CN101443355A - 活性钾通道转运蛋白（akt）及它们产生胁迫耐受性植物的用途 - Google Patents

Abstract

提供了胁迫相关多肽(SRP)编码核酸转化的转基因植物，其中所述核酸序列在植物中的表达导致植物与野生型变种植物相比，在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫的耐受性增加。还提供的是农产品，包括由转基因植物产生的种子。还提供了分离的SRP，和编码SRP的分离的核酸和包含所述核酸的载体和宿主细胞。

Description

活性钾通道转运蛋白(AKT)及它们产生胁迫耐受性植物的用途

发明背景

发明领域

本发明一般涉及核酸序列，其编码与植物生长加速相关的多肽。具体而言，本发明涉及编码多肽的核酸序列，所述多肽赋予植物在正常和非生物胁迫条件下生长加速和/或在非生物胁迫条件下耐性增加。

背景技术

非生物环境胁迫，如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫和冷胁迫是植物生长和生产力的主要限制因素。由这些胁迫引起的主要农作物如大豆、稻、玉米、棉花和小麦的农作物损耗和农作物产量降低代表了重要的经济和政治因素并造成了许多不发达国家的粮食短缺。

植物在其生活周期过程中通常暴露于环境水分含量减少的情况中。大多数植物已发展了对策来保护自身免于这些干燥条件。然而，如果干燥情况的严重性和持续时间太长，对大多数农作物植物的发育、生长和产量的影响是显著的。持续暴露于干燥情况中引起植物代谢的主要改变，其最终导致细胞死亡，因而产量降低。

开发胁迫耐受植物是具有潜力解决或调节至少一些这些问题的策略。然而，开发对这些类型的胁迫显示抗性(耐受性)的新株系的传统植物育种策略相对缓慢并且需要用于与期望株系进行杂交的特异的有抵抗力的株系。用于胁迫耐受性的有限种质资源和亲缘关系远的植物物种间的杂交不相容性代表了传统育种中遇到的重要问题。此外，在模式的耐干旱、耐寒和/或耐盐植物中导致耐干旱性、耐寒性和耐盐性的细胞过程本质上是复杂的并涉及细胞适应的多种机制和多种代谢途径。胁迫耐受性的这种多组分性质不仅使得培育耐受性多半不能成功，而且使得使用生物技术方法遗传改造胁迫耐受性植物的能力受限。

干旱胁迫、热胁迫、冷胁迫和盐胁迫具有对植物生长重要的共同主题，即水分可用性。如上讨论，大多数植物已发展对策来保护自身免于这些干燥条件，然而，如果干燥情况的严重性和持续时间太长，对大多数农作物植物的发育、生长和产量的影响是显著的。此外，大多数农作物植物对土壤中的较高盐浓度是非常敏感的。因为一些土壤中的高盐含量导致供细胞吸收的可用水更少，高盐浓度对植物的影响与干旱对植物的影响相似。此外，在冰冻温度以下，植物细胞因在质外体开始并从共质体吸取水分形成冰而失水。植物对每一种这些胁迫条件的分子应答机制是普遍的，并且离子转运蛋白在这些分子机制中起主要作用。

来自不同胁迫如干旱、盐度和冷胁迫的常见损伤似乎主要是因为脱水(Smirnoff，1998，Curr.Opin.Biotech.9：214-219)。通过离子和溶质在耐受性植物中的显著积累(其导致渗透调节)可以清楚地区分耐干旱(水胁迫)植物和干旱敏感植物(Bohnert和Jensen，1996，TIBTECH 14：89-97)。因为(1)通过土壤到达根的离子运输减少；和/或(2)根对离子的吸收受到改变，干旱和高盐条件可与矿质营养以许多方式相互作用。

钾是主要的植物常量营养物，并且钾离子是植物中最丰富的阳离子。钾的运动及运输对植物生长、发育、渗透调节和内环境稳定是重要的。植物中钾的转运蛋白已鉴定为属于包括HAK家族的若干家族。HAK家族含有与在大肠杆菌(Escherichia coli)和许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)中首次鉴定的钾转运蛋白具有同源性的成员。在拟南芥(Maeser等人，2001)和稻(Banuelos等人，2002)中发现这些HAK钾转运蛋白为大的基因家族。该HAK类钾转运蛋白的疏水性图提示这些蛋白质具有12个跨膜结构域和一个长的胞质环。该家族的一些成员已显示起低亲和力钾离子转运蛋白的作用(Quintero等人，1997)，而在其它生物中钾离子转运蛋白已显示起高亲和力转运蛋白的作用(Rubio等人，2000)。

钾不仅作为营养物，还作为渗压剂对植物特别重要。钾可以贡献30-50％的水势，特别是在较老的叶组织中(Munns等人，1979，Aust.J.Plant Physiol.6：379-389)。田地中长时期干旱后，钾积累在裸麦草和大麦的叶中，并可能在渗透调节中起作用。此外，钾在气孔的开放中起关键作用。因为钾从保卫细胞中损失(Ehret和Boyer，1979，J.Exper.Bot.30：225-234)，减少的钾供应相比于它降低内部电导而言更大地降低了对CO₂的气孔导度(Terry和Ulrich，1973，Plant Physiol.51：783-786)。

植物根可在超过1000倍浓度范围内吸收钾，并且根对钾吸收的浓度依赖性具有复杂的动力学，暗示存在多种钾吸收体系。已经在几种植物物种中鉴定了编码内向整流K+通道的基因家族。AKT1 K+通道基因主要在根中表达并且遗传分析表明AKT1通道介导微摩尔和毫摩尔范围内的K+吸收(Hirsch等人，1998，Science 280：918-921)。活性转运蛋白也参与K+吸收，并且已经鉴定了几种编码能化转运蛋白的候补基因(Hirsch和Sussman，1999，TIBTECH 17：356-361)。

植物生物量是饲料作物(像苜蓿、青贮饲料玉米和干草)的产量。产量的许多取代物已经用于谷类作物中。这些取代物中最主要的是植物大小评估。植物大小可以根据物种和发育阶段在许多方面进行测量，但是包括总植物干重、地上干重、地上湿重、叶片面积、茎体积、植物高度、莲座直径、叶长、根长、根质量、分蘖数目和叶数目。许多物种在给定发育阶段植物不同部分的大小间维持保守比例。这些异速生长关系用于从一种这些大小的测量外推到另一大小的测量(例如Tittonell等2005 Agric Ecosys& Environ 105：213)。早期发育阶段的植物大小通常与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶片面积的较大植物通常比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳并因此将可能在相同的期间内获得更大重量(Fasoula和Tollenaar 2005 Maydica 50：39)。除了微环境优势或遗传优势的潜在持续外，植物还必须最初实现较大尺寸。植物大小和生长速率具有强的遗传组分(例如ter Steege等人2005 Plant Physiology 139：1078)，并因此对于不同基因型范围，一种环境条件下植物大小有可能与在另一种环境条件下的大小相关(Hittalmani等人2003 Theoretical Applied Genetics107：679)。这样，标准环境用作田地中农作物在不同位置和时间遇到的不同环境和动态环境的代表。

收获指数——种子产量与地上干重的比值——在许多环境条件下相对稳定并因此可经常获得植物大小与谷物产量间的稳健相关(例如Rebetzke等人2002 Crop Science 42：739)。因为大多数谷物生物量依赖于通过植物叶和茎的当前或储藏的光合生产力，这些过程是内在关联的(Gardener等人1985 Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press，页68-73)。因此，甚至在发育早期选择植物大小已用作未来潜在产量的指示器(例如Tittonell等人2005 Agric Ecosys & Environ 105：213)。当检测遗传差异对胁迫耐受性的影响时，使土壤性质、温度、水和营养物可用性和光强度标准化的能力是温室或植物生长室环境相比于田地的优势。然而，由于缺少风或昆虫引起的授粉减弱造成对产量的人工限制，或成熟根或株冠生长需要的空间不足可以限制这些用于检测产量差异的受控环境的使用。因此，在生长室或温室中标准化条件下，对早期发育的植物大小的测量是提供潜在遗传产量优势的指示的标准实践。

在所有陆生光合生物中，二氧化碳(CO₂)吸收与水分损失间具有基本的生理化学上约束的折衷(Taiz和Zeiger，1991，Plant Physiology，Benjamin/Cummings Publishing Co.，页94)。CO₂需要处于水溶液中以便用于CO₂固定酶如Rubisco(核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶)和PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)的活化。因为CO₂扩散需要湿润的细胞表面，当湿度低于100％时蒸发将不可避免地发生(Taiz和Zeiger，1991，页257)。植物具有很多生理学机制来降低水分损失(例如蜡质角质层、气孔关闭、叶毛、凹陷的气孔窝)。因为这些屏障不能分辨水和CO₂流，这些水分保存措施将也增加对CO₂吸收的抗性(Kramer，1983，Water Relationsof Plants，Academic Press页305)。植物生长和光能自养植物中生物量的积累绝对需要光合CO₂吸收。

水分利用效率(WUE)是经常用于评估水分消耗和CO₂吸收/生长之间折衷的参数(Kramer，1983，Water Relations of Plants，Academic Press页405)。已经以多种方式定义并测量了WUE。一种方法是计算整株植物干重与植物一生消耗的水分重量的比值(Chu等人，1992，Oecologia89：580)。另一种变型是当测量生物量积累和水分利用时使用较短的时间间隔(Mian等人，1998，Crop Sci.38：390)。另一种方法是利用来自植物有限部分的测量，例如仅测量地上部分的生长和水分利用(Nienhuis等人1994 Amer J Bot 81：943)。WUE也被定义为经常在很短时间期限内(例如秒钟/分钟)测量的叶或叶部分的CO₂吸收与水蒸汽损失间的比值(Kramer，1983，406页)。在植物组织中被固定并用同位素比率质谱仪测量的¹³C/¹²C比值也已经用于评估使用C₃光合作用的植物中的WUE(Martin等人，1999，Crop Sci.1775)。

WUE的提高对相对提高的生长效率和耗水量可提供信息，但该信息单独不能说明这两个过程中的一个过程改变了还是两者均改变了。在选择用于改善农作物的性状中，由于水分利用减少而无生长改变导致WUE的提高将在水分输入费用高的灌溉农业***中具有特殊优点。主要由生长增加而水分利用没有相应上涨驱动的WUE的提高将适用于所有的农业***。在水分供应不受限制的许多农业***中，生长的增加，即使它以水分利用增加为代价(即WUE没有改变)也会增加产量。因此需要提高WUE和生物量积累的新方法以提高农业生产力。因为WUE整合了与初级代谢和水分利用相关的许多生理学过程，它通常是通过环境相互作用而具有大基因型的高度多基因性状(Richards等人，2002，Crop Sci.42：111)。因为这些原因和其它原因，在传统育种计划中选择WUE改变的尝试很少成功过。

虽然已经表征过植物中参与胁迫应答和水分利用效率的一些基因，但赋予胁迫耐受性和水分利用效率的植物基因的表征和克隆大多数不完整并且未完成。例如，某些研究已表明一些植物中干旱胁迫和盐胁迫可能是因为加性基因效应，其与表明特定基因在植物营养组织中渗透胁迫条件下被转录激活的其它研究相反。虽然通常认为胁迫诱导的蛋白质在耐受性中起作用，但仍然缺乏直接证据，并且许多胁迫应答基因的功能未知。

因此，需要鉴定在胁迫耐受性植物和水分利用有效的植物中表达的额外基因，其具有赋予宿主植物和其它植物物种胁迫耐受性和/或提高水分利用效率的能力。新产生的胁迫耐受性植物和水分利用效率提高的植物将具有许多优势，通过例如减少植物物种的需水量来增加培养农作物植物的范围。其它想要的优势包括增加应答风、雨、害虫或疾病中倒伏、枝条或茎弯曲的抗性。

发明概述

本发明部分完成了鉴定新的独特基因的需要，当修饰基因表达时，所述基因能够赋予植物胁迫耐受性和/或在正常或胁迫条件下增加的生长。本发明描述了新的种类的胁迫相关多肽(SRP)和SRP编码核酸，其对调节植物生长并应答环境胁迫是重要的。更具体而言，修饰植物中这些SRP编码核酸的表达导致植物在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加。

因此，本发明包括分离的植物细胞，其包含SRP编码核酸，其中核酸序列在植物细胞中的表达导致与野生型变种的植物细胞相比在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加。优选地，SRP是活性钾通道转运蛋白(AKT)。更优选地，所述AKT来自展叶剑叶藓(Physcomitrellapatens)、大豆(Glycine max)或普通小麦(Triticum aestivum)。即，此处描述的是展叶剑叶藓活性钾通道转运蛋白(PpAKT-3)、大豆活性钾通道转运蛋白(GmAKT-2)和普通小麦活性钾通道转运蛋白(TaAKT-1)。

本发明在一些实施方案中提供了：SRP和编码核酸是在剑叶藓属(Physcomitrella)、大豆属(Glycine)或小麦属(Triticum)的成员中发现的那些。在另一个优选实施方案中，核酸和多肽来自展叶剑叶藓植物、大豆植物或普通小麦植物。本发明提供环境胁迫可以是盐胁迫、干旱胁迫、氮胁迫、温度胁迫、金属胁迫、化学品胁迫、致病胁迫和氧化胁迫，或其组合。在优选的实施方案中，环境胁迫可以选自干旱、高盐和低温中的一种或更多种。

本发明还提供SRP编码核酸转化的转基因植物产生的种子，其中所述植物与野生型变种植物相比对于在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加是不分离的。

本发明还提供任何下述转基因植物、植物部分或种子产生的农产品。本发明还提供如下描述的分离的SRP。本发明还提供分离的SRP编码核酸，其中所述SRP编码核酸编码如下描述的SRP。

本发明还提供分离的重组表达载体，其包含如下描述的SRP编码核酸，其中载体在宿主细胞中的表达导致与野生型变种的宿主细胞相比植物在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加。本发明还提供包含载体的宿主细胞和包含宿主细胞的植物。

本发明还提供用SRP编码核酸产生转基因植物的方法，其中所述核酸在植物中的表达导致与野生型变种的植物相比植物在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加，所述方法包括：(a)用包含SRP编码核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从植物细胞产生转基因植物，其与野生型变种植物相比在正常或水分受限条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加。在优选的实施方案中，SRP和SRP编码核酸如下描述。

本发明还提供了鉴定新SRP的方法，其包括(a)如下描述，提高对SRP或其片段的特异抗体应答；(b)筛选具有所述抗体的推定的SRP物质，其中所述抗体与该物质的特异性结合表明存在潜在的新SRP；和(c)从结合的物质中鉴定与已知SRP相比新的SRP。或者，与如下描述的核酸探针杂交可用于鉴定新SRP核酸。

本发明也提供修饰植物生长和/或植物胁迫耐受性的方法，其包括修饰植物中SRP核酸的表达，其中所述SRP如下描述。本发明提供可以进行该方法，使得在正常或胁迫条件下的生长或胁迫耐受性增加或降低。优选地，通过增加SRP核酸的表达，在植物中在正常或胁迫条件下的生长或胁迫耐受性增加。

附图简述

图1显示基因名称与序列列表中SEQ ID NO的相关性。

图2显示公开的PpAKT-3(SEQ ID NO：2，EST472)、GmAKT-2(SEQID NO：4，GM59666231)和TaAKT-1(SEQ ID NO：6，TA59824966)氨基酸序列的详细比对。使用Vector NTI的Align X进行比对。用白色正文和黑色阴影标明在全部序列上相同的氨基酸，用黑色正文和浅灰色阴影标明序列中保守的氨基酸，并用白色正文和深灰色阴影标明在一些或全部序列上相似的氨基酸。钾转运蛋白结构域存在于：EST472的从氨基酸78至772、TA59824966的从氨基酸82至732，GM59666231的从氨基酸43至768。

发明详述

可参考本发明优选实施方案的以下详细描述和此处包括的实施例来更容易地理解本发明。然而，在公开并描述本化合物、组合物和方法前，应理解本发明不限于特定的核酸、特定的多肽、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定条件或特定方法等，因为这些当然可以变化，并且其中许多修改和变化对本领域的技术人员是显而易见的。也应理解此处所用的术语仅为描述特定实施方案的目的并不旨在限制。具体而言，指定氨基酸序列为“胁迫相关多肽”(SRP)决非限制这些序列的功能。

本发明描述了新的种类的SRP和SRP编码核酸，其对在正常或胁迫条件下调节植物生长和/或调节植物对环境胁迫的应答是重要的。更具体而言，修饰植物中这些SRP编码核酸的表达导致植物在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加。SRP属的典型成员包括，但不局限于PpAKT-3、GmAKT-2和TaAKT-1。在优选的实施方案中，该种类的所有成员均是生物学上有活性的离子转运蛋白。

因此，本发明包括胁迫相关多核苷酸和多肽序列及它们用于在正常或胁迫条件下增加植物生长和/或增加植物对环境胁迫的耐受性的用途。在一个实施方案中，所述SRP序列来自植物，优选来自剑叶藓属植物、大豆属植物或小麦属植物，并更优选来自展叶剑叶藓植物、大豆植物或普通小麦植物。在另一个实施方案中，所述SRP序列包括PpAKT-3(SEQ ID NOs：1和2)、GmAKT-2(SEQ ID NOs：3和4)和TaAKT-1(SEQ ID NOs：5和6)。下文表明了展叶剑叶藓AKT、大豆AKT和普通小麦AKT的公开的氨基酸序列，其与已知的活性钾通道转运蛋白具有显著的百分比同一性。

本发明提供SRP编码核酸转化的转基因植物细胞，其中修饰所述核酸序列在植物细胞中的表达导致与野生型变种植物细胞相比在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加。本发明还提供包含此处描述的植物细胞的转基因植物部分和转基因植物。植物部分包括，但不局限于茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。在一个实施方案中，转基因植物是雄性不育的。也提供的是SRP编码核酸转化的转基因植物产生的植物种子，其中所述种子包含SRP编码核酸，并且其中所述植物与野生型变种植物相比对于在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加是不分离的。本发明还提供了表达SRP的转基因植物产生的种子，其中所述种子含有SRP，其中所述植物与野生型变种植物相比对于在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫耐受性增加是不分离的。本发明也提供由任何下述转基因植物、植物部分和植物种子产生的农产品。农产品包括，但不局限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。

