CN101446574A - 人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法，其特征在于包括：采用同位素稀释技术，在尿样的预处理时分别加入含13C3；15N3－三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3；15N3－三聚氰酸的内标溶液；液－液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC－MS/MS方法分别定量检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸浓度，液相色谱以苯基、氟苯基、硅胶等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离进行等度洗脱或梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源(ESI)检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可达10ng/ml。本方法的样品处理经济、简便，检测专一性强、灵敏度高，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求。

Description

人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用(液相色谱串联质谱技术)定量检测方法。

背景技术

三聚氰胺(Melamine，2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，分子式C₃N₃(NH₂)₃，分子量126.12。结构式为：

三聚氰胺遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸：

由于蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30％，而三聚氰胺的分子式(C₃N₆H₆)含氮量为66.7％。现阶段通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”，是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，不法分子在食品中添加三聚氰胺使得食品的蛋白质测试含量上升。1978年Newton和Utley发现三聚氰胺具有这种作用，近期曝光的三鹿婴幼儿奶粉中含有大量三聚氰胺也是基于同样的缘由。

毒性学研究表明三聚氰胺在体内的毒性非常微弱，大鼠口服的LD₅₀(半数致死量)为3161mg/kg。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片指出：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。动物实验表明三聚氰胺在尿内形成草酸钙结晶，与泌尿***结石有明显的关联性，并可引起肾功能衰竭，导致动物死；近期在我国所发生婴儿死亡事件也支持这种观点。

据报道，三聚氰胺在不同物种中代谢存在差异。其在猪体内的其半衰期大约为4.04±0.37h，是老鼠体内(2.71h)的1.5倍，其原因为老鼠的肾脏清除率是猪的5倍。三聚氰胺在体内的清除机制并不明确，但是根据其作为极性小分子的理化性质，以及猪体内的清除率(27ml/min)和肾小球滤过率(31-42ml/min)，可以认为主要经肾脏清除。雄性Fischer大鼠的毒代研究表明，24h 90％的口服剂量在尿中清除，28小时已经超过99％，肾脏和膀胱中三聚氰胺的量高于其他组织。体内清除速度如此之快，说明三聚氰胺可能很少在体内聚集。动物实验研究表明，在猪体内三聚氰胺的表观分部容积为0.61(±0.04)L/kg，接近体液的总量，故推测三聚氰胺在猪体内主要分布于细胞外液，大部分器官组织中并不存在。现有的文献资料表明，三聚氰胺在不同的哺乳动物中的代谢特征有较大的差异；有关三聚氰胺在人体的代谢情况尚未见报道。

目前常见的三聚氰胺检测方法有高效液相色谱法(HPLC法)、反相HPLC法、液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱联用法、升华法、离子交换色谱-紫外检测法。样品来源主要为动物食品、饲料、乳制品。样品处理方法多需固相萃取、过滤、衍生化处理等步骤，测定方法中均未见同位素内标的使用。

2008年9月媒体报道三鹿婴幼儿奶粉中检测出三聚氰胺，并导致食用该奶粉的婴幼儿发生肾结石的重大食品安全事件，引起了全社会的关注。建立可靠灵敏的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测方法，以便能及时了解人体内三聚氰胺的残留情况、临床跟踪观察并采取有效的诊疗措施等，均具有十分重大的临床意义。

有关三聚氰胺和三聚氰酸在人尿中的检测方法尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，在于利用液相色谱-串联质谱和同位素稀释质谱原理，为临床提供一种操作简便、专一灵敏的临床人尿中三聚氰胺和三聚氰酸定量检测方法，以满足临床的需求。

本发明公开的定量检测的方法包括：采用同位素稀释技术，在尿样的预处理时分别加入含13C3；15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3；15N3-三聚氰酸的内标溶液；液-液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC-MS/MS方法分别定量检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸浓度，液相色谱以苯基、氟苯基、硅胶等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离进行等度洗脱或梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源(ESI)检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可达10ng/ml。

本发明方法包括以下步骤：

1、样品预处理

根据三聚氰胺和三聚氰酸的酸碱性质，采用液-液萃取的样品预处理方法分别处理三聚氰胺和三聚氰酸样品。三聚氰胺用氢氧化钠或氨水碱化，液-液萃取所用的提取溶剂为乙酸乙酯。三聚氰酸用甲酸酸化，液-液萃取所用的提取溶剂为异丙醇、乙酸乙酯或者二者的混合溶剂。

2、液相分离三聚氰胺和三聚氰酸分别进行液相色谱分离：

(1)流动相：由A和B组成，流速为0.2～0.5ml，其中A为含0.0001～0.1％甲酸水溶液，B为含0.0001～0.1％甲酸的甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合液。

