性的可见迹象，或者任何的血管和血小板计数上的变化。

此外，在经HB-19处理的异种移植小鼠的外周血细胞中，不可能检测HLA-DR⁺人类细胞(从而检测MDA-MB231肿瘤细胞)(图11)。事实上，与未处理小鼠(PBS)(其中MDA-MB231细胞(HLA-DR⁺)的比例代表外周血细胞的22.2％)相反，在经皮下或腹腔内以HB-19处理的小鼠的情况下，这个比例只有0.1％至0.31％。这些结果暗示，HB-19也能够在血液中防止肿瘤细胞循环，从而防止转移现象。

1.4 结论

实施例2中呈现的结果表明，因为其在肿瘤生长和血管生成上的双效应，五价化合物HB-19是细胞增殖有利的抑制剂。这些观测在体内模型(其表明，在无胸腺小鼠的PC3细胞异种移植模型中，癌周注射HB-19的处理能够诱导肿瘤的抑制甚至是退化)中经过了确认，并且没有组织毒性。

与在癌症治疗中常规使用的处理例如紫杉醇相比，实验模型中所用的HB-19似乎更有效。与它莫西芬相比HB-19这种更强的功效可能来源于HB-19对肿瘤生长和肿瘤增殖所需的血管形成都具有抑制效应。不管是肿瘤细胞还是激活的内皮细胞的情况，HB-19靶向并阻断这两种类型细胞的增殖。

存在很多具有抑制肿瘤细胞增殖特性的细胞。这些分子通常具有效应，而没有细胞靶点。实际上，对于很多化疗试剂，肿瘤细胞中存在的分子靶点也在正常细胞中发现，这就解释了这种治疗的很多副作用。经靶向的生物试剂具有较少的副作用，因为它们阻断的目标不存在于正常细胞中或只是很少地存在于正常细胞中。激活细胞表面存在的核仁素响应这种特性，因此成为癌症治疗中理想的治疗靶点。应着重注意，我们不仅靶向癌细胞而且靶向激活的内皮细胞。而且，表面核仁素似乎不限于一种特定类型的癌症。

双靶向(肿瘤细胞本身和激活的内皮细胞)的功效应该与Genentech所进行的一项研究(其表明，在一个随机试验中，抗增殖试剂(5-氟尿嘧啶)与抗血管生成试剂(阿瓦斯丁(Avastin))结合对人结肠直肠癌的情况有很高的功效)的结果相比较。在III期临床试验中，在以前未经处理的转移的结肠直肠癌个体中，阿瓦斯丁处理作为化疗(依列替康(irinotecan)/5-氟尿嘧啶/亚叶酸(leucovorin))的补充，将生存率显著延长了平均5个月(20.3个月，与15.6个月相比)。在这些病人中发现，与只接受化疗的病人相比，肿瘤不生长的时间长度，从6.2个月增长到10.6个月(29)。

这种对肿瘤细胞和内皮细胞的双效应使HB-19成为癌症治疗中可选择的一种分子。

实施例2.三价化合物Nucant 01的抗肿瘤活性

2.1三价化合物Nucant 01的合成

三价化合物Nucant 01的化学结构在图2B中给出。这个化合物具有环形六肽作为载体，所述环形六肽由交替的D构型的丙氨酸残基(A)和L构型的赖氨酸残基(K)组成。3个KψPR单元(ψ＝CH₂-NH)共价连接至3个赖氨酸残基(K)中的每个的ε氨基基团。

化合物Nucant 01的合成包括将KψPR单元共价连接至三元对称碳环核心分子。核心分子的合成如S.Fournel等人(30)所描述。在氯三苯甲基型树脂上使用根据Fmoc化学的标准固相合成技术组装经保护的KψPR单元，然后在弱酸性条件下从树脂上切割下来。然后，以1.1KψPR/1个环形分子的化学计量学标准将经保护的KψPR单元连接至核心分子的每个赖氨酸残基(K)的εNH2基团。根据BOP/HoBt激活程序进行连接，持续48小时。在反应末尾，在三氟乙酸中切割保护KψPR单元的基团，在醚中沉淀最终的化合物。通过HPLC纯化程序末尾所获得的Nucant 01分子，并以质谱进行完全的描述。