如此处所用，术语“变种”指物种中的一组植物，其具有将它们从典型形式和该物种中其它可能变种中分离出来的恒定特征。在具有至少一种显著性状的同时，主要基于连续后代中性状的孟德尔分离，变种同样特征在于变种中个体间的一些变异。如果变种对于该性状在遗传学上一定程度上是纯合的(即不分离变种自交时，没有观察到后代中性状显著量的独立分离)，那么就认为变种对该特定性状是“不分离的”。在本发明中，性状产生于引入植物变种中的一种或更多SRP DNA序列的转基因表达。如此处同样所用，术语“野生型变种”指一组植物，其作为对照植物用于比较目的而被分析，其中野生型变种植物与试验植物(转化有SRP的植物或其中SRP编码核酸的表达已被修饰的植物)相同，除了野生型变种植物未曾转化有SRP编码核酸和/或SRP编码核酸在野生型变种植物中的表达未曾被修饰过。

本发明描述了展叶剑叶藓SRP(PpAKT-3)、大豆SRP(GmAKT-2)和普通小麦SRP(TaAKT-1)可用于增加植物在正常或胁迫条件下的生长和/或增加植物对环境胁迫的耐受性。如此处所用，术语多肽指通过肽键连接在一起的至少4个氨基酸的链。链可以是线性的、分支的、环形的或其组合。因此，本发明提供选自PpAKT-3、GmAKT-2、TaAKT-1和其同源物的分离的SRP。在优选的实施方案中，所述SRP选自如SEQ ID NO：2中定义的展叶剑叶藓活性钾通道转运蛋白-3(PpAKT-3)多肽、如SEQ IDNO：4中定义的大豆活性钾通道转运蛋白-2(GmAKT-2)多肽、如SEQ IDNO：6中定义的普通小麦活性钾通道转运蛋白(TaAKT-1)多肽及其同源物和直向同源物。下文中定义了氨基酸序列的同源物和直向同源物。

本发明的SRP优选通过重组DNA技术产生。例如，将编码多肽的核酸分子克隆到表达载体上(如下描述)，将表达载体引入宿主细胞(如下描述)，并且SRP在宿主细胞中表达。然后通过适当的纯化方案使用标准的多肽纯化技术从细胞中分离SRP。为本发明目的，术语“重组多核苷酸”指通过遗传工程已经改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括任何克隆的多核苷酸和连接或结合到异源序列的多核苷酸。术语“重组的”不是指由天然发生的事件如自发突变引起的多核苷酸的改变。除了重组表达，可使用标准的肽合成技术化学合成SRP或其肽。此外，例如可使用抗SRP抗体从细胞(例如，展叶剑叶藓、大豆、普通小麦或欧洲油菜(Brassica napus))中分离天然SRP，所述抗体可通过标准技术利用SRP或其片段产生。

如此处所用，术语“环境胁迫”或“胁迫”指与盐度、干旱、氮、温度、金属、化学物质、致病和氧化胁迫或其组合相关的次优条件。在优选的实施方案中，环境胁迫可选自盐度、干旱或温度或其组合中的一组或更多组，并尤其选自高盐、低含水量或低温的一组或更多组。也应理解如在说明书和权利要求书中所用，“一个”根据使用它的上下文可以指一个或更多个。因此，例如，对“一个细胞”的参考指可利用至少一个细胞。同样如此处所用，术语“水分利用效率”指植物产生的有机物质量除以植物产生该有机物质使用的水量，即，关于植物水分利用的植物干重。如此处所用，术语“干重”指植物中除水以外的任何物质，并包括例如，糖类、蛋白质、油和矿质营养物。

同样如此处所用，术语“核酸”和“多核苷酸”指RNA或DNA，其为线性的或分支的，单链的或双链的，或其杂种分子。该术语也包括RNA/DNA杂种分子。这些术语也包括位于基因编码区3’和5’末端的非翻译序列：基因编码区5’末端上游至少约1000个核苷酸的序列和基因编码区3’末端下游至少约200个核苷酸的序列。较少见碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其它也可用于反义、双链RNA和核酶配对。例如，包含尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已显示以高亲和力结合RNA并显示为基因表达的有效反义抑制剂。也可进行其它修饰，如修饰磷酸二酯骨架或RNA核酸糖基团的2’-羟基。反义多核苷酸和核酶可完全由核糖核苷酸组成，或可包含混合的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸可通过任何方法产生，包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、RT-PCR和体外或体内转录。

“分离的”核酸分子是大体上从其它核酸分子中分离出来的一种分子，其存在于核酸的天然来源中(即编码其它多肽的序列)。优选地，“分离的”核酸没有在天然发生的复制子中天然地位于核酸侧翼的一些序列(即，定位于核酸5’和3’末端的序列)。例如，认为克隆的核酸是分离的。在多个实施方案中，分离的SRP核酸分子可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在核酸分子来源的细胞(例如，展叶剑叶藓细胞、大豆细胞、普通小麦细胞或欧洲油菜细胞)基因组DNA中天然位于核酸分子两侧。核酸如果已通过人类干涉改变，或被置于不是其天然位点的基因座或位置中，或如果通过农杆菌感染将其引入到细胞中，也认为其是分离的。此外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，可以不含一些与它天然联系的其它细胞物质，或当通过重组技术产生时不含培养基，或当化学合成时不含化学前体或其它化学品。

“分离的核酸”的定义中特别排除的是天然发生的染色体(如染色体扩展)、人工染色体文库、基因组文库和cDNA文库，其存在为体外核酸制剂或转染/转化的宿主细胞制剂，其中所述宿主细胞是体外异质制剂或平板接种为单克隆的异质群体。也特别排除的是上述文库，其中特定的核酸占载体分子中核酸***物数目的少于5％。进一步特别排除的是全细胞基因组DNA或全细胞RNA制剂(包括进行机械剪切或酶促消化的全细胞制剂)。甚至进一步特别排除的是作为体外制剂或通过电泳分离的异质混合物而发现的全细胞制剂，其中本发明的核酸在电泳介质中未曾从异源核酸中进一步分离出来(例如，在琼脂糖凝胶或尼龙印迹中通过从异质条带群中切除单条带进一步分离)。

可使用标准分子生物学技术和此处提供的序列信息来分离本发明的核酸分子，如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其部分的核酸分子。例如，可使用此处公开的序列全部或部分从展叶剑叶藓文库中分离展叶剑叶藓SRP cDNA。此外，可使用基于该序列设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离包括SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5的序列的全部或部分的核酸分子。例如，可从植物细胞中分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)，并且可使用反转录酶(例如，从Gibco/BRL，Bethesda，MD可得的Moloney MLV反转录酶；或从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL可得的AMV反转录酶)制备cDNA。可基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核苷酸序列设计用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸。可使用cDNA或备选地基因组DNA作为模板和适当寡核苷酸引物根据标准的PCR扩增技术来扩增本发明的核酸分子。可以将如此扩增的核酸分子克隆到适当载体中并通过DNA序列分析进行表征。此外，可通过标准合成技术，例如使用自动DNA合成仪来制备对应于SRP核苷酸序列的寡核苷酸。

在优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核苷酸序列。这些cDNA可包含编码SRP的序列(即，“编码区”)，及5’非翻译序列和3’非翻译序列。或者，本发明的核酸分子可以仅包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5的编码区，或可以包含从基因组DNA中分离的全基因组片段。本发明也包括SRP编码核酸，其编码如此处描述的SRP。优选为SRP编码核酸，其编码选自PpAKT-3(SEQ ID NO：2)、GmAKT-2(SEQ ID NO：4)和TaAKT-1(SEQ ID NO：6)的SRP。

此外，本发明的核酸分子可包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5中序列编码区的一部分，例如可用作探针或引物的片段或编码SRP生物活性部分的片段。从展叶剑叶藓、大豆和普通小麦克隆SRP基因中确定的核苷酸序列允许产生探针和片段，其设计用于在其它细胞类型和生物中鉴定和/或克隆SRP同源物，及从其它苔藓和相关物种中鉴定SRP同源物。编码区的部分也可编码SRP的生物活性片段。

如此处所用，术语SRP的“生物活性部分”旨在包括部分，例如SRP的结构域/基序，其参与调节正常或胁迫条件下的生长和/或调节植物中的胁迫耐受性，并更优选为耐干旱性或耐盐性。为本发明目的，调节正常或水分受限条件下植物的生长和/或胁迫耐受性指与对照野生型变种植物在正常或水分受限条件下的生长和/或胁迫耐受性相比，包含SRP表达盒(或表达载体)的转基因植物在正常或水分受限条件下的生长具有至少10％的增加或降低和/或胁迫耐受性具有至少10％的增加或降低。至少在下文实施例8、13和14中提供了用于定量在正常或水分受限条件下的生长和/或胁迫耐受性的方法。在优选的实施方案中，与对照野生型变种植物相比，SRP的生物活性部分增加了植物在正常或水分受限条件下的生长和/或植物对环境胁迫的耐受性。

SRP的生物活性部分包括肽，其包含来自SRP氨基酸序列(例如SEQID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或与SRP同一的多肽的氨基酸序列)的氨基酸序列，其包括比全长SRP或与SRP同一的全长多肽更少的氨基酸，并显示SRP的至少一种活性。通常，生物活性部分(例如，全长为例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多氨基酸的肽)包含具有SRP的至少一种活性的结构域或基序。此外，可通过重组技术来制备其中多肽的其它区域缺失的其它生物活性部分并评估此处描述的一种或更多种活性。如图2显示，钾转运蛋白结构域存在于EST472的从氨基酸78至氨基酸772、TA59824966的从氨基酸82至氨基酸732、GM59666231的从氨基酸43至氨基酸768中。

本发明也提供SRP嵌合或融合多肽。如此处所用，SRP“嵌合多肽”或“融合多肽”包含有效连接到非SRP的SRP。SRP指具有对应SRP的氨基酸序列的多肽，然而非SRP指多肽，其具有对应于基本不与SRP相同的多肽的氨基酸序列，例如与SRP不同并来自相同或不同生物的多肽。就融合多肽而言，术语“有效连接”旨在表明SRP和非SRP彼此融合，使得两序列因所用的序列而实现所提出的功能。非SRP可融合到SRP的N-末端或C-末端。例如，在一个实施方案中，融合多肽是GST-SRP融合多肽，其中SRP序列融合到GST序列的C-末端。此类融合多肽可利于重组SRP的纯化。在另一个实施方案中，融合多肽是在其N-末端包含异源信号序列的SRP。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列增强SRP的表达和/或分泌。

优选地，本发明的SRP嵌合或融合多肽通过标准的重组DNA技术产生。例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起，例如通过使用平端或交错末端用于连接、限制性内切酶消化以提供适当的末端、适当时补平粘性末端、碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接和酶促连接。在另一个实施方案中，可通过常规技术，包括自动化DNA合成仪来合成融合基因。或者，可使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，其随后退火并重扩增以产生嵌合基因序列(参阅，例如，Current Protocols in MolecularBiology，编辑Ausubel等人，1992，John Wiley & Sons)。此外，早已编码融合部分(例如，GST多肽)的许多表达载体可通过商业途径获得。可以将SRP编码核酸克隆到此类表达载体中，使得融合部分符合读框地连接到SRP上。

除了此处描述的SRP的片段和融合多肽，本发明包括植物中天然发生的SRP和SRP编码核酸的同源物或类似物。“同源物”此处定义为分别具有相似的或基本相同的核苷酸或氨基酸序列的两个核酸或多肽。同源物包括如下文定义的SRP等位变体、直向同源物、旁系同源物、激动剂和拮抗剂。术语“同源物”还包括核酸分子，其因遗传密码的简并性而不同于SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核苷酸序列中的一种序列(和其部分)并因此编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核苷酸序列编码的SRP相同的SRP。如此处所用，“天然发生”的SRP指自然界中出现的SRP氨基酸序列。优选地，天然发生的SRP包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列。

SRP的激动剂可基本保留SRP生物活性的相同活性或部分活性。SRP的拮抗剂可抑制SRP天然发生形式的一种或更多种活性。例如，SRP拮抗剂可竞争性结合到包括SRP的细胞膜组分代谢级联下游或上游成员上，或结合到介导化合物经该膜转运的SRP上，因此防止发生易位。

对应SRP cDNA的天然等位变体和类似物、直向同源物和旁系同源物的核酸分子可基于它们与此处描述的展叶剑叶藓、大豆或普通小麦SRP核酸的同一性，使用SRP cDNA或其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格的杂交条件下来分离。在备选的实施方案中，可通过筛选突变体的组合文库，例如SRP激动剂或拮抗剂活性的SRP截短突变体来鉴定SRP的同源物。在一个实施方案中，SRP变体的多样化文库通过核酸水平上的组合诱变产生并由多样化基因文库编码。可通过例如酶促连接合成寡核苷酸的混合物到基因序列上来产生SRP变体的多样化文库，使得一组简并的潜在SRP序列表达为个体多肽，或备选地表达为含有其中的SRP序列组的一组较大的融合多肽(例如，用于噬菌体展示)。许多方法可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在SRP同源物的文库。简并基因序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行，并且所述合成基因然后连接到适当表达载体中。使用简并组基因允许在一种混合物中提供编码想要的一组潜在SRP序列的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法为本领域所知(参阅，例如，Narang，1983，Tetrahedron 39：3；Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem53：323；Itakura等人，1984，Science 198：1056；Ike等人，1983，NucleicAcid Res.11：477)。

此外，SRP编码区的片段文库可用于产生SRP片段的多样化群体用于筛选并随后选择SRP的同源物。在一个实施方案中，可如下产生编码序列片段的文库：通过利用核酸酶在其中每个分子仅发生约一次切割的条件下处理SRP编码序列的双链PCR片段、变性双链DNA、复性DNA以形成双链DNA(其可包括来自不同切割产物的有义/反义对)、通过利用S1核酸酶处理从重新形成的双链体去除单链部分并将得到的片段文库连接到表达载体中。通过该方法，可得到表达文库，其编码不同大小的SRP的N末端、C末端和内部片段。

若干技术为本领域已知用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物，并用于筛选具有所选性质的基因产物的cDNA文库。此类技术适用于快速筛选由SRP同源物的组合诱变产生的基因文库。易于高通量分析的用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到复制表达载体中、用得到的载体文库转化适当细胞并在一定条件下表达组合基因，在所述条件下，想要的活性的检测便于分离编码基因的载体(该基因的编码产物被检测)。递归总体诱变(REM)——提高文库中功能突变体频率的技术可用于与筛选试验组合来鉴定SRP同源物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS 89：7811-7815；Delgrave等人，1993，PolypeptideEngineering 6(3)：327-331)。在另一个实施方案中，可利用基于细胞的测定，使用本领域所熟知的方法来分析多样化SRP文库。本发明还提供鉴定新的SRP的方法，其包括：(a)如此处描述，产生对SRP或其片段的特异抗体应答；(b)利用抗体筛选推定的SRP物质，其中抗体与所述物质的特异性结合表明存在潜在的新SRP；和(c)与已知SRP比较分析结合的物质以确定它的新颖性。

如上所述，本发明包括SRP和其同源物。为了测定两条氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列之一和其突变体形式)的百分比序列同一性，比对序列用于最佳比较目的(例如，可在一条多的肽序列中引入空位用于与另一多肽或核酸进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当一条序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的序列之一)中的位置被另一序列(例如，选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽序列的突变体形式)中相应位置上相同的氨基酸占据时，那么所述分子在该位置处是同一的。相同类型的比较可在两条核酸序列间进行。

两条序列间的百分比序列同一性是序列共有的同一位置数目的函数(即，百分比序列同一性＝同一位置的数目/位置总数目 x 100)。优选地，本发明中包括的分离的氨基酸同源物与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的完整氨基酸序列有至少约50-60％，优选至少约60-70％，并更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并最优选至少约96％、97％、98％、99％，或更高同一性。在另一个实施方案中，本发明中包括的分离的氨基酸同源物与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5中显示的核酸序列编码的完整氨基酸序列有至少约50-60％，优选至少约60-70％，并更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并最优选至少约96％、97％、98％、99％，或更高同一性。在其它实施方案中，SRP氨基酸同源物在SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的至少15个相邻氨基酸残基，更优选至少25个相邻氨基酸残基，并最优选至少35个相邻氨基酸残基上具有序列同一性。

在另一个优选实施方案中，本发明分离的核酸同源物包含核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核苷酸序列或包含其至少60个连续核苷酸的部分有至少约40-60％，优选至少约60-70％，并更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并甚至更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％，或更高同一性。核酸的序列比较的优选长度为至少75个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，并最优选编码区的全长。甚至更优选地，核酸同源物编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6在下文显示的功能结构域上具有同源性的蛋白质。

进一步优选地，本发明分离的核酸同源物编码SRP或其部分，其与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少90％，更优选至少95％同一性，并且其作为植物中植物生长和/或环境胁迫应答的调节剂。在更优选的实施方案中，核酸同源物在植物中的过表达增加了植物在正常或胁迫条件下的生长和/或增加了植物对环境胁迫的耐受性。在进一步优选的实施方案中，核酸同源物编码SRP，其作为离子转运蛋白，更优选作为活性钾通道转运蛋白起作用。

为本发明目的，使用Vector NTI 9.0(PC)软件包(Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA92008)来测定两条核酸或多肽序列间的百分比序列同一性。15的空位打开罚分和6.66的空位延伸罚分用于测定两条核酸的百分比同一性。10的空位打开罚分和0.1的空位延伸罚分用于测定两条多肽的百分比同一性。所有其它参数设置为默认设置。为了多重比对的目的(Clustal W算法)，使用blosum62矩阵，空位打开罚分是10，并且空位延伸罚分是0.05。应理解当DNA序列与RNA序列进行比较时，为了测定序列同一性的目的，胸腺嘧啶核苷酸与尿嘧啶核苷酸等同。

