CN101444630B

CN101444630B - 一种具有肿瘤靶向功能的高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子的制备方法

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Publication number: CN101444630B
Application number: CN2008102207275A
Authority: CN
Inventors: 帅心涛; 苑仁旭; 洪国斌; 梁碧玲
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: CN101444630A

Abstract

本发明公开了一种具有肿瘤靶向功能高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子的制备方法，是将肿瘤靶向配体封端的两亲性的嵌段聚合物和超顺磁性四氧化三铁溶解在四氢呋喃中，再将得到的溶液加入到去离子水或蒸馏水中，挥去四氢呋喃，分离溶液中的超顺磁性氧化铁，用蒸馏水洗涤，然后分散到去离子水或蒸馏水中，离心，即得；所述瘤靶向配体为叶酸、多肽或抗体。本发明通过把亲油性的四氧化三铁纳米粒子负载到自组装形成的胶束的内核，开发了一种具有肿瘤靶向性，溶于水，尺寸在50纳米以下的四氧化三铁纳米粒子，通过在胶束表面耦连叶酸或抗体来实现胶束的肿瘤靶向功能，具有广泛的应用前景。

Description

一种具有肿瘤靶向功能的高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子的制备方法

技术领域

本发明涉及一种四氧化三铁纳米粒子的制备方法，尤其是一种具有肿瘤靶向功能、磁共振显像灵敏度高的、小粒径四氧化三铁纳米粒子的制备方法，属高分子化学和生物医学工程领域。

背景技术

核磁共振显像(MRI)是临床医学中一种非常重要的诊断技术，近年来，科研工作者付出了越来越多的努力以便提高其分辨率和对比质量。把对比试剂靶向地传输到目的部位是一种非常重要的方法，这样既可以提高对比效果又可以降低负面影响和毒性。磁共振技术对于检测疾病的早期征兆尤其有用。超顺磁性氧化铁或超顺磁性四氧化三铁(super paramagnetic iron oxide，SPIO)，是磁共振的新型对比剂，由于它的组织特异性高、安全性强在国外已作为磁共振对比剂用于某些癌症的早期诊断，甚至可以在分子和细胞水平上无创监测体内的情况。到目前为止，大家对于超顺磁性纳米粒子的注意力主要集中在四氧化三铁(Fe₃O₄)和三氧化二铁(γ-Fe₂O₃)。

现有技术中磁性纳米粒子通常通过在水溶液中的共沉淀方法来制备，该方法适宜于大批量生产磁性纳米颗粒，但是，在合成过程中需要严格控制溶液的pH值，难以控制粒径和粒径分布，尤其是当粒径的尺寸小于20纳米时。高温分解法得到的纳米粒子的粒径比较容易控制，尺寸分布单一。高温分解法得到的磁性纳米粒子更加适宜于生物应用，比如用于磁共振显像、磁性细胞分离，在这些应用中要想达到长循环或者细胞的有效吸收通常要求纳米粒子具有良好的粒径和均一的粒径尺寸分布。然而，为了防止纳米粒子聚集，用这种方法制备的纳米粒子表面通常被一些亲油性的表面活性剂分子覆盖。这些表面活性剂较长的碳链使得SPIO粒子的表面具有高度的亲油性，使得SPIO在水中的溶解度非常差，进而限制它们在生物方面的应用。而且，具有高度亲油性表面的SPIO很容易被血液中的成分包裹住，进而很快被从血液循环中排出。因此，对于用在生物方面的磁性氧化物晶体进行表面改性是非常必要的。理想的表面改性应该具有以下特点：(a)在生理环境下可以稳定分散SPIO；(b)在粒子表面提供一些反应性官能团以便于进一步改性；(c)可以抑止网状内皮***对纳米粒子的吸收。到目前为止，一些方法已经成功的把亲油性的SPIO转化为亲水性，比如配体交换法、双极性分子法、高分子稳定剂法。这些改性可以避免SPIO的亲油性表面暴露在外面，防止被血液蛋白的吸收，并有可能延长SPIO在血液中的循环时间。当前，越来越多的注意力被集中到利用两亲性的聚合物来改性SPIO的表面，因为相对于小分子表面活性剂来说，它们具有更好的胶体稳定性。比如，用两亲性的聚-马来酸酐-alt-1-十四烯)负载油性的SPIO，然后再用己二胺交联，即可得到亲水性的SPIO；由聚氧化乙烯和聚氧化丙稀组成的ABA-型三嵌段聚合物(Pluronic F127)也被用于把亲油性的SPIO转化为亲水性的SPIO。另外，把亲油性的磁性纳米粒子团簇负载到聚合物胶束的内核可以得到一种超灵敏的磁共振显像自旋-自旋弛豫时间(MRI T₂)对比剂。这些方法已经被证明可以成功的制备具有良好单分散性、较高水溶液中稳定性的磁性纳米粒子。值得一提的是以上文献中报道的方法所制备的纳米粒子都缺乏对于病灶部位的特异性，进而限制了它们在体内的应用。实际上，SPIO作为显像探针多数令人信服的体内实验结果都是用粒径小于50纳米的SPIO得到的。在减小粒径以便于长循环的同时，提高MRI敏感性，并兼具分子靶向实现定点传输是磁共振对比剂研发中面临的重大挑战。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服已有技术的不足，目的在于提供一种具有肿瘤靶向功能的高磁共振灵敏度小粒径四氧化三铁纳米粒子的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种具有肿瘤靶向功能高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子的制备方法，是将肿瘤靶向配体封端的两亲性的嵌段聚合物和超顺磁性四氧化三铁溶解在四氢呋喃(THF)中，再将得到的溶液加入到去离子水或蒸馏水中，挥去THF，分离溶液中的超顺磁性四氧化三铁，用蒸馏水洗涤，然后分散到去离子水或蒸馏水中，离心，即得。

