CN101426805A

CN101426805A - 核酸保护基的脱去方法

Info

Publication number: CN101426805A
Application number: CNA2007800138626A
Authority: CN
Inventors: 柴佳伸
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2006-02-27
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2027-02-26
Also published as: JPWO2007099896A1; CA2643108A1; JP5187189B2; EP1995253A1; US8158775B2; KR101345465B1; WO2007099896A1; EP1995253A4; CN101426805B; KR20080106441A; EP1995253B1; US20090149645A1

Abstract

本发明的目的是提供可以良好的再现性有效地将在核糖的2’位羟基取代的2－氰基乙氧基甲氧基(CEM基)脱去的方法。通过在使TBAF作用于通式(10)表示的低聚核酸衍生物将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的工序中，作为反应溶剂使用亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂，制得通式(11)表示的低聚核酸衍生物。

Description

核酸保护基的脱去方法

技术领域

本发明涉及以良好的再现性有效地将保护低聚核酸衍生物的各核糖的2’位羟基的在中性条件下可脱去的醚型保护基，例如2-氰基乙氧基甲基(以下称为CEM基)脱去的方法。

背景技术

低聚核糖核酸(低聚RNA)作为基因解析的RNA探针、RNA药物原材料(反义RNA、核酶、利用了RNAi的基因表达控制)、人工酶、适体有用。

作为用于制造低聚RNA的1种试剂，已知的有核糖的2’位羟基被中性条件下可脱去的CEM基取代保护起来的亚磷酰胺化合物(非专利文献1)。

使用所述亚磷酰胺化合物制造低聚RNA时，在固相载体上制得所希望的链长的低聚RNA后，必须要从该低聚RNA除去固相载体和各取代基的保护基。作为除去该保护基的工序之一，有将保护低聚RNA的各核糖的2’位羟基的中性条件下可脱去的醚型保护基脱去的工序，在该工序中，一般使用氟化四丁基铵(以下称为TBAF)作为脱保护剂，使用四氢呋喃(以下称为THF)作为溶剂(非专利文献1)。

非专利文献1：大木等，ORGANIC LETTERS，Vol，7，3477(2005)

发明的揭示

本发明的目的主要是提供以良好的再现性有效地将保护低聚核酸衍生物的各核糖的2’位羟基的在中性条件下可脱去的醚型保护基脱去的方法。

本发明者为了实现上述目的而进行认真探讨的结果是，通过在使TBAF作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、将保护各核糖的2’位羟基的中性条件下可脱去的醚型保护基脱去的工序中，作为反应溶剂使用可含THF的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂，可有效地制得以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物，藉此完成了本发明。

式(10)及(11)中，各B分别独立，表示核酸碱基或其修饰体，n表示1～200的范围内的整数，n优选为10～100的范围内的整数，更好为15～50的范围内的整数，各Q分别独立，表示O或S，各R分别独立，表示H、羟基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1个表示羟基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基。

R¹表示以下的通式(3)表示的取代基。

式(3)中，R¹¹、R¹²、R¹³相同或不同，表示氢或烷氧基。

各R⁴分别独立，表示H、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基。

式(4)中，WG¹表示吸电子基团。

对以B表示的核酸碱基无特别限定，可例举例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。

B的修饰体由核酸碱基被任意的取代基取代而得，作为该取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它们在任意的位置取代1～3个基团。

作为B的修饰体中的卤素，可例举例如氟、氯、溴、碘。

作为B的修饰体中的酰基，可例举例如直链状或支链状的碳数1～6的烷酰基、碳数7～13的芳酰基。具体可例举例如甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、乙酰丙酰基等。

作为B的修饰体中的烷基，可例举例如直链状或支链状的碳数1～5的烷基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基等。该烷基可被取代，作为该取代基，可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有1～3个。

作为B的修饰体中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基及二烷基氨基的烷基部分，可例举与上述烷基相同的基团。