在另一方面，本发明提供分离的核酸，所述核酸包含在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的多核苷酸杂交的多核苷酸。更具体而言，本发明的分离的核酸分子长度为至少15个核苷酸并在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，所述核酸长度为至少30、50、100、250或更多个核苷酸。优选地，本发明的分离的核酸同源物包含核苷酸序列，其在高度严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中显示的核苷酸序列杂交，并作为在正常或胁迫条件下生长的调节剂和/或植物中胁迫耐受性的调节剂起作用。在进一步优选的实施方案中，植物中分离的核酸同源物的过表达增加了植物在正常或胁迫条件下的生长和/或植物对环境胁迫的耐受性。在甚至进一步优选的实施方案中，分离的核酸同源物编码SRP，其作为离子转运蛋白，更优选作为活性钾通道转运蛋白起作用。

如此处所用，对DNA与DNA印迹杂交而言，术语“严格条件”指在60℃，10X Denhart’s溶液、6X SSC、0.5％ SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中过夜杂交。印迹于62℃在3X SSC/0.1％ SDS中、随后在1XSSC/0.1％ SDS中、最后在0.1X SSC/0.1％ SDS中顺序洗涤，每次洗涤30分钟。同样如此处所用，在优选的实施方案中，短语“严格条件”指在6X SSC溶液中65℃下杂交。在另一个实施方案中，“高度严格条件”指在65℃，10X Denhart’s溶液、6X SSC、0.5％ SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中过夜杂交。印迹于65℃在3X SSC/0.1％ SDS中、随后在1X SSC/0.1％ SDS中、最后在0.1X SSC/0.1％ SDS中顺序洗涤，每次洗涤30分钟。在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284；Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等人，编辑，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1995；和Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization withNucleic Acid Probes，第一部分，第2章，Elsevier，New York，1993中描述了用于核酸杂交的方法。优选地，在严格或高度严格条件下与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列杂交的本发明分离的核酸分子对应于天然发生的核酸分子。如此处所用，“天然发生的”核酸分子指具有自然界中发生的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然多肽)。在一个实施方案中，核酸编码天然发生的展叶剑叶藓SRP、大豆SRP或普通小麦SRP。

使用上述方法和本领域技术人员已知的其它方法，本领域的普通技术人员可分离SRP的同源物，所述SRP包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中显示的氨基酸序列。这些同源物的一个亚组是等位变体。如此处所用，术语“等位变体”指含有多态性的核苷酸序列，所述多态性导致SRP的氨基酸序列改变并且其存在于天然群体(植物物种或变种)中。此类天然等位变异可通常导致SRP核酸中1-5％的变异。可通过在许多不同植物中对目的核酸序列进行测序来鉴定等位变体，所述测序可容易地通过使用杂交探针来进行以鉴定那些植物中相同的SRP遗传基因座。天然等位基因变异引起的并且不改变SRP功能活性的SRP中任何和所有此类核酸变异和获得的氨基酸多态性或变异旨在涵盖于本发明的范围内。

此外，来自相同或其它物种的编码SRP的核酸分子如SRP类似物、直向同源物和旁系同源物旨在涵盖于本发明的范围内。如此处所用，术语“类似物”指具有相同或相似功能但分别在不相关生物中进化的两种核酸。如此处所用，术语“直向同源物”指来自不同物种但通过物种形成从共同祖先基因进化来的两种核酸。通常，直向同源物编码具有相同或相似功能的多肽。同样如此处所用，术语“旁系同源物”指通过基因组内复制相关的两种核酸。旁系同源物通常具有不同的功能，但是这些功能可以相关(Tatusov等人，1997，Science 278(5338)：631-637)。天然发生的SRP的类似物、直向同源物和旁系同源物可通过翻译后修饰、氨基酸序列差异或通过两者而不同于天然发生的SRP。翻译后修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化，并且此类修饰可以在多肽合成或加工过程中或在分离的修饰酶处理后发生。具体而言，本发明的直向同源物将通常显示出与所有或部分天然发生的SRP氨基酸序列至少80-85％，更优选85-90％或90-95％，并最优选95％、96％、97％、98％或甚至99％的同一性，或100％的序列同一性，并且将显示与SRP相似的功能。优选地，本发明的SRP直向同源物作为植物中植物生长和/或环境胁迫应答的调节剂起作用和/或作为离子转运蛋白起作用。更优选地，SRP直向同源物增加植物在正常或胁迫条件下的生长和/或增加植物的胁迫耐受性。在一个实施方案中，SRP直向同源物维持参与植物中细胞膜构建所必需的化合物代谢或参与分子跨这些膜转运的能力。

除了可能存在于群体中的SRP序列的天然发生的变体外，技术人员将进一步理解可通过突变向SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列中引入改变，因此导致编码的SRP的氨基酸序列改变，而不改变SRP的功能活性。例如，可以在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5的序列中进行核苷酸替代，其导致在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸替代。“非必需”氨基酸残基是在不改变所述SRP活性的情况下从一种SRP的野生型序列中改变的残基，而“必需”氨基酸残基为SRP活性所需。然而其它氨基酸残基(例如，在具有SRP活性的结构域中保守或仅半保守的那些)可能对活性不是必需的并因此可能易于在不改变SRP活性的情况下受到改变。

因此，本发明的另一个方面涉及编码SRP的核酸分子，所述SRP包含对SRP活性不是必需的氨基酸残基的改变。此类SRP的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中包含的序列，然而保留至少一种此处描述的SRP活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少约50％同一的氨基酸序列。优选地，由核酸分子编码的多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：6的氨基酸序列至少约60％同一，更优选地与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少约60-70％同一，甚至更优选地与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％同一，并且最优选地与SEQID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少约96％、97％、98％或99％同一。本发明优选的SRP同源物优选参与植物生长和/或胁迫耐受性应答，或更具体而言，作为离子转运蛋白起作用，优选地，作为活性钾通道转运蛋白起作用。

可分别向SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列中引入一个或更多个核苷酸替代、添加或缺失来产生编码与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽序列具有序列同一性的SRP的分离的核酸分子，使得一个或更多个氨基酸替代、添加或缺失被引入编码的多肽中。可通过标准技术如定向诱变和PCR介导的诱变向SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列中引入突变。优选地，在一个或更多个非必需氨基酸残基处产生保守氨基酸替代。“保守的氨基酸替代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的一种替代。

本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，SRP中预测的非必需氨基酸残基优选由来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。或者，在另一个实施方案中，可例如通过饱和诱变沿全部或部分SRP编码序列随机引入突变，并可筛选得到的突变体的此处描述的SRP活性来鉴定保留SRP活性的突变体。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的序列诱变后，可重组表达编码的多肽并例如如实施例8中描述，可通过分析转基因植物的胁迫耐受性或在正常或水分受限条件下的生长来测定多肽的活性。

此外，可产生优化的SRP核酸。优选地，优化的SRP核酸编码结合到磷酸基团和/或调节植物在正常或胁迫条件下的生长和/或对环境胁迫的耐受性的SRP，并且更优选地由于它在植物中的过表达而增加植物在正常或胁迫条件下的生长和/或对环境胁迫的耐受性。如此处所用，“优化的”指被遗传改造以增加它在给定植物或动物中表达的核酸。为了提供植物优化的SRP核酸，可以修饰基因的DNA序列以1)包含高表达植物基因优选的密码子；2)包含植物中大量发现的核苷酸碱基组成中的A+T含量；3)形成植物起始序列；或4)去除引起RNA的不稳定、不适当的多腺苷酸化、降解和终止的序列，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。植物中SRP核酸的升高的表达通常通过利用植物或特定植物中密码子选择的分布频率来实现。用于优化植物中核酸表达的方法可见于EPA 0359472；EPA 0385962；PCT申请号WO 91/16432；美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；Perlack等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：3324-3328；和Murray等人，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。

可优化SRP核酸使得其密码子选择的分布频率优选与高表达植物基因偏离不高于25％，并更优选地不高于约10％。此外，考虑简并的第三个碱基的百分比G+C含量(单子叶植物在该位置倾向G+C，然而双子叶植物却不倾向于此)。也认为XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸是双子叶植物中最少优选的密码子，然而在单子叶植物和双子叶植物中均避免XTA密码子。本发明的优化的SRP核酸也优选具有接近所选宿主植物(例如展叶剑叶藓，大豆或普通小麦)的CG和TA双联体避免指数。更优选地，这些指数与宿主指数偏离不高于约10-15％。

除了编码上述SRP的核酸分子外，本发明的另一方面涉及反义的分离核酸。认为反义多核苷酸通过特异性结合靶核苷酸并干扰靶多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性来抑制靶多核苷酸的基因表达。现有技术中描述了用于将反义多核苷酸靶定到染色体DNA、初级RNA转录物或加工的mRNA的方法。优选地，靶定区包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子和可读框内的其它序列。

为本发明的目的，术语“反义的”指包含多核苷酸的核酸，所述多核苷酸与基因、初级转录物或加工的mRNA的全部或部分充分互补以干扰内源基因的表达。“互补的”多核苷酸是能够根据标准的沃森-克里克互补原则进行碱基配对的那些多核苷酸。尤其是，嘌呤将与嘧啶碱基配对来形成鸟嘌呤与胞嘧啶的配对组合(G:C)并且在DNA的情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶的配对组合(A:T)，或在RNA的情况下腺嘌呤与尿嘧啶的配对组合(A:U)。理解两种多核苷酸可彼此杂交，即使它们彼此不完全互补，只要每一种多核苷酸的至少一个区域与另一种基本互补。术语“反义核酸”包括单链RNA及双链DNA表达盒，其可被转录来产生反义RNA。“活性的”反义核酸是能够与编码多肽的初级转录物或mRNA选择性杂交的反义RNA分子，所述多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少80％的序列同一性。

反义核酸可与完整的SRP编码链或仅其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子是与编码SRP的核苷酸序列编码链的“编码区”反义的。术语“编码区”指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。在另一个实施方案中，反义核酸分子是与编码SRP的核苷酸序列编码链的“非编码区”反义的。术语“非编码区”指位于不翻译成氨基酸的编码区两侧的5’和3’序列(即也称作5’和3’非翻译区)。反义核酸分子可与SRP mRNA完整的编码区互补，但更优选为寡核苷酸，其是仅与SRP mRNA的编码或非编码区的部分反义的。例如，反义寡核苷酸可与SRP mRNA翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸长度可以为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。通常，本发明的反义分子包含与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或编码SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6的多肽的多核苷酸的至少14个连续寡核苷酸具有60-100％序列同一性的RNA。优选地，序列同一性将为至少70％，更优选为至少75％、80％、85％、90％、95％或98％，并最优选为99％。

本发明的反义核酸分子通常被施用给细胞或经原位产生，使得它们与编码SRP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制多肽的表达。杂交可以是通过常规核苷酸互补性来形成稳定的双链体，或例如在结合到DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用。可以修饰反义分子，使得它结合到受体或所选细胞表面上表达的抗原，例如通过将反义核酸分子连接到肽或抗体，所述肽或抗体结合细胞表面受体或抗原。反义核酸分子也可以使用此处描述的载体递送到细胞中。为了达到足够细胞内浓度的反义分子，优选载体构建体，其中所述反义核酸分子被置于强的原核、病毒或真核(包括植物)启动子的控制下。

作为反义多核苷酸的备选，核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)可用于降低SRP多肽的表达。如此处所用，术语“核酶”指具有核糖核酸酶活性的催化性的基于RNA的酶，其能够剪切具有其互补区的单链核酸，如mRNA。核酶(例如，在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585-591中描述的锤头状核酶)可用于催化剪切SRP mRNA转录物以便因此抑制SRP mRNA的翻译。可基于如此处公开的SRP cDNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5)或根据本发明教导的方法分离的异源序列来设计对SRP编码核酸具有特异性的核酶。例如，可构建四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与编码SRP的mRNA中待剪切的核苷酸序列互补(参阅，例如Cech等人的美国专利号4,987,071和5,116,742)。或者，SRP mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA(参阅，例如Bartel和Szostak，1993，Science 261：1411-1418)。在优选的实施方案中，核酶将含有具有至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸，并更优选7或8个核苷酸的部分，其与靶RNA的部分具有100％的互补性。用于制备核酶的方法为本领域技术人员已知(参阅，例如美国专利号6,025,167；5,773,260；和5,496,698)。

如此处所用，术语“dsRNA”指包含RNA两条链的RNA杂种分子。dsRNA结构上可以是线性的或环状的。在优选的实施方案中，dsRNA对编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽或与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽是特异的。杂交RNA可以大体上互补或完全互补。“大体上互补”指当使用如上描述的BLAST程序将两个杂交RNA最佳比对时，杂交部分为至少95％互补。优选地，dsRNA长度将为至少100个碱基对。通常，杂交RNA将具有相同长度，无突出的5’或3’末端并且无缺口。然而，具有高达100个核苷酸的5’或3’突出部分的dsRNA可用于本发明的方法。

dsRNA可包含核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物，如2’-O-甲基核糖基残基或其组合(参阅，例如美国专利号4,130,641和4,024,222)。在美国专利号4,283,393中描述了dsRNA多核糖肌苷酸：多核糖胞苷酸。制备和使用dsRNA的方法为本领域已知。一种方法包括在体内或在单个体外反应混合物中同时转录两条互补DNA链(参阅，例如美国专利号5,795,715)。在一个实施方案中，可直接通过标准转化方法将dsRNA引入到植物或植物细胞中。或者，可通过转录两条互补RNA在植物中表达dsRNA。

抑制内源基因表达，如三股螺旋形成(Moser等人，1987，Science 238：645-650和Cooney等人，1988，Science 241：456-459)和共抑制(Napoli等人，1990，The Plant Cell 2：279-289)的其它方法为本领域已知。部分和全长cDNA已用于共抑制内源植物基因(参阅，例如美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等人，1990，The Plant Cell2：291-299；Smith等人，1990，Mol.Gen.Genetics224：477-481和Napoli等人，1990，The Plant Cell 2：279-289)。

对于有义抑制，据信有义多核苷酸的引入阻断了相应靶基因的转录。有义多核苷酸将与靶植物基因或RNA具有至少65％的序列同一性。优选地，百分比同一性为至少80％、90％、95％或更高。引入的有义多核苷酸相对于靶基因或转录物不需要是全长的。优选地，有义多核苷酸将与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的至少100个连续核苷酸具有至少65％的序列同一性。同一性区域可包含内含子和/或外显子和非翻译区。引入的有义多核苷酸可暂时存在于植物细胞中，或可稳定整合到植物基因组或染色体外复制子中。

或者，可通过靶定与SRP核苷酸序列的调节区(例如，SRP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成三股螺旋结构(其阻止SRP基因在靶细胞中的转录)来抑制SRP基因表达(通常参阅，Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene等人，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，1992，Bioassays14(12)：807-15)。

除上述SRP核酸和多肽外，本发明包括附着到部分的这些核酸和多肽。这些部分包括，但不局限于检测部分、杂交部分、纯化部分、递送部分、反应部分、结合部分等。具有附着部分的典型核酸组是探针和引物。探针和引物通常包含大体上分离的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列区，所述核苷酸序列区在严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中给出的序列有义链、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5中给出的序列的反义序列或其天然发生的突变体的至少约12，优选约25，更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的核苷酸序列的引物可用于PCR反应中以克隆SRP同源物。基于SRP核苷酸序列的探针可用于检测编码相同或基本相同多肽的转录物或基因组序列。在优选的实施方案中，探针还包含附着到其上的标记组，例如所述标记组可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作鉴定表达SRP的细胞的基因组标记检测试剂盒的一部分，如通过在细胞样品中测定SRP编码核酸的水平，例如检测SRP mRNA水平或确定基因组SRP基因是否已突变或缺失。

具体而言，确定基因转录水平(可用于翻译成基因产物的mRNA的量的指示)的有用方法是进行RNA印迹(关于参考，参阅例如Ausubel等人，1988，Cu rrent Protocols in Molecular Biology，Wiley：New York)。来自RNA印迹的信息至少部分表明转化基因的转录程度。可通过本领域众所周知的若干方法如Bormann等人，1992，Mol.Microbiol.6：317-326描述的方法从细胞、组织或器官中制备总的细胞RNA。为了评估从该mRNA翻译得到的多肽的存在或相对量，可使用标准技术，如蛋白质印迹。这些技术为本领域的技术人员所熟知(参阅，例如Ausubel等人，1988，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley：New York)

本发明还提供包含上述SRP核酸的分离的重组表达载体，其中载体在宿主细胞中的表达导致与野生型变种宿主细胞相比，植物在正常或水分受限的条件下生长增加和/或对环境胁迫的耐受性增加。如此处所用，术语“载体”指核酸分子，其能够运输其已连接另一个核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指可连接额外的DNA区段的环形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体能在它们引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)被引入到宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中利用的表达载体经常是质粒形式。因为质粒是最经常使用的载体形式，在本说明书中“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明旨在包括表达载体的其它形式，如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其行使等同的功能。

本发明的重组表达载体包含以适合核酸在宿主细胞中表达的形式存在的本发明核酸，其意思是重组表达载体包括一种或更多种调节序列，根据待用于表达的宿主细胞来选择所述调节序列，所述调节序列有效连接到待表达的核酸序列中。对于重组表达载体，如此处所用，“有效连接”旨在表示目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式(例如，在体外转录/翻译体系中或在载体引入宿主细胞的情况下，在宿主细胞中)。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。例如在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)和Gruber and Crosby，in：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，编辑Glick和Thompson，第7章，89-108，CRC Press：Boca Raton，Florida，包括其中的参考文献中描述了此类调节序列。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些序列。本领域的技术人员将理解表达载体的设计可依赖于这样的因素，如待转化的宿主细胞的选择、想要的多肽的表达水平等。本发明的表达载体可引入宿主细胞中因此产生多肽或肽，包括由此处描述的核酸编码的融合多肽或肽(例如，SRP、SRP的突变形式、融合多肽等)。

