CN101445786B - 一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法 - Google Patents
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Abstract
一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法，属于生物工程技术领域。本发明公开了一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 208157。该菌株来源自酱香型白酒的高温大曲，根据其菌落、细胞形态和生理生化特征以及16S rRNA基因序列比对结果，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。该菌株能以葡萄糖、蔗糖、糖蜜以及豆饼粉为底物，以大量积累内源前体来提高四甲基吡嗪的产量。解决了微生物发酵生产四甲基吡嗪中产物浓度低、需外源添加前体和前体利用率低的问题。以蔗糖豆饼粉为底物时，37℃条件下摇瓶培养120h可获得4.08g/L的四甲基吡嗪。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌能大量积累3-羟基-2-丁酮为前驱物质发酵法生产四甲基吡嗪的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
四甲基吡嗪(2，3，5，6-tetramethylpyrazine)是一种常见的杂环含氮化合物，广泛存在于食品原料、加工食品和酒精饮料中，被认为是一类重要的香味化合物，具有烘烤、花生、榛子和可可的香气，常用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配。在中国的传统白酒中亦检测到一定量的四甲基吡嗪和其它烷基吡嗪，它们通常具有较低的风味阈值，因此被认为对中国酱香型白酒的风味有重要的贡献。除了作为食品风味添加剂的用途，四甲基吡嗪作为中药材川芎(Ligusticum wallichii)根茎的主要活性生物碱成分，已被证明具有治疗心脑血管疾病的药理作用，并对顺铂诱导的氧化应激、细胞凋亡和肾毒性有预防作用。随着药理研究的深入，现在已经作为一种新型的钙离子拮抗剂广泛应用于临床，是循环、中枢神经、呼吸及其它***相关疾病的大宗用药，广泛应用于心脑血管疾病、呼吸***疾病、肾小球疾病等的治疗。
3-羟基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)是许多微生物具有生理意义的代谢产物，其作为四甲基吡嗪的前驱物质应用于微生物发酵生产四甲基吡嗪中已被许多研究者证实。通过外源添加前驱物质3-羟基-2-丁酮的方法已被成功应用于提高发酵法生产四甲基吡嗪的产量中，但该工艺存在一定的技术困难，研究水平仍停留在实验室阶段，尚未进行工业化生产。
四甲基吡嗪和3-羟基-2-丁酮的化学结构：
四甲基吡嗪的生产方法可分为生物合成法、直接从植物中提取法和化学合成法三种。截止目前，已有相当量的文献报道及专利利用美拉德反应和Strecker降解化学法合成吡嗪类化合物，然而，化学合成法普遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且消费者更倾向于使用‘天然’或‘生 物合成’吡嗪，虽然化学合成得到的吡嗪的价格远低于前者。直接从中药材川芎根茎中提取四甲基吡嗪的方法经常面临川芎植物原材料供应有限，四甲基吡嗪在川芎根茎中的含量较低(约0.075％)导致提取工艺成本较高而很难实现大规模生产。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物工程的手段生产四甲基吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点而广受消费者关注。
早在1962年，Kosuge等人首次从日本纳豆发酵食品功能菌Bacillus natto的发酵液中分离到四甲基吡嗪，在随后的几十年内，多位研究者在微生物发酵法产吡嗪领域上做出了卓越贡献，相当量的文献报道了在液态、固态和固态底物发酵中生产吡嗪的实例，生产菌种包括杆菌及其突变株(Bacillus sp.)、谷氨酸棒杆菌突变株(Corynebacterium glutamicum mutant)和乳酸杆菌(Lactococcuslactis subsp.Lactis biovar.Diacetylactis FC1)等。根据以上文献，杆菌属(Bacillussp.)能利用廉价的工业原料作为营养物质进行发酵大量生成四甲基吡嗪，被认为是一类良好的吡嗪生产菌株。
