CN101445829B - Egfr基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种EGFR基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法，该EGFR基因突变检测液相芯片主要包括有：包被探针的微球；用于扩增出具有19外显子和/或21外显子的目标序列的引物。采用本发明提供的EGFR基因突变检测液相芯片和检测方法，可同时对EGFR基因突变相对频率较高的位点进行检测，可以对19外显子和21外显子各单独进行检测，也可以两者同时检测，检测时的反应条件均一，检测结果特异性好，灵敏度高，检测准确度达90％以上，检测所需时间短。本发明所提供的检测方法不仅能检测肿瘤组织样本中的EGFR基因突变，同时也能检测肿瘤病人体液中的EGFR基因突变，且能够动态监测的优势。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及EGFR基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法。
技术背景
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为ErbB家族的四个成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。因此，以表皮生长因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。其中，EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Genfitinib，Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib，特罗凯，Tarceva)已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。我国在2005年2月也批准了吉非替尼进入临床。这些药物用于其他肿瘤(如乳腺癌、结肠癌和胃癌等)的治疗，目前也已经进入临床试验阶段。
吉非替尼，厄洛替尼是一种口服的小分子EGFR拮抗剂，可与ATP竞争结合EGFR酪氨酸激酶区的ATP结合袋从而抑制EGFR的活性，已应用于晚期和不适宜传统化疗方案的非小细胞肺癌患者的临床治疗，是目前对于部分NSCLC患者治疗最有效的药物。然而，患者对这种分子靶向药物的反应性与个体的遗传背景相关。2004年6月，美国哈佛医学院的研究人员Lynch等和Paez等率先报道，肺癌细胞中EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向治疗药物奏效的一个必要前提条件。研究结果显示，对EGFR酪氨酸激酶基因编码区突变型肿瘤，吉非替尼的有效率高达80％以上，而对无突变的野生型肿瘤上述药物基本无效。这一最新研究结果发表后受到了各国学者的高度重视，并在不足一年的时间内相继被美国、日本、韩国和我国(包括台湾)学者的研究所证实(Pao W等，2004；Han SW等，2005；Mitsudomi T等，2005；Huang SF等，2004；Mu XL等，2005)。因此，在进行吉非替尼，厄罗替尼等药物治疗前，检测患者是否存在相关的EGFR功能性突变，可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，显著提高药物疗效，使病人最大限度地受益，同时可以避免不合理用药所造成的病人医疗费用增加和社会医疗资源浪费，减少不必要治疗的时效损失以及经济损失。
目前，EGFR(酪氨酸激酶区)基因突变的检测标准是组织DNA样本的直接测序。该方法由Lynch等和Pacz等率先报道，优点是可以确切了解EGFR基因突变的范围和类型，并且基因突变与吉非替尼临床疗效的关系已得到肯定。然而，基因测序作为临床常规诊断方法也存在不少障碍，有待排除。首先，微量组织标本的检测困难。组织DNA经PCR扩增后进行基因测序，DNA需要量至少在100ng以上。目前检测EGFR基因突变的标本主要取自术后的组织样本，然而70％—80％的癌症患者在确诊时已难以进行根治性手术切除，无法获得组织标本进行EGFR基因突变测定。晚期癌症病人唯一能够获得组织的途径是穿刺活检。但肿瘤穿刺活检组织的样本很小。通常仅含数万个细胞。因而微量组织标本的EGFR基因检测相当困难。这类标本的EGFR基因检测国内还没有成功的报道。其次，肿瘤穿刺活检手术仅适用部分病人，标本采集的难度较大。晚期肿瘤多处于破裂出血的高危状态，穿刺活检作为一种损伤性手术存在一定的医疗风险。并且相当一部分病人由于病灶所处的特殊解剖部位(如脑转移、病灶邻近心脏及大血管等)而不适宜进行这种手术。导致不能提供肿瘤组织进行基因诊断。最后，该方法对技术的要求高、结果判读耗时费力。基因测序虽然是最直观、准确的检测方法，可以明确诊断突变的范围及其类型。但其检测周期长，从收到待检样品到顺利完成检测发出报告，需要连续的15—21小时。如以正常工作时间进行检测，实际至少需要3个工作日才能发出检测结果报告，因此，难以满足指导临床用药时效性的要求。同时，由于95％以上的突变属于杂合性突变(即同时存在野生型和突变型扩增产物)，准确诊断突变类型难度较大，尤其是外显子19的基因突变谱比较复杂，不少标本需要通过基因克隆后才能确定其突变类型。因而该方法仅适合少数技术装备精良的实验室开展，国内现有的研究都是依托重点大学及科研机构(如中科院和协和医科大学)完成的，各级医院很少能独立开展这项诊断。
因此，EGFR基因突变的检测要成为一项临床常规诊断技术，迫切需要解决二个关键问题：①需要寻找合适的肿瘤组织替代材料(surrogate source)，可以使晚期癌症病人不必从肿瘤组织中获取材料也能进EGFR基因诊断。②有必要研制开发特异性好、敏感性高、简便易行的检测新技术，使各级医院都有条件开展这一基因诊断项目。
