CN101450206A - 大肠埃希氏菌k88、k99、987p纤毛亚单位油乳剂疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种是用于预防仔猪黄痢的大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗的生产方法，本发明是用分别生长K88、K99、987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌，接种于适宜培养基培养，提取生长于菌体表面的纤毛抗原，与油佐剂混合乳化制成。用于预防由大肠埃希氏菌引起的新生仔猪腹泻病(即仔猪黄痢)。本发明采用新型设备和新的工艺参数，实现了三种纤毛抗原的高效、快速提取，免疫效力比普通铝胶佐剂疫苗高3～5倍。

Description

大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗的生产方法

技术领域 本发明涉及一种用于预防仔猪黄痢的大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术 仔猪黄痢是由特定O抗原型的致病性大肠埃希氏菌(E.coli)引起的初生仔猪的以下痢为特征的传染病。该病主要导致1周龄内(主要是1～3日龄)仔猪发病，以排出黄色水样粪便和渐进性死亡为特征，是影响规模化种猪场和农村散养猪仔猪成活率的重要疾病(Salajka E，et al..Colonization factor different from K88，K99，F41，and987P inenterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from postweaningdiarrhoea in pigs.VetMicrobiol，1992，32(2)：163；逢媛，等.仔猪腹泻性大肠杆菌基因工程疫苗的研究进展.上海畜牧兽医通讯，2007，(5)：2-3)。

致仔猪黄痢的致病性大肠埃希氏菌的致病力主要由粘附素性纤毛和肠毒素两类毒力因子构成，二者密切相关且缺一不可。己发现猪大肠埃希氏菌的的纤毛主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)以及比例较小的F41。纤毛是一种蛋白质，具有良好的免疫原性，以含单价或多价纤毛抗原的灭活全菌疫苗或亚单位疫苗对妊娠母猪进行免疫，可使仔猪从初乳中获得抗仔猪黄痢的被动保护力(袁万哲等.仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制V.疫苗生产与免疫效力试验.中国兽医学报，2007，27(6)：818-821；Gill P，Purchid V D.Identification of K88 fimbriae of E.coli associated with piglet diarrhea.Indian Journal of Comparative Microbiology Immunology and InfectiveDiseases，1999，20(2)：126-128；JinL Z，et al..Inhibition ofenterotoxingenic Escherichia coli K88，K99 and 987p by the Lactobacillusisolates from porcine intestine.Journal of the Science of Food andAgriculture，2000，80(5)：619-624)。

发明内容

本发明的目的是由大肠埃希氏菌分别提取出F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)三种纤毛抗原按一定比例混合，然后与油佐剂进行乳化制成大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗，用于预防仔猪黄痢。

大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗的生产方法，主要是：

1.按发酵罐容积70％(V/V)加入改良Minca液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30min，待培养基温度降至35～37℃，按3％(V/V)向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35％，培养5～7h分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液。

2.各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30min，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25min分别进行各纤毛抗原的提取。

3.按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液。

4.按常规方法制备成油乳剂疫苗。

具体实施方式

一、疫苗制备

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将表达K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌菌种C83549菌种接种到改良Minca液体培养基(每1000ml该培养基含：KH₂PO₄ 1.36g，Na₂HPO₄·12H₂O 20.3g，酵母粉1g，酪蛋白胨5g，甘油5ml，微量盐液1ml，固体培养基另加琼脂粉15g。其中微量盐溶液配方为每1000ml含：MgSO₄·2H₂O 10g，MnCl₂·4H₂O 1g，FeCl₂·6H20 0.135g，CaCl₂·2H₂O 0.4g)，37℃振荡培养6～10h后，转接到改良Minca固体培养基平板划线分离，36～37℃培养20h，用低倍镜选取光滑圆整的单个菌落若干，分别接入改良Minca液体培养基，37℃振荡培养16h，用相应的(K88、K99、987P)纤毛抗血清(购自于中国兽医药品监察所)平板凝集反应达“++++”，纯检合格，按培养物量的10％(V/V)加入甘油混匀，分装于灭菌小试管中，作为一级种子。用同样方法分别制备表达K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株和表达987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的一级种子。分别作好标记(注明名称、代次、分装量、日期等)，在-20℃保存，使用期不超过6个月。