2.2Nucant 01在体外对肿瘤细胞增殖的抑制活性

将Nucant01对经HARP刺激的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合物HB-19进行了比较。在所示浓度(0.1，0.2，0.4，1，2和4μM)的HB19或Nucant 01存在的情况下，不刺激或以4nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定NIH-3T3细胞的增殖，如前所述。

与HB 19和Nucant 01不存在的情况下经HARP刺激的对照(100％细胞增殖)相比较发现，化合物Nucant 01(对于KPR单元只是三价的)在2μM的浓度下也引起对经HARP刺激的NIH-3T3细胞增殖的50％的抑制。因此这个结果证明，具有至少3个接枝到环肽上的通式(I)的假肽单元的合成多价化合物可能和五价化合物HB-19(其载体是直链肽)以同样的方式来抑制由HARP引发的肿瘤细胞的增殖。

所需要的浓度比达到同样水平的抑制所需的HB-19的浓度(0.2μM高10倍，但是化合物Nucant 01只具有3个通式(I)的假肽单元而化合物HB-19具有5个。

因此，增加接枝到环肽上的通式(I)的假肽单元的数目(如Nucant 01中所用)至4或5可能进一步增加该化合物的功效，可能至100倍。

2.3结论

这些结果清晰地表明了通式(I)的假肽单元的多价态形式对本发明中所用化合物的活性的重要性，可使用众多的载体，可使用直链肽或环肽而不影响该化合物的功效。

因此可同样使用其它可接受的载体，只要它们允许至少3个，优选3至8个，优选4至6个，优选5或6个通式(I)的假肽单元接枝到它们上面。

实施例3.五价化合物Nucant 2和Nucant 3的抗肿瘤活性

3.1五价化合物Nucant2和Nucant3的合成

通过固相合成来组装两个已知的采用螺旋面结构的肽载体(其上锚定了KψPR单元)。这些载体由重复的序列单元组成，连接起来5次：对于NUCANT2为Aib-Lys-Aib-Gly，对于NUCANT 3为Lys-Aib-Gly。以Boc化学的方式进行组装。然后通过DMF中的哌啶处理(3次，5分钟)切割来除去侧链上的赖氨酸残基的保护性Fmoc基团。赖氨酸的5个εNH₂基团作为KψPR单元(ψ＝CH₂-N)的支撑点。以氢氟酸进行最后的切割。经过在醚中沉淀肽、在水性条件下分解和冷冻-干燥之后，通过HPLC纯化NUCANT 2和NUCANT 3类似物并以质谱分析，然后冻干。

3.2Nucant 2和Nucant 3在体外对肿瘤细胞增殖的抑制活性

将Nucant 2和Nucant 3对HARP引发的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合物HB-19进行了比较。在所示浓度(0.1，0.25和0.5μM)的HB19、Nucant 2或Nucant3存在的情况下，不刺激或以4nM HARP刺激静止的NIH-3T3细胞。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定NIH-3T3细胞的增殖，如前所述。

在本实验中，HB19抑制的IC50为0.1μM。Nucant 2和Nucant 3以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，其IC50为1.5μM。

因此五价化合物Nucant 2和Nucant 3能够以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，其IC50(引起细胞增殖抑制50％的浓度)与化合物HB19非常类似。

也将Nucant 3对5％FCS处理的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合物HB-19进行了比较。在不同浓度(介于0.125至2μM)的NUCANT 3，6或7存在或不存在的情况下，以5％FCS刺激静止的NIH-3T3细胞(通过血清剥夺来使其静止)。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞的增殖，如前所述。

结果表示于图14中，以相对于经5％FCS刺激的对照细胞的百分率表示。结果表明NUCANT 3对细胞增殖具有抑制效应。对图表的分析表明NUCANT 3具有和HB-19分子相似但比其稍低的ID₅₀值(抑制50％的剂量)，因此其效应比HB-19稍低。没有观察到NUCANT 3对未经刺激的细胞的效应，表明这些分子无任何毒性。