虽然很多微生物能够利用自身的代谢途径‘从头合成’各种高附加值产物，但是这些产物在微生物的发酵液中含量普遍很低(小于0.60克每升)，从而很难进行工业化生产。当发酵产物的生成涉及结构类似的前驱物质时，外加前驱物质的方法作为一种能大幅度提高发酵产物的有效方法而广受应用。同样，许多文献已证明往微生物的培养基中大量添加3-羟基-2-丁酮的方法提高四甲基吡嗪的产量方法的可行性。然而，这种外加的前驱物质被微生物的利用程度很低，即使较高量吡嗪产生的情况下，前驱物质的利用率也不高(小于1％)。大量外源添加的前驱物质3-羟基-2-丁酮添加到培养基中，导致微生物代谢平衡的紊乱，微生物体内‘从头合成’前驱物质的代谢途径中各种酶被高浓度前驱物质抑制，虽然产物四甲基吡嗪的浓度得到一定的提高，但是细胞对环境中各种营养物质的利用符合‘细胞经济学’原则，仅有少量的前驱物质参与富含前驱物质环境条件下微生物的代谢途径中，导致前驱物质的利用率较低。同时，大量外源前驱物质的加入和一定量产物的生成通常对微生物细胞具有毒性，对生物过程的工业应用有着不利影响。除此之外，天然前驱物质3-羟基-2-丁酮的市场需求量仍较高，因此，通过外加前驱物质提高四甲基吡嗪产量的方法不符合经济可行性。这种情况下，筛选能够利用葡萄糖或其它糖为碳源物质高效积累前驱物质3-羟基-2-丁酮，从而达到实现四甲基吡嗪高产的新菌株十分必要。
据报道，在不同种类的中国传统白酒中能够检测到一系列的吡嗪类化合物，相比于其它类型的白酒，酱香型白酒中四甲基吡嗪的含量最高。高温大曲以其严格和复杂的制作工艺，以及其作为酱香型白酒制造过程的糖化和发酵剂，富含各种微生物包括细菌、酵母和真菌。杆菌属(Bacillus sp.)因其能在低水分高 温情况下生存而成为大曲微生物菌群体系中的主要微生物，杆菌属(Bacillus sp.)微生物分泌的淀粉酶和蛋白酶等使得微生物充分利用环境中的营养物质，以糖为营养物质代谢产生的前驱物质3-羟基-2-丁酮亦有大幅度的提高，因此，四甲基吡嗪的含量相应地有所增加。据我们所知，大部分烷基吡嗪产生菌是一类产芽孢的杆菌属。同时，来源于食品级高温大曲的野生杆菌属(Bacillus sp.)，其发酵产物能在一定程度上满足消费者对天然产品的需求。
发明内容
针对现有技术难点及存在的问题，本发明的目的在于提供一株新分离的枯草芽孢杆菌在发酵法生产四甲基吡嗪中的应用，该菌株能以大量积累内源前体的方法提高四甲基吡嗪的产量。本发明所述菌株能够利用自身的代谢途径有效地转化葡萄糖或蔗糖生成四甲基吡嗪的前驱物质3-羟基-2-丁酮，在微生物酶的生物催化作用下，前驱物质转化生成四甲基吡嗪，从而达到高产四甲基吡嗪的目的。
本发明的技术方案：一株产四甲基吡嗪的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M208157。
该枯草芽孢杆菌的细菌学特征是：菌落形态初期为灰色、突起、圆形、表面光滑有光泽，培养后期菌落边缘呈不规则状，表面扁平、灰白色、无光泽；显微镜镜检为短杆状，长1.6-3.0μm，直径0.6-0.7μm，产芽孢；生理生化特征为革兰氏阳性、好氧、化能异养菌，从葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖或蔗糖产酸，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，V-P反应阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐；其16S rRNA基因序列与多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S rRNA的基因序列具有>99％同源性。
上述用于菌体形态观察的培养基为肉汤琼脂培养基，组成为(克每升)：葡萄糖5，蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，琼脂15-20，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
上述菌落形态特征的试验方法和生理生化试验培养基及试验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌***鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-398。
上述用于V-P试验的MR-VP培养基组成为(克每升)：葡萄糖5，蛋白胨5，氯化钠5，pH7.2，蒸馏水配制。
一种提高枯草芽孢杆菌发酵法生产四甲基吡嗪产量的方法：该枯草芽孢杆菌以葡萄糖培养基、蔗糖培养基、糖蜜培养基、蔗糖豆饼粉培养基或糖蜜豆饼粉培养基发酵法生产四甲基吡嗪，发酵转化葡萄糖或蔗糖及工业原料糖蜜和豆饼粉生成四甲基吡嗪的前驱物质3-羟基-2-丁酮，在微生物酶的生物催化作用下，大量存在的前驱物质3-羟基-2-丁酮转化生成四甲基吡嗪。
发酵法生产四甲基吡嗪的培养基以g/L计，以蒸馏水定容至1L，选用：
(1)葡萄糖培养基：葡萄糖100-150，蛋白胨30，酵母膏10，磷酸氢二铵30，pH7.0-7.5；
(2)蔗糖培养基：蔗糖100-150，蛋白胨30，酵母膏10，磷酸氢二铵30，pH7.0-7.5；
(3)蔗糖豆饼粉培养基：蔗糖100-150，豆饼粉40，酵母膏5，磷酸氢二铵30，pH7.0-7.5；
(4)糖蜜培养基：糖蜜处理液占培养基体积的21％-27％，蛋白胨30，酵母膏10，磷酸氢二铵30，pH7.0-7.5；