因此，建立一种采样方便、病人痛苦小、特异性好、灵敏度高、准确快速、简便易行且无需组织标本的EGFR基因突变诊断方法是NSCLC患者应用EGFR TKIs治疗需要解决的重要问题。
肿瘤病人的体液(血浆、血清或胸水等)中存在大量游离的核酸(DNA或RNA)，其含量约为健康人的10倍以上。这类游离核酸主要来自癌细胞凋亡坏死，其遗传特性与肿瘤基因组DNA相同。因而血清游离核酸可用于癌基因突变检测。但游离核酸可能仅有非常小量的突变基因，而含有大量的野生型基因，混杂的大量野生型基因会阻碍突变基因的检出，因此需要一种高敏感性和特异性的突变体检测方法来评估EGFR基因突变。
根据目前的文献报道，EGFR与药物疗效相关的基因突变的发生频率在亚洲约为30％-50％，主要集中在19外显子的碱基缺失突变(ΔE746-750A，包括两种常见类型，见下表)以及21外显子的点突变(L858R)。在我国，19外显子的碱基缺失突变约占突变总数的54.5％，21外显子的点突变约占40.3％，其他外显子的突变仅占5.2％。为此，本发明选择突变率最高的19外显子和21外显子进行检测。
发明内容
本发明的目的之一在于提供用于EGFR基因突变检测的探针序列。
实现上述目的的技术方案如下：
用于EGFR基因突变检测的探针：包括有
选自于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一种的、针对Exon19外显子的野生型探针，以及选自于SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6任一种的、针对Exon19外显子的del E746-A750(1)突变型探针，和/或选自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一种的、针对Exon19外显子的突变型del E746-A750(2)探针；和/或
选自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一种的针对Exon21外显子的野生型探针，和选自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一种的针对Exon21外显子的突变型探针。
本发明的另一目的是提供EGFR基因突变检测的液相芯片。该液相芯片可用于检测EGFR基因19和21外显子上的相关突变，从而可用于预测吉非替尼，厄罗替尼等药物治疗疗效。
实现上述目的的技术方案如下：
一种EGFR基因突变检测的液相芯片，主要包括有：包被有碱基序列选自于SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3任一种的、针对Exon19外显子野生型的氨基修饰探针的微球，以及包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6任一种的、针对Exon19外显子delE746-A750(1)突变型的氨基修饰探针的微球，和/或包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一种的、针对Exon19外显子del E746-A750(2)突变型的氨基修饰探针的微球；和/或
包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一种的针对Exon21外显子野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一种的针对Exon21外显子突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；
以及用于扩增出具有19外显子和/或21外显子突变位点的目标序列的引物，且该目标序列的末端具有生物素标记。
以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5—30个T，更优选为10个T。
具有间隔臂的氨基修饰探针的组成 SEQ ID NO.
5’NH2-TTTTTTTTTTcaaggaattaagagaagcaacat3’ 1
5’NH2-TTTTTTTTTTaaggaattaagagaagcaac3’ 2
5’NH2-TTTTTTTTTTgttgcttctcttaattcctt3’ 3
5’NH2-TTTTTTTTTTgtcgctatcaaaacatctccg3’ 4
5’NH2-TTTTTTTTTTtcgctatcaaaacatctccg3’ 5
5’NH2-TTTTTTTTTTcggagatgttttgatagcga3’ 6
5’NH2-TTTTTTTTTTagattttgggcTggccaaact3’ 7
5’NH2-TTTTTTTTTTgattttgggcTggccaaact3’ 8
5’NH2-TTTTTTTTTTagtttggccAgcccaaaatc3’ 9
5’NH2-TTTTTTTTTTtttgggcGggccaaactctg3’ 10
5’NH2-TTTTTTTTTTgattttgggcGggccaaact3’ 11
5’NH2-TTTTTTTTTTagtttggccCgcccaaaatc3’ 12
5’NH2-TTTTTTTTTT ccgtcgctatcaagacatctc3’ 29
5’NH2-TTTTTTTTTT cgtcgctatcaagacatct3’ 30
5’NH2-TTTTTTTTTT gagatgtcttgatagcgacgg3’ 31。