3.3结论

这些结果亦表明通式(I)的假肽单元的多价态形式对本发明中所用化合物活性的重要性，所用载体完全可以是含有或不含有结构元件(β折叠，β片层)的直链肽，具有螺旋面结构的直链肽甚至是环形化合物，而不影响该结构的功效。

因此可互换地使用各种可接受的载体，只要它们允许至少3个，优选3至8个，优选4至6个，优选5或6个通式(I)的假肽单元接枝到它们上面。

实施例4.六价化合物Nucant 6和Nucant 7的抗肿瘤活性

4.1六价化合物Nucant 6和Nucant 7的合成

使用和五价化合物Nucant 2和Nucant 3相同的合成过程获得这些六价化合物。

4.2Nucant 6和Nucant 7在体外对肿瘤细胞增殖的抑制活性

将Nucant 6和Nucant 7对5％FCS处理的NIH-3T3细胞增殖的效应与五价化合物HB-19进行了比较。在不同浓度(介于0.125至2μM)的NUCANT 3，6或7存在的情况下，以5％FCS刺激静止的NIH-3T3细胞(通过血清剥夺来使其静止)。温育24小时后，通过测定氚化胸苷的引入来确定细胞的增殖，如前所述。

结果表示于图14中，以相对于经5％FCS刺激的对照细胞的百分率表示。结果表明NUCANT 6和7对细胞增殖具有抑制效应。NUCANT 6和7具有和HB-19分子相似但比其稍低的ID₅₀值(抑制50％的剂量)，因此其效应比HB-19稍低。没有观察到NUCANT 6或7对未经刺激的细胞的效应，表明这些分子无任何毒性。

4.3结论

这些结果进一步证明通式(I)的假肽单元的多价态形式对本发明中所用化合物的活性的重要性，所用载体完全可以是含有或不含有结构元件(β折叠，β片层)的直链肽，具有螺旋面结构的直链肽甚至是环形化合物，而不影响该结构的功效。

特别地，具有6个假肽单元的形式似乎在获得所需要的抗增殖和抗血管生成方面更加有效。

实施例5 Nucant 6和Nucant 7是比HB-19更强的表面核仁素抑制剂

5.1Nucant 6和Nucant 7是比HB-19更强的抑制剂并且抑制表面核仁素的活性

使用我们以前描述的技术(13)在Hela P4细胞中测定了表面核仁素的活性。

结果表示于图15中，其表明：Nucant 3对表面核仁素活性的抑制与HB-19相当。另一方面，Nucant 6和Nucant 7具有比HB-19更大的抗表面核仁素活性。HB-19和Nucant 3的ID₅₀值(抑制50％的剂量)为介于0.1-0.2μM，而Nucant 6和Nucant 7的ID₅₀值低于0.1μM。此外，Nucant 6和Nucant 7在0.8μM下引起对表面核仁素活性超过95％的抑制。

5.2HB-19，Nucant 3，6和7引起人乳癌细胞MDA-MB231中表面核仁素的抑制

表面核仁素在增殖和肿瘤血管生成中扮演重要角色。HB-19以及相关的分子Nucant 3，Nucant 6和Nucant 7特异性结合至表面核仁素，因此阻断肿瘤生长和血管生成。在这些假肽结合至表面核仁素之后，复合体[假肽-核仁素]通过主动过程被迅速内在化。这些结果显示于图16A中，其表明，与未经处理的细胞相比，以HB-19(线1)、Nucant 3(线2)、Nucant 6(线3)或Nucant 7(线4)处理细胞导致表面核仁素存在的减少。在处理24小时后而且在处理48小时后观察到这个减少，在处理48小时后核仁素已检测不到。