(2)二级种子繁殖取以上制备的各一级种子直接接种改良Minca固体培养基平板，36～37℃培养20小时，选取光滑圆整菌落，用相应的纤毛抗血清逐个做平板凝集反应，选取“++++”的菌落若干个后混合接入改良Minca液体培养基，37℃摇振培养16h，以相应的因子血清做平板凝集反应，凝集反应达到“++++”，纯检合格，即可用于接种。在2～8℃保存，应不超过7天。

2.菌液培养采用发酵培养法分别培养C83549、C83644、C83710菌株菌液。生产工艺流程如下：按发酵罐容积70％加入改良Minca液体培养基，同时按培养基0.1％加入花生油，通入高温蒸汽灭菌30min，待培养基温度降至35～37℃，按3％向发酵罐中加入二级种子，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35％，发酵培养5～7h。取小量样品进行染色镜检，无杂菌污染后，以相应型纤毛抗血清进行玻板凝集观察纤毛生长情况，检验合格(凝集相在“+++”以上)后，菌液经管式离心机离心，菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。

3.各菌株发酵培养菌液经管式离心机(CQ105型，湘潭离心机有限公司生产)，10000r/min离心30min，分别收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。对重悬菌液中的K88、K99、987P纤毛抗原按以下条件进行提取：C83549株悬液、C83710株悬液在60℃水浴条件下，以剪切机5000r/min剪切20min，C83644株悬液在65℃水浴条件下，以剪切机6000r/min剪切20min。处理菌悬液经连续流离心机(CR22G，日本日立公司生产)，16000r/min离心30min，收集上清液，再经无菌0.22μm纤维膜过滤除菌，置2～8℃保存备用(纤毛抗原的电泳图见附图1)。

4.根据菌毛液的抗原单位高低不同，计算出三种菌毛液的配比量，按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液。

培养物中(K88、K99、987P)纤毛抗原含量的测定按以下方法进行：取试管若干支，第一管加入生理盐水2ml，其余各管加入生理盐水0.5ml，向第1管中加入待检菌悬液0.5ml进行5倍稀释，然后从第2管开始对待检菌悬液进行1.25倍比系列稀释。向所有试管中加入4个单位纤毛抗血清0.5ml，混匀后置38℃水浴2小时，取出以3000r/min离心30分钟，吸出上清0.5ml移入新的试管中，同时设生理盐水对照、因子血清对照和待检菌悬液对照。向所有试管中加入指示抗原0.5ml，混匀后置2～8℃过夜后按以下公式计算待检菌悬液纤毛抗原单位值。

计算公式应为：

待检菌悬液纤毛抗原单位值＝(“-”稀释倍数+“+”稀释倍数)×2

5.疫苗制备

(1)水相配制取灭菌的吐温-804份、无菌检验合格的混合纤毛液96份，加入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝2份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，152℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3000r/min搅拌30min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.005％。乳化后，取样3～5ml，以3000r/min离心15min，若有分层现象，应重新乳化30min。

(4)分装定量分装，加盖密封。

二、疫苗的安全试验

1.仔猪大肠埃希氏菌病三价纤毛疫苗对靶动物和非使用日龄动物的一次单剂量接种的安全性试验

将购自山东青岛某良种猪场的断奶前3～5天健康仔猪、配种前7天母猪和产前7天的怀孕初产母猪各分成4组，每组10头，前3组为疫苗免疫试验组，每组分别用由本发明人试制的大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗01、02、03批用颈部肌肉注射，2ml/头的剂量各免疫1组，第4组为非免疫对照组。观察免疫过后2周内，试验猪有无过敏，精神、饮食、粪便有无变化，注射部位有无红肿、溃烂现象，仔猪增重或母猪产子情况是否正常。结果试验猪均无过敏，精神、饮食、粪便无变化，注射部位无红肿、溃烂现象，仔猪增重或母猪产子情况均正常。详见表1、表2、表3。

表1 断奶前3～5天健康仔猪一次单剂量接种安全性试验结果

表2 配种前7天母猪一次单剂量接种安全性试验结果

表3 产前7天母猪一次单剂量接种安全性试验结果

2.对产前35天怀孕母猪的一次超剂量接种安全试验

用本发明人试制的3批(01、02和03)大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗对购自山东青岛某良种猪场产前35天怀孕母猪进行颈部肌肉两点注射，4ml/头，观察疫苗接种对免疫猪的安全性。结果表明，试制的3批疫苗对免疫猪无明显影响，免疫猪无过敏现象，注射部位不红肿，免疫猪的精神、饮食及产仔均正常，说明我们试制的疫苗一次超剂量接种怀孕母猪是安全的。详见表4。