优选地，用于扩增出具有19外显子突变位点的目标序列的引物包括有SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15引物序列，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或用于扩增山具有21外显子突变位点的目标序列的SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
本发明的另一目的还在于提供一种EGFR基因突变的检测方法，该方法快速、准确、操作简便，可同时并行检测多个突变位点，待测样本可以是组织样本，还可以是血清，血浆或者胸腔积液。
一种使用上述EGFR基因突变检测的液相芯片EGFR基因突变的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待检测样本中的DNA后，以用于扩增出具有19外显子和/或21外显子突变位点的目标序列的引物进行第一轮PCR扩增；
(2)酶切富集第一轮PCR扩增产物；
(3)以酶切产物为模板进行第二轮PCR扩增；
(4)第二轮PCR扩增产物与上述包被有探针序列的微球进行杂交；
(5)杂交反应后加入链霉亲和素-藻红蛋白进行反应，然后通过Luminex仪器检测信号。
优选地，进行第一轮PCR扩增用的引物对为：SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和/或SEQID NO.16、SEQ ID NO.17。
进行第二轮PCR扩增用的引物对：SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.17。
优选地，杂交的温度为55—60℃。
优选地，每种包被有探针的微球的制备方法包括步骤如下：
(1)取微球母液，涡旋，充分混匀成微球悬液；
(2)取出8μl微球母液，共含0.8×105—1.2×105个微球至0.5ml离心管中；
(3)15,000rpm离心10min，小心弃去上清液；
(4)加入10μl偶联液(pH4.5)，涡旋使之充分混匀；
(5)加入2pmol/μl探针工作液2μl；
(6)加入2.5μl10mg/ml的EDC工作液，25℃孵育30min；重复该步骤一次；
(7)加入0.2ml洗涤液，涡旋使之充分混匀，12,000g离心5min，小心弃去上清液；重复该步骤一次；
(8)加入500μlTE溶液，涡旋使之充分混匀；
(9)12,000g离心5min，小心弃去上清液；
(10)加入17μlTE溶液，涡旋使之充分混匀，微球浓度应约为5×103个/μl；
(11)取2μl，用水稀释50倍，计数，储存于2-8℃。
本发明的主要优点在于：
(1)采用本发明提供的EGFR基因突变检测液相芯片，可同时对EGFR基因突变相对频率较高的位点进行检测，可以对19外显子和21外显子各单独进行检测，也可以两者同时检测，检测时的反应条件均一，检测结果特异性好，灵敏度高，检测准确度达90％以上。
(2)本发明的检测方法步骤简单，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
(3)本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
(4)本发明采用酶切富集的方法进行目标序列的PCR扩增进而用于检测，避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰。
(5)本发明所提供的检测方法不仅能检测肿瘤组织样本中的EGFR基因突变，同时也能检测肿瘤病人体液中的EGFR基因突变，从而具有采样方便、病人痛苦小、能够动态监测的优势。
具体实施方式
以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex***的读取。Luminex阅读***分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。
溶液配方：
偶联液(pH4.5)：0.1mol/L MES(Sigma M-2933)
洗涤液：0.2ml/LTween-20(Sigma P-9416)，1g/L SDS(Sigma L-4390)
TE(pH8.0)(储存液)：10mmol/L Tris(Sigma 337501)，1mmol/L EDTA(Sigma E-5134)2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃
1×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | Sigma T3038 | 0.1M | 25ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.2M | 10ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.08％ | 0.2ml |
过滤后贮存于4℃。
实施例1
EGFR基因突变检测的液相芯片的制备
一、探针序列设计及微球包被
针对EGFR基因19、21外显子的野生型与突变型序列，设计特异的寡核苷酸探针。探针的5’端为一个氨基基团，接着是一个10个T的间隔臂。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探针分别与不同颜色编码的微球(购自Luminex公司)通过共价结合偶联在一起(包被过程)。探针序列如下表所示：
每种微球包被的具体步骤如下：
(1)将探针干粉10,000rpm离心1min；
(2)用ddH2O溶解至0.1mM(0.1nmol/μl，约70μl)；
(3)短时离心将溶液聚在管底；
(4)分装为10μl和2μl，储存于-20℃；
(5)取微球母液，涡旋，充分混匀成微球悬液；
(6)分别取出1×105微球(共8μl母液)至0.5ml离心管中；
(7)15,000rpm离心10min，小心弃去上清液；