可设计本发明的重组表达载体用于SRP在原核或真核细胞中的表达。例如，使用载体按照PCT申请号WO 98/01572中描述的转化方法，SRP基因可表达于细菌细胞如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌细胞(参阅Romanos等人，1992，Foreign gene expression in yeast：a review，Yeast 8：423-488；van denHondel等人，1991，Heterologous gene expression in filamentous fungi，in：More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet & L.L.Lasure，编辑，p.396-428：Academic Press：San Diego；和van den Hondelm和Punt，1991，Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy等人，编辑，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge)、藻类(Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)：239-251)、多种类型的纤毛虫：Holotrichia，缘毛亚纲(Peritrichia)，旋毛亚纲(Spirotrichia)，吸管亚纲(Suctoria)，四膜虫(Tetrahymena)，草履虫(Paramecium)，豆形虫(colpidium)，瞬目虫(Glaucoma)，匙口虫(Platyophrya)，Potomacus，Pseudocohnilembus，游仆虫(Euplotes)，Engelmaniella和Stylonychia，尤其是Stylonychia lemnae，和多细胞植物细胞(参阅Schmidt和Willmitzer，1988，High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants，PlantCell Rep.583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，6/7章，S.71-119，1993；F.F.White，B.Jenes等人，Techniq ues for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，Vol.1，Engineeringand Utilization，编辑Kung和R.Wu，128-43，Academic Press：1993；Potrykus，1991，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42：205-225和其中引用的参考文献)，或哺乳动物细胞。在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press：San Diego，CA，1990中进一步讨论了合适的宿主细胞。或者，重组表达载体可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外进行转录和翻译。

原核生物中多肽的表达最经常使用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。融合载体向其中编码的多肽添加许多氨基酸，通常向重组多肽的氨基末端添加，但也向C末端添加或融合在该多肽合适区域内。此类融合载体通常具有三个目的：1)提高重组多肽的表达；2)增加重组多肽的溶解度；和3)通过充当亲和纯化中的配体来帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，蛋白酶剪切位点被引入融合部分和重组多肽的接点处以纯化所述融合多肽后能够从融合部分中分离重组多肽。此类酶和它们的相关识别序列包括凝血因子Xa、凝血酶和肠激酶。

典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988，Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A到靶重组多肽。在一个实施方案中，将SRP的编码序列克隆到pGEX表达载体中以产生编码融合多肽的载体，所述融合多肽从N端到C端包含GST-凝血酶剪切位点-X多肽。可使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析来纯化融合多肽。可利用凝血酶剪切融合多肽来回收未融合到GST的重组SRP。

合适的诱导型非融合大肠杆菌(E.coli)表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，1988，Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等人，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，California，60-89)。从pTrc载体的靶基因表达依赖于来自杂种trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。从pET 11d载体的靶基因表达依赖于从共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的T7 gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由来自停留λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述停留λ原噬菌体携带在lacUV 5启动子的转录调控下的T7 gn1基因。

使重组多肽表达达到最大化的一种策略是在蛋白酶剪切重组多肽能力受损的宿主细菌中表达多肽(Gottesman，1990，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California，119-128)。另一种策略是改变待***到表达载体的核酸序列，使得每一个氨基酸的个体密码子是所选用于表达的细菌如谷氨酸棒杆菌中优先利用的那些密码子(Wada等人，1992，Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。可通过标准的DNA合成技术来进行对本发明核酸序列的此类改变。

在另一个实施方案中，SRP表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari，等人，1987，EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene 54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。适合用于其它真菌如丝状真菌中的载体和载体构建方法包括在van den Hondel和Punt，1991，“Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi，”in：AppliedMolecular Genetics of Fungi，Peberdy，等人，编辑，1-28页，CambridgeUniversity Press：Cambridge中详细描述的那些。

在本发明优选的实施方案中，SRP在植物和植物细胞如单细胞植物细胞(例如藻类)(参阅Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)：239-251和其中的参考文献)和高等植物的植物细胞(例如，种子植物，如农作物植物)中表达。SRP可通过任何手段，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染等“引入”到植物细胞中。本领域技术人员已知的一种转化方法是将开花植物浸入农杆菌溶液中，其中所述农杆菌包含SRP核酸，随后将转化的配子育种。

用于转化或转染宿主细胞包括植物细胞的其它合适的方法可见于Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Latest编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989，和其它实验室手册如Methods inMolecular Biology，1995，卷44，Agrobacterium protocols，编辑：Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。因为生物和非生物胁迫耐受性是希望在多种植物中遗传的一般性状，所述植物像玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊，茄科植物像马铃薯、烟草、茄子、和番茄，野豌豆属物种、豌豆、苜蓿，灌木植物(咖啡、可可、茶)，柳属物种，树(油椰、椰子)、多年生草本植物和饲料作物，这些农作物植物也是用于如本发明另一个实施方案来遗传改造的优选靶植物。饲料作物包括，但不局限于冰草(wheatrass)、虉草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(Wildrye Grass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(Birdsfoot Trefoil)、杂三叶(Alsike clover)、红三叶(red clover)和草木樨(Sweet clover)。

在本发明的一个实施方案中，SRP转染至植物通过农杆菌介导的基因转移实现。农杆菌介导的植物转化可以使用例如根瘤农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)进行。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等，1994，Nucl.Acids Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B.和Schilperoort，Robert A，Plant Molecular BiologyManual，第二版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-在Sect，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，BernardR.；Thompson，John E.，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993 360 S.，ISBN 0-8493-5164-2)开展。例如，油菜可以通过子叶转化法或下胚轴转化法(Moloney等，1989，Plant cell Report 8：238-242；De Block等，1989，Plant Physiol.91：694-701)转化。用于农杆菌和植物选择的抗生素取决于所用于转化的双元载体和农杆菌。油菜的选择通常使用作为植物可选择标志的卡那霉素进行。农杆菌介导至亚麻属植物的基因转移可以使用例如由Mlynarova等，1994，PlantCell Report 13：282-285所述的技术进行。此外，大豆的转化可以使用如欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所述技术实施。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳化硅纤维法技术(见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer Verlag：NewYork(1993)ISBN 3-540-97826-7)完成。玉米转化的具体实例存在于美国专利号5,990,387中，并且小麦转化的具体实例存在于PCT申请号WO93/07256内。

根据本发明，导入的SRP可以在它导入非染色体的自主复制体内或整合至植物染色体内时稳定维持在植物细胞内。或者，导入的SRP可以存在于染色体外的非复制性载体中并且得以瞬时表达或具有瞬时活性。

[Para]在一个实施方案中，可以产生同源重组的微生物，其中SRP整合至染色体，制备了含有这样的SRP基因的至少部分的载体，在所述SRP基因中已导入缺失、添加或替换以改变，例如功能性地破坏SPR基因。SRP基因优选地是展叶剑叶藓、大豆、普通小麦或欧洲油菜的SRP基因，但是它可以是来自相关植物或甚至来自哺乳动物、酵母或昆虫的同源物。在一个实施方案中，如此设计载体以至当发生同源重组时，内源SRP基因受到功能性破坏(即不再编码功能性多肽；也称作敲除载体)。或者，载体可以如此设计以至当发生同源重组时，内源SRP基因受到突变或改变，但仍编码功能性多肽(如上游调节区可被改变从而改变内源SRP的表达)。为了通过同源重组产生点突变，DNA-RNA杂交体可以在称做嵌合修复的技术中使用(Cole-Strauss等，1999，Nucleic acids Research 27(5)：1323-1330和Kmiec，1999 Gene therapy American Scientist.87(3)：240-247)。在展叶剑叶藓、大豆、普通小麦或欧洲油菜中的同源重组方法也在本领域众所周知并且预期用于本文。

当存在于同源重组载体内时，SRP基因的改变的部分在其5′和3′端侧分布SRP基因的额外核酸分子以允许在微生物或植物中载体所携带的外源SPR基因与内源SRP基因间的同源重组发生。这种侧翼分布的额外SRP核酸分子的长度足够用于与内源基因成功发生同源重组。一般地，在载体内包含(在5′端和3′端)数百个碱基对至数千碱基对的侧翼DNA。参见例如Thomas和Capecchi，1987，Cell 51：503对同源重组载体的描述或Strepp等，1998，PNAS，95(8)：4368-4373对在展叶剑叶藓中基于cDNA的重组的描述)。将载体导入微生物或植物细胞(例如通过聚乙二醇介导的DNA)并且使用本领域已知技术选择其中所导入SRP基因已经与内源SRP基因同源重组的细胞。

在另一个实施方案中，可以产生重组微生物，其含有允许导入的基因发生受调节表达的选择的***。例如，在将SRP基因置于lac操纵子控制下的载体内包含SRP基因允许仅存在IPTG时SRP基因才表达。此类调节***在本领域内众所周知。

无论SRP多核苷酸是否存在于染色体外的非复制性载体或整合至染色体的载体内，SRP多核苷酸优选地位于植物表达盒内。植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中驱动基因表达的有效连接以至每一序列可充分实现其功能的调节序列，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号不但是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)中称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物的那些聚腺苷酸化信号，而且在植物中呈功能活性的所有其它终止子也是适合的。由于植物基因表达往往不在转录水平上受限，因此植物表达盒优选地包含有效连接的其它序列，如翻译增强子，如含有来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列的增强每RNA对多肽比率的超驱动序列(GaINe等，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括那些在Becker，Kemper，Schell，和Masterson，1992，New plant binary vectors withselectable markers located proximal to the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，1984，Binary Agrobacterium vectors for planttransformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；Vectors for Gene Transferin Higher Plants；in：Transgenic Plants，卷1，Engineering and Utilization，编辑：Kung和Wu，Academic Press，1993，S.15-38中详述的植物表达载体。

植物基因表达应有效连接到适当启动子上，所述启动子以时间、细胞特异或组织特异的方式赋予基因表达。用于本发明表达盒中的启动子包括能够启动植物细胞中转录的任何启动子。此类启动子包括，但不局限于可从植物、植物病毒和包含在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌)中获得的那些启动子。

启动子可以是组成型的、诱导型的、发育阶段优选的、细胞类型优选的、组织优选的或器官优选的。组成型启动子是在大多数情况下有活性的。组成型启动子的实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)、sX CaMV35S启动子(Kay等人，1987，Science 236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，PlantCell 2：163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、ubiquitan启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J 3：2723-2730)、GRP1-8启动子、super启动子(美国专利号5,955,646)、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)、来自农杆菌T-DNA的启动子，如甘露碱合酶、胭脂碱合酶和章鱼碱合酶、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。

诱导型启动子在某些环境条件如存在或不存在营养物或代谢物、热或冷、光、病原体攻击、缺氧等条件下优先有活性。例如，来自芸苔属的hsp80启动子由热激诱导；PPDK启动子由光诱导；来自烟草、拟南芥和玉米的PR-1启动子由病原体感染诱导；并且Adh1启动子由缺氧和冷胁迫诱导。也可通过诱导型启动子来促进植物基因表达(对于综述，参阅Gatz，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果希望基因表达以时间特异性方式发生，化学诱导型启动子尤其合适。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(PCT申请号WO 95/1944)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和乙醇诱导型启动子(PCT申请号WO 93/21334)。

在本发明的一个优选实施方案中，诱导型启动子是胁迫诱导型启动子。为了本发明目的，胁迫诱导型启动子在一种或更多以下胁迫下优先有活性：与盐度、干旱、温度、金属、化学品、致病和氧化胁迫相关的次优条件。胁迫诱导型启动子包括，但不局限于Cor78(Chak等人，2000，Planta 210：875-883；Hovath等人，1993，Plant Physiol.103：1047-1053)、Cor15a(Artus等人，1996，PNAS 93(23)：13404-09)、Rci2A(Medina等人，2001，Plant Physiol.125：1655-66；Nylander等人，2001，Plant Mol.Biol.45：341-52；Navarre和Goffeau，2000，EMBO J.19：2515-24；Capel等人，1997，Plant Physiol.115：569-76)、Rd22(Xiong等人，2001，Plant Cell 13：2063-83；Abe等人，1997，Plant Cell 9：1859-68；Iwasaki等人，1995，Mol.Gen.Genet.247：391-8)、cDet6(Lang和Palve，1992，Plant Mol.Biol.20：951-62)、ADH1(Hoeren等人，1998，Genetics 149：479-90)、KAT1(Nakamura等人，1995，Plant Physiol.109：371-4)、KST1(Müller-等人，1995，EMBO 14：2409-16)、Rha1(Terryn等人，1993，Plant Cell 5：1761-9；Terryn等人，1992，FEBS Lett.299(3)：287-90)、ARSK1(Atkinson等人，1997，GenBank登录号# L22302，和PCT申请号WO97/20057)、PtxA(Plesch等人，GenBank登录号# X67427)、SbHRGP3(Ahn等人，1996，Plant Cell 8：1477-90)、GH3(Liu等人，1994，Plant Cell6：645-57)、病原体诱导型PRP1基因启动子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22：361-366)、来自番茄的热诱导型hsp80启动子(美国专利号5187267)、来自马铃薯的冷诱导型α淀粉酶启动子(PCT申请号WO96/12814)或损伤诱导型pinII启动子(欧洲专利号375091)。对于干旱、冷和盐诱导型启动子的其它实例如RD29A启动子，参阅Yamaguchi-Shinozalei等人，1993，Mol.Gen.Genet.236：331-340。

发育阶段优选的启动子在发育的某些阶段优先表达。组织和器官优选的启动子包括在某些组织或器官，如叶、根、种子或木质部中优先表达的那些。组织优选的和器官优选的启动子的实例包括，但不局限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、茎优选的、果皮优选的和叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、梗节优选的、长角果优选的、茎优选的、根优选的启动子等。种子优选的启动子在种子发育和/或萌发过程中优先表达。例如，种子优选的启动子可以是胚优选的、胚乳优选的和种皮优选的(参阅Thom pson等人，1989，BioEssays 10：108)。种子优选的启动子的实例包括，但不局限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

其它合适的组织优选或器官优选的启动子包括来自油菜的napin基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆的USP启动子(Baeumlein等人，1991，Mol.Gen.Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO 98/45461)、来自菜豆的菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自油菜的Bce4启动子(PCT申请号WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，及赋予种子在单子叶植物像玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中特异性表达的启动子。值得注意的合适的启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(PCT申请号WO 95/15389和PCT申请号WO 95/23230)或在PCT申请号WO 99/16890中描述的那些(来自大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin-基因和黑麦裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。

用于本发明表达盒中的其它启动子包括，但不局限于主要的叶绿素a/b结合蛋白质启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆植物凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、γ玉米醇溶蛋白启动子、waxy，shrunken 1、shrunken 2和bronze启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)及合成的和其它天然启动子。

可通过使用DNA结合结构域和异源来源的应答元件(即，来自非植物来源的DNA结合结构域)获得控制植物中异源基因表达的额外灵活性。此类异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736)。

本发明还提供重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的本发明SRP DNA分子。即，DNA分子以允许与SRP mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子的转录)的方式有效连接到调节序列。可选择有效连接到以反义方向克隆的核酸分子的调节序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中的持续表达。例如，可以选择病毒启动子和/或增强子，或调节序列，其指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可是是重组质粒、噬菌粒和减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效调节区的控制下产生。调节区的活性可通过载体引入的细胞类型来确定。对于使用反义基因调节基因表达的讨论，参阅Weintraub，H.等人，1986，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，综述-Trends in Genetics，卷1(1)，和Mol等人，1990，FEBS Letters 268：427-430。

本发明的另一方面涉及其中已引入了本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”此处可互换使用。理解此类术语不仅指特定的目的细胞，而且它们也应用于此细胞的后代或潜在后代。因为因突变或环境影响，某些修饰可在连续世代中发生，此类后代实际上可能不同于亲本细胞，但仍然包括在如此处所用的术语范围内。宿主细胞可是是任何原核或真核细胞。例如，SRP可以在细菌细胞如谷氨酸棒杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其它微生物像谷氨酸棒杆菌中表达。其它合适的宿主细胞为本领域的技术人员已知。

本发明的宿主细胞，如培养物中的原核或真核宿主细胞可用于产生(即表达)SRP。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞产生SRP的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经引入了编码SRP的重组表达载体，或其基因组中已经引入了编码野生型或改变的SRP的基因)，直至产生SRP。在另一个实施方案中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞中分离SRP。

本发明的另一方面涉及分离的SRP和其生物学活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分当通过重组DNA技术产生时不含一些细胞物质，或当化学合成时不含化学前体或其它化学试剂。术语“基本上不含细胞物质”包括SRP的制剂，其中所述多肽与天然或重组产生其的细胞的一些细胞组分分离出来。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞物质”包括SRP的制剂，其具有低于约30％(以干重计)的非SRP物质(此处也称为“污染多肽”)，更优选低于约20％的非SRP物质，更优选低于约10％的非SRP物质，并最优选低于约5％的非SRP物质。

当重组产生SRP或其生物学活性部分时，也优选基本上不含培养基，即培养基占多肽制剂体积的低于约20％，更优选低于约10％，并最优选低于约5％。术语“基本上不含化学前体或其它化学试剂”包括SRP的制剂，其中多肽从参与多肽合成的化学前体或其它化学试剂中分离出来。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体或其它化学试剂”包括SRP的制剂，其具有低于约30％(以干重计)的化学前体或非SRP化学试剂，更优选低于约20％的化学前体或非SRP化学试剂，更优选低于约10％的化学前体或非SRP化学试剂，并最优选低于约5％的化学前体或非SRP化学试剂。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物学活性部分缺少污染多肽，所述污染多肽与SRP来自相同生物。通常，此类多肽通过在除了展叶剑叶藓、大豆或普通小麦之外的植物中或微生物如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或真菌中重组表达例如展叶剑叶藓、大豆或普通小麦SRP而产生。