作为B的修饰体中的烷氧基，可例举例如直链状或支链状的碳数1～4的烷氧基。具体可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。其中较好的是碳数1～3的烷氧基，特好的是甲氧基。

B的修饰体中的烷氧基烷基的烷氧基部分可例举与上述烷氧基相同的基团。

作为B的修饰体中的芳烷基的芳基部分，可例举例如碳数6～12的芳基。具体可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基等。该芳基可被取代，作为该取代基，可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有1～3个。

作为B的修饰体中的烷基、芳基的取代基的卤素、烷基及烷氧基可分别例举与上述相同的基团。

作为R及R⁴中的卤素、烷氧基、烷基氨基或二烷基氨基，可例举与上述B的修饰体中的对应的基团相同的基团。

作为R及R⁴中的烷氧基烷氧基、烷硫基的烷基部分，可例举与上述B的修饰体中的烷基相同的基团。

作为R及R⁴中的烷氧基烷氧基的烷氧基，可例举与上述B的修饰体中的烷氧基相同的基团。

作为R及R⁴中的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分，可例举例如直链状或支链状的碳数2～6的链烯基。具体可例举例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基等。

作为R及R⁴中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分可例举例如直链状或支链状的碳数2～4的炔基。具体可例举例如乙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基等。

作为R¹¹、R¹²、R¹³中的烷氧基，可例举与上述B中的烷氧基相同的基团。

作为WG¹的吸电子基团，可例举例如氰基、硝基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、卤素。其中优选氰基。

作为WG¹的烷基磺酰基中的烷基部分，可例举与上述B中的烷基相同的基团。

作为WG¹中的芳基磺酰基的芳基部分，可例举与上述B中的芳基相同的基团。

作为亚砜类溶剂，可例举例如下述通式(I)表示的化合物。具体可例举二甲亚砜(以下称为DMSO)、乙基甲基亚砜等。其中优选DMSO。

作为酰胺类溶剂，可例举例如下述通式(II)表示的化合物。具体可例举N，N-二甲基甲酰胺(以下称为DMF)、N，N-二乙基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二乙基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。其中优选DMF。

式(I)及(II)中，R^a、R^b相同或不同，表示烷基，R^c、R^d相同或不同，表示烷基，R^e表示氢或烷基，或者R^d表示烷基，R^c、R^e表示与邻接的氮原子及碳原子一起形成的5或6元的饱和环状酰胺基。

此外，作为本发明，可例举以下的通式(A)表示的低聚RNA(以下称为低聚RNA(A))的制造方法。该方法包括制造以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步骤，该步骤的特征是，在使TBAF作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、将保护各核糖的2’位羟基的中性条件下可脱去的醚型保护基脱去的工序中，作为反应溶剂使用可含THF的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂。

式(10)及(11)中，各B、各Q、各R、各R⁴分别独立，其含义如前所述，n、R¹、Z如前所述。

式(A)中，各B、各Q、各R分别独立，其含义如前所述，n、Z如前所述。

以下，对本发明进行详细说明。

I.亚磷酰胺化合物

作为用于上述低聚RNA(A)的制造的核糖核酸衍生物，可例举以下的通式(B)表示的亚磷酰胺化合物(以下称为亚磷酰胺化合物(B))。

式(B)中，BZ表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，R¹、WG¹如前所述，WG²表示吸电子基团，R^2a、R^2b相同或不同，表示烷基或表示R^2a、R^2b与邻接的氮原子一起形成的5～6元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子。

作为B_Z中的核酸碱基，只要是被用于核酸的合成的碱基即可，无特别限定，可例举例如胞嘧啶、尿嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。

B_Z中的核酸碱基可被保护，其中具有氨基的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保护。作为该氨基的保护基，只要是作为核酸的保护基使用的基团即可，无特别限定，具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基等。

B_Z的修饰体由核酸碱基被任意的取代基取代而得，作为B_Z的修饰体的取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有1～3个。