所述瘤靶向配体为叶酸、多肽、抗体。

所述叶酸或抗体功能化比率为0～100％。

所述肿瘤靶向配体封端的两亲性的嵌段聚合物的亲水段为聚乙二醇，亲油段为聚酯，如聚己内酯，聚乳酸等；聚乙二醇段的分子量为1000～5000Da，比较好的是2500～3500Da；亲油性的聚酯的分子量为500～2500Da，比较好的是800～1500Da。

所述将溶液加入到去离子水或蒸馏水中，优选方案是在超声作用下将溶液加入到去离子水中。

所述挥去THF可采用室温条件下搅拌的方法。

所述分离溶液中的SPIO是用用磁铁分离溶液中的SPIO。

所述离心的优选方案是在3000rpm下离心10min。

本发明的上述技术方案是采用溶剂挥发法，把亲油性的单颗粒四氧化三铁纳米粒子负载到两亲性的聚合物所形成的胶束内部，每个胶束中只负载一个四氧化三铁纳米粒子，其中，用蒸馏水洗涤是为了除去过量的聚合物；把得到的产物再次分散到蒸馏水中，然后离心是为了除去其中的较大的聚集体。

所述具有肿瘤靶向功能高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子(SPIO)的制备方法，更具体可描述为：

将20mg含20％叶酸-聚乙二醇-聚己内酯(folate-PEG-PCL)的烯丙基-聚乙二醇-聚己内酯(ally-PEG-PCL)混合物和2mg亲油性的四氧化三铁纳米粒子溶解在1mL THF中，在超声作用下缓慢滴加到10mL去离子水中，室温下搅拌48小时以使THF挥发完全。然后用磁铁分离出溶液中的SPIO，并用蒸馏水洗涤以除去过量的聚合物。最后，把所得产物再次分散到蒸馏水中，在3000rpm离心10min以除去其中较大的聚集体，即得新型肿瘤靶向功能的四氧化三铁纳米粒子。

所述的亲油性的四氧化三铁纳米粒子的直径为4～20纳米，较好的是6～10纳米。

所述的具有肿瘤靶向功能高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子的平均粒径为20～80nm，比较好的是30～50nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过把亲油性的四氧化三铁纳米粒子负载到聚乙二醇-聚己内酯或聚乳酸自组装形成的胶束的内核，开发了一种具有肿瘤靶向性，溶于水，尺寸在50纳米以下的四氧化三铁纳米粒子。本发明把单颗粒的SPIO负载到胶束的核内，通过在胶束表面耦连叶酸或肿瘤靶向抗体来实现胶束的肿瘤靶向功能。研究了负载单颗粒SPIO靶向胶束的MRI T₂敏感性并研究了其在1.5T MRI扫描仪上作为MRI T₂探针的潜力。