(8)加入10μl偶联液(pH4.5)，涡旋使之充分混匀；
(9)取2μl探针母液，用偶联液(pH4.5)稀释2pmol/μl；
(10)往装有微球的离心管中加入相对应的2pmol/μl探针工作液2μl；
(11)用ddH2O配制EDC工作液(10mg/ml)；
(12)每个反应管各加入2.5μl EDC工作液，把剩余的EDC工作液丢弃；
(13)25℃孵育30min；
(14)每个反应管再各加入2.5μl EDC工作液；
(15)25℃孵育30min；
(16)加入0.2ml洗涤液，涡旋使之充分混匀；
(17)12,000g离心5min，小心弃去上清液；
(18)重复步骤(16)、(17)一次；
(19)加入500μlTE溶液(pH8.0)，涡旋使之充分混匀；
(20)12,000g离心5min，小心弃去上清液；
(21)加入17μl TE溶液(pH8.0)，涡旋使之充分混匀。(微球浓度应约为5×103个/μl)；
(22)取2μl，用水稀释50倍，计数；
(23)储存于2-8℃。
二、微球包被效果的检测
19外显子与21外显子分别设置6组实验。以19外显子为例，微球包被效果检测第一组反应体系中含野生型探针包被的微球与相应的包被效果检测用的生物素标记的反向互补序列即E19w-P+E19w-b；第二组反应体系中含野生型探针包被的微球，突变型探针包被的微球及生物素标记的野生型探针的反向互补序列即E19w-P+E19m-P+E19w-b；第三组反应体系中含突变型探针包被的微球与生物素标记的野生型探针的反向互补序列即E19w-P+E19m-b；第四组反应体系中含突变型探针包被的微球与生物素标记的突变型探针的反向互补序列即E19m-P+E19m-b；第五组反应体系中含突变型探针包被的微球，野生型探针包被的微球及生物素标记的突变型探针的反向互补序列即E19w-P+E19m-P+E19m-b；第六组反应体系中含突变型探针包被的微球与生物素标记的野生型探针的反向互补序列即E19m-P+E19w-b。21外显子的微球包被效果检测实验设计同19外显子。具体操作流程如下：
(1)将微球管涡旋，使微球充分混匀；
(2)用1.5×Tm杂交液将微球稀释至75个/μl(每反应需微球工作液33μl)；
(3)将微球工作液涡旋使之充分混匀；
(4)每孔加入33μl微球工作液；
(5)用TE(pH8.0)将包被效果检测用的生物素标记的探针反向互补序列(即E19w-b，E19m-b，E21w-b，E21m-b)稀释至25fmol/17μl；
(6)背景孔加入17μl TE(pH8.0)；
(7)其他每孔分别加入17μl包被效果检测用的生物素标记的探针反向互补序列(即E19w-b，E19m-b，E21w-b，E21m-b)工作液(溶于TE溶液)；
(8)轻轻混匀；
(9)盖上反应板(管盖)防止蒸发；
(10)设置PCR仪程序：95℃3min；60℃杂交孵育15min；
(11)用1×Tm杂交液配制SA-PE至10ug/ml；
(12)每孔加入25μl SA-PE，轻轻混匀；
(13)60℃杂交孵育5min；
(14)将Luminex仪器设置到杂交温度，读数。
微球包被效果检测结果如下
| 19外显子 | MFI | 21外显子 | MFI |
| E19w-P+E19w-b | 3777 | E21w-P+E21w-b | 3368 |
| E19w-P+E19m-P+E19w-b | 2860 | E21w-P+E21m-P+E21w-b | 4674.5 |
| E19w-P+E19m-b | 5 | E21w-P+E21m-b | 92 |
| E19m-P+E19m-b | 6866.5 | E21m-P+E21m-b | 5657 |
| E19w-P+E19m-P+E19m-b | 5011 | E21w-P+E21m-P+E21m-b | 5932 |
| E19m-P+E19w-b | 0 | E21m-P+E21w-b | 425 |
实验结果表明，本发明所设计的19外显子野生型探针，19外显子突变型探针，21外显子野生型探针，21外显子突变型探针均能很好地识别相应的互补序列，杂交后的荧光值均在2500以上。同时，19外显子野生型探针与19外显子突变型探针之间不存在交叉反应；21外显子野生型探针与21外显子突变型探针之间存在部分交叉反应，但交叉反应率在10％以内，基本上不影响检测结果。
引物的设计与标记
针对EGFR基因19与21外显子的基因序列，分别设计如下引物：
引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。其中，Exon19-S1与Exon19-As1用于19外显子的第一轮PCR扩增，生物素标记Exon19-S1与Exon19-As2用于19外显子的第二轮PCR扩增；Exon21-S1与Exon21-As1用于21外显子的第一轮PCR扩增，Exon21-As1与生物素标记的Exon21-S2用于21外显子的第二轮PCR扩增。
制备得到的EGFR基因突变检测的液相芯片包括有：
包被有SEQ ID NO.3的、针对Exon19外显子的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQID NO.6的、针对Exon19外显子的del E746-A750(1)突变型氨基修饰探针的微球、包被有SEQID NO.31的、针对Exon19外显子的del E746-A750(2)突变型氨基修饰探针的微球、包被有于SEQ ID NO.9的针对Exon21外显子的野生型氨基修饰探针的微球、和包被有SEQ ID NO.12的针对Exon21外显子的突变型氨基修饰探针的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；以及
SEQ ID NO.13—15和SEQ ID NO.16—18的引物序列，其中SEQ ID NO.13与SEQ IDNO.18碱基序列的5’端分别加上生物素标记。