或(5)糖蜜豆饼粉培养基：糖蜜处理液占培养基体积的21％-27％，豆饼粉40，酵母膏5，磷酸氢二铵30，pH7.0-7.5。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 208157，在装有50mL上述葡萄糖培养基或蔗糖培养基的250mL摇瓶中，于37℃条件下，在摇床上以200rpm的转速发酵培养120h，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为3.25或3.68克每升的四甲基吡嗪。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC M 208157，在装有50mL上述蔗糖豆饼粉培养基的250mL摇瓶中，于37℃条件下，在摇床上以200rpm的转速发酵培养120h，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为4.08克每升的四甲基吡嗪。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC M 208157，在装有50mL上述糖蜜培养基的250mL摇瓶中，于37℃条件下，在摇床上以200rpm的转速发酵培养120h，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为2.97克每升的四甲基吡嗪。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC M 208157，在装有50mL上述糖蜜豆饼粉培养基的250mL摇瓶中，于37℃条件下，在摇床上以200rpm的转速发酵培养120h，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为3.19克每升的四甲基吡嗪。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC M 208157，在装有4-5L上述蔗糖豆饼粉培养基的7L发酵罐中，糖蜜处理液浓度为24％，设置搅拌转速为400-600rpm、温度为37℃、通气量1vvm，发酵培养基初始pH值为7.5，发酵过程中流加酸或碱控制发酵液pH值为7.5，发酵时间为120小时，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为3.92克每升的四甲基吡嗪。
本发明的有益效果：所述的高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M208157发酵法生产四甲基吡嗪，通过大量积累内源前驱物质3-羟基-2-丁酮可显著提高四甲基吡嗪的产量。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 208157可发酵转化葡萄糖或蔗糖及工业原料糖蜜和豆饼粉生成四甲基吡嗪的前驱物质3-羟基-2-丁酮，在微生物酶的生物催化作用下，大量存在的前驱物质3-羟基-2-丁酮转化生成四甲基吡嗪。
所述枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 208157来源于酱香型白酒的高温大曲，其发酵产物四甲基吡嗪符合相关食品安全法则，对人、动物安全无毒害，属于绿色安全食品。
产物四甲基吡嗪的浓度高，菌种发酵性能稳定。
该工艺具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富和生产成本低等特点，极具诱人的工业应用前景。
本发明提供的高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌，即Bacillus subtilis菌株，解决了微生物发酵法生产四甲基吡嗪中发酵产物浓度低、需外源添加前驱物质提高四甲基吡嗪的产量和外源添加前驱物质利用率低的问题。本发明菌株来源于高温大曲，发酵产物食品安全性高，能够以葡萄糖或蔗糖及工业原料糖蜜和豆饼粉为原料直接内源生成四甲基吡嗪的前驱物质3-羟基-2-丁酮，从而极大地促进了发酵液中四甲基吡嗪的生成(四甲基吡嗪的摇瓶发酵浓度可达4.08克每升)。微生物发酵法通过内源大量积累前驱物质的方法提高四甲基吡嗪产量的工艺具有原料价廉易得、反应条件温和、产品绿色天然和环境友好等有点。
生物材料样品保藏
一株产四甲基吡嗪的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008年10月11日，其保藏编号为CCTCC NO：M 208157。
附图说明
图1本发明的Bacillus subtilis CCTCC NO：M 208157菌株的芽孢放大60000倍的电镜照片。
图2本发明的Bacillus subtilis CCTCC NO：M 208157菌株在蔗糖豆饼粉培养基中发酵液的分析及四甲基吡嗪和前驱物质3-羟基-2-丁酮的鉴定。经质谱MS鉴定：2.768min的峰为内标2-庚酮；3.734min的峰为3-羟基-2-丁酮，6.067min的峰为四甲基吡嗪。
图3本发明的Bacillus subtilis CCTCC NO：M 208157菌株在蔗糖豆饼粉培养基中发酵生产四甲基吡嗪的情况。
具体实施方式
实施例1：高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC NO：M208157菌株的筛选