本发明通过把亲油性的四氧化三铁纳米粒子负载到两亲性的聚合物胶束内部，可以容易地得到亲水性的四氧化三铁纳米粒子，并通过对该负载四氧化三铁纳米粒子的靶向化修饰，通过在纳米胶束亲水性外壳结构中引入能与肿瘤细胞表面受体特异性结合的配体，利用配体与受体特异性结合的原理，产生纳米胶束对肿瘤细胞的主动靶向功能，降低毒副作用、延长生存期；同时，通过纳米胶束高效负载SPIO及延长胶束在体内的循环时间，负载SPIO的纳米胶束可望作为一种新型、特异性MRI分子探针，以促进MRI对早期肿瘤的靶向诊断。

而且，本发明制备的纳米粒子在肿瘤的诊断方面具有重要的意义，和现有技术常规的磁共振对比剂相对，这种方法制备的磁共振对比剂具有制备方法简便，制得的纳粹粒子磁共振灵敏度高等特点；本发明的制备方法，用肿瘤靶向配体修饰生物相容性好、可生物降解的两亲性嵌段共聚物为载体原料，制备可以溶于水的四氧化三铁纳米粒子，该四氧化三铁纳米粒子具有粒径小、磁共振显像灵敏度高和肿瘤靶向功能。

本发明提供的制备方法，通过把SPIO负载到叶酸-聚乙二醇-聚己内酯(folate-PEG-PCL)或肿瘤靶向抗体-聚乙二醇-聚己内酯(Antibody-PEG-PCL)胶束的内核得到了溶于水、具有肿瘤靶向性的超顺磁氧化铁纳米粒子，负载单颗粒SPIO的胶束(Fa-PEG-PCL-SPIONs)具有较小的尺寸(40nm)有助于体内长循环，同时还具有较高的MRI T₂敏感度，叶酸功能化可以提高细胞对SPIO胶束的吸收；而且，体内MRI实验和体外组织学分析表明靶向化的聚乙二醇-聚己内酯-四氧化三铁纳米粒子(PEG-PCL-SPIONs)可以在肿瘤组织内聚集，表明其有作为受体过渡表达的肿瘤所用的MRI诊断探针的潜力。

附图说明

图1是合成四氧化三铁纳米粒子的示意图；

图2是实施例6中6nm亲油性的SPIONs透射电镜图片；亲油性的SPIONs可以溶解在正己烷中，而不能溶解在水中；

图3是实施例6中两亲性的聚合物改性的SPIO(PEG-PCL-SPIONs)透射电镜图片；PEG-PCL-SPIONs可以溶解在水中，而不能溶解在正己烷中；

图4是实施例6中四氧化三铁纳米粒子的电子衍射图；其中的1、2、3、4、5、6是标注了六个衍射环及其相应波长，可以据此推断其是四氧化三铁纳米粒子。

图5是实施例6中空白聚乙二醇-聚及内酯及负载单颗粒四氧化三铁纳米粒子的聚乙二醇-聚及内酯胶束的粒径。

图6是实施例6中6nm Fe₃O₄纳米粒子的磁滞曲线；测量温度为300K和10K。

图7是实施例6中PEG-PCL-SPIONs的磁滞曲线，测量温度为300K和10K；由图可知，合成的Fe₃O₄粒子与PEG-PCL-SPIONs均具有超顺磁性，饱和磁化强度可观，能作为MRI对比剂。

图8是实施例6中PEG-PCL-SPIONs和WSPIO T₂驰豫率(1/T₂，s^-1)与铁浓度之间的关系(mM)(1.5T，25℃)图。

图9实施例7中叶酸修饰的PEG-PCL-SPIONs在体外对肝癌细胞的靶向效果图。

图10和图11是实施例7中T₂-加权MRI图像(TT/TE，5000/100ms)注射前(图10)和注射后3.5小时(图11)老鼠肿瘤部位信号强度的变化，注射量为5mg of Fe/kg裸鼠的重量，注射方式为尾静脉注射，肿瘤的直径为1cm左右；图10和图11中，1为肿瘤，2为肌肉组织。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

叶酸修饰的肿瘤双靶向纳米胶束载体材料folate-PEG-PCL或folate-PEG-PLA的制备

1)烯丙基-聚乙二醇-聚己内酯的合成(ally-PEG-PCL)