作为B_Z的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基，可例举与上述B的修饰体中的对应的基团相同的基团。

作为R^2a、R^2b中的烷基，可例举与上述B的修饰体中的烷基相同的基团。

作为R^2a、R^2b中的5～6元饱和氨基环基，可例举例如吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、吗啉-1-基、硫代吗啉-1-基。

作为WG²的吸电子基团，可例举与上述WG¹的吸电子基团相同的基团。

亚磷酰胺化合物(B)是在2’位羟基具有中性条件下可脱去的醚型保护基的亚磷酰胺化合物。此外，由于被导入2’位羟基的基团是直链状的取代基，与3’位的羟基结合的磷原子的周围的空间不拥挤，因此与以往使用的亚磷酰胺化合物相比，在合成低聚RNA时具有缩合反应在非常短的时间内进行、缩合收率良好的特征。通过使用亚磷酰胺化合物(B)，用与低聚DNA的制造相同的方法可制得高纯度的低聚RNA(A)。

这里，低聚DNA是指仅由脱氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸。此外，本发明中的低聚RNA是指由核糖核酸(RNA)及脱氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸，是含有至少1个核糖核酸(RNA)的低聚核酸。

实施发明的最佳方式

以下所示的制法中，在原料具备对反应有影响的取代基(例如，羟基、氨基、羧基)时，预先按照公知的方法用合适的保护基对原料进行保护后再进行反应。最后通过催化还原、碱处理、酸处理等公知方法将保护基脱去。

II.亚磷酰胺化合物(B)的制造方法

亚磷酰胺化合物(B)可按照如下步骤制备。

亚磷酰胺化合物(B)可由公知化合物或易制备的中间体通过实施例如以下的步骤a～步骤h的操作而制得。

以下进行详细说明。

(1)步骤a：

通过使烷基化试剂作用于以下的通式(12)表示的核糖核酸衍生物，制备在2’位羟基导入中性条件下脱去的醚型保护基的下述通式(13)、(13’)表示的核糖核酸衍生物的步骤。

式(12)、(13)及(13’)中，B_Z、R¹、WG¹如前所述。

烷基化试剂可例举例如以下的通式(14)表示的醚化合物。

式(14)中，L表示卤素、芳硫基、烷基亚砜基或烷硫基，WG¹如前所述。

L所表示的卤素、芳硫基中的芳基、烷基亚砜基及烷硫基中的烷基可例举与上述B的修饰体中的卤素、芳基、烷基相同的基团。

作为醚化合物(14)的具体例，可例举以下的1～2的化合物。

1.氯甲基2-氰基乙基醚

2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚

醚化合物(14)是可在碱性条件下对2’位羟基导入中性条件下可脱去的醚型取代基的新的烷基化试剂，作为制备亚磷酰胺化合物(B)的试剂有用。

醚化合物(14)可通过实施以下的步骤1～步骤4来制备。

步骤1：

将以下的通式(15)表示的醇化合物烷硫基甲基化，制备以下的通式(16)表示的化合物的步骤。

式(15)及(16)中，WG¹如前所述，R³表示烷基或芳基。

化合物(16)是L为烷硫基的醚化合物(14)。

R³所表示的烷基可例举与上述B的修饰体中的烷基同样的基团。

R³为甲基时，作为烷硫基甲基化试剂，可例举例如二甲亚砜、乙酸酐及乙酸的混合溶液。二甲亚砜的用量相对于化合物(15)的摩尔量以10～200倍摩尔量为宜，优选20～100倍摩尔量。乙酸的用量相对于化合物(15)的摩尔量以10～150倍摩尔量为宜，优选20～100倍摩尔量。乙酸酐的用量相对于化合物(15)的摩尔量以10～150倍摩尔量为宜，优选20～100倍摩尔量。反应温度优选0℃～100℃。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以1～48小时为宜。