有趣的是，和以HB-19及Nucant 3(线1和2)处理的细胞相比，以假肽Nucant6及Nucant 7(线3和4)处理24小时的细胞中表面核仁素的减少要大得多。在处理48小时后有同样的观测结果。应该着重注意，表面核仁素的减少不是表面核仁素细胞内数量减少的结果。事实上，在未经处理和经HB-19或各种类型的Nucant处理的细胞的提取物中发现了同样数量的核仁素(图16B)。类似地，发现：从未经处理和经HB-19或各种类型的Nucant处理的细胞中提取的蛋白，其电泳图谱没有差异。这个结果表明：蛋白合成不受HB-19或不同类型Nucant研究的影响。此外，有趣的是，HB-19和所研究的各种类型的Nucant没有细胞毒性效应(其可能解释所观测到的表面核仁素的减少)。

5.3结论

这一套结果表明：

a)核仁素在肿瘤细胞表面大量表达，例如在人乳癌细胞(MDA-MB231)中。

b)以HB-19、Nucant 3、Nucant 6和Nucant 7处理引发细胞表面存在的核仁素“库”显著的减少。

c)假肽Nucant 6和Nucant 7对于产生细胞表面存在的核仁素“库”的减少以及抑制表面核仁素活性方面更加有效。

实施例6.HB-19和Nucant 7对血管生成的效应

方法

在体外血管生成模型(鸡胚绒毛***，CAM)中测试了HB-19和Nucant 7对血管生成的效应。

将含有或不含有(对照)HB-19(10μM；0.6μg)或Nucant 7(10μM；0.8μg)的20μl 水沉淀至CAM表面。温育48小时后进行血管的观测。

结果

结果显示于图17中，其表明：温育48小时后HB-19和Nucant 7清晰地引起血管生成的抑制。图像分析研究(不仅考虑毛细血管长度，而且考虑分支的数目)显示了在区域中相对于对照来说50％的抑制。

实施例7.化合物HB 19和Nucant 7的抗炎症活性

7.1HB-19对经LPS刺激的人初级PBMC产生TNF-α的抑制方法

使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬于含有1％人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640。在HB-19不存在(0)或存在(1和5μM)的情况下，以100ng/ml的来自大肠杆菌(Escherichia coli)型0111：B4和055：B5的LPS以及来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型Re 595的LPS刺激浓度为10⁶个细胞/0.5ml的细胞。同样的PBMC以20ng/ml：1μM的PMA：伊屋诺霉素(Ionomycin)(佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯：伊屋诺霉素)刺激。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培养物上清，以ELISA测定TNF-α的水平。

结果

结果(见图18)表明，新鲜分离的PBMC产生TNF-α，这种TNF-α的组成型产生不受HB-19的影响。另一方面，HB-19以剂量依赖性方式抑制PBMC针对各种来自大肠杆菌或肠道沙门氏菌LPS制备物刺激而产生TNF-α。这种效应是特异性的，因为HB-19对于PBMC针对PMA-伊屋诺霉素刺激而产生TNF-α没有效应。

在5μM的HB-19存在下，人PBMC针对各种LPS制备物刺激而产生TNF-α被抑制达到与未经LPS刺激而观察到的基本水平类似的程度。

7.2 HB-19和Nucant 7对经LPS刺激的鼠腹膜初级巨噬细胞产生TNF-α和IL-6的抑制

方法

为了获得经刺激的巨噬细胞，在实验前4天，以1.5ml巯基乙酸盐溶液(3％盐溶液)通过腹腔内注射balb/c小鼠(7-8周龄)。以5ml含有1％胎牛血清的RPMI培养液洗涤腹膜腔来收集巨噬细胞，然后将细胞以RPMI 1640培养液中10⁶个细胞/0.5ml的浓度置于培养板，在37℃下5％CO₂的温育箱中温育，2小时后除去非吸附的细胞。

在4μM HB-19或10μM Nucant 7不存在(-)或存在(+)的情况下，不刺激或以浓度为10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml的来自大肠杆菌(Escherichia coli)血清型0111：B4的LPS刺激巨噬细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定TNF-α和IL-6蛋白的水平。

结果

对于HB-19所获得的结果显示于图19。在4μM的HB-19存在下，鼠腹膜巨噬细胞针对LPS刺激而产生的TNF-α和IL-6被显著性抑制。如果考虑到未经LPS刺激所观测到的基本水平，对TNF-α的净抑制程度为72-75％，对IL-6为68-71％。