利用环氧乙烷(EO)和己内酯(ε-CL)的阴离子开环聚合物合成两嵌段共聚物。向三口瓶中加入0.48g萘，室温真空干燥12h，加入约20mL新蒸的THF，磁力搅拌均匀，加入过量的钾，搅拌0.5h，制备萘钾试剂。向二口瓶中加入0.25mL的丙烯醇和萘钾试剂，磁力搅拌0.5h，加入预先36℃真空干燥12h的1.0g 18-冠-6醚的THF溶液，搅拌0.5h。在冰盐浴条件下，通入约25mL的干燥的环氧乙烷，室温搅拌反应5天。在搅拌下，向反应体系继续加入7.0mL的己内酯，室温反应3天。产物先用石油醚沉淀除去萘，再用二氯甲烷溶解，***沉淀洗涤，真空干燥。

¹H-NMR(CDCl₃)：δ＝1.40(m，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，1.65(m，4H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，2.31(t，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，3.65(s，4H，-CH₂CH₂O-)，4.05(t，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，4.2(s，2H，-CH₂CH₂OCO-)，5.15～5.30(q，1H，CH₂＝CH-)，5.80(m，2H，CH₂＝CH-).

2)氨基-聚乙二醇-聚己内酯的合成(H₂N-PEG-PCL)

称取2.0g Ally-PEG-PCL(Mn＝3800Da)，溶于约8mL的THF中，过滤除去不溶物。在超声乳化下，滴加到60mL的二次去离子水中，搅拌挥发过夜，用旋转蒸发仪除去残留的THF，制备Ally-PEG-PCL的胶束水溶液。移取30mL的胶束溶液，用氮气鼓泡半小时后，依次加入308.3mg的半胱胺盐酸盐和36.7mg的K₂S₂O₈，50℃油浴下反应6小时。

反应停止后，将体系溶液在30℃下旋转蒸发浓缩至10mL，用截留分子量为1K的透析袋透析，以除去未反应的硫醇和过硫酸钾，然后冻干。得白色粉状产物，收率为80.3％。

¹H-NMR(CDCl₃)：δ＝1.40(m，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，1.65(m，4H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，2.31(t，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，2.65～2.70(m，4H，-CH₂SCH₂-)，2.94(t，3H，H₂NCH₂CH₂S-)，3.65(s，4H，-CH₂CH₂O-)4.05(t，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，4.2(s，2H，-CH₂CH₂OCO-).

3)叶酸-聚乙二醇-聚己内酯的合成(folate-PEG-PCL)

1g叶酸加入50ml两口瓶中，真空干燥5h后，加入30ml干燥的二甲基亚砜(DMSO)，然后依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.9g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.5g，避光反应12h，离心去掉反应生成的N，N′-二环己基脲(DCU)；随后，把活化的叶酸加入到溶有0.4g NH₂-PEG-PCL(Mn＝3800Da)的5ml DMSO溶液中，然后用三乙胺把反应体系pH值调到8，避光反应24h，用的透析袋(截流分子量＝1kDa)在蒸馏水中透析72h，冷冻干燥得黄色粉末状产物。把粉末状产物溶解在THF(3mL)中，过虑，除去不溶物，虑液在搅拌下滴到水中。挥发除去其中的THF，得到的胶束溶液透析五天以便除掉未反应的叶酸及残留的THF(截流分子量＝8kDa)。把胶束溶液冻干的粉末状产物(产率≥82％)。

¹H-NMR(DMSO-d₆)：δ＝1.40(m，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，1.65(m，4H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，2.31(t，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，2.65～2.70(m，4H，-CH₂SCH₂-)，3.2(t，3H，H₂NCH₂CH₂S-)，3.65(s，4H，-CH₂CH₂O-)，4.05(t，2H，-COCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂O-)，4.2(s，2H，-CH₂CH₂OCO-)，4.45(d，2H，C₉-H₂ of folic acid)，6.61(d，2H，aromatic protons offolic acid)，7.60(d，2H，aromatic protons of folic acid)，8.62(s，1H，C₇-H of folicacid).