实施例2
运用实施例1中的EGFR基因突变检测的液相芯片对非小细胞肺癌血清样本的检测
一、待测样本的准备(血浆、血清和胸水上清游离核酸的提取)：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，详细步骤如下：
(1)取患者抗凝静脉血或胸腔积液约2.5ml，3000rpm离心15分钟，取300μl上清加到一个1.5ml干净无菌的离心管中；
(2)向离心管中加入500μl AP1缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
(3)加入100μl AP2缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
(4)室温下12,000rpm离心10分钟；
(5)小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中，盖上盖子，以6,000rpm离心1分钟；
(6)倒掉废液收集管中的废液，用800μl缓冲液W1洗涤1次，以6,000rpm离心1分钟；
(7)倒掉废液收集管中的废液，加入800μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟；倒掉废液收集管中的废液，加入500μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟，弃掉废液；
(8)将吸附柱AxyPrep放回空收集管中，12,000rpm离心1分钟；
(9)将吸附柱AxyPrep置于一干净无菌的1.5ml离心管中，加入40μl TE缓冲液，室温下放置1分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱DNA，电泳检测，-20℃保存。
二、待测样品的PCR扩增与酶切富集：
(1)样本DNA的PCR扩增与酶切富集
外显子19突变型的酶切富集PCR扩增如下：
1.第一轮PCR扩增
PCR反应体系：
PCR反应条件：
步骤 温度 时间 循环次数
预变性 95℃ 5min 1
变性 95℃ 30sec
复性 60℃ 30sec 30
延伸 72℃ 45sec
最后延伸 72℃ 10min 1
2.PCR产物Mse I酶切：
反应体系如下：
10×Mse I Buffer 1μμl
PCR产物 3μμl
100×BSA 0.1μμl
Mse I 0.5μμl(50U/μμl)
加入灭菌双蒸水至 10μl
37℃温育2小时，65℃20分钟灭活酶。
3.第二轮PCR扩增
PCR反应体系：
PCR反应条件：
步骤 温度 时间 循环次数
预变性 95℃ 5min 1
变性 95℃ 30sec
复性 60℃ 30sec 30
延伸 72℃ 45sec
最后延伸 72℃ 10min 1
外显子21突变型的酶切富集PCR扩增如下：
1.第一轮PCR扩增
PCR反应体系：
PCR反应条件：
步骤 温度 时间 循环次数
预变性 95℃ 5min 1
变性 95℃ 30sec
复性 60℃ 30sec 30
延伸 72℃ 45sec
最后延伸 72℃ 10min 1
2.PCR产物Msc I酶切：
反应体系如下：
10×Msc I Buffer 1μl
PCR产物 3μl
Msc I 0.5μl(10U/μl)
加无酶水至 10μl
37℃温育2小时，65℃ 20分钟灭活酶。
3.第二轮PCR扩增
PCR反应体系：
PCR反应条件：
步骤 温度 时间 循环次数
预变性 95℃ 5min 1
变性 95℃ 30sec
复性 60℃ 30sec 30
延伸 72℃ 45sec
最后延伸 72℃ 10min 1
或者进行EGFR基因19，21外显子突变型与野生型序列的同步扩增(多重PCR扩增)
1. 19外显子，21外显子第一轮PCR扩增以及酶切与上述相同，不同的是第二轮PCR扩增采取同步扩增的方法。
2. 第二轮PCR扩增(19，21外显子野生型序列与突变型序列同时扩增)
PCR反应体系：
PCR反应条件：
步骤 温度 时间 循环次数
预变性 95℃ 5min 1
变性 95℃ 30sec
复性 60℃ 30sec 30
延伸 72℃ 45sec
最后延伸 72℃ 10min 1
三、杂交与上机检测
(1)将包被有19外显子野生型探针(E19w-P)，19外显子del E746-A750(1)突变型探针(E19m-P)，19外显子del E746-A750(2)突变型探针(E19m-P11)，21外显子野生型探针(E21w-P)，21外显子突变型探针(E21m-P)，阴性对照探针(N-P)的微球分别vortex 30s，超声处理30s；
(2)用1.5×Tm杂交液配制含有包被有探针的混合微球工作液，使溶液中每种微球浓度为75个/μl；
(3)将混合微球工作液vortex 30s，超声处理30s；
(4)每孔加入对应的33μl混合微球工作液，使反应体系中最终含有每种微球各约2500个；
(5)背景孔加入17μl TE(pH8.0)；其他每孔分别加入每个样本的19外显子及21外显子的第二轮PCR产物各2-17μl，补加TE至17μl；轻轻混匀；盖上反应板(管盖)防止蒸发；
(6)设置PCR仪程序：95℃5min；60℃杂交孵育15min；
(7)用1×Tm杂交液配制SA-PE至2ug/ml(75μl/孔)；
(8)将反应管(板)12,000g离心5min，小心弃去上清液。或者转移至滤板中，抽滤除去液体；
(9)每孔加入75μl SA-PE(链亲和素藻红蛋白)工作液(含150ng的SA-PE)，轻轻混匀；
(10)马上置于杂交温度(60℃)，孵育5min；
(11)将Luminex仪器设置到杂交温度，读数。