对于Nucant 7所获得的结果显示于图20。在10μM的Nucant 7存在下，鼠腹膜巨噬细胞针对LPS刺激而产生的TNF-α和IL-6几乎被完全抑制，因为在经Nucant 7处理的培养物观测到的针对LPS刺激所产生的细胞因子水平与没有LPS中所观测到的相类似。

如果考虑到未经LPS刺激所观测到的基本水平，10μM的Nucant 7对经10，100和1000ng/ml LPS刺激的培养物的抑制程度超过95％。LPS浓度为100倍大的情况下抑制程度没有变化，这一事实意味着Nucant 7的抑制机理主要是由于结合至表面核仁素。实际上，如果Nucant 7抑制的机理是与LPS相互作用，则100ng/mlLPS的情况会比10ng/ml LPS的情况抑制效应低。

7.3HB-19对经LPS刺激的HUVEC细胞产生IL-8和表达ICAM-1的抑制方法

HUVEC细胞以10000个细胞/cm²在96孔板中以含有2％胎牛血清的EBM-2培养液进行培养。在5μM HB-19不存在或存在的情况下，以100ng/ml的来自大肠杆菌(Escherichia coli)血清型055：B5的LPS刺激细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育细胞培养物20小时。以ELISA测定IL-8和ICAM-1的水平。在5μMHB-19不存在或存在的情况下HUVEC细胞用作对照作为基础水平。

结果

如果考虑到未经LPS刺激所观测到的基本水平，5μM HB-19对IL-8和ICAM-1产生的抑制程度为大约50％。因此这些结果证明了HB-19和相关的Nucant类型的化合物作为IL-8和ICAM-1产生抑制剂的潜在的功效(见图21)。

7.4HB19对经灭活的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激的人初级PBMC产生TNF-α的抑制

金黄色酿脓葡萄球菌感染被证明是引起心内膜炎的主要因素之一(24，25)。

因此本发明人测定了在10μM的化合物HB-19、Nucant 3、Nucant 6或Nucant7不存在(对照)或存在的情况下，人初级PBMC培养物针对热灭活的金黄色酿脓葡萄球菌(HKSA，热杀死的金黄色酿脓葡萄球菌)而产生的TNF-α和IL-6的水平。作为阳性对照(Dex.)，也使用***(Dexamethasone，已知的具有抗炎和免疫抑制活性的糖皮质激素)处理PBMC。

方法

使用人全血EDTA-钾通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC并重悬于含有1％人血清AB(Invitrogen)的RPMI 1640培养液。在HB-19，Nucant 3，Nucant 6或Nucant7(10μM)或***(Dexamethasone)(1μg/ml)不存在(对照)或存在的情况下，以10⁸个HKSA/ml的颗粒(InvivoGen，San Diego，USA)刺激浓度为10⁶个细胞/0.5ml 的细胞。在37℃下5％CO₂的温育箱中温育PBMC培养物。温育20小时后收集培养物上清，以ELISA测定TNF-α和IL-6蛋白的水平。

结果

结果显示于图22，其表明：所有测试的假肽(HB-19、Nucant 3、Nucant 6和Nucant 7)都可能获得对经热杀死的金黄色酿脓葡萄球菌刺激而产生TNF-α和IL-6的显著性抑制。假肽与标准抗炎治疗例如***同样有效。

因此通式(I)的假肽例如HB-19、Nucant 3、Nucant 6和Nucant 7也可用于治疗心脏发炎，特别是用于治疗由感染起源的心内膜炎。

7.5结论

因此本发明人获得的结果表明，化合物HB-19和Nucant 7能够抑制各种类型的细胞针对LPS刺激而产生促炎性细胞因子例如TNF-α和IL-6，以及同时抑制各种类型的细胞针对LPS刺激而产生趋化因子IL-8和黏附分子ICAM-1。