此处描述的核酸分子、多肽、多肽同源物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可用于一种或更多种以下方法：展叶剑叶藓、大豆或普通小麦和相关生物的鉴定；展叶剑叶藓、大豆或普通小麦相关生物基因组的作图；目的展叶剑叶藓、大豆或普通小麦序列的鉴定和定位；进化研究；功能所需SRP区域的确定；SRP活性的调节；一种或更多种细胞功能代谢的调节；一种或更多种化合物跨膜转运的调节；在水分受限条件下的生长调节；胁迫抗性的调节；和SRP核酸表达的调节。

藓类展叶剑叶藓与其它藓类如能在无光条件下生长的角齿藓(Ceratodon purpureus)相关。藓类像角齿藓属(Ceratodon)和剑叶藓属(Physcomitrella)在DNA序列和多肽水平上具有高度序列同一性，允许使用从其它藓类或生物演化来的探针异源筛选DNA分子，因而能衍生适合于在第三种物种中进行异源筛选或功能注释和基因功能预测的共有序列。鉴定此类功能的能力因而具有显著相关性，例如预测酶的底物特异性。另外，这些核酸分子可作为藓类基因组或相关生物基因组作图的参考点。

本发明的SRP核酸分子具有多种用途。最重要的是，本发明的核酸和氨基酸序列可用于转化植物，因此增加植物生长和/或诱导对胁迫如干旱、高盐和寒冷的耐受性。本发明因此提供转化有SRP核酸的转基因植物，其中核酸序列在植物中的表达导致与野生型变种植物相比，植物在正常或胁迫条件下生长增加和/或对环境胁迫的耐受性增加。转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。本发明还提供转基因植物可选自例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子、多年生草本植物和饲料作物。

具体而言，本发明描述了使用展叶剑叶藓的PpAKT-3；大豆的GmAKT-2和普通小麦的TaAKT-1的表达来人工改造耐干旱、耐盐和/或耐寒植物，和/或在正常或胁迫条件下生长增加的植物。该策略此处已经显示用于拟南芥(A.thaliana)，但它的应用不限于该植物。因此，本发明提供转基因植物，其包含SRP，如在SEQ ID NO：2中定义的PpAKT-3、在SEQ ID NO：4中定义的GmAKT-2或在SEQ ID NO：6中定义的TaAKT-1，其中植物在正常或胁迫条件下生长增加和/或对选自一组或更多组由干旱、高盐或降低或升高温度组成的环境胁迫的耐受性增加。在优选的实施方案中，所述环境胁迫是干旱或降低的温度。

因此，本发明提供产生具有SRP编码核酸的转基因植物的方法，其中所述核酸在植物中的表达导致与野生型变种植物相比，植物在正常或水分受限的条件下生长增加和/或对环境胁迫的耐受性增加，所述方法包括：(a)将包含SRP核酸的表达载体引入植物细胞，和(b)从植物细胞产生转基因植物，其与野生型变种的植物相比在正常或水分受限的条件下生长增加和/或对环境胁迫的耐受性增加。植物细胞包括，但不局限于原生质体、配子产生细胞和再生成整株植物的细胞。如此处所用，术语“转基因的”指任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分，其包含至少一种重组SRP多核苷酸的全部或部分。在许多情况下，重组SRP多核苷酸的全部或部分稳定整合到染色体或稳定的染色体外元件中，使得其在连续世代间传递。在优选的实施方案中，SRP核酸编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的多肽。

本发明也提供调节植物在正常或胁迫条件下的生长和/或调节植物对环境胁迫的耐受性的方法，所述方法包括修饰SRP编码核酸在植物中的表达。可分别通过增加或降低SRP的表达来实现植物在正常或胁迫条件下的生长和/或植物对环境胁迫的耐受性的提高或降低。优选地，通过增加SRP的表达来提高植物在正常或胁迫条件下的生长和/或植物对环境胁迫的耐受性。可通过本领域技术人员已知的任何方法来修饰SRP的表达。增加SRP的表达的方法可用于转基因或非转基因植物。在植物为转基因植物的情况下，例如可使用包含任何上述SRP编码核酸的载体转化植物，或者可使用指导天然SRP在植物中表达的启动子来转化植物。本发明提供此类启动子可以是组织优选的启动子、发育调节的启动子、胁迫诱导的启动子或其组合。或者，非转基因植物可具有天然的SRP表达，其通过诱导天然启动子来修饰。如SEQ ID NO：1中定义的PpAKT-3、SEQ ID NO：3中定义的GmAKT-2或SEQ ID NO：5中定义的TaAKT-1在靶植物中的表达可通过，但不局限于以下实例中的一个来完成：(a)组成型启动子，(b)胁迫诱导型启动子，(c)化学药品诱导型启动子和(d)例如通过锌指衍生转录因子改造的启动子过表达(Greisman和Pabo，1997，Science 275：657)。

在优选的实施方案中，使用如Greisman和Pabo，1997，Science 275：657中描述并由Sangamo Biosciences，Inc制造的锌指衍生转录因子(ZFP)来调节SRP的转录。这些ZFP包含DNA识别结构域和功能结构域，其引起靶核酸如SRP核酸的激活或抑制。因此，可产生激活和抑制ZFP(其特异性识别上文描述的SRP启动子)并用于增加或降低植物中SRP的表达，因而调节植物的生长和/或胁迫耐受性。本发明也包括鉴定靶植物中如SEQID NO：1中定义的PpAKT-3、SEQ ID NO：3中定义的GmAKT-2或SEQ IDNO：5中定义的TaAKT-1的同源物，及所述同源物的启动子。本发明还提供与野生型变种宿主细胞相比，增加宿主细胞中目的基因的表达的方法，其中目的基因应答SRP转录，所述方法包括：(a)用包含SRP编码核酸的表达载体转化宿主细胞，和(b)在宿主细胞中表达SRP，因而与野生型变种宿主细胞相比，增加应答SRP而转录的基因的表达。

除向转基因植物中引入SRP核酸序列外，该序列也可用于鉴定生物，如展叶剑叶藓、大豆或普通小麦，或其近亲。同样，它们可用于鉴定展叶剑叶藓、大豆或普通小麦，或其近亲在微生物混合群体中的存在。本发明提供展叶剑叶藓、大豆和普通小麦基因的核酸序列；通过微生物唯一群体或混合群体的培养物中的提取的基因组DNA在严格条件下与跨越展叶剑叶藓、大豆或普通小麦基因区域的探针(其对该生物是独特的)杂交，可确定该生物是否存在。

另外，本发明的核酸和多肽分子可作为基因组特定区域的标记物。这不仅在基因组作图中有用，还在展叶剑叶藓、大豆或普通小麦多肽的功能研究中有用。例如，为了鉴定特定展叶剑叶藓DNA结合多肽结合的基因组区域，可消化展叶剑叶藓基因组并温育片段与DNA结合多肽。结合多肽的这些片段可以额外用本发明的核酸分子探测，所说核酸分子优选具有容易检测的标记物。此类核酸分子与基因组片段的结合能够将片段定位到展叶剑叶藓的基因组图谱中，并且当使用不同的酶进行多次时可促进多肽结合的核酸序列的快速测定。另外，本发明的核酸分子可与相关物种的序列充分同一，使得这些核酸分子可作为在相关藓类中构建基因组图谱的标记物。

本发明的SRP核酸分子也可用于进化和多肽结构研究。本发明的分子参与的代谢和转运过程为多种原核细胞和真核细胞所利用；通过比较本发明核酸分子的序列与编码来自其它生物的相似酶的那些序列，可评估生物的进化亲缘关系。类似地，此类比较允许评估序列区域保守和不保守，其可帮助测定酶起作用所必需的多肽的这些区域。该类型的测定对于多肽工程研究是有价值的并且可说明多肽在不丧失功能的情况下耐受怎样的诱变。

操纵本发明的SRP核酸分子可导致产生与野生型SRP具有功能差异的SRP。这些多肽可在性能或活性上有所提高，可比平常以更多数目存在于细胞中，或可在效率或活性上有所降低。

可通过在次于合适条件下生长经修饰的微生物或植物并然后分析植物的生长特性和/或代谢来评估植物、谷氨酸棒杆菌、真菌、藻类或纤毛虫中遗传修饰对胁迫耐受性的影响。此类分析技术为本领域技术人员所熟知，并包括干重、湿重、多肽合成、糖类合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、一般植物和/或农作物产率、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸速率、光合速率等(Applications of HPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，卷17；Rehm等人，1993，Biotechnology，卷3，第III章：Product recovery and purification，页469-714，VCH：Weinheim；Belter等人，1988，Bioseparations：downstreamprocessing for biotechnology，John Wiley和Sons；Kennedy和Cabral，1992，Recovery processes for biological materials，John Wiley和Sons；Shaeiwitz和Henry，1988，Biochemical separations，in：Ulmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，卷B3，第11章，页1-27，VCH：Weinheim；和Dechow，1989，Separation and purification techniques inbiotechnology，Noyes Publications)。

例如，可使用标准方案构建包含此处公开的核酸或其片段的酵母表达载体并转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。然后可测定所得转基因植物对干旱、盐和温度胁迫的耐受性的丧失或改变。类似的，可使用标准方案构建包含此处公开的核酸或其片段的植物表达载体并转化到适当的植物细胞中，如拟南芥、大豆、油菜籽、玉米、小麦、Medicago truncatula等等。然后可测定所得转基因细胞和/或来源于其的植物对干旱、盐和温度胁迫的耐受性的丧失或改变。

改造本发明的一种或更多种SRP基因也可导致具有改变活性的SRP，其间接影响藻类、植物、纤毛虫或真菌，或其它微生物像谷氨酸棒杆菌的胁迫应答和/或胁迫耐受性。例如，代谢的正常生物化学过程导致产生多种产物(例如，过氧化氢和其它活性氧种类)，其可积极地干扰这些相同的代谢过程。例如，过氧亚硝酸盐被称为硝酸酪氨酸侧链，因而使活性位点具有酪氨酸的一些酶灭活(Groves，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)：226-235)。当这些产物为代表性分泌时，可遗传改变细胞以比野生型细胞转运更多的产物。通过优化一种或更多种本发明的SRP的活性，所述SRP参与特定分子如盐分子的输出，这可能提高细胞的胁迫耐受性。

此外，此处公开的序列或其片段可用于在多种生物如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞的基因组中产生敲除突变(Girke，1998，ThePlant Journal 15：39-48)。然后可评估所得敲除细胞耐受多种胁迫条件的能力或承受力、其对多种胁迫条件的应答和对突变表型和/或基因型的影响。对于基因灭活的其它方法，参阅美国专利号6,004,804“Non-ChimericMutational Vectors”和Puttaraju等人，1999，Spliceosome-mediated RNAtrans-splicing as a tool for gene therapy，Nature Biotechnology 17：246-252。

SRP的上述诱变策略导致在正常或胁迫条件下生长增加和/或胁迫耐受性增加不旨在限制；这些策略上的改变对本领域的技术人员是显而易见的。使用此类策略并结合此处公开的机制，可利用本发明的核酸和多肽分子来产生表达突变SRP核酸和多肽分子的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其它微生物像谷氨酸棒杆菌，使得在正常或胁迫条件下的生长和/或胁迫耐受性得到改善。

本发明也提供抗体，其特异性结合到由此处描述的核酸编码的SRP或其部分上。可通过许多众所周知的方法来产生抗体(参阅，例如Harlow和Lane，“Antibodies；A Laboratory Manual，”Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，1988)。简言之，可将纯化的抗原以足够引起免疫应答的量和间隔注射到动物中。可直接纯化抗体，或可从动物中获得脾细胞。所述细胞然后与无限增殖细胞系融合并筛选抗体分泌。抗体可用于筛选核酸克隆文库用于得到分泌抗原的细胞。这些阳性克隆然后可进行测序(参阅，例如Kelly等人，1992，Bio/Technology 10：163-167；Bebbington等人，1992，Bio/Technology 10：169-175)。

短语与多肽“选择性结合”和“特异性结合”指结合反应，其决定多肽在多肽和其它生物制剂的异质群体中的存在。因此，在指定的免疫测定条件下，结合到特定多肽的特定抗体不以显著量结合到样品中存在的其它多肽上。抗体在此类情况下的选择性结合可以需要这样的抗体，其由于其对特定多肽的特异性而被选择。多种免疫测定形式可用于选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与多肽选择性免疫反应的抗体。对于可用于测定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述，参阅Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual，”ColdSpring Harbor Publications，New York，1988。

在一些实例中，希望从多种宿主中制备单克隆抗体。用于制备此类单克隆抗体的技术的描述可见于Stites等人，编辑，“Basic and ClinicalImmunology，”(Lange Medical Publications，Los Altos，Calif.，第四版)和其中引用的参考文献，并见于Harlow和Lane“Antibodies，A LaboratoryManual”Cold Spring Harbor Publications，New York，1988。

在该申请范围内，参照了多种出版物。所有这些出版物的公开内容和那些出版物中引用的那些参考文献此处被引入该申请中作为参考，以更彻底地描述本发明所述领域的情况。

也应理解上述涉及本发明的优选实施方案并且其中可在不背离本发明范围的情况下在其中进行许多改变。本发明进一步通过以下实施例进行阐明，所述实施例不以任何方式解释为对其范围强加限制。相反，应明确理解手段可以是多种其它实施方案、修饰和其等同物，其在阅读此处的说明书后，可在不背离本发明的精神和/或所附权利要求的范围下提示给本领域的技术人员。

实施例

实施例1展叶剑叶藓培养物的生长

对于此项研究，使用来自汉堡大学(University of Hamburg)遗传研究组采集的展叶剑叶藓(Hedw.)B.S.G.种的植物。它们来自由GransdenWood，Huntingdonshire(英国)的H.L.K.Whitehouse采集的菌株16/14，由Engel从孢子对其进行继代培养(1968，Am.J.Bot.55，438-446)。通过孢子和通过配子体的再生进行植物的增殖。原丝体作为富含叶绿体的绿丝体(chloronema)和叶绿体含量低的轴丝体从单倍体孢子发育而来，约12天后在其上面形成芽。这些生长以产生带有***器和颈卵器的配子托。受精后，产生带短刚毛和孢子囊的二倍体孢子体，减数***孢子在其中成熟。

在空气温度为25℃且光强度为55 micromols^-1m^-2(白光；Philips TL65W/25日光灯管)且光/暗变化为16/8小时的气候箱中进行培养。按照Reski和Abel(1985，Planta 165：354-358)使用Knop培养基在液体培养物中改良该藓类或使用1％的oxoid琼脂(Unipath，Basingstoke，England)在Knop固体培养基上培养该藓类。在通气的液体培养基中培养用于RNA和DNA分离的原丝体。每9天粉碎原丝体并将其转移至新鲜培养基中。

实施例2

从植物中分离总DNA

总DNA的分离细节涉及处理一克鲜重的植物材料。所用材料包括以下缓冲液：CTAB缓冲液：2％(w/v)N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化铵(CTAB)；100mM Tris HCI pH 8.0；1.4M NaCl；20mM EDTA；N-十二烷基肌氨酸缓冲液：10％(w/v)N-十二烷基肌氨酸；100mM Tris HClpH8.0；20mM EDTA。

在研钵中用液氮将植物材料研磨以生成细粉并转移至2ml Eppendorf容器内。然后在冰冻的植物材料上覆盖一层1ml的分解缓冲液(1ml CTAB缓冲液，100μl N-十二烷基肌氨酸缓冲液，20μl β-巯基乙醇，和10μl蛋白酶K溶液，10mg/ml)并在60℃持续振荡温育一小时。将所获匀浆分装至两个Eppendorf容器(2ml)中并通过用相同体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡抽提两次。对于相分离，每种情况中在室温8000xg下离心15分钟。然后使用冰冷的异丙醇在-70℃沉淀DNA 30分钟。沉淀的DNA在4℃和10,000g沉淀30分钟并重悬浮于180μl的TE缓冲液(Sambrook等人1989.Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)。对于进一步纯化，用NaCl(终浓度1.2M)处理DNA并使用两倍体积的无水乙醇于-70℃再次沉淀30分钟。经70％乙醇洗涤步骤后，干燥DNA并随后溶于50μl H₂O+RNA酶(终浓度50mg/ml)。4℃过夜溶解该DNA并随后在37℃进行RNA酶消化1小时。于4℃进行DNA贮藏。

实施例3

总RNA和poly-(A)+RNA的分离和从展叶剑叶藓构建cDNA文库

为进行转录物的研究，分离总RNA和多聚-(A)+RNA。按照GTC方法从9天龄野生型原丝体中获得总RNA(Reski等人1994，Mol.Gen.Genet.，244：352-359)。使用Dyna BeadsR(Dynal，Oslo，Norway)按照制造商方案的说明书来分离多聚(A)+RNA。测定RNA或多聚(A)+RNA的浓度后，通过加入1/10体积的3M醋酸钠pH4.6和2倍体积的乙醇沉淀RNA并贮存于-70℃。

对于cDNA文库构建，使用小鼠白血病病毒(Murine LeukemiaVirus)反转录酶(Roche，Mannheim，Germany)和寡聚-d(T)-引物完成第一链合成，通过在12℃(2小时)、16℃(1小时)、和22℃(1小时)与DNA聚合酶I、Klenow酶温育和RNA酶H消化进行第二链合成。通过在65℃温育(10分钟)终止该反应并随后转移至冰上。使用T4-DNA-聚合酶(Roche，Mannheim)在37℃(30分钟)使双链DNA分子平端化。通过苯酚/氯仿抽提和Sephadex G50离心柱去除核苷酸。通过T4-DNA-连接酶将EcoRI接头(Pharmacia，Freiburg，Germany)连接至cDNA末端(Roche，12℃，过夜)并通过与多核苷酸激酶温育将其磷酸化(Roche，37℃，30分钟)。将该混合物置于低熔点琼脂糖胶上进行分离。从凝胶上洗脱大于300个碱基对的DNA分子，苯酚抽提、在Elutip-D-柱(Schleicher和Schuell，Dassel，德国)上浓缩并连接至载体臂并使用Gigapack Gold试剂盒(Stratagene，Amsterdam，荷兰)使用材料并按照制造商的说明书将其包装入lambda ZAPII噬菌体或lambda ZAP-Express噬菌体中。