实施例2

1)α-羟基-ω-氨基聚乙二醇(HO-PEG-NH₂)的合成

在三口瓶中加入1g萘，室温下真空干燥24h，迅速加入20mL干燥的THF，搅拌待萘溶解后，迅速加入新鲜金属钾1g，搅拌0.5h后溶液变成墨绿色；称取0.7g(5.73mmol)18-冠-6醚加入到100mL三口瓶中，在40℃左右真空干燥24h后加入20mL干燥的THF溶解；移取0.5mL干燥的乙醇胺置于另100mL三口瓶中，把萘钾溶液移入盛有乙醇胺的三口瓶中，搅拌0.5h，反应颜色变为深红色，迅速把萘钾和乙醇胺的THF溶液转移入盛有18-冠-6醚三口瓶中，搅拌0.5h(所有操作均在氩气保护下进行)。

把盛有引发剂的反应瓶置于冰盐浴中，在氩气保护下通1h经3

分子筛干燥过的环氧乙烷，反应体系颜色逐渐变为透明黄色，黏度加大，室温下继续反应72h；加入盐酸调pH值至4.5，粗产物沉淀在正己烷中，然后溶解在二氯甲烷中，沉淀在冷无水***中，过滤后再用无水***洗涤产物，得到白色粉末状固体。

2)α-羟基-ω-马来酰亚胺聚乙二醇(mal-PEG-OH)的合成

2g H₂N-PEG-OH(Mn＝3600Da)溶解到饱和碳酸氢钠水溶液中(5mL)，冷却到0℃。在强烈搅拌下加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺(0.1g)至上述溶液。10min后加入10mL双蒸水，再把反应物搅拌45min。用0.5N的硫酸把溶液的pH值调至3.0，加入15wt％的氯化钠。用二氯甲烷萃取反应物，把3次的萃取液合到一起，用无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发仪除掉滤液中的部分二氯甲烷，沉淀至大量无水***中，过滤，把收集到的沉淀在室温下真空干燥。产物为白色固体粉末，产率90％。

3)马来酰亚胺-聚乙二醇-聚己内酯的合成(mal-PEG-PCL)

氩气保护下将0.2g马来酰亚胺基PEG在70℃下真空干燥8h，加三滴Sn(Oct)₂继续干燥0.5h，然后加入20mL干燥的的ε-己内酯，在105℃搅拌反应24h；冷却后加入5mL乙醇溶解未反应的ε-己内酯，过滤，粗产品溶于15mL四氢呋喃，沉淀在大量无水***中，过滤后干燥得白色粉末状产物，产率95％。

4)抗体-聚乙二醇-聚己内酯的合成(antibody-PEG-PCL)

a CD3抗体50μL用EDTA溶液(10μL 0.5M)预处理15min。

b把60mg巯基乙胺溶解在0.5mL PBS(含10μL，0.5M EDTA)，在4℃孵育15min。然后加入到上述含CD3抗体的溶液中。在37℃孵育90min。然后超滤离心3次(用PBS洗涤含EDTA)，除掉过量的巯基乙胺。

c 把含有游离巯基的抗体立即与含有mal-PEG-PCL(10μg)的PBS(含EDTA)溶液混和(预冷)，在4℃放置过夜。离心三次(用PBS洗涤，不含EDTA)，除去其中的EDTA，以免影响下一步反应。

实施例3

亲油性超顺磁四氧化三铁的合成

在无水无氧和氮气保护条件下，快速加入Fe(acac)₃(2mmol)、1，2-Hexadecandiol(10mmol)、油酸(6mmol)、油胺(6mmol)和20mL苄醚，磁力搅拌均匀。在磁力搅拌和氮气保护下，在砂浴中迅速升温到200℃，待温度稳定后，持续加热2小时。然后，迅速升温至回流状态(外浴温度约为300℃)，持续回流1小时。反应完后，反应体系移离热源，在氮气保护条件下，冷却至室温。

在大气气氛、磁力搅拌条件下，将黑色的产物加入到约3～4倍体积比的无水乙醇中，搅拌均匀后，在10000r/min的条件下离心分离5min。将黑色的沉淀物溶于20mL的混有约0.05mL的油酸和0.05mL的油胺的正己烷中，在6000r/min的条件下离心分离10min。将上层黑色的溶液用约3～4倍体积比的无水乙醇进行沉淀，将混合液在6000r/min的条件下离心分离10min。黑色的沉淀物溶于20mL的正己烷中，存放于氩气氛围下的密封的试剂瓶中，并置于冰箱保存。