此外，这些化合物也引起针对金黄色酿脓葡萄球菌(引起由感染起源的各种形式的心内膜炎的一种试剂)刺激而产生促炎性细胞因子例如TNF-α和IL-6的显著性抑制。

因此，本发明所描述的这些化合物以及相关的通式(I)的化合物能够抑制促炎性细胞因子和发炎位置白细胞补充所涉及分子的产生。因此这些化合物可用于抗炎症用途，特别是用于治疗一般描述中提及的各种疾病。

参考文献

1.Hovanessian，A.G.，Puvion-Dutilleul，F.，Nisole，S.，Svab，J.，Perret，E.，Deng，J.S.，and Krust，B.The cell-surface-expressed nucleolin is associated with theactin cytoskeleton.(2000)Exp.Cell Res.261，312-328

2.Nisole，S.，Krust，B.，Callebaut，C.，Guichard，G.，Muller，S.，Briand，J.P.，andHovanessian，A.G.The anti-HIV composé HB-19 forms a complex with thecell-surface-expressed nucleolin independent of heparan sulfate proteoglycans.(1999)J.Biol.Chem.274，27875-27884

3.Ginisty，H.，Sicard，H.，Roger，B.，and Bouvet，P.Structure and functions ofnucleolin.(1999)J.Cell Science 112，761-772

4.Srivastava，M.，and Pollard，H.B.Molecular dissection of nucleolin′s role ingrowth and cell proliferation:new insights.(1999)FASEB J.13，1911-1922

5.Nisole，S.，Krust，B.，and Hovanessian，A.G.Anchorage of HIV on permissivecells leads to coaggregation of viral particles with surface nucleolin atmembrane raft microdomains.(2002)Exp.Cell Res.276，155-173

6.Semenkovich，C.F.，Ostlund，R.E.J.，Olson，M.O.，and Yang，J.W.A proteinpartially expressed on the surface of HepG2cells that binds lipoproteinsspecifically is nucleolin.(1990)Biochemistry 29，9708-9713

7.Callebaut，C.，Jacotot，E.，Krust，B.，Guichar，G.，Blanco，J.，Svab，J.，Muller，S.，Briand，J.P.，and Hovanessian，A.G.Composé TASP inhibitors of HIV entry bind specifically to a95-kDa cell surface protein.(1997)J.Biol.Chem.272，7159-7166

8.Callebaut，C.，Blanco，J.，Benkirane，N.，Krust，B.，Jacotot，E.，Guichard，G.，Seddiki，N.，Svab，J.，Dam，E.，Muller，S.，Briand，J.P.，and Hovanessian，A.G.Identification of V3 loop-binding proteins as potential receptors implicated inthe binding of HIV particles to CD4(+)cells.(1998)J.Biol.Chem.273，21988-2199

9.Christian，S.，Pilch，J.，Akerman，M.E.，Porkka，K.，Laakkonen，P.，andRuoslahti，E.Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelialcells in angiogenic blood vessels.(2003)J.Cell Biol.163，871-878

10.Said，A.E.，Krust，B.，Nisole，S.，Briand，J.P.，and Hovanessian，A.G.Theanti-HIV cytokine midkine binds the cell surface-expressed nucleolin as a lowaffinity receptor.(2002)J.Biol.Chem.277，37492-37502

11.Said，E.A.，Courty，J.，Svab，J.，Delbé，J.，Krust，B.，and Hovanessian，A.G.Pleiotrophin inhibits HIV infection by binding the cell surface-expressednucleolin.(2005)FEBS J.272，4646-4659

12.Legrand，D.，Vigie，K.，Said，E.A.，Elass，E.，Masson，M.，Slomianny，M.C.，Carpentier，M.，Briand，J.P.，Mazurier，J.，and Hovanessian，A.G.Surfacenucleolin participates in both the binding and endocytosis of lactoferrin in targetcells.(2004)Eur.J.Biochem.271，303-317

13.Nisole，S.，Krust，B.，Dam，E.，Blanco，A.，Seddiki，N.，Loaec，S.，Callebaut，C.，Guichard，G.，Muller，S.，Briand，J.P.，and Hovanessian，A.G.The HB-19composé 5[Kpsi(CH2N)PR]-TASP inhibits attachment of T lymophocyte-andmacrophage-tropic HIV to permissive cells.(2000)AIDS Res.Hum.Retroviruses 16，237-249