本发明涉及的菌株来源于生产‘口子窖酒’、‘郎酒’、‘今世缘’和‘茅台酒’等酱香型白酒的高温大曲。取一定量的上述大曲，粉碎后加入盛有玻璃珠的适量无菌生理盐水中，在37℃、150rpm摇床上振荡24小时；制成的菌悬液于80℃水浴20min，流水冷却；取适量上述菌悬液无菌操作接入肉汤培养基中， 37℃、150rpm培养18h，梯度稀释涂布平板，于37℃培养48h；挑取生长较好、性状不同菌落接种于肉汤琼脂斜面，作为筛选用菌株。
将上述菌接种MR-VP培养基中，37℃培养48h，按Meara法进行V-P试验，取1ml发酵液加1ml含0.3％肌酸的40％ NaOH溶液于试管中，震荡1min，静置于30℃培养箱10min，以混合液出现伊红色代表V-P试验阳性，选取颜色较深的上述菌株作为初筛菌株。
将上述菌株接种于修改的PYG培养基中，37℃培养48h，取一定量的发酵液GC分析四甲基吡嗪和3-羟基-2-丁酮的浓度，选取四甲基吡嗪产量最高的菌株，再经过多次分离筛选，得到XZ-1124菌株。
由生理生化鉴定试验表明，上述试验得到的菌株为革兰氏阳性、好氧、化能异养菌，从葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖产酸，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，V-P反应阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐；其16S rRNA基因序列与多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S rRNA的基因序列具有高度同源性(>99％)。
实施例2：CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物的制备
步骤1：斜面培养物活化：将CCTCC NO：M 208157菌种接种于肉汤琼脂培养基，37℃条件下，静置培养24-48h，备用；
步骤2：液体种子培养物的制备：将步骤1培养的菌株，在无菌条件下用接种环挑1-2环于装有30-50ml液体种子培养基的250ml摇瓶中，置摇床上以旋转转速为150-200rpm、35-40℃培养16-20小时，即制得液体种子培养物。
实施例3：利用上述CCTCC NO：M 208157菌株在蔗糖培养基中发酵法生产四甲基吡嗪。
将上述实施例2的CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物以体积百分比为5％的接种量接种到装有已灭菌的50mL蔗糖培养基的250mL摇瓶中，于转速为200rpm的摇床上，37℃培养96-120小时，发酵液中前驱物质3-羟基-2-丁酮的积累量为31.0克每升，四甲基吡嗪的浓度可达3.68克每升。
上述蔗糖培养基的成分为(克，每升蒸馏水)：蔗糖100，蛋白胨30，酵母膏10，磷酸氢二铵30，调节培养基初始pH7.5。
实施例4：利用上述CCTCC NO：M 208157菌株在葡萄糖培养基中发酵法生产四甲基吡嗪。
将上述实施例2的CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物以体积百分比为2-5％的接种量接种到装有已灭菌的50ml葡萄糖培养基的250ml摇瓶中，于转速为200rpm的摇床上，37℃培养96-120小时，发酵液中前驱物质3-羟基-2-丁酮的积累量为28.2克每升，四甲基吡嗪的浓度可达3.25克每升。
上述葡萄糖培养基的成分为(克，每升蒸馏水)：葡萄糖100，蛋白胨30， 酵母膏10，磷酸氢二铵30，调节培养基初始pH7.5。
实施例5：利用上述CCTCC NO：M 208157菌株在糖蜜培养基中发酵法生产四甲基吡嗪。
将上述实施例2的CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物以体积百分比为2％-5％的接种量接种到装有已灭菌的50mL蔗糖豆饼粉培养基的250mL摇瓶中，于转速为200rpm的摇床上，37℃培养96-120小时，发酵液中前驱物质3-羟基-2-丁酮的积累量为26.6克每升，四甲基吡嗪的浓度可达2.97克每升。
上述糖蜜培养基的成分为(克，每升蒸馏水)：糖蜜处理液24％(v/v)，蛋白胨30，酵母膏10，磷酸氢二铵30，调节培养基初始pH7.5。
实施例6：利用上述CCTCC NO：M 208157菌株在蔗糖豆饼粉培养基中发酵法生产四甲基吡嗪。
将上述实施例2的CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物以体积百分比为2-5％的接种量接种到装有已灭菌的50mL蔗糖豆饼粉培养基的250mL摇瓶中，于转速为200rpm的摇床上，37℃培养96-120小时，发酵液中前驱物质3-羟基-2-丁酮的积累量为34.7克每升，四甲基吡嗪的浓度可达4.08克每升。
上述蔗糖豆饼粉培养基的成分为(克，每升蒸馏水)：蔗糖100，豆饼粉40，酵母膏5，磷酸氢二铵30，调节培养基初始pH7.5。
实施例7：利用上述CCTCC NO：M 208157菌株在糖蜜豆饼粉培养基中发酵法生产四甲基吡嗪。