实施例4

展叶剑叶藓EST的测序和功能注释

如实施例3中描述的cDNA文库按照标准方法用于DNA测序，并具体而言，使用ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction试剂盒(Perkin-Elmer，Weiterstadt，德国)通过链终止法进行。经体内大量切除、再转化、并随后将DH10B涂布于琼脂平板上(材料和方案细节来自Stratagene，Amsterdam，荷兰)，从cDNA文库中制备质粒回收后进行随机测序。按照制造商方案在Qiagene DNA制备机器人(Qiagen，Hilden)上从生长于含氨苄青霉素的Luria-Broth培养基中的过夜生长的大肠杆菌中制备质粒DNA(参阅Sambrook等人，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6)。使用具有如下核苷酸序列的测序引物：

5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′SEQ ID NO：7

5′-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3′SEQ ID NO：8

5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′SEQ ID NO：9。

使用由Bio-Max(Munich，德国)商业提供的软件包EST-MAX处理并注释序列。该程序整合几乎所有对蛋白质序列功能和结构表征重要的生物信息学方法。对于参考，见网址pedant.mips.biochem.mpg.de。整合于EST-MAX的最重要算法是：FASTA(具有统计学显著性评估的非常灵敏的序列数据库搜索；Pearson，1990，Rapid and sensitive sequencecomparison with FASTP and FASTA，Methods Enzymol.183：63-98)；BLAST(具有统计学显著性评估的非常灵敏的序列数据库搜索；Altschul等人，Basic local alignment search tool，Journal of Molecular Biology215：403-10)；PREDATOR(从单一序列和多序列高准确度地预测二级结构；Frishman和Argos，1997，75％ accuracy in protein secondarystructure prediction.Proteins 27：329-335)；CLUSTALW(多序列比对；Thompson等人，1994，CLUSTAL W(通过序列加权、位置特异性空位罚分和加权矩阵选择来提高递增多序列比对的灵敏性)，Nucleic AcidsResearch 22：4673-4680)；TMAP(从多重比对的序列预测跨膜区；Persson和Argos，1994，Prediction of transmembrane segments in proteinsutilizing multiple sequence alignments，J.Mol.Biol.237：182-192)；ALOM2(从单一序列预测跨膜区；Klein等人，Prediction of proteinfunction from sequence properties：A discriminate analysis of a database.Biochim.Biophys.Acta 787：221-226(1984).Dr.K.Nakai的第二版本)；PROSEARCH(PROSITE蛋白质序列模式检测；Kolakowski等人，1992，ProSearch：fast searching of protein sequences with regular expressionpatterns related to protein structure and function.Biotechniques 13，919-921)；BLIMPS(针对非缺口块数据库的相似性搜索，Wallace和Henikoff，1992)；PATMAT(用于序列、模式和块查询及数据库的搜索和提取程序，CABIOS 8：249-254.Bill Alford编写)。

实施例5

鉴定对应于PpAKT-3的展叶剑叶藓ORF

使用程序EST-MAX通过BLAST分析在展叶剑叶藓EST测序程序中鉴定展叶剑叶藓部分cDNA(EST)。PpAKT-3的全长核苷酸cDNA序列定义为SEQ ID NO：1。PpAKT-3(EST472)的ORF编码SEQ ID NO：2显示中的825个氨基酸的多肽，包括SEQ ID NO：2中氨基酸位置78至氨基酸位置772处的钾转运蛋白结构域。表1中显示PpAKT-3的氨基酸序列与已知蛋白质序列的同一性和相似性。

表1

PpAKT-3与其它同源蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度

 

公共数据库检索号	蛋白质名称	物种	序列同一性(％)	序列相似性(％)
					Q8VXB2	推测的钾转运蛋白	稻	51.8	66.9
Q8VXB1	推测的钾转运蛋白	稻	50.5	67.1
					Q653B6	推测的钾转运蛋白	稻	51.9	67.2
G86436	大麦可能的钾转运蛋白	拟南芥	51.0	66.5
					Q9M7K3	HAK2钾离子转运蛋白	大麦	46.7	60.6

实施例6

克隆编码PpAKT-3的全长展叶剑叶藓cDNA

为从展叶剑叶藓中分离编码PpAKT-3(SEQ ID NO：1)的克隆，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)按制造商的说明书生成cDNA文库。使用如实施例3中描述分离的总RNA作为模板。在RNA分离前如下处理培养物：盐胁迫：用补加1-M NaCl的培养基处理2、6、12、24、48小时；冷胁迫：按盐胁迫相同时间点4℃处理；干旱胁迫：按盐胁迫相同时间点在干滤纸上温育培养物。

5’RACE方案

使用如实施例4中描述从数据库搜索鉴定的EST序列设计RACE用的寡核苷酸(oligos)(参阅表2)。使用Advantage 2 PCR试剂盒(ClontechLaboratories)和SMART RACE cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboratories)按生产商说明书在Biometra T3 Thermocycler上通过进行cDNA末端快速扩增聚合酶链式反应(RACE PCR)获得这些基因的延伸序列。从RACE反应中获得的序列对应于全长编码区并用于设计用于各基因全长克隆的寡核苷酸(参阅下面的全长扩增)。

全长扩增

通过用基因特异引物(参阅表2)和原始EST作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)获得对应PpAKT-3(SEQ ID NO：1)的全长克隆。反应条件为使用PWO DNA聚合酶(Roche)的标准条件。根据标准条件和制造商的方案进行PCR反应(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual.2nd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，N.Y.，Biometra T3 Thermocycler)。反应参数为：94℃五分钟，然后94℃一分钟、50℃一分钟和72℃ 1.5分钟的五个循环。其后为94℃一分钟、65℃一分钟和72℃ 1.5分钟的二十五个循环。

使用QIAquick Gel提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖胶中提取扩增的片段并按制造商的说明书将其连入TOPO pCR 2.1载体(Invitrogen)中。使用标准条件将重组载体转化入Top10细胞(Invitrogen)中(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual.第二版.ColdSpring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor，NY)。转化细胞在含100μg/ml羧苄青霉素、0.8mg X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和0.8mg IPTG(异丙硫基-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂上于37℃过夜生长进行选择。挑选白色菌落并用于接种3ml含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB并在37℃过夜生长。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)按制造商的说明书提取质粒DNA。按照标准分子生物学技术进行后续克隆及限制性作图的分析(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual.第二版.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold SpringHarbor，N.Y.)。

表2

用于克隆全长克隆的方案及引物

 

基因	终产物位点	分离方法	Race引物	RT-PCR引物
					PpAKT-3	XmaI/EcoRV	全长克隆的5′RacePCR和RT-PCR	(SEQ ID NO：10)CTGAAGCCGGTTTGGAGTGATCGTCRC523：(SEQ ID NO：11)GGAGGGTGGTGACGATCATGACCATCACRC738：(SEQ ID NO：12)CCAGCTGTGACGCAGAGGCAGAGAACRC756：(SEQ ID NO：13)ACCAGCGGCACCCAGCCTCCTTGAGRC757：(SEQ ID NO：14)AGGCAAGGAGGAAGTGCTTCCGCCAA	RC856：(SEQ ID NO：15)ATCCCGGGCGATTGCCTGCTCTGAATGATCAGRC857：(SEQ ID NO：16)GCGTTAACGTCGCCCTGTACAAAACTCAGACCCA

实施例7

PpAKT-3同源物的鉴定

组织收获、RNA分离和cDNA文库构建

在不同条件和处理下种植大豆、小麦和油菜植物，并在不同的发育阶段收获不同组织。以策略方式完成植物生长和收获，使得在至少一个或更多所得文库中收获所有可表达基因的可能性达到最大化。如实施例3描述了从每一种收集样品中分离mRNA，并构建cDNA文库。在文库产生过程中无扩增步骤，以使样品中基因的冗余度减到最小并保留表达信息。从在oligo dT柱上纯化的mRNA的3’产生所有文库。随机挑选来自转化cDNA文库到大肠杆菌中的克隆并将其置于微量滴定板中。

探针杂交

从大肠杆菌菌落中分离质粒DNA，并然后印迹到膜上。一组288 ³³P放射标记的7-mer寡核苷酸顺序杂交到这些膜上。为了提高通量，处理一式两份膜。每一次杂交后，在感光成像(phosphorimage)扫描过程中捕捉印迹图像以产生每一寡核苷酸的杂交谱。该原始数据图像通过LIMS自动转移到计算机中。通过为图像盒(image cassette)、滤膜和盒中的定向来维持绝对同一性。然后使用相对温和的条件处理所述滤膜以除去结合的探针并返回杂交室用于另一轮杂交。重复杂交和成像循环直至形成一组288种寡聚物。

杂交完成后，为每一斑点(代表cDNA***物)关于哪些288 ³³P放射标记的7-mer寡核苷酸结合到该特定斑点(cDNA***物)上，和结合的程度产生图谱。该图谱定义为由该克隆产生的标记。将每一克隆的标记与由相同生物产生的所有其它标记比较以鉴定相关标记簇。该方法在测序前将生物的所有克隆“分类”成簇。

基因分离

基于它们具有相同或相似的杂交标记将克隆分类成多种簇。簇应表明个体基因或基因家族的表达。该分析的副产物是每一基因在特定文库中丰度的表达谱。从5’末端的单向测序用于通过序列数据库中的相似性和基序搜索预测特定克隆的功能。

展叶剑叶藓PpAKT-3(SEQ ID NO：1)的全长DNA序列在大豆、小麦和油菜的专有数据库中以E-10的E值进行blast检索。(Altschul，Stephen等人，Gapped BLAST and PSI_BLAST：a new generation of proteindatabase search program，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。分析所有重叠群命中的推测的全长序列，并对代表推测全长重叠群的最长克隆进行完全测序。鉴定了一条来自大豆的序列和一条来自小麦的序列。其为GmAKT-2和TaAKT-1。GmAKT-2和TaAKT-1氨基酸序列与最接近的现有技术序列的同源性表示于表3和4中。

表3

GmAKT-2和相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度

 

基因名称	公共数据库序列	蛋白质名称	物种	序列同一性(％)	序列相似性(％)
						GmAKT-2	POT4_ARATH	钾转运蛋白4	拟南芥	76％	84％

表4

TaAKT-1和相似蛋白质的氨基酸同一性和相似性程度

 

基因名称	公共数据库序列	蛋白质名称	物种	序列同一性(％)	序列相似性(％)
						TaAKT-1	NP_914903	推测的高亲和力钾转运蛋白	稻	80％	84％

表5

PpAKT-3、GmAKT-2和TaAKT-1蛋白质的氨基酸同一性程度

 

	PpAKT-3	GmAKT-2	TaAKT-1
				PpAKT-3	100％	45.9％	43.2％
GmAKT-2		100％	40.4％
				TaAKT-1			100％

GmAKT-2(GM59666231)的ORF编码SEQ ID NO：4中显示的821个氨基酸多肽，包括从氨基酸位置43处到氨基酸768的钾转运蛋白结构域。TaAKT-1(TA59824966)的ORF编码SEQ ID NO：6中显示的785个氨基酸多肽，包括从氨基酸位置82到氨基酸732的钾转运蛋白结构域。

实施例8

通过过表达AKT基因改造胁迫耐受的拟南芥植株

克隆AKT基因至双元载体

按照制造商的说明书通过用限制性酶双消化从重组PCR2.1 TOPO载体亚克隆含展叶剑叶藓ATK基因(例如，PpAKT-3)的片段。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照制造商的生产商说明书从琼脂糖凝胶中切除随后的片段并将其连接入含选择标记基因的双元载体中。所得重组载体包含在组成型超强启动子控制下的正向的相应AKT基因。

农杆菌转化

按标准条件将重组载体转化入根癌农杆菌C58C1和PMP90(Hoefgen和Willmitzer，1990)。

植物转化

根据标准条件生长和转化拟南芥生态型C24植物(Bechtold，1993，Acad.Sci.Paris.316：1194-1199；Ben等人，1994，Science 265：1856-1860)。

筛选转化的植株

筛选T1代植株的由选择标记基因赋予的对筛选剂的抗性，并收集T1代种子。按标准方案对T1代种子消毒(Xiong等人，1999，Plant MolecularBiology Reporter 17：159-170)。将种子平板接种于含0.6％琼脂并添加1％蔗糖、0.5g/L2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)(Sigma-Aldrich)、50-150μg/ml筛选剂、500μg/ml羧苄青霉素(Sigma-Aldrich)和2μg/ml苯菌灵(Sigma-Aldrich)的用KOH调节pH为5.7的1/2 Murashige和Skoog培养基(MS)(Sigma-Aldrich)上。平板上的种子在4℃春化四天。种子在气温为22℃且光强度为40micromols-1m^-2(白光；Philips TL 65W/25日光灯管)和16小时光照和8小时黑暗的日长周期下在气候箱中萌发。对转化的幼苗进行选择14天后转移至添加有0.6％琼脂、1％蔗糖、0.5g/LMES(Sigma-Aldrich)、和2μg/ml苯菌灵(Sigma-Aldrich)的用KOH调节pH为5.7的1/2MS培养基0.6％琼脂板上，并允许其恢复五至七天。

在水份受限条件下的生长筛选

在拟南芥中在组成型启动子的调控下过表达PpAKT-3基因。在平板上筛选T2和/或T3代种子的由选择标记基因赋予的对筛选剂的抗性，并将阳性植株移植到土壤中并在生长室中生长3周。在此期间维持土壤湿度约为土壤最大持水量的50％。

测定在此期间由植物造成的总水份损失(蒸腾作用)。3周后，收集整个地上植物材料，在65℃干燥2天并称重。结果显示于表6和表7。地上植物干重(DW)与植物水分利用之比为水分利用效率(WUE)。表6和表7分别给出了独立转化事件(株系)的WUE和DW。给出了来自方差分析的株系与野生型对照相比的最小二乘均值(least square mean)、标准误和显著性值(p)。还给出了PpAKT-3(EST 472)过表达植株与野生型对照植株相比，WUE(表6)和DW(表7)的提高百分比。

表6

表7

干旱耐受性筛选

转移T1代幼苗至培养皿中干燥无菌的滤纸上，并在80％RH(相对湿度)的Percieval Growth Cabinet MLR-350H，micromols-1m2(白光；Philips TL 65W/25日光灯管)中干燥两小时。随后降低RH至60％并将幼苗继续干燥八小时。然后移去幼苗并将其放置于添加2μg/ml苯菌灵(Sigma-Aldrich)和0.5g/L MES(Sigma-Aldrich)的1/2 MS 0.6％琼脂板上，并在五天后评分。

实施例9

在转基因拟南芥株系中检测AKT转基因

Taqman拷贝数测定

从含铬钢球的96孔深孔板中的叶片样品中分离用于TaqMan拷贝数测定的基因组DNA，将板置于-80℃冰箱中超过30分钟和/或过夜冻干。将深孔板中包含的冰冻组织磨碎。使用

 Genomic DNAExtraction试剂盒(Promega，Madison，WI)根据制造商的说明书来提取基因组DNA。

使用Primer

软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计PCR引物和探针。为内源对照基因及对构建体中存在的转基因特异的区域设计引物和探针。用一种报告荧光基团标记探针的5′末端用于内源对照并用另一种报告荧光基团标记探针的5′末端用于转基因，并且两种都用淬灭剂在3′末端进行标记。

如通过Ingham等人(BioTechniques 31：132-140，2001)和Ingham(Methods in Molecular Biology 286：273-289，2004)描述来进行聚合酶链式反应。

实施例10

在转基因拟南芥株系中检测AKT转基因mRNA

qRT-PCR测定

从含铬钢球的1.2ml 96孔深孔板(Corning)孔中的叶片样品中分离用于qRT-PCR测定的总RNA，将板置于负80℃冰箱中超过30分钟和/或过夜冻干。将深孔板中的冰冻组织磨碎。使用

 Genomic DNAExtraction试剂盒(Promega，Madison，WI)根据制造商的说明书来提取总RNA。然后使用不含DNA的试剂盒(Ambion，Austin，TX)根据制造商的说明书对RNA进行DNA酶处理。

使用Primer 

软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计PCR引物和探针。为内源对照基因及对构建体中存在的转基因特异的区域设计引物和探针。对于内源对照，用一种报告荧光基团标记探针的5′末端并对于转基因另一种报告荧光基团，并且两者都用淬灭剂在3′末端进行标记。

在96孔反应板(Applied Biosystems，Foster City，CA)中进行聚合酶链式反应。根据制造商的说明书使用一步SYBR Green I qRT-PCR标准混合物(mastermix)(Eurogentec，San Diego，CA)。利用如Ingham等人(BioTechniques 31：132-140，2001)和Ingham(Methods in MolecularBiology 286：273-289，2004)描述的输出循环阈值(C_t)来计算表达的倍数差异。

实施例11

通过过表达AKT基因改造胁迫耐受的油菜籽/油菜植物

将4天龄幼苗的子叶柄用作组织培养的外植体并根据专利EP1566443进行转化。商品化的栽培种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但可使用其它品种。

含有双元载体的根癌农杆菌GV3101：pMP90RK用于油菜转化。用于转化的标准双元载体是pSUN(专利WO02/00900)，但已描述了用于植物转化的许多不同的双元载体***(例如，An，G.in AgrobacteriumProtocols.Methods in Molecular Biology卷44，pp 47-62，GartlandKMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。植物基因表达盒由至少两个基因组成，这两个基因是选择标记基因和调节性状基因的cDNA或基因组DNA转录的植物启动子。可使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)(美国专利5767366和6225105)的拟南芥基因。类似地，多种启动子可用于调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育、组织或环境调节。在该实施例中，34S启动子(GenBank检索号M59930和X16673)用于提供性状基因的组成型表达。