表4 怀孕猪一次超剂量接种安全性试验结果

3.单剂量重复接种安全试验

用本发明人试制的3批(01、02和03)大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗对购自山东青岛某良种猪场产前42天怀孕母猪分别于产前42、35天进行颈部肌肉单剂量重复接种，1头份/头/次，观察疫苗接种对免疫猪的安全性。结果表明，试制的3批疫苗对免疫怀孕母猪均无明显影响，免疫猪无过敏现象，注射部位不红肿，免疫猪的精神、饮食及产仔均正常，说明我们试制的疫苗重复接种怀孕母猪是安全的。详见表5。

表5 怀孕猪单剂量重复接种安全性试验结果

4.疫苗接种对靶动物免疫学功能的影响

用本发明人试制的3批(01、02和03)大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗对购自山东青岛某良种猪场产前35天怀孕母猪进行免疫接种，同时注射猪瘟活疫苗(购自乾元浩南京生物药厂)，分组免疫后2周采血分离血清用购自中国农科院兰州兽医研究所的猪瘟间接血凝诊断试剂盒测定猪瘟间接血凝效价。结果表明注射猪瘟活疫苗同时注射大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗组与单独注射猪瘟活疫苗组的平均效价差别不明显，说明该疫苗对靶动物的免疫学功能没有明显影响。观察疫苗接种对免疫猪免疫学功能的影响(结果见表6)

表6 疫苗接种对靶动物免疫学功能的影响试验结果

5.疫苗接种对靶动物生产性能的影响

用本发明人试制的3批(01、02和03)大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗对购自山东青岛某良种猪场产前35天怀孕母猪进行免疫接种，颈部肌肉注射2ml，结果表明试验猪疫苗注射部位没有红肿现象，精神没有受到影响，饮食正常，活动正常，母猪在生产过程中，无流产、弱仔等现象，试验母猪所产仔猪体健活泼，无弱仔。第4组作为非免疫对照。结果详见表7。

表7 疫苗接种对怀孕母猪生产性能的影响

三、疫苗免疫剂量和攻毒保护试验

用发明人制备的大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗(01批)，按0.125ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml不同剂量免疫购自青岛平度市某良种猪场的产前35～42天左右的初产怀孕母猪，生产的仔猪正常哺乳至6～12小时后，同对照一起，分别口服相应免疫疫苗型的攻毒菌株[大肠埃希氏菌菌株C83902(K88)、C83912(K99)、C83917(987P)株均购自中国兽医药品监察所]新鲜培养物5ml(含菌量为6～8×10⁹CFU/ml)，观察7天内攻毒仔猪和对照仔猪的大肠埃希氏菌性下痢的发生和致死情况，以及体重增加情况。结果表明，与对照组相比，疫苗免疫母猪所产仔猪能显著提高对强毒菌株的保护率。其中K88免疫攻毒组，0.125ml、0.25ml免疫的初产母猪所产仔猪在强毒攻击时，分别出现不同程度的致死率、致病率和增重缓慢现象，而0.5ml、1.0ml免疫的初生母猪所产仔猪能够100％抵抗强毒菌液的攻击，没有出现死亡或者下痢，而且增重正常，因此三价灭活疫苗对K88纤毛的最小免疫量为0.5ml；根据试验结果，K99、987P纤毛的最小免疫量均为0.5ml(详见表8)。

表8 不同抗原含量单价苗攻毒保护试验结果

a：总计      b：平均增重

四、子代通过母源抗体获得被动免疫力的效力和免疫期试验

用本发明人制备的大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛亚单位油乳剂疫苗(02批)免疫购自青岛平度市某良种猪场的产前35～42天健康怀孕(母猪血清中三种纤毛抗体的间接血凝效价均小于3(log2))，母猪产子后，将正常哺乳仔猪分组后交替采血分离血清，从1日龄采血至7日龄，测定仔猪血清中特异性抗K88、K99、987P菌毛抗体平均效价(用青岛易邦生物工程有限公司技术中心提供的三种纤毛抗体的间接血凝检测试剂进行检测)。