实施例4

20mg ally-PEG-PCL和folate-PEG-PCL的混合物(含20％folate-PEG-PCL)、2mg SPIO溶解在1mL THF中。在超声作用下，把上述溶液滴加到10mL去离子水中，室温下搅拌48小时，挥发其中THF。用磁铁分离溶液中的SPIO，用蒸馏水洗涤出去过量的聚合物。把得到的产物再次分散到蒸馏水中，在3000rpm下离心10min以便除去其中的较大的聚集体。制备过程如图1所示，所制备的四氧化三铁纳米粒子的基本性质如表1所示。

表1四氧化三铁纳米粒子的基本性质

注：r1和r2值的单位为Fe mM-1s-1.[a]SPIO的表面被PEG-PCL所包裹，其中叶酸的含量为20％.[b]通过热分析法测定.[c]通过小分子表面活性剂得到的亲水性的SPIO.

实施例5抗体靶向PEG-PCL负载SPIO纳米粒子

20mg mal-PEG-PCL、2mg SPIO溶解在1mL THF中。在超声作用下，把上述溶液滴加到10mL去离子水中，室温下搅拌48小时，挥发其中THF。

1)CD3抗体50μL用EDTA溶液(10μL 0.5M)预处理15min。

2)把60mg巯基乙胺溶解在0.5mL PBS(含10μL，0.5M EDTA)，在4℃孵育15min。然后加入到上述含CD3抗体的溶液中。在37℃孵育90min。然后超滤离心3次(用PBS洗涤含EDTA)，除掉过量的巯基乙胺。

3)把含有游离巯基的抗体立即与含有mal-PEG-PCL(10μg)的PBS(含EDTA)溶液混和(预冷)，在4℃放置过夜。离心三次(用PBS洗涤，不含EDTA)，除去其中的EDTA，以免影响下一步反应。

用磁铁分离溶液中的SPIO，用蒸馏水洗涤出去过量的聚合物。把得到的产物再次分散到蒸馏水中，在3000rpm下离心10min以便除去其中的较大的聚集体。

实施例6负载单颗粒四氧化三铁纳米粒子胶束的基本性能的测试

1)负载单颗粒四氧化三铁纳米粒子胶束的粒径大小及形态的测试

所得胶束的粒径大小采用动态光散射***进行测量，其形态则通过透射电子显微镜来观察确定，测试结果见图2、图3、图4、图5。

2)负载单颗粒四氧化三铁纳米粒子胶束的磁学性质的测试

所得胶束的变温磁化率通过磁强计来测量，测试结果见图6、图7。

3)肿瘤靶向四氧化三铁纳米粒子的磁共振灵敏度的测定

MRI信号强度与物理和化学参数相关，如质子密度、自旋-晶格弛豫时间T₁、自旋-自旋弛豫时间T₂。T₁、T₂参数控制了成像的对比强度。在软组织中氢质子密度变化很小，因此在诊断中使用T₁加权成像、T₂加权成像。

MRI对比剂的效率可以通过它的纵向和横向松弛率r₁和r₂来评估。r₁和r₂分别反应了对比剂影响T₁和T₂的能力。r₂/r₁的比值越大，T₂类制剂的效率越高。

负载单颗粒四氧化三铁纳米粒子胶束的磁共振灵敏强度如图8和表1所示，图8中的横坐标是铁离子浓度，纵坐标是自旋-自旋弛豫时间T₂的倒数，结果显示其灵敏度高于小分子改性的四氧化三铁纳米粒子。

实施例7体外与体内成像

MRI扫描采用1.5T磁共振成像***(Philips Inter 1.5T)，环形表面线圈，轴位及冠状位扫描，T₁WI采用SE序列，TE 15ms，TR 500ms，层厚1.5mm，间距1mm，矩阵64×64，激励次数3。T2WI采用TSE序列，TE 100ms，TR2600ms，层厚1.5mm，间距1mm，矩阵64×64，激励次数4。分别测量感兴趣区信号，计算信号变化率(ΔSI)，ΔSI＝(SIL-SIU)/SI×100％，其中SIL及SIU分别为处理及未处理细胞的信号强度