四、检测结果与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，检测结果如表1所示。19外显子野生型与突变型(缺失)探针不存在交叉反应，因此以突变型荧光值(两种突变型荧光值较高者)除以阴性对照荧光值(即M/N)>25作为阳性判定值(cut-off值)。当19外显子检测结果M/N>25时，则判定该样本为存在19外显子的缺失，否则判定该样本为19外显子野生型。21外显子野生型探针与突变型探针存在交叉反应(交叉反应率在10％以内)，因此，以(突变型荧光值-阴性对照荧光值)/(野生型荧光值-阴性对照荧光值)即((M-N)/(W-N))>2作为阳性判定值(cut-off值)。当21外显子检测结果((M-N)/(W-N))>2时，判定该样本存在21外显子的L858R点突变，否则判定该样本为21外显子野生型。
根据这一判定标准，本实施例所检测的10份样本中，3例存在19外显子的缺失(3号，5号，7号样本)，2例存在21外显子的点突变(2号，10号样本)。检测结果与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳再进行银染的结果作比较，计算吻合率。19外显子的检测吻合率达到100％，21外显子的检测吻合率亦达到90％。整体吻合率为95％。因此，使用本发明所提供的EGFR基因突变检测液相芯片及其检测方法可以准确检测EGFR基因19外显子的缺失突变及21外显子的点突变，准确率高达95％，为评估吉非替尼，厄罗替尼等靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，避免不必要治疗的时效损失以及经济损失提供了重要的检测手段。
表1 血清样本的检测结果
| 序号 | 阴性对照 | E19w | E19ml | E19m2 | E21w | E21m |
| NO. | (MFI) | (MFI) | (MFI) | (MFI) | (MFI) | (MFI) |
| 1 | 13 | 1751 | 70 | 56 | 189 | 21 |
| 2 | 14 | 1366.5 | 39.5 | 49 | 40 | 1299 |
| 3 | 9 | 1373 | 1593.5 | 29.5 | 194 | 23 |
| 4 | 7 | 1132 | 40 | 36.5 | 69 | 75.5 |
| 5 | 4 | 236 | 53 | 1876.5 | 154.5 | 21.5 |
| 6 | 10.5 | 656 | 51.5 | 54 | 38 | 31 |
| 7 | 19 | 661.5 | 1818 | 78 | 61 | 99 |
| 8 | 4 | 83 | 91 | 38 | 71.5 | 58.5 |
| 9 | 15 | 46 | 9 | 7.5 | 35 | 38.5 |
| 10 | 11.5 | 1169 | 48.5 | 29 | 189 | 412 |
表2 血清样本EGFR突变类型分析结果
| 样本号 | 突变型荧光值/阴性对照荧光值(M/N) | (突变性荧光值-阴性对照荧光值)/(野生型荧光值-阴性对照荧光值((M-N)/(W-N)) | 突变类型分析结果 | 凝胶电泳检测分析结果 |
| 19外显子 | 21外显子 | |||
| 1 | 5.38 | 0.05 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | 3.50 | 49.42 | 21外显子点突变 | 21外显子点突变 |
| 3 | 177.06 | 0.08 | 19外显子缺失 | 19外显子缺失 |
| 4 | 5.71 | 1.10 | 野生型 | 野生型 |
| 5 | 469.13 | 0.12 | 19外显子缺失 | 19外显子缺失 |
| 6 | 5.14 | 0.75 | 野生型 | 野生型 |
| 7 | 95.68 | 1.90 | 19外显子缺失 | 19外显子缺失 |
| 8 | 22.75 | 0.81 | 野生型 | 野生型 |
| 9 | 0.60 | 1.18 | 野生型 | 野生型 |
| 10 | 4.22 | 2.26 | 21外显子点突变 | 野生型 |
实施例3
运用实施例1中的EGFR基因突变检测的液相芯片对肺癌组织样本的检测
取上述实施例2所用的1-10号病人的肺癌组织样本进行检测，具体过程如下：
一、待测样本的准备
肺癌组织样本中DNA的提取：取肺癌术后或活检的组织标本5-50mg，研磨后，用pH7.4的PBS溶液洗涤2次；洗涤后的组织标本重悬于1ml的消化液(50mmol/L Tris，1mmo/LNa2EDTA，0.5％ Tween-20，200ug/ml的蛋白酶K200，pH 8.5)，55℃水浴消化1小时，99℃水浴15min灭活蛋白酶K；12000转/分钟离心10分钟；取上清，通过酚-氯仿-异戊醇法抽提，乙醇沉淀法获得用于PCR反应的DNA样品。也可通过微量离心柱法提取DNA；
二、待测样品的PCR扩增与酶切富集：
具体方法同实施例2。
三、杂交与上机检测：
具体方法同实施例2进行检测。
四、检测结果与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测，检测结果如表3，表4所示。判定标准同实施例2所述。实验结果显示，肺癌组织样本检测的分析结果与用血清样本进行检测分析的结果一致，即10例样本中存在3例19外显子的缺失突变(3号，5号，7号样本)，存在2例21外显子的点突变(2号，10号样本)。说明本发明所提供的用血清游离核酸进行EGFR基因突变检测的方法是可行的，也说明本发明所提供的方法是稳定可靠的。
表3 肺癌组织样本的检测结果
| 序号NO. | 阴性对照(MFI) | E19w(MFI) | E19ml(MFI) | E19m2(MFI) | E21w(MFI) | E21m(MFI) |