(2)色谱柱：采用苯基、氟苯基、氰基、硅胶等填料柱，色谱柱内径为1～5mm，长度为50～250mm。

(3)洗脱方法：采用等度或梯度洗脱方式。采用等度洗脱时，流动相A为0.02％甲酸水，流动相B为含0.02％甲酸的体积比为1∶1的甲醇和乙腈溶液，A：B为体积比(20～50)：(80～50)。采用梯度洗脱时，流动相A：甲醇(含0.001％甲酸)，流动相B：水，梯度比例A为10～100％，B为0～90％。使用色谱柱为XbridgeTMPhenyl(150×2.1mm，5μm，Waters)，梯度程序可参考表1；流速0.35ml/min。

表1 流动相梯度程序表

 

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	96	4
0.1	40	60
			1	40	60
1.1	20	80
			3	20	80
3.1	96	4
			7	96	4

3、质谱检测

三聚氰胺：采用电喷雾电离源(ESI)，正离子多反应监测扫描(MRM)，离子选择通道(Q1/Q3)：三聚氰胺m/z 127/68(定量)和127/85(定性)，内标通道为13C3；15N3-三聚氰胺m/z 133/72。离子通道范围可为±1.0amu。

三聚氰酸：采用电喷雾电离源(ESI)，负离子多反应监测扫描(MRM)，离子选择通道(Q1/Q3)：m/z 128/42(定量)和128/85(定性)，内标13C3；15N3-三聚氰酸m/z 134/44。离子通道范围可为±1.0amu。

4、浓度计算方法和检测限

按内标法以峰面积或峰高法，分别计算尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。

本发明三聚氰胺和三聚氰酸的检测限为1ng/ml，定量范围为10～5000ng/ml，线性相关系数0.9990以上，批内、批间精密度小于10％，准确度85～115％之间。样品稳定性良好。

本发明的有益结果是：

1.根据三聚氰胺和三聚氰酸不同的理化性质，本发明分别对其进行样品处理、色谱分离和质谱检测。建立了相对经济简便的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的预处理方法。本研究采用了液液萃取的样品预处理方法，在满足方法学各项指标的前提下，与已有的固相萃取方法相比，更为快速、简便和经济。

2.采用同位素稀释法定量，在尿样的预处理时就加入三聚氰胺和三聚氰酸稳定同位素内标，实现了对测试的全过程的跟踪校正，确保测定结果的准确可靠。

3.本发明方法对样品检测的专一性强、灵敏度高、操作简便，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

实施例中非特别声明均为体积百分浓度。

实施例1

检测条件和方法实例

1.试剂配制：

(1)标准曲线：吸取三聚氰胺和三聚氰酸标准工作液适量，加入双重蒸馏水，分别制成含三聚氰胺和三聚氰酸浓度为10、50、100、500、1000、2500、5000ng/ml的标准水溶液。含7个浓度点，每个浓度配制1ml。

(2)质控品：吸取三聚氰胺和三聚氰酸标准工作液适量，加入双重蒸馏水，分别制成含三聚氰胺和三聚氰酸浓度为10，20，2000，4000ng/ml的三聚氰胺和三聚氰酸作为质控品，含4个浓度点，每个浓度配制2ml。

(3)内标：吸取250μl三聚氰胺内标(100μg/ml)溶液至10ml容量瓶，用50％甲醇水溶液定容，配制成2.5μg/ml工作溶液，4℃冷藏备用，得2.5μg/ml三聚氰胺内标溶液。同时，另外吸取250μl三聚氰酸内标(100μg/ml)溶液至10ml容量瓶，用50％甲醇水溶液定容，配制成2.5μg/ml工作溶液，4℃冷藏备用，得2.5μg/ml三聚氰酸内标溶液。

(4)流动相(甲醇∶乙腈为1:1，含0.02％甲酸溶液)：将500ml甲醇与500ml乙腈混合，取200μl甲酸溶液于混合液中，混匀，即得。

(5)流动相(含0.02％甲酸水溶液)：取200μl甲酸溶液于1000ml水中，混匀，即得。

(6)流动相(含0.001％甲酸甲醇溶液)：取10μl甲酸溶液于1000ml甲醇中，混匀，即得。

(7)1％甲酸水溶液：取1ml甲酸溶液于100ml水中，混匀，即得。

(8)0.1％甲酸水溶液：取100μl甲酸溶液于100ml水中，混匀，即得。

(9)1％氢氧化钠溶液：称取1g氢氧化钠，溶于100ml水中，混匀，即得。

(10)提取溶剂：取异丙醇和乙酸乙酯，按体积比5:95的比例混合。配制总体积1000ml。

2.尿样采集：

采集临床尿样约2ml，然后在-80℃保存。样品测定时，取冻存样品室温下解冻，备用。

3.样品预处理：

3.1 测定人尿样中三聚氰胺处理步骤

取100μl尿样，依次加入10μl三聚氰胺同位素内标工作液(5μg/ml)及20μl 1N NaOH溶液，涡旋10s，加入1ml乙酸乙酯，旋涡振荡10min，18000rpm离心3min；吸取上层有机相，加入100μl含0.1％甲酸的水溶液，旋涡振荡10min，18000rpm离心3min；吸取下层水相转移至300μl塑料管进样分析。