结果表明，免疫母猪所产的仔猪在吮吸母猪后12小时，血清中三种纤毛的抗体于对照仔猪相比即有明显上升，K88、K99、987P纤毛抗体平均效价分别达到了8.1(log2)、6.3和9.4(log2)，而对照仔猪三种纤毛的抗体效价均≤2(log2)，至24小时，达到最高，K88、K99、987P纤毛抗体平均效价分别达到了11.5(log2)、10.6(log2)和11.7(log2)，可维持至第4日龄，此后抗体水平开始下降，至第7、10天抗体水平仍可以检测到。结果详见表9。

表9 仔猪血清3种菌毛间接血凝(log2)抗体平均效价检测结果

同时分别对正常哺乳的出生12小时、1日龄、2日龄、3日龄、4日龄、5日龄、6日龄、7日龄、10日龄仔猪分别口服相应效检强毒菌株C83902株、C83912株、C83917株新鲜培养物5ml(含菌量为6～8×10⁹CFU/ml)进行强毒攻击，每个型每次至少选择4头仔猪攻毒，同时选择4头相同条件的非免疫母猪所产仔猪同时攻毒作为对照。观察攻毒仔猪下痢和致死情况。攻毒试验表明，疫苗免疫后传递给子代的被动免疫力可以保护仔猪在整个哺乳期内不发病(结果详见表10)。

表10 被动免疫仔猪攻毒保护试验结果

注：表中分子表示攻毒后被保护仔猪数，分母表示攻毒仔猪总数。

五、疫苗成品检验

(1)性状

外观 乳白色乳液。

剂型 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应呈油滴状不扩散。

稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5ml。

粘度 用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)吸取25℃左右疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，应在6s以内。

(2)无菌检验按《中华人民共和国兽药典》方法进行，应无菌生长。

(3)安全检验取体重20kg左右健康仔猪4头，每头颈部肌肉注射4ml，观察14日，应无明显的不良反应。

(4)效力检验取成品疫苗5～10ml，于-20℃反复冻融8次，以3000r/min离心15min，取管底析出的水相测定K88、K99、987P三种纤毛的抗原单位，以析出的水相中，K88纤毛抗原≥300个抗原单位/ml、K99纤毛抗原≥150个抗原单位/ml、987P纤毛抗原≥150个抗原单位/ml为合格。

(5)汞类防腐剂含量测定按《中华人民共和国兽药典》方法进行，应符合兽用生物制品通则的规定。

六、疫苗的作用与用途

用于免疫妊娠母猪，新生仔猪通过吮吸母猪的初乳而获得被动免疫。预防初生仔猪大肠埃希氏菌病(即仔猪黄痢)。

七、用法与用量

颈部肌肉注射，妊娠母猪在产仔前35～42日免疫，2ml/头。

本发明的积极意义：本发明相对于传统的预防仔猪黄痢的纤毛化菌体灭活的铝胶疫苗或K88、K99基因工程疫苗，具有用量少、免疫效力高、免疫期长等优点。

附图说明

图1是本发明实施后，K88、K99、987P纤毛提取的SDS-PAGE电泳图。

图2是本发明研制疫苗的标签。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1.生产用种子制备

(1)一级种子繁殖与鉴定将表达K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌菌种C83549菌种接种到改良Minca液体培养基(每1000ml该培养基含：KH₂PO₄ 1.36g，Na₂HPO₄·12H₂O 20.3g，酵母粉1g，酪蛋白胨5g，甘油5ml，微量盐液1ml，固体培养基另加琼脂粉15g。其中微量盐溶液配方为每1000ml含：MgSO₄·2H₂O 10g，MnCl₂·4H₂O 1g，FeCl₂·6H20 0.135g，CaCl₂·2H₂O 0.4g)，37℃振荡培养6～10h后，转接到改良Minca固体培养基平板划线分离，36～37℃培养20h，用低倍镜选取光滑圆整的单个菌落若干，分别接入改良Minca液体培养基，37℃振荡培养16h，与相应纤毛抗血清的平板凝集反应达“++++”，纯检合格，按培养物量的10％(V/V)加入甘油混匀，分装于灭菌小试管中，作为一级种子。用同样方法分别制备表达K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株和表达987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的一级种子。分别作好标记(注明名称、代次、分装量、日期等)，在-20℃保存，使用期不超过6个月(参见表11)。

表11 一级种子

(2)二级种子繁殖取以上制备的各一级种子直接接种改良Minca固体培养基平板，36～37℃培养20小时，选取光滑圆整菌落，用00相应的因子血清逐个做平板凝集反应，选取“++++”的菌落若干个后混合接入改良Minca液体培养基，37℃摇振培养16h，以相应的纤毛抗血清做平板凝集反应，凝集反应达到“++++”，纯检合格，即可用于接种。在2～8℃保存，应不超过7天(参见表12)。