| 1 | 15 | 1987 | 77 | 54 | 201 | 41 |
| 2 | 10 | 1421 | 41 | 47 | 45 | 1412 |
| 3 | 9 | 1405 | 1657.5 | 36 | 231 | 35 |
| 4 | 8 | 1387 | 39 | 25.5 | 62.5 | 84.5 |
| 5 | 6 | 321 | 65.5 | 1905.5 | 275 | 51 |
| 6 | 12 | 761.5 | 84 | 62 | 42 | 54 |
| 7 | 5 | 657 | 1854 | 81 | 55 | 76 |
| 8 | 9 | 91 | 132 | 36.5 | 81 | 73.5 |
| 9 | 13 | 41 | 17 | 11 | 56 | 51 |
| 10 | 12.5 | 1241.5 | 53.5 | 34 | 215 | 451 |
表4 肺癌组织样本EGFR突变类型分析结果
| 样本号 | 突变型荧光值/阴性对照荧光值(M/N) | (突变型荧光值-阴性对照荧光值)/(野生型荧光值-阴性对照荧光值((M-N)/(W-N)) | 突变类型分析结果 |
| 19外显子 | 21外显子 | ||
| 1 | 5.13 | 0.14 | 野生型 |
| 2 | 4.70 | 40.06 | 21外显子点突变 |
| 3 | 184.17 | 0.12 | 19外显子缺失 |
| 4 | 4.88 | 1.40 | 野生型 |
| 5 | 317.58 | 0.17 | 19外显子缺失 |
| 6 | 7.00 | 1.40 | 野生型 |
| 7 | 370.80 | 1.42 | 19外显子缺失 |
| 8 | 14.67 | 0.90 | 野生型 |
| 9 | 1.31 | 0.88 | 野生型 |
| 10 | 4.28 | 2.17 | 21外显子点突变 |
实施例4
一、制备EGFR基因突变检测的液相芯片
按照实施例1的方法将探针包被微球：
一、EGFR突变检测其他备选探针设计及微球包被
针对EGFR基因19、21外显子的野生型与突变型序列，设计两组寡核苷酸探针(E19w-P1，E19m-P1，E19m-P13，E21w-P1，E21m-P1以及E19w-P2，E19m-P2，E19m-P12，E21w-P2，E21m-P2)。探针的5’端为一个氨基基团，接着是一个10个T的间隔臂。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探针分别与不同颜色编码的微球(购自Luminex公司)通过共价结合偶联在一起(包被过程)，同实施例1所述。探针序列如下表所示：
本实施例的EGFR基因突变检测的液相芯片包括有：
包被有SEQ ID NO.2的、针对Exon19外显子的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQID NO.5的、针对Exon19外显子del E746-A750(1)的突变型氨基修饰探针的微球、包被有SEQ ID NO.30的、针对Exon19外显子del E746-A750(2)的突变型氨基修饰探针的微球、包被有于SEQ ID NO.8的针对Exon21外显子的野生型氨基修饰探针的微球、和包被有SEQ IDNO.11的针对Exon21外显子的突变型氨基修饰探针的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；以及
SEQ ID NO.13—15和SEQ ID NO.16—18的引物序列，其中SEQ ID NO.15与SEQ IDNO.17碱基序列的5’端分别加上生物素标记。
二、将本实施例的EGFR基因突变检测的液相芯片用于肺癌血清样本的检测
运用E19w-P1，E19m-P1，E19m-P13，E21w-P1，E21m-P1探针包被的微球对非小细胞肺癌血清样本的检测。
选择实施例2中所用的1-5共五份非小细胞肺癌血清样本进行检测。待测样本的准备，待测样本的PCR扩增与酶切富集，杂交与上机检测的实验步骤同实施例2所述。实验结果如下所示：
表5 血清样本的检测结果
| 样品 | 阴性对照(MFI) | E19w-P1(MFI) | E19m-P1(MFI) | E19m-P13(MFI) | E21w-P1(MFI) | E21m-P1(MFI) |
| 1 | 19 | 1695 | 85.5 | 44 | 192 | 25 |
| 2 | 14 | 1409 | 51 | 57 | 41 | 1305 |
| 3 | 13 | 1327 | 1421 | 36 | 201 | 31 |
| 4 | 10 | 1052 | 39 | 41 | 63 | 81 |
| 5 | 15 | 259 | 54 | 1881 | 167 | 23 |
表6 血清样本EGFR突变类型分析结果
| 样品 | 突变型荧光值/阴性对照荧光值(M/N) | (突变性荧光值-阴性对照荧光值)/(野生型荧光值-阴性对照荧光值((M-N)/(W-N)) | 突变类型分析结果 |
| 1 | 4.50 | 0.03 | 野生型 |
| 2 | 4.07 | 47.81 | 21外显子点突变 |
| 3 | 109.31 | 0.10 | 19外显子缺失 |
| 4 | 4.10 | 1.34 | 野生型 |
| 5 | 125.40 | 0.05 | 19外显子缺失 |
实验结果表明，探针E19w-P1，E19m-P1，E19m-P13，E21w-P1，E21m-P1同样可用于对临床样本EGFR的突变检测，分析结果与用探针(E19w-P，E19m-P，E19m-P11，E21w-P，E21m-P)检测的结果一致。
实施例5
一、制备EGFR基因突变检测的液相芯片
制备方法同实施例1.