油菜种子在70％乙醇中进行表面消毒2分钟，在55℃温自来水中温育15分钟，然后在1.5％次氯酸钠中温育10分钟，随后用无菌蒸馏水冲洗三遍。然后将种子置于不含激素而含有Gamborg B5维生素、3％蔗糖和0.8％ Oxoidagar的MS培养基上。种子在24℃低光照(<50μMol/m2s)16小时光照下萌发4天。从体外幼苗中切除具有附着子叶的子叶柄外植体，并通过将柄外植体的切口浸入农杆菌悬浮液中用农杆菌进行接种。外植体然后在含有维生素、3.75mg/l BAP、3％蔗糖、0.5g/l MES，pH5.2、0.5mg/lGA3、0.8％ Oxoidagar的MS培养基上24℃，16小时光照下培养3天。与农杆菌共培养3天后，将叶柄外植体转移至含有3.75mg/l BAP、0.5mg/lGA3、0.5g/l MES，pH5.2、300mg/l特美汀(timentin)和筛选剂的再生培养基中直至再生出苗。外植体一旦开始形成苗，立即将它们转移至苗伸长培养基中(A6，含有充分强度培养基，其包括维生素、2％蔗糖、0.5％Oxoidagar、100mg/l肌醇、40mg/l硫酸腺嘌呤、0.5g/l MES，pH 5.8、0.0025mg/l BAP、0.1mg/l IBA、300mg/l特美汀和筛选剂)。

使用TaqMan探针通过qPCR来分析来自原代转基因植物(T0)的体外和温室材料的样品以确认T-DNA的存在并测定T-DNA整合的数目。

种子产生自自花授粉的原代转基因植物。第二代植物在温室条件下生长并进行自花授粉。使用TaqMan探针通过qPCR来分析所述植物以确认T-DNA的存在并测定T-DNA整合的数目。比较纯合转基因植物、杂合转基因植物和不成对(无效转基因)植物的生长特征和产量。

实施例12

通过过表达AKT基因改造胁迫耐受性玉米植物

在相同质粒上携带基因和玉米ahas基因的农杆菌细胞在添加了合适抗生素的YP培养基上生长1-3天。收集一个菌环的农杆菌细胞并在2mlM-LS-002培养基(LS-inf)中悬浮，并将含有农杆菌细胞的试管在摇床上1,200rpm(转/分钟)保持1-3小时。

在授粉后7-12天收获玉米穗轴[基因型J553x(HIIIAxA188)]。穗轴在20％ Clorox溶液中灭菌15分钟，然后用无菌水进行彻底冲洗。将大小为0.8-2.0mm的未成熟胚解剖到含有农杆菌细胞(在LS-inf溶液中)的试管中。

通过将试管水平保存在层流通风厨中于室温下30分钟进行农杆菌感染。将农杆菌感染的混合物倒在含共培养培养基(M-LS-011)的平板上。在吸出液体农杆菌溶液后，将胚放置在schutellum面朝上的共培养培养基上并在黑暗中22℃培养2-4天。

将胚不经选择转移至M-MS-101培养基中。7至10天后，将胚转移至含有0.75μM咪草烟(imazethapyr)的M-MS-101培养基中并生长4周来选择转化的愈伤组织细胞。

植物再生通过转移有抵抗力的愈伤组织至添加了0.75μM咪草烟的M-LS-504培养基中开始并在光下2℃生长2至3周。然后将再生的苗转移至含有M-MS-607培养基(0.5μM咪草烟)的生根箱中。

将有根的小植株转移至盆栽混合物中并在生长室中生长一周，然后移植到更大的盆中并在温室中维持直至成熟。

实施例13

AKT转基因植物的温室胁迫耐受性筛选

高通量干旱性能筛选

在小盆中种植用于转化事件的分离转基因玉米种子。对这些植物的每一株进行独特地标记、取样并分析转基因拷贝数目。标记转基因阳性和阴性植物并与相似大小配对用于一起移植至大盆中。这为转基因阳性和阴性植物提供了统一的和竞争性的环境。根据想要的水胁迫的严重性，向大盆浇水以达到一定百分比的土壤持水量。通过每隔一天浇水来维持土壤的水位。在生长期测定植物生长和生理性状，如高度、茎直径、叶卷曲、植物萎蔫、叶片延伸速率、叶片水分状态、叶绿素含量和光合作用速率。在生长期后，收获植物的地上部分，并称量每一植物的鲜重和干重。然后进行转基因阳性和阴性植物间表型的比较。

水分利用效率(WUE)测定

将用于转化事件的转基因阳性和阴性玉米苗移植到具有给定量土壤和水的盆中。用盖子盖住盆，所述盖子允许苗生长穿过但使水分损失降至最低。定期称量每个盆并添加水来维持初始含水量。实验结束时，测量每一植物的湿重和干重，计算每一植物消耗的水分并用计算每一植物的WUE。在实验过程中测量植物生长和生理性状，如高度、茎直径、叶卷曲、植物萎蔫、叶片延伸速率、叶片水分状态、叶绿素含量和光合作用速率。然后进行转基因阳性和阴性植物间表型的比较。

脱水测定

在小盆中种植用于转化事件的分离转基因玉米种子。这些盆保持在具有统一环境条件的温室中区域内，并被最佳地培养。对这些植物的每一株进行独特地标记、取样并分析转基因拷贝数目。允许植物在这些条件下生长直至它们达到预定生长阶段。然后停止供水。随着胁迫强度的提高，测量植物生长和生理性状如高度、茎直径、叶卷曲、植物萎蔫、叶片延伸速率、叶片水分状态、叶绿素含量和光合作用速率。然后进行转基因阳性和阴性植物间表型的比较。

循环干旱测定

在小盆中种植用于转化事件的分离转基因玉米种子。这些盆保持在具有统一环境条件的温室中区域内，并最佳地培养。对这些植物的每一株进行独特地标记、取样并分析转基因拷贝数目。允许植物在这些条件下生长直至它们达到预定生长阶段。然后以固定时间间隔对植物重复浇水至饱和。在实验持续过程中重复该水/干旱循环。在生长期测量植物生长和生理性状如高度、茎直径、叶卷曲、植物萎蔫、叶片延伸速率、叶片水分状态、叶绿素含量和光合作用速率。实验结束时，收获植物用于测量地上鲜重和干重。然后进行转基因阳性和阴性植物间表型的比较。

实施例14

AKT转基因植物的田间胁迫耐受性筛选

无雨条件下分离玉米干旱耐受性筛选

在单个位置或多个位置上使用受控的干旱胁迫。在平均5个月季节过程中期望的降水量少于10cm并且最低温度高于5℃的位置，或在具有通过自动挡雨屏障(“rain-out shelter”)(其在不需要时撤销以提供开放田地条件)拦截的期望应时降水量的位置处通过滴灌带或喷灌来控制农作物水分利用。遵循本领域内的标准农学实践用于土壤制备、种植、受精和害虫控制。每一样地上种植对于单个转基因***事件的存在分离的种子。Taqman转基因拷贝数量测定(如在实施例9中描述)用于叶片样品以区分转基因植物与无效分离子对照植物。已经通过该方式进行基因分型的植物也在与干旱耐受性、生长和产量相关的表型范围内计分。这些表型包括植物高度、单株粒重、单株粒数、单株穗数、地上干重、叶片对水蒸气的传导、叶片CO₂吸收、叶片的叶绿素含量、光合作用相关的叶绿素荧光参数、水分利用效率、叶片水势、叶片的相对含水量、茎液流率、茎的水分传导率、叶片温度、叶片反射能力、叶片光吸收度、叶片面积、开花日期、开花-抽丝间隔、籽粒灌浆的持续时间、渗透势、渗透调节、根系大小、叶片延伸速率、叶夹角、叶片卷曲和存活。利用用于野外生理学的市售仪器使用按照制造商提供的标准方案进行所有的测量。个体植物用作每件事件的重复单元。

无雨条件下非分离玉米干旱耐受性筛选

在单个位置或多个位置上使用受控的干旱胁迫。在平均5个月季节过程中期望的降水量少于10cm并且最低温度高于5℃的位置，或在具有通过自动挡雨屏障(“rain-out shelter”)(其在不需要时撤销以提供开放田地条件)拦截的期望应时降水量的位置处通过滴灌带或喷灌来控制农作物水分利用。遵循本领域内的标准农学实践用于土壤制备、种植、受精和害虫控制。设计试验布局以使含有非分离转基因事件的样地与无效分离子对照的邻近样地配对。转基因植物的后代(或来自后代衍生的株系)因孟德尔分离而不含转基因。用于特定事件的额外重复配对样地分布于试验周围。与干旱耐受性、生长和产量相关的一系列表型在配对样地中被评分并在样地水平上进行评估。当所述测量技术仅可应用于个体植物时，这些每一次随机从样地中选择。这些表型包括植物高度、单株粒重、单株粒数、单株穗数、地上干重、叶片对水蒸气的传导、叶片CO₂吸收、叶片的叶绿素含量、光合作用相关的叶绿素荧光参数、水分利用效率、叶片水势、叶片的相对含水量、茎液流率、茎的水分传导率、叶片温度、叶片反射能力、叶片光吸收度、叶片面积、开花日期、开花-抽丝间隔、籽粒灌浆的持续时间、渗透势、渗透调节、根系大小、叶片延伸速率、叶夹角、叶片卷曲和存活。利用用于野外生理学的市售仪器使用按照制造商提供的标准方案进行所有的测量。个体样地用作每件事件的重复单元。

多位置玉米干旱耐受性和产量筛选

选择包含主要玉米生长区域的5至20个位置。这些广泛分布以提供基于平均温度、湿度、降水量和土壤类型的期望的农作物水分可用性范围。农作物水分可用性在标准农学实践外没有被改变。设计试验布局以使含有非分离转基因事件的样地与无效分离子对照的邻近样地配对。转基因植物的后代(或来自后代衍生的株系)因孟德尔分离而不含转基因。用于特定事件的额外重复配对样地分布于试验周围。与干旱耐受性、生长和产量相关的一系列表型在配对样地中被评分并在样地水平上进行评估。当所述测量技术仅可应用于个体植物时，这些每一次随机从样地中选择。这些表型包括植物高度、单株粒重、单株粒数、单株穗数、地上干重、叶片对水蒸气的传导、叶片CO₂吸收、叶片的叶绿素含量、光合作用相关的叶绿素荧光参数、水分利用效率、叶片水势、叶片的相对含水量、茎液流率、茎的水分传导率、叶片温度、叶片反射能力、叶片光吸收度、叶片面积、开花日期、开花-抽丝间隔、籽粒灌浆的持续时间、渗透势、渗透调节、根系大小、叶片延伸速率、叶夹角、叶片卷曲和存活。利用用于野外生理学的市售仪器使用按照制造商提供的标准方案进行所有的测量。个体样地用作每件事件的重复单元。

附件

来自展叶剑叶藓的PpAKT-3的核苷酸序列(EST472)(SEQ ID NO：1)