14.Nisole，S.，Said，E.A.，Mische，C.，Prevost，M.C.，Krust，B.，Bouvet，P.，Bianco，A.，Briand，J.P.，and Hovanessian，A.G.The anti-HIV pentameric composéHB-19 binds the C-terminal end of nucleolin and prevents anchorage of virusparticles in the plasma membrane of target cells.(2002)J.Biol.Chem.277，20877-20886

15.Bates，P.J.，Kahlon，J.B.，Thomas，S.D.，Trent，J.O.，and Miller，D.M.Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides correlates with proteinbinding.(1999)J.Biol.Chem.274，26369-26377

16.Huang Y，Shi H，Zhou H，Song X，Yuan S，Luo Y.The angiogenesis function ofnucleolin is mediated by vascular endothelial growthfactor and nonmusclemyosin.(2006)Blood 107，3564-3571.

17.Seko Y，Cole S，Kasprzak W，Shapiro BA，Ragheb JA.The role of cytokinemRNA stability in the pathogenesis of autoimmune disease.Autoimmun Rev2006；5：299-305.

18.Rot A.Neutrophil attractant/activation protein-1(intrleukin-8)induces in vitroneutrophil migration by haptotactic mechanism.Eur J Immunol1993；23：303-06.

19.Elass E，Masson M，Mazurier J，Legrand D.Lactoferrin inhibits thelipposaccharaide-induced expression and proteoglycan-binding ability of IL-8in human entothelial cells.Infect Immun 2002；70：1860-66.

20.Kevil CG，Patel RP，Bullard DC.Essential role of ICAM-1 in mediatingmonocyte adhesion to aortic endothelial cells.Am J Physiol Cell Physiol 2001；281：C1442-47.

21.Bucklin SE，Silverstein R，Morrison DC.An interleukin-6-induced acute-phaseresponse does not confer protection against lipopolysaccharide lethality.InfectImmun 1993；61：3184-89.

22.Karima R，Matsumoto S，Higashi H，Matsushima K.The molecularpathogenesis of endotoxic shock and organfailure.Mol Med Today 1999；5：123-32.

23.Zanotti S，Kulmar A，Kumar A.Cytokine modulation in sepsis and septic shoc k.Expert Opin Investig Drugs2002；11：1061-75.

24.Alter，P，Hoeschen，J.，Ritter，M.，Maisch，B.Usefulness of cytokinesinterleukin-6 and interleukin-2R concentrations in diagnosingactive infectiveendocarditis involving native valves.(2002)Am.J.Cardiol.89，1400-1404

25.Shun，C.T.，Lu，S.Y.，Yeh，C.Y.，Chaing，C.P.，Chia，J.S.，Chen，J.Y.Glucosyltransferases of viridans streptococci are modulins of interleukin-6induction in infective endocarditis.(2005)Infec.Immun.73，3261-3270.

26.Kannan K，Ortmann RA，Kimpel D.Animal models of rheumatoid arthritis andtheir relevance to human disease.Pathophysiology 2005；12：167-81.

27.Peifer C，Wagner G，Laufer S.New approaches to the treatment of inflammatorydisorders small molecule inhibitors of p38 MAP kinase.Curr Top Med Chem2006；6(2)：113-49 2006；6：113-49.

28.Kabbinavar，F.，Hurwitz，H.I.，Fehrenbacher，L.，Meropol，N.J.，Novotny，W.F.，Lieberman，G.，Griffing，S.，and Bergsland，E.Phase II，randomized trialcomparing bevacizumab plus fluorouracil(FU)/leucovorin(LV)with FU/LValone in patients with metastatic colorectal cancer.(2003)J Clin Oncol 21，60-65.

29.Hurwitz，H.I.New agents in colon cancer.(2003)Clin Adv Hematol Oncol 1，404-405

30.Fournel，S.et al.C3-symmetric peptide scaffolds are functional mimetics oftrimeric CD40L.(2005)Nat Chem Biol1，377-382.