步骤2：

将化合物(16)卤化，制备以下的通式(17)表示的化合物的步骤。

式(16)及(17)中，WG¹、R³如前所述，X²表示卤素。

化合物(17)是醚化合物(14)中的L为卤素的化合物。

X²所表示的卤素可例举与上述B的修饰体中的卤素同样的卤素。

本步骤可按照公知的方法(例如，T.Benneche等，Synthesis 762(1983))实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等卤代烃类等。作为卤化剂，可例举例如硫酰氯、磷酰氯。卤化剂的用量相对于化合物(16)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。反应温度以0℃～100℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

步骤3：

将化合物(17)芳硫化，制备以下通式(18)表示的化合物的步骤。

式(17)及(18)中，WG¹、X²如前所述，R^3a表示芳基。

化合物(18)是醚化合物(14)中的L为芳硫基的化合物。

R^3a所表示的芳基可例举与上述B的修饰体中的芳基同样的基团。

本步骤可采用公知方法实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、乙腈。作为芳硫基化试剂，可例举例如苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化试剂的用量相对于化合物(17)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～5倍摩尔量。反应温度以0℃～100℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以1～48小时为宜。

步骤4：

将化合物(16)氧化，制备下述通式(19)表示的化合物的步骤。

式(16)及(19)中，WG¹、R³如前所述。

化合物(19)是醚化合物(14)中的L为烷基亚砜基的化合物。

R³所表示的烷基可例举与上述B的修饰体中的烷基相同的基团。

本步骤可采用公知方法实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、甲醇。作为氧化剂，可例举例如间氯过苯甲酸、偏高碘酸盐、过氧化氢。氧化剂的用量相对于化合物(16)的摩尔量以0.8～10倍摩尔量为宜，优选1～2倍摩尔量。反应温度以0℃～100℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以1～48小时为宜。

烷基化试剂采用化合物(17)时，可如下实施。

本步骤可按照公知方法，通过使烷基化试剂和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(12)而实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等卤代烃类。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。本步骤中，也可根据需要使金属试剂和碱作用于核糖核酸衍生物(12)，制得中间体后再使烷基化试剂与之作用。所述金属试剂可例举例如二氯化二丁基锡。金属试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。作为碱，可例举吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二异丙基乙胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。反应温度以0℃～120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

烷基化试剂采用化合物(16)或(18)时，可如下实施。

本步骤可按照公知方法(例如，M.Matteucci，Tetrahedron Letters，Vol.31，2385(1990))，通过使烷基化试剂、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(12)而实施。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.8～5倍摩尔量为宜，优选1～3倍摩尔量。作为酸，可例举例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.01～20倍摩尔量为宜，优选0.02～10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它们的任意的混合溶剂。作为本步骤中所用的针对于硫原子的卤化剂，可例举例如N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.8～10倍摩尔量为宜，优选1～5倍摩尔量。反应温度以—78℃～30℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟～5小时为宜。

烷基化试剂采用化合物(19)时，可如下实施。

本步骤可按照公知方法，通过使烷基化试剂、酸酐和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(12)而实施。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.8～5倍摩尔量为宜，优选1～3倍摩尔量。作为酸酐，可例举例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.01～20倍摩尔量为宜，优选0.02～10倍摩尔量。作为碱，可例举例如四甲基脲、三甲基吡啶。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(12)的摩尔量以0.01～20倍摩尔量为宜，优选0.02～10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它们的任意的混合溶剂。反应温度以—78℃～30℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟～24小时为宜。

(2)步骤b：

分离精制步骤a制得的核糖核酸衍生物(13)的步骤。

本步骤可通过例如薄层色谱法、硅胶色谱法等常规的分离精制方法从步骤a制得的混合物进行分离精制。

(3)步骤c：

与步骤b分别进行，通过使烷基化试剂作用于以下的通式(20)表示的核糖核酸衍生物，制得在2’位羟基导入了中性条件下脱去的醚型保护基的以下的通式(21)表示的核糖核酸衍生物的步骤。