ATCCCGGGCGATTGCCTGCTCTGAATGATCAGTGTGGTGAGTGAAGGAACTGTGGCTA

GTGTGCCCGCCATTGTGCTCGCCGTCTGAGGATCATGTCGACCACTACGGTGTCGGAG

GACGCCGAAGATGGGAGAGGTGGTCGCAACGGCCAGCAGGCCAACCAAGGGCGCCT

GTGGGACATGGATCAGCGGATCGACCAGCCGCTGGGTGCCGAAGCCGACCATGTTAG

GTCCATGTATCGCGACCAGACTATGCCTCCGAGTGTGGTGTTGTGCCTAGCGTTTCAG

AGCCTTGGGGTGGTCTACGGAGACTTGGGCACATCACCGTTGTATGTTTTCAAGAGCA

CGTTTGCTAATGGAGGAGTGAGGAACGAGGATGACATCATTGGAGCTCTATCCCTCATT

ATCTACACCCTCACCATTATCCCCTTGATTAAATACGTCTTCATCGTGCTCAGAGCAAAT

GACAATGGCGAAGGGGGTTCTTTCGCTCTCTATTCATTGCTGTGTCGTTACTGTAATATA

AGCGCCCTGCCAAATCAACACCCTTCCGATGCGGAGCTTACCACGTATGTCGTAGACA

ACGCCCGCCGCAAAACCTGGATTCAGAGGAAGCTGGAAAGTAGTGTGCTTGCGCAGCA

AGTGTTGTTGGTTATTGTGCTCTTCGGGACTTGCATGGTTATCGGCGACGGCATATTAA

CCCCGTCTATCTCAGTCTTATCGGCAGTTGTTGGAATTAAAGCTGCTTCTTCCTCCTTGG

ATACTAATTTGGTGACAGGCATTTCGTGCGTCATCTTAGTCATCCTCTTTAGCGTACAGC

GCTTCGGCACAGCGAAAATCTCAGTCTTGTTCGCACCGATTTTCTTGGTTTGGTTCCTAT

CTCTTGCCTGTATCGGCTGCTACAACATAATCAAATGGGAGAAATCAATCTTCTTAGCCT

TCAATCCCCTTCAAATCGTACACTTCTTCAGACGGAATGGAAGACAGGGGTGGGAGCAT

CTCGGAGGCATCGTGCTGTGTATGACAGGGACTGAAGCGTTGTTTGCCGACTTGGGCC

ATTTCAGTTGTCGGTCTATTCAGATTGTCTTCACTTCTCTAGTGTACCCGTGCTTATTTCT

GACTTACCTCGGGCAAGCTGCTTACCTCGTGGAACATATGGAAGACGTTAACGATCCCT

TTTATTCCTCACTGCCGAGTAGTATTTACTGGCCAATCTTCGTGCTGGCAACAATATCAG

CCATGATAGCGAGCCGAGCCATGATCTCCGCCACGTTTTCTATCGTGAAGCAGGCGAC

AGCTCTGGGATGCTTTCCTCGAGTGAAGGTTGTGCACACATCAAATAATGTTGCAGGAC

AGGTGTATATCCCCGAAATCAACTGGATTCTTATGGTTCTCTGCCTCTGCGTCACAGCT

GGTTTCCGAGACACGGACCAAATCGGAAATGCTTACGGTATCGCCGTGGTGATGGTCA

TGATCGTCACCACCCTCCTGATGACCCTAGTGATAATCATCATTTGGCGGAAGCACTTC

CTCCTTGCCTTGCTATTCCTTGTCGTGTTCGCATCAATCGAGGGAATTTATGTCAGTGC

GGTCCTATTCAAGACAACTCAAGGAGGCTGGGTGCCGCTGGTCATTTCGGTGGTCTTC

GGCACAGTCATGGGCACATGGCATTACGGAACCTTGAAACGCTACCAGTATGAGATGC

AGCACAAGGTTTCAGTGGGATGGTTGCTTGGGCTTGGACCTAGCCTCGGCCTCGTTCG

TGTCCCCGGAATCGGTCTCATGTACACAGATCTCGCTCATGGAGTGCCGCCGCTATTCT

CGCATTTCATCACCAATCTCCCCGCCATCCATTCCACCGTAGTCTTCGTCTGCGTTAAAT

ACCTGCCAGTGAACACGGTACCACAAGATGAGAGATTTCTAATCCGTCGCATCGGTTCA

AGAGCTTATTCCATGTACCGTTGTGCAGCACGTTACGGCTACATAGACCTCCACAAGAA

AGATGACAACTTCGAGCAACTGCTAATTCAAAGCTTAATCAGTTTCGTCGAGATTGAGTC

TATGAGAGAGAGCTCAGGCCGGGAGTCCATGGCTGCAAGCTGGACCCCAGATCAACA

GCCGATGGAGGAGGCCACGGTGCCAACTACGTCGACGATCACTCCAAACCGGCTTCA

GTTGCAAAGAATGCTGAGATTACACAGTCTGATGGGCGGAGGCAACAGCGTCGGCGAC

GGTTATTCCACTCAGTACTCCCAGACCGCCTCGAACTCGGTCGAGATGTCTGCTAACCA

GGAATGCAGTATTCCAAACCTGAGCGTCAACGGCAGCAACAGCAGCAGCAGCCCGCAT

CCGCAAGACGAAGTTGCCTTCCTGAATGCATGCAAAGATGCTGGCGTGGTGTACATAC

TCGGTAACAACATCGTGAAAGCGAGAAAGGATGCAGGATTTTTCAAGAAGCTGGTGATC

AACTACATGTATACCTTTCTGCGAAGGATAAGCCGAGACAGCAGCGTGGTGCTCAACAT

CCCGCACGAGTGCCTACTTCATGTCGGCATGGTGTACTATGTTTGATTCTTTTGGGTCT

GAGTTTTGTACAGGGCGACGTTAACGC

来自展叶剑叶藓的PpAKT-3的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

MSTTTVSEDAEDGRGGRNGQQANQGRLWDMDQRIDQPLGAEADHVRSMYRDQTMPPSV

VLCLAFQSLGVVYGDLGTSPLYVFKSTFANGGVRNEDDIIGALSLIIYTLTIIPLIKYVFIVLRAN

DNGEGGSFALYSLLCRYCNISALPNQHPSDAELTTYVVDNARRKTWIQRKLESSVLAQQVL

LVIVLFGTCMVIGDGILTPSISVLSAVVGIKAASSSLDTNLVTGISCVILVILFSVQRFGTAKISVL

FAPIFLVWFLSLACIGCYNIIKWEKSIFLAFNPLQIVHFFRRNGRQGWEHLGGIVLCMTGTEAL

FADLGHFSCRSIQIVFTSLVYPCLFLTYLGQAAYLVEHMEDVNDPFYSSLPSSIYWPIFVLATI

SAMIASRAMISATFSIVKQATALGCFPRVKVVHTSNNVAGQVYIPEINWILMVLCLCVTAGFR

DTDQIGNAYGIAVVMVMIVTTLLMTLVIIIIWRKHFLLALLFLVVFASIEGIYVSAVLFKTTQGGW

VPLVISVVFGTVMGTWHYGTLKRYQYEMQHKVSVGWLLGLGPSLGLVRVPGIGLMYTDLA

HGVPPLFSHFITNLPAIHSTVVFVCVKYLPVNTVPQDERFLIRRIGSRAYSMYRCAARYGYID

LHKKDDNFEQLLIQSLISFVEIESMRESSGRESMAASWTPDQQPMEEATVPTTSTITPNRLQ

LQRMLRLHSLMGGGNSVGDGYSTQYSQTASNSVEMSANQECSIPNLSVNGSNSSSSPHP

QDEVAFLNACKDAGVVYILGNNIVKARKDAGFFKKLVINYMYTFLRRISRDSSVVLNIPHECL

LHVGMVYYV^＊

来自大豆的GmAKT-2(GM59666231)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)：

ATTAAAGGAATCATCCAAAGGGAACTCAAAATGAAATGAAATGGAAATGTAAGAAGTAGT

ACTGAAAACTGAACTCAACTAACTCGTGACTCGTCAGAGAGAAGAAAAGAATATCGTTC

GTTCGCTCTTACCTTCTTCACCTTCCTTCCTCTCTCTCTCTAGAGAATGGAACCGGAATC

CGGAACTTCGACTTCTCGGAATCCTTCTCAGTTGTCTTGGGTGAATCTGTCTAGGAATTT

ATTATTAGCGTATCAAAGCTTTGGTGTGGTGTATGGAGATCTGAGCACTTCTCCTCTCTA

TGTCTTCACAAGCACCTTCAAGGGGAAGTTGCAGAATCACCATGACGAGGAAACTATAT

TCGGCACGTTTTCGTTGATTTTTTGGACCCTTACTTTGATTCCGTTGCTTAAGTATGTATT

CATCCTATTGAGTGCTGATGACAACGGGGAAGGTGGAACATTCGCTCTTTATTCGCTGC

TCTGTAGGCATGCCAAGTTTAATTTGCTCCCCAATCAACAAGCAGCTGATGAGGAGTTA

TCATCCTATAAATATGGTCCCTCTTCACAGGCTATAGCCTCTTCTCCTCTAAAGAGGTTT

CTGGAGAAACATAAAAGGTTAAGAACAGCCCTGCTTGTTGTGGTATTGTTTGGTGCTTG

CATGGTCATTGGTGATGGTGTGCTTACTCCAGCAATTTCGGTTCTAGCATCAGTCTCAG

GACTAAAAGTTACAGAAAAAAAATTAACAGATGGTGAGCCAAATCTCATTTATTCCTTTTT

TTTTGTTCTCATCATTGCTTTTGTTATGCTAAGGGCAAATTGGTTGCAGGTGAACTTGAG

AAATTTCATGTTGTTTGCAGGTGAACTTGTCCTGCTTGCCTGTGTCATATTGGTTGGACT

GTTTGCTCTCCAACATTGTGGCACACACAAAGTTGCAGTTATGTTTGCACCAATTGTAAT

AATCTGGCTTGTATCAATATTTTCTATTGGGGTGTATAATACAATTCATTGGAATCCAAAA

ATAGTCCGTGCTATATCGCCATATTATATCATCAAGTTTTTTAGCAGGACTGGTAAAGAA

GGTTGGGTTTCTCTTGGAGGGATACTTCTTTGTATCACTGGAACTGAAGCTATGTTTGC

GGATCTTGGTCATTTCACTGCTTCGTCAATAAGGCTTGCATTTGCGTTTGTTATATACCC

GTGTTTAGTGGTACAGTATATGGGTCAAGCTGCTTTCTTGTCTAAAAATCTCGACTCTGT

TGATAACGGTTTTTATGACTCAATACCTGACCCTGTGTTTTGGCCTGTTTTCATAATCGC

CACCCTTGCTGCAATTGTTGGGAGTCAAGCTGTTATAACTGCAACTTTCTCCATCATCAA

GCAGTGTCATGCGCTTGGTTGCTTTCCGCGAGTCAAAGTTGTACACACCTCAAAACATA

TATATGGACAGATCTATATCCCAGAAATCAATTGGATACTTATGATCCTAACTCTTGCAA

TAACCATTGGATTTCAGGACACGACCATAATTGGAAATGCTTATGGGTTGGCTTGTATG

ACAGTTATGTTCATAACTACATTTCTGATGACACTAGTCGCAATCTTTGTCTGGCAGAAA

AGTGTCTTGATTGCTGTTGTATTTCTTTTATTCCTTTGGGTGATAGAGGGCGTATATCTAT

CAGCAGCTTTCATCAAAGTGCCTCAGGGAGGATGGGTACCTCTAGTCTTATCATTCATC

TTCATGATTGTTATGTACGTGTGGCATTATGGAACTCGTAGGAAGTACAGCTATGATCTG

CACAACAAAGTTTCATTGAAATGGTTACTGGGCTTGGGCCCAAGCCTTGGCATTGTTCG

TGTACCTGGGATTGGTCTCATCTACACTGAACTGGCAACAGGCATACCTGCAATATTTT

CCCATTTTGTAACAAATCTTCCTGCATTTCACCAGGTGTTGGTTTTTGTTTGTGTAAAATC

AGTTCCTGTTCCATATGTTTCACCGGAAGAACGTTTCCTTATTGGGCGAGTTTGCCCCA

GACCATATCGAATGTATAGGTGCATTGTCAGATATGGTTACAAGGACATTCAAAGGGAT

GATGGAGATTTTGAGAATCATCTTATACAGAGTATAGCAGAATTTATCCAAATGGAAGCA

GTGCAACCTCAGTTCTCAAGTTCCGAAGCTTCTTCTTCACTTGATGGGAGGATGGCCGT

TATAAGTTCTAGAAACTATGATTATGCTTCAAGTTTAATAGTTTCTGAGCAGGAGGATAT

AGGCGTTGACATATCCATCCCTAGCAGCAGATCTGCAACCCTGCAAAGTTTGCAATCGG

来自大豆的GmAKT-2的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：

MEPESGTSTSRNPSQLSWVNLSRNLLLAYQSFGVVYGDLSTSPLYVFTSTFKGKLQNHHD

EETIFGTFSLIFWTLTLIPLLKYVFILLSADDNGEGGTFALYSLLCRHAKFNLLPNQQAADEEL

SSYKYGPSSQAIASSPLKRFLEKHKRLRTALLVVVLFGACMVIGDGVLTPAISVLASVSGLKV

TEKKLTDGEPNLIYSFFFVLIIAFVMLRANWLQVNLRNFMLFAGELVLLACVILVGLFALQHCG

THKVAVMFAPIVIIWLVSIFSIGVYNTIHWNPKIVRAISPYYIIKFFSRTGKEGWVSLGGILLCIT

GTEAMFADLGHFTASSIRLAFAFVIYPCLVVQYMGQAAFLSKNLDSVDNGFYDSIPDPVFWP

VFIIATLAAIVGSQAVITATFSIIKQCHALGCFPRVKVVHTSKHIYGQIYIPEINWILMILTLAITIGF

QDTTIIGNAYGLACMTVMFITTFLMTLVAIFVWQKSVLIAVVFLLFLWVIEGVYLSAAFIKVPQG

GWVPLVLSFIFMIVMYVWHYGTRRKYSYDLHNKVSLKWLLGLGPSLGIVRVPGIGLIYTELAT

GIPAIFSHFVTNLPAFHQVLVFVCVKSVPVPYVSPEERFLIGRVCPRPYRMYRCIVRYGYKDI

QRDDGDFENHLIQSIAEFIQMEAVQPQFSSSEASSSLDGRMAVISSRNYDYASSLIVSEQEDI

GVDISIPSSRSATLQSLQSVYDDETPQVRRRRVRFQLPENTGMDPDVREELLDLIQAKEAG

VAYIMGHSYVKARKSSSFLKKLVIDIGYSFLRKNGRGPAVALNIPHISLIEVGMIYYV

来自普通小麦的TaAKT-1(TA59824966)的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)：

GTGAGAGAGAGATCATCATCGTACCTTGACGATGGCTGAGCCTCTGAAGGCAAACGGC

AATGGAGCTGCCGAAGGGGGTGCTGCGGGCTCTGCGTTTGCATCGGTGAAGGTGCCG

CCGTCGCCGCCAAGGAGGCTGCAGAGGTTCGACTCCCTGCATATGGAGGCCGGGAAG

ATTCCTGGTGGCCACAGCTATGCAGCCAAGGTTGGCTGGGCGACGACACTGCACTTGG

CCTTCCAGAGCCTAGGTGTGGTTTATGGGGACATGGGAACTTCACCCCTCTATGTGTTC

TCCAGCACCTTTACTGGTGGGATCAAGGACACAGATGACCTCCTTGGTGTCATGTCCTT

GATAATCTATACTGTACTTCTCCTTCCATTGATGAAATATTGTTTCATTGTCTTGAGAGCT

AATGACAACGGCGATGGCGGAACATTTGCACTTTATTCCTTGATATCTCGGTATGCTAG

GATTAGCTTGATACCAAACCAGCAGGCTGAAGATGCAACAGTCTCTCACTACAAGTTAG

AGTCCCCTACGAATCGTGTCAAGCGGGCTCATTGGATTAAGGAAAAGATGGAAAACAG

CCCGAAATTTAAGGTCATACTTTTCCTAGTGACAATTCTAGCAACATCAATGGTTATTGG

TGACGGTGTGCTAACTCCATGTATTTCAGTGCTTAGTGCAGTTACGGGAATCAAGCAAT

CAGCAAAGTCGTTAACTCAAGGACAAATTGCTGGCATCGCAATCGGCATTCTGATCGCC

CTCTTTCTTGTCCAGCGCTTTGGCACAGACAAAGTTGGTTACACATTTGGCCCAGTAAT

CTTTATATGGTTCATCTTAATTGCCGGCATTGGAATTTATAATTTGATCAAACATGATACT

GGAATTCTGAAAGCATTCAACCCACAATACATAGTGGAATATTTCCAAAGAAATGGGAA

GGACGGCTGGATTTCGCTTGGAGGTGTTATCTTATGCATTACAGGAACCGAAGCAATGT

TTGCTGACCTTGGTCACTTCAATGTGAGAGCAATTCAGATTGGCCTTTCTGCAGTTCTG

CTCCCATCAGTATTGCTTGCTTACATGGGACAGGCTGCATATCTTCGCATCCACCCTGA

AGATGTTGCAGATACATTCTACAAATCAATCCCAGGTCCATTATATTGGCCAACATTTGT

GGTGGCCGTGGCTGCTGCTATAATTGCAAGCCAAGCTATGATTTCTGGTGCCTTTGCAA

TCATTGCTCAGTCCCAAGTTCTTGGTTGCTTTCCACGGGTTCGTGTCACTCACACCTCA

AAAAAGTATCATGGGCAGGTCTACATCCCTGAGATCAACTATGCATTAATGATCTTATGT

GTAGCTGTGACAGCTATTTTCCAAACTACAGACAAGATTGGCAATGCATATGGTATCGC

TGTCGTCTTTGTGATGTTCATAACAACACTTCTAGTCACACTGGTAATGGCCATGATATG

GAAGACAAGTCTGCTGTGGATTGCACTCTTTCCAATAATATTTGGCGGCGCAGAGCTCG

TGTACTTATCCTCAGCATTCTACAAATTTGTAGAAGGTGGCTACTTGCCACTAGGTTTTG

CAGCAATTTTGATGCTTATAATGGGCACATGGCACTATGTTCATGTTCATCGGTACAAAT

ACGAGCTCAAGAACAAAGTGTCAAACAACTATGTGGCAGATTTGGCAACAAGGAGAAAT

CTTGCTAGGTTGCCAGGAATAGGCGTTCTGTACTCTGAGCTTGTGCAAGGAATCCCACC

CATACTGCCCCATTTGGTAGAAAAAGTACCTTCCATCCATTCAGTTCTTGTGATTACCTC

AATAAAGTACTTACCAATCAGCAATATAGAAACAAATGAGCGGTTCCTCTTCCGATACGT

GGAGCCAAGAGAATACAGGGTATTCCGATGTGTGGTGCGCTATGGTTACAACAATAAA

GTAGAAGATCCAAGAGAGTTCGAGAACTTGCTTATTGGGAACTTGAAGCAATTCATCCA

TCAAGAATCACTCTACAGCGAAAGTAGTCATTCCCTTGAAGGAGAAGATAATGCATTCG

AAGAATCAGGAGATGCAATGGAGCCTTCTATTGAAGTTCAAGATGCAAGGTTGCCGAAA

AGGTTTTTAGATGGAATCACTGCTAGCCCAGTGAACGGGTTAATGGATGAGATAGAGTT

TATTCAGAGAGGGATGGATGATGGTGTTGTCCATCTGCTGGGAGAAACTAATGTGGTG

GCGGAGCAAAATGCCGGTTTGGTGAAGAAAATAATAGTTGACTACGCCTACAATTTCAT

GAGGAAGAACTTCAGGCAACCAGAGAAGATCACATGTGTCCCTCATAACAGGCTGCTG

CGGGTGGGAATGACATACGAGATCTAGAGAGATGCTCAGTGGATTGATCAAATTGACAA

TAGCTTCAGTTTTCTCAGTACCAAGTGCAGAAAGGATATGCAGAGGAACAGCCTCCTTG

ACTGAACAGCAGAGGATGGAGAGATTTTATGCGTACAAGTGGTGAAACTACAGTACATG

CAATATGTATTTACCATATAATATTTTTTTTGTTAGGGAAATTCTACTGTATAAGTGTTTGT

TAGCAGTAAGTATGCATAGCTGTCAAACCCCTAGTTTGGCCAACTCTTTGCCTTATTGTG

GAAAACTCAAAATCTTAGTATGTGCAGTTGTACACAAAGATTGTAACCTACCGGCAAAAG

TTAAACAAATAATAAAGTATGACTTGTGTGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGAGAGAG

AGACCGACACGCA

来自普通小麦的TaAKT-1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：

MAEPLKANGNGAAEGGAAGSAFASVKVPPSPPRRLQRFDSLHMEAGKIPGGHSYAAKVG

WATTLHLAFQSLGVVYGDMGTSPLYVFSSTFTGGIKDTDDLLGVMSLIIYTVLLLPLMKYCFI

VLRANDNGDGGTFALYSLISRYARISLIPNQQAEDATVSHYKLESPTNRVKRAHWIKEKMEN

SPKFKVILFLVTILATSMVIGDGVLTPCISVLSAVTGIKQSAKSLTQGQIAGIAIGILIALFLVQRF

GTDKVGYTFGPVIFIWFILIAGIGIYNLIKHDTGILKAFNPQYIVEYFQRNGKDGWISLGGVILCI

TGTEAMFADLGHFNVRAIQIGLSAVLLPSVLLAYMGQAAYLRIHPEDVADTFYKSIPGPLYWP

TFVVAVAAAIIASQAMISGAFAIIAQSQVLGCFPRVRVTHTSKKYHGQVYIPEINYALMILCVAV

TAIFQTTDKIGNAYGIAVVFVMFITTLLVTLVMAMIWKTSLLWIALFPIIFGGAELVYLSSAFYKF

VEGGYLPLGFAAILMLIMGTWHYVHVHRYKYELKNKVSNNYVADLATRRNLARLPGIGVLYS

ELVQGIPPILPHLVEKVPSIHSVLVITSIKYLPISNIETNERFLFRYVEPREYRVFRCVVRYGYN

NKVEDPREFENLLIGNLKQFIHQESLYSESSHSLEGEDNAFEESGDAMEPSIEVQDARLPKR

FLDGITASPVNGLMDEIEFIQRGMDDGVVHLLGETNVVAEQNAGLVKKIIVDYAYNFMRKNF

RQPEKITCVPHNRLLRVGMTYEI

Claims (30)

1.分离的核酸，其中所述核酸选自：

-如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的多核苷酸；

-与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；和

-编码与如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。

2.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含如SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸。

3.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸。

4.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸有至少80％序列同一性的多核苷酸。

5.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸有至少90％序列同一性的多核苷酸。

6.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的多核苷酸。

7.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含编码与如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。

8.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含编码与如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽有至少80％序列同一性的多肽的多核苷酸。

9.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸包含编码与如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。

10.权利要求1的分离的核酸，其中所述核酸编码多肽，该多肽的功能是增加植物与野生型变种植物相比在正常或胁迫条件下的生长和/或胁迫耐受性。

11.载体，其包含权利要求1的核酸。

12.转基因植物细胞，其包含权利要求1的核酸。

13.转基因植物，其包含权利要求12的植物细胞。

14.权利要求13的转基因植物，其中所述植物与野生型变种植物相比在正常或胁迫条件下的生长增加和/或胁迫耐受性增加。

15.权利要求13的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。

16.权利要求13的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。

17.权利要求13的转基因植物，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子、多年生草本植物和饲料作物植物。

18.由权利要求13的植物产生的植物种子，其中所述种子包含所述核酸。

19.权利要求18的种子，其中所述种子与野生型变种种子相比在正常或胁迫条件下生长增加和/或胁迫耐受性增加。

20.产生含有分离的核酸的转基因植物的方法，其中所述植物与野生型变种植物相比在正常或胁迫条件下生长增加和/或胁迫耐受性增加和/或水分利用效率增加，所述方法包括用包含所述核酸的表达载体转化植物细胞，并从植物细胞产生转基因植物，其中所述核酸选自：

-如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸；

-编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的多核苷酸；

-与如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；和

-编码与如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。

21.权利要求20的方法，其中所述植物是单子叶植物。

22.权利要求20的方法，其中所述植物是双子叶植物。

23.权利要求20的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、油菜、木薯、胡椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油椰、椰子、多年生草本植物和饲料作物植物。

24.权利要求20的方法，其中所述核酸包含如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸。

25.权利要求20的方法，其中所述核酸包含与如SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸。

26.权利要求20的方法，其中所述核酸包含编码如SEQ ID NO：2、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽的多核苷酸。

27.权利要求20的方法，其中所述核酸包含编码与如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中定义的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。

28.权利要求20的方法，其中所述表达载体包含指导所述核酸表达的启动子。

29.权利要求28的方法，其中所述启动子是组织特异性的。

30.权利要求28的方法，其中所述启动子是受发育调节的。

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