将上述实施例2的CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物以体积百分比为2-5％的接种量接种到装有已灭菌的50mL蔗糖豆饼粉培养基的250mL摇瓶中，于转速为200rpm的摇床上，37℃培养96-120小时，发酵液中前驱物质3-羟基-2-丁酮的积累量为29.5克每升，四甲基吡嗪的浓度可达3.19克每升。
上述糖蜜豆饼粉培养基的成分为(克，每升蒸馏水)：糖蜜处理液24％(v/v)，豆饼粉40，酵母膏5，磷酸氢二铵30，调节培养基初始pH7.5。
实施例8：利用上述CCTCC NO：M 208157菌株在7L发酵罐中发酵法生产四甲基吡嗪。
将上述实施例2的CCTCC NO：M 208157菌株的液体种子培养物以体积百分比为以2％-5％的体积比的接种量，接种于装有4-5L蔗糖豆饼粉发酵培养基的7L发酵罐中，设置发酵罐搅拌转速为400-600rpm、温度为35-40℃、通气量1vvm，发酵时间为96-112小时，发酵培养基初始pH值为7.0-7.5，发酵过程中流加酸碱控制发酵液pH值为7.0，发酵过程中间隔一定时间取样分析发酵液中的葡萄糖、四甲基吡嗪和3-羟基-2-丁酮的含量，当发酵液中四甲基吡嗪的浓度不再上升时结束发酵。发酵120小时，发酵液中前驱物质3-羟基-2-丁酮的积累量为33.7克每升，四甲基吡嗪的浓度可达3.92克每升。
上述蔗糖豆饼粉培养基的成分为(克，每升蒸馏水)：蔗糖100，豆饼粉40，酵母膏5，磷酸氢二铵30，调节培养基初始pH7.5。
利用上述Bacillus subtilis CCTCC NO：M 208157菌株发酵法生产四甲基吡嗪过程中发酵液成分分析方法为：取上述发酵液以8000-10000rpm离心8-10分钟，测定上清液中葡萄糖的含量，取5mL上清液加入一定量的二氯甲烷萃取，用气相测定萃取相中四甲基吡嗪和3-羟基-2-丁酮的含量。
上述气相色谱定量分析的方法为：GC6890，使用DB-Wax柱，载气为氮气(N2)；进样口温度250℃，检测器温度250℃；程序升温：50℃维持2分钟，然后以10℃/min的速度升到210℃，保持2分钟；进样量1μL；分流比为2。在上述条件下3-羟基-2-丁酮的保留时间为3.7分钟，四甲基吡嗪的保留时间为6.1分钟。
Claims (4)
1.一株产四甲基吡嗪的菌株，其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XZ1124，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M208157。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征是该枯草芽孢杆菌的细菌学特征是：菌落形态初期为灰色、突起、圆形、表面光滑有光泽，培养后期菌落边缘呈不规则状，表面扁平、灰白色、无光泽；显微镜镜检为短杆状，长1.6-3.0μm，直径0.6-0.7μm，产芽孢；生理生化特征为革兰氏阳性、好氧、化能异养菌，从葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖或蔗糖产酸，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，V-P反应阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐；其16S rRNA基因序列与多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S rRNA的基因序列具有＞99％同源性。
3.在用枯草芽孢杆菌发酵生产四甲基吡嗪的方法中提高四甲基吡嗪产量的方法，其特征是枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 208157在装有50mL葡萄糖培养基或蔗糖培养基的250mL摇瓶中，于37℃条件下，在摇床上以200rpm的转速发酵培养120h，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为3.25或3.68克每升的四甲基吡嗪；
所述葡萄糖培养基以蒸馏水定容至1L：葡萄糖100-150g/L，蛋白胨30g/L，酵母膏10g/L，磷酸氢二铵30g/L，pH7.0-7.5；
所述蔗糖培养基以蒸馏水定容至1L：蔗糖100-150g/L，蛋白胨30g/L，酵母膏10g/L，磷酸氢二铵30g/L，pH7.0-7.5。
4.在用枯草芽孢杆菌发酵生产四甲基吡嗪的方法中提高四甲基吡嗪产量的方法，其特征是枯草芽孢杆菌CCTCC M 208157在装有50mL蔗糖豆饼粉培养基的250mL摇瓶中，于37℃条件下，在摇床上以200rpm的转速发酵培养120h，在大量积累前驱物质3-羟基-2-丁酮的情况下，得到浓度为4.08克每升的四甲基吡嗪；
所述蔗糖豆饼粉培养基以蒸馏水定容至1L：蔗糖100-150g/L，豆饼粉40g/L，酵母膏5g/L，磷酸氢二铵30g/L，pH7.0-7.5。
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