表12 二级种子

2.菌液培养采用发酵培养法分别培养C83549、C83644、C83710菌株菌液。生产工艺流程如下：按发酵罐容积70％加入改良Minca液体培养基，同时按培养基0.1％加入花生油，通入高温蒸汽灭菌30min，待培养基温度降至35～37℃，按3％向发酵罐中加入二级种子，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35％，发酵培养5～7h。取小量样品进行染色镜检，无杂菌污染后，以相应型纤毛抗血清进行玻板凝集观察纤毛生长情况，检验合格(凝集相在“+++”以上)后，菌液经管式离心机离心，菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中(参见表13)。

表13 发酵培养和收获

3.混合纤毛液的制备各菌株发酵培养菌液经管式离心机(CQ105型，湘潭离心机有限公司生产)10000r/min离心30min，分别收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。对重悬菌液中的K88、K99、987P纤毛抗原按以下条件进行提取：C83549株悬液、C83710株悬液在60℃水浴条件下，以剪切机5000r/min剪切20min，C83644株悬液在65℃水浴条件下，以剪切机6000r/min剪切20min。处理菌悬液经连续流离心机(CR22G，日本日立公司生产)，16000r/min离心30min，收集上清液，再经无菌0.22μm纤维膜过滤除菌，置2～8℃保存备用(参见表14)。

表14 菌毛提取、过滤和效价测定

 

纤毛液种类	纤毛液体积(ml)	滤后体积(ml)	效价(抗原单位/ml)
				K88纤毛液	700	680	5112
K99纤毛液	680	640	2095
				987P纤毛液	730	690	4090

根据菌毛液的抗原单位高低不同，计算出三种菌毛液的配比量，按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液。

4.疫苗配制(参见表15)

(1)水相配制 取灭菌的吐温-804份、无菌检验合格的混合纤毛液96份，加入配液罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌至吐温-80完全溶解。

(2)油相制备 取注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝2份加入油相制备罐中，开启搅拌电机，匀速搅拌，同时开启导热油开关，152℃加热30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(3)乳化 取油相2份置于乳化罐内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3000r/min搅拌30min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.005％。

(4)分装 定量分装，加盖密封。

表15 疫苗乳化和分装

实施例2

疫苗成品检验

(1)性状 外观呈乳白色乳液。将疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散。流出0.4ml时间为：4.9秒。3000r/min离心15min，不分层。

(2)无菌检验按《中华人民共和国兽药典》方法进行，无菌生长。

(3)安全检验取体重20kg左右健康仔猪4头，每头颈部肌肉注射4ml，连续测量体温观察14日，0/4出现局部、全身反应或其它不良反应。

(4)效力检验取1ml成品疫苗，于-20℃反复冻融3次，以3000r/min离心15分钟，取管底析出的水相测定K88、K99、987P三种纤毛的抗原单位。结果：K88：327个抗原单位/ml、K99：167个抗原单位/ml、987P：167个抗原单位/ml。

(5)汞类防腐剂含量测定按《中华人民共和国兽药典》方法进行，硫柳汞含量为0.009％。

Claims (4)

1.一种预防仔猪黄痢的K88、K99、987P纤毛亚单位疫苗的生产方法，其特征在于包括一下几个步骤：

1)按发酵罐容积70％(V/V)加入改良Minca液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30min，待培养基温度降至35～37℃，按3％(V/V)向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35％，培养5～7h分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液；

2)各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30min，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25min分别进行各纤毛抗原的提取；

3)按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液；

4)按常规方法制备成油乳剂疫苗。

2.如权利要求1所述一种预防仔猪黄痢的K88、K99、987P纤毛亚单位疫苗的生产方法，其特征在于含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按温度58～60℃、剪切强度5000～5500r/min、剪切时间20～25min进行提取。

3.如权利要求1所述一种预防仔猪黄痢的K88、K99、987P纤毛亚单位疫苗的生产方法，其特征在于含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按温度58～60℃、剪切强度5000～5500r/min、剪切时间20～25min进行提取。

4.如权利要求1所述一种预防仔猪黄痢的K88、K99、987P纤毛亚单位疫苗的生产方法，其特征在于含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按温度60～65℃、剪切强度5500～6000r/min、剪切时间20～25min进行提取。

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