1)体外实验：

将叶酸靶向和非叶酸靶向纳米胶束分别与人肝癌细胞Bel 7402共孵育1小时后，通过体外MRI成像，利用SPIO的T₂负性增强效应，观察信号强度变化情况，探索利用临床型MRI评价纳米胶束对Bel 7402细胞的靶向效应。

将Fe浓度分别为5、10、20、40和80μg/ml的叶酸靶向及非靶向纳米胶束分别与人肝癌细胞Bel 7402(细胞计数1×10⁶个)在无叶酸RPMI 1640培养基中共培养1h，用0.25％胰酶消化液消化，用PBS液洗涤并重悬细胞，置于1.5ml EP管(Ependoff管)中，行MRI扫描，同时以未作任何处理的Bel 7402细胞作为空白对照组。

如图9所示，叶酸受体介导的聚合物纳米胶束在体外细胞水平对人肝癌细胞Bel 7402具有较好的靶向效应。

2)动物实验

建立裸小鼠荷人肝癌皮下移植瘤动物模型，

利用SPIO(即Fe)的T₂负性对比增强效应，通过测量T₂WI上MRI信号强度、计算信号变化率(Rate of signal intensity variety)和对比噪声比(contrastnoise ratio，CNR)，反映局部肿瘤组织含Fe的情况，探索一种新的靶向投递***及利用临床型MRI仪对其进行监测的可行性。

扫描仪器为Philips Intera 1.5T MR成像***，环形表面线圈(即C3线圈)，行轴面及冠状面SE T₂WI和T₁WI扫描。SE T₂WI采用快速自旋回波(FSE)序列，TR 2600ms，TE 100ms，层厚2.0mm，矩阵256×256，视野(Field of view，FOV)120～150mm，激励次数4次。SE T₁WI扫描参数为TR 500ms，TE 15ms，层厚2.0mm，矩阵256×256，视野(Field of view，FOV)120～150mm，激励次数2次。

裸小鼠MRI检查步骤如下：

1)以4.3％水合氯醛(430mg/kg)对裸小鼠进行腹腔注射麻醉。

2)每只裸小鼠均先行平扫(plain scan)，即注射纳米粒子之前扫描作为基线扫描。

3)按分组要求，经鼠尾静脉分别注入叶酸靶向纳米粒子及非靶向纳米粒子。注射剂量为5mg Fe/kg。

4)注药后进行不同时点的MRI扫描。扫描时点的选择为注药后即刻(用st表示，指注药后10min以内)、1h、3h、6h及24h，共5个不同的扫描时间点。

5)MRI扫描完成后，将数据传至后处理工作站，进行后续的MRI图像分析。

如图10、图11、表2，在体MRI成像结果显示，注射叶酸靶向纳米胶束后肿瘤组织不同时点的T₂WI强度及信号变化率均有明显下降，具有统计学差异。而非靶向组在注射后立即、1h和3h三个时间点的信号亦有轻度下降，但下降幅度较叶酸靶向组小，且持续时间较靶向组短(非靶向组注射后6h的信号强度即恢复至平扫水平，而靶向组注射后24h的信号强度仍然维持在较低水平)。

表2注射四氧化三铁纳米粒子后裸鼠肿瘤部位磁共振信号强度随时间的变化

^*P＞0.05

Claims

1.一种具有肿瘤靶向功能高磁共振灵敏度四氧化三铁纳米粒子的制备方法，其特征是将肿瘤靶向配体封端的两亲性的嵌段聚合物和超顺磁性四氧化三铁溶解在四氢呋喃中，再将得到的溶液加入到去离子水或蒸馏水中，挥去四氢呋喃，分离溶液中的超顺磁性四氧化三铁，用蒸馏水洗涤，然后分散到去离子水或蒸馏水中，离心，即得；所述肿瘤靶向配体为叶酸、多肽或抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述肿瘤靶向配体封端的两亲性的嵌段聚合物的亲水段为聚乙二醇，分子量为1000～5000Da，亲油段为聚酯，分子量为500～2500Da。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述聚酯为聚己内酯或聚乳酸。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述将溶液加入到去离子水或蒸馏水中，是在超声作用下将溶液加入到去离子水或蒸馏水中。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述挥去四氢呋喃是在室温条件下搅拌挥发。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述分离溶液中的超顺磁性四氧化三铁是用磁铁分离溶液中的超顺磁性四氧化三铁。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述离心的是在3000rpm下离心10min。