本实施例的EGFR基因突变检测的液相芯片包括有：
包被有SEQ ID NO.1的、针对Exon19外显子的野生型氨基修饰探针的微球、包被有SEQID NO.4的、针对Exon19 del E746-A750(1)的突变型氨基修饰探针的微球、包被有SEQ IDNO.29的、针对Exon19外显子del E746-A750(2)的突变型氨基修饰探针的微球、包被有于SEQ ID NO.7的针对Exon21外显子的野生型氨基修饰探针的微球、和包被有SEQ ID NO.10的针对Exon21外显子的突变型氨基修饰探针的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；以及
SEQ ID NO.13—15和SEQ ID NO.16—18的引物序列，其中SEQ ID NO.15与SEQ IDNO.17碱基序列的5’端分别加上生物素标记。
二、将本实施例的EGFR基因突变检测的液相芯片用于肺癌血清样本的检测
运用E19w-P2，E19m-P2，E19mP12，E21w-P2，E21m-P2探针包被的微球对非小细胞肺癌血清样本的检测
同样选择1-5共五个非小细胞肺癌血清样本进行检测。待测样本的准备，待测样本的PCR扩增与酶切富集，杂交与上机检测的实验步骤同实施例2所述。实验结果如下所示：
表7 血清样本的检测结果
| 样品 | 阴性对照(MFI) | E19w-P2(MFI) | E19m-P2(MFI) | E19m-P12(MFI) | E21w-P2(MFI) | E21m-P2(MFI) |
| 1 | 11 | 1795 | 74 | 62 | 175 | 33.5 |
| 2 | 17 | 1329 | 43 | 53 | 51 | 1276 |
| 3 | 15 | 1346 | 1542 | 33 | 187 | 41 |
| 4 | 10 | 1075 | 47 | 47 | 52 | 84 |
| 5 | 15 | 241 | 59 | 1796 | 139 | 27 |
表8 血清样本EGFR突变类型分析结果
| 样品 | 突变型荧光值/阴性对照荧光值(M/N) | (突变性荧光值-阴性对照荧光值)/(野生型荧光值-阴性对照荧光值((M-N)/(W-N)) | 突变类型分析结果 |
| 1 | 6.73 | 0.14 | 野生型 |
| 2 | 3.12 | 37.03 | 21外显子点突变 |
| 3 | 102.80 | 0.15 | 19外显子缺失 |
| 4 | 4.70 | 1.76 | 野生型 |
| 5 | 119.73 | 0.10 | 19外显子缺失 |
实验结果表明，探针E19w-P2，E19m-P2，E19m-P12，E21w-P2，E21m-P2也可用于对临床样本EGFR的突变检测，分析结果与探针(E19w-P，E19m-P，E19m-P11，E21w-P，E21m-P)检测的结果一致。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>EGFR基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法
<160>34
<170>PatentIn version 3.1
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212>DNA
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<213>人工序列
<400>32
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
Claims (4)
1.用于EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于：主要包括有：
A.包被有探针的微球：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任一种的、针对Exon19外显子野生型的氨基修饰探针的微球，以及选自以下任一种微球：包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6任一种的、针对Exon19外显子del E746-A750(1)突变型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.31任一种的、针对Exon19外显子del E746-A750(2)突变型的氨基修饰探针的微球；和/或包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9任一种的针对Exon21外显子野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12任一种的针对Exon21外显子突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及
B.引物：用于扩增出具有19外显子突变位点的目标序列的SEQ ID NO.13～SEQ IDNO.15引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记；和/或用于扩增出具有21外显子突变位点的目标序列的SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18引物，所述引物中至少有一条带有末端的生物素标记。
2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征是，包被探针的微球为：包被有碱基序列为SEQ ID NO.3的、针对Exon19外显子野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列为SEQ ID NO.6的、针对Exon19外显子突变型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列为SEQ ID NO.31的、针对Exon19外显子突变型的氨基修饰探针的微球；和包被有碱基序列为SEQ ID NO.9的针对Exon21外显子野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列为SEQ ID NO.12、针对Exon21外显子突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码。
3.根据权利要求1所述的用于EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于：所述间隔臂为5-30个T。
4.根据权利要求3所述的用于EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于：所述间隔臂为10个T。
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