3.2 测定人尿样中三聚氰酸处理步骤

取100μl尿样，依次加入10μl三聚氰酸同位素内标工作液(5μg/ml)及20μl含1％甲酸的水溶液，涡旋10s，加入1ml含5％异丙醇的乙酸乙酯溶液，旋涡振荡10min，18000rpm离心3min；吸取上层有机相，洁净空气37℃吹干，残渣加入100μL含70％甲醇的水溶液，旋涡振荡3min，18000rpm离心3min，转移至300μl塑料管进样分析。

4.液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定条件

4.1 色谱条件

4.1.1 测定三聚氰胺色谱条件

色谱柱：     Allure PFP Propyl(100×2.1mm，5μm，RESTEK)

保护柱：     C18(4.0×3.0mm，5μm，Phenomenex)

流动相：     流动相A：双蒸水(含0.02％甲酸)

             流动相B：甲醇/乙腈(1:1，含0.02％甲酸)

流动相比例：  A：B＝70：30

流速：        0.4ml/min

柱温：        室温

进样量：      5μl

典型保留时间：三聚氰胺：1.9min；内标：1.9min

4.1.2 测定三聚氰酸色谱条件

色谱柱：       XbridgeTM Phenyl(150×2.1mm，5μm，Waters)

保护柱：       C18(4.0×3.0mm，5μm，Phenomenex)

流动相：       甲醇(含0.001％甲酸)

流速：         0.35ml/min

柱温：         室温

进样量：       5μl

典型保留时间： 三聚氰酸：1.3min；内标：1.3min

4.2 质谱条件

4.2.1 测定三聚氰胺质谱条件

仪器           API3000

离子源：       电喷雾离子源

扫描方式：     正离子MRM扫描

离子源参数：   雾化气：60psi(10*)；气帘气：40psi(10*)；碰撞气：42psi

               (7*)；辅助气：7L/min；电压：5500V；温度：450℃

               (注：*为仪器设定值)

4.2.2 测定三聚氰酸质谱条件

仪器        3200 Q Trap

离子源：    电喷雾离子源

扫描方式：  负离子MRM扫描

离子源参数：雾化气：50*；气帘气：20*；碰撞气：High*；辅助气：50*；电

            压：-4500V；温度：500℃

            (注：*为仪器设定值)

5.浓度计算方法

按内标法以峰面积或峰高法，计算尿中三聚氰胺和三聚氰酸的浓度。

6.结果

三聚氰胺和三聚氰酸测定的方法学包括线性关系、准确度、精密度、稳定性等均符合中国药典的规定。

实施例2

色谱条件

试剂配制、样品的采集及样品处理的方法、检测条件同实施例1。色谱条件中三聚氰胺改用Thermo Hypersil Silica(150mm×2.1mm i.d.，5μm，Thermo)分析柱，等度洗脱，流动相(A)0.0001％甲酸水，(B)0.0001％甲酸乙腈，A：B为体积比15：85。在此条件下，三聚氰胺和内标的保留时间为2.6min。三聚氰酸采用RESTEK Allure PFP Propyl(100mm×2.1mm i.d.，5μm，RESTEK)分析柱，等度洗脱，流动相(A)0.1％甲酸水，(B)0.1％甲酸50％乙腈50％甲醇，A：B为体积比30：70。在此条件下，三聚氰酸和内标的保留时间为1.3min。三聚氰胺和三聚氰酸的色谱峰峰形良好，在相应的色谱保留时间未见干扰存在。

实施例3

方法学验证

采用实施例1所列的检测条件和方法，对测定方法进行了方法学验证。在10-5000ng/ml三聚氰胺和三聚氰酸的浓度范围内，线性关系良好(r≥0.9990)，最低检测限可达1ng/ml。批内、批间精密度RSD分别≤3.26％和≤5.43％，准确度为93.7～102.8％。提取回收率为78.0～83.3％，RSD≤4.6％，介质效应为96.4～97.6％。方法学验证的结果说明LC-MS/MS可灵敏、准确、快速地对大批量临床样品进行检测。

1.标准曲线和定量范围

按实施例1方法配制标准曲线，分三批处理和进样测定，共得3套标准曲线。以浓度为x轴，三聚氰胺和三聚氰酸与各自同位素内标峰面积之比为y轴，进行线性回归，建立回归方程。结果表明：标准曲线方程为Y＝0.0304X+0.04036(三聚氰胺)，Y＝0.00406X+0.01367(三聚氰酸)。3批次测定标准曲线的r值分别为0.9994～0.9998。详见表2。本法三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限为10ng/ml。

表2 标准曲线测定结果(3批次，每批n＝2)

2.准确度与精密度

按实施例1方法配制质控品。每种浓度配制6份，在同一天内按上述样品处理方法及液相色谱串联质谱条件进行处理和分析，计算批内精密度和准确度。按上述方法，分3天配制3批样品处理和分析，计算批间精密度和准确度。结果见表3，批内、批间精密度CV％≤10％，准确度88.91～111.6％之间。

表3 准确度和精密度结果(3批次，每批n＝6)

注：MLM：三聚氰胺，CA：三聚氰酸

3.提取回收率

三聚氰胺、三聚氰酸及各自内标的提取回收率见表4，结果显示低、中、高浓度质控样品的三聚氰胺平均提取回收率分别为17.69％、20.23％和20.88％；三聚氰胺内标的提取回收率为19.68％；三聚氰酸平均提取回收率分别为70.88％、71.51％和64.32％；三聚氰酸内标的提取回收率为64.59％。

表4 三聚氰胺、三聚氰酸及内标的提取回收率

4.稳定性

4.1 样品在自动进样器中(室温)的稳定性

三个浓度质控样品，经过样品处理步骤操作后，放入自动进样器中(室温)，在不同时间测定，其结果见表5，表明提取后的样品在自动进样器中6h内稳定。

表5 自动进样器稳定性结果

4.2 样品室温放置的稳定性

质控样品室温放置24h内的浓度测定值结果见表6。结果表明样品在室温放置24h内保持稳定。

表6 样品室温放置的稳定性结果

4.3 多次冻融试验

冻融后与不经冻融的质控样品的浓度测定值结果见表7。结果表明三个浓度质控样品经过3次冻融后的仍保持稳定。

表7 冻融试验稳定性结果

实施例4

临床尿样中的测定结果

按实施例1的条件和方法，从2008年9月19日到2008年10月1日期间，收集到“奶粉门诊”婴幼儿尿样86例，年龄0-8岁。收集成人健康体检尿样110例年龄25-57岁。尿样中三聚氰胺和三聚氰酸测定结果见表8。

表8“奶粉门诊”婴幼儿和健康体检尿样中

三聚氰胺和三聚氰酸的浓度分布范围及比例

从表8可见，110例健康体检尿样中96例(87.2％)检测出三聚氰胺，109例(99.1％)检测出三聚氰酸。说明采用同位素稀释液相色谱串联质谱法可灵敏、准确的对尿样中三聚氰胺和三聚氰酸进行定量检测。

Claims (5)

1.人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法，其特征在于，以同位素稀释法定量，在尿样的预处理时加入含三聚氰胺和三聚氰酸稳定同位素的内标溶液；液-液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；液相色谱串联质谱技术检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量；按内标法以峰面积或峰高法，计算尿中三聚氰胺和三聚氰酸的浓度。

2.根据权利要求1所述定量检测方法，其特征在于，在尿样预处理时添加的稳定同位素内标分别是13C3；15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺，13C3；15N3-三聚氰酸。

3.根据权利要求1所述定量检测方法，其特征在于，所述液-液萃取是样品用氢氧化钠或氨水碱化，然后用提取溶剂乙酸乙酯提取三聚氰胺；样品用甲酸酸化，再用提取溶剂异丙醇或乙酸乙酯，或异丙醇和乙酸乙酯的混合溶剂提取三聚氰酸。

4.根据权利要求1所述定量检测方法，其特征在于，色谱分离时以苯基、氟苯基、硅胶等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离，等度洗脱或梯度洗脱。

5.根据权利要求1所述定量检测方法，其特征在于，质谱检测用电喷雾电离源；(1)三聚氰胺用正离子多反应监测扫描(MRM)模式，离子选择通道(Q1/Q3)：定量通道m/z 127/68和定性通道m/z 127/85，内标通道为13C3，15N3-三聚氰胺m/z 133/72；

(2)三聚氰酸用负离子多反应监测扫描(MRM)模式，离子选择通道(Q1/Q3)：定量通道m/z 128/42和定性通道m/z 128/85，内标通道13C3，15N3-三聚氰酸m/z 134/44。