式(20)及(21)中，B_Z、WG¹如前所述，A表示以下的通式(22a)或(22b)所示的硅取代基。

式(22a)及(22b)中，R⁶表示烷基。

R⁶所表示的烷基可例举与上述B的修饰体中的烷基相同的基团。

烷基化试剂可例举与前述相同的试剂。

烷基化试剂采用化合物(17)时，可如下实施。

本步骤可按照公知方法，通过使烷基化试剂和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等卤代烃类。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。本步骤中，也可根据需要使金属试剂和碱作用于核糖核酸衍生物(20)，制得中间体后再使烷基化试剂作用。所述金属试剂可例举例如二氯化二丁基锡、氯化叔丁基镁。金属试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。作为碱，可例举吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二异丙基乙胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱等。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。反应温度以0℃～120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

烷基化试剂采用化合物(16)或化合物(18)时，可如下实施。

本步骤可按照公知方法(例如，M.Matteucci，Tetrahedron Letters，Vol.31，2385(1990))，通过使烷基化试剂、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而实施。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.8～5倍摩尔量为宜，优选1～3倍摩尔量。作为酸，可例举例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.01～20倍摩尔量为宜，优选0.02～10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它们的任意的混合溶剂。作为本步骤中所用的针对于硫原子的卤化剂，可例举例如N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.8～10倍摩尔量为宜，优选1～5倍摩尔量。反应温度以—78℃～30℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟～5小时为宜。

烷基化试剂采用化合物(19)时，可如下实施。

本步骤可按照公知方法，通过使烷基化试剂、酸酐和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而实施。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.8～5倍摩尔量为宜，优选1～3倍摩尔量。作为酸酐，可例举例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.01～20倍摩尔量为宜，优选0.02～10倍摩尔量。作为碱，可例举例如四甲基脲、三甲基吡啶。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以0.01～20倍摩尔量为宜，优选0.02～10倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷或它们的任意的混合溶剂。反应温度以—78℃～30℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟～24小时为宜。

(4)步骤d：

与步骤a～步骤c分别进行，通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(20)而制得下述通式(23)表示的核糖核酸衍生物的步骤。

式(20)及(23)中，A、B_Z如前所述。

本步骤可按照公知方法，通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(20)而实施。

二甲亚砜的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以10～200倍摩尔量为宜，优选20～100倍摩尔量。酸酐的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以10～150倍摩尔量为宜，优选20～100倍摩尔量。乙酸酐的用量相对于核糖核酸衍生物(20)的摩尔量以10～150倍摩尔量为宜，优选20～100倍摩尔量。反应温度以10℃～50℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

(5)步骤e：

通过使下述通式(24)表示的醇化合物、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于步骤d制得的核糖核酸衍生物(23)，制备在2’位羟基导入了中性条件下脱去的醚型保护基的下述通式(21)表示的核糖核酸衍生物的步骤。

式(21)、(23)及(24)中，A、B_Z、WG¹如前所述。

本步骤可按照公知方法，通过使醇化合物(24)、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于核糖核酸衍生物(23)而实施。

所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它们的任意的混合溶剂。醇化合物(24)的用量相对于核糖核酸衍生物(23)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。作为酸，可例举例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作为针对于硫原子的卤化剂，可例举例如N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(23)的摩尔量以0.1～20倍摩尔量为宜，优选0.2～10倍摩尔量。反应温度以—100℃～20℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟～12小时为宜。

(6)步骤f：

通过实施脱去步骤c或步骤e制得的核糖核酸衍生物(21)的3’位和5’位羟基的保护基的反应，制得下述通式(25)表示的核糖核酸衍生物的步骤。

式(21)及(25)中，A、B_Z、WG¹如前所述。

本步骤可通过将核糖核酸衍生物(21)溶于有机溶剂，使单独的氟化剂或氟化剂和酸(例如，乙酸、盐酸、硫酸)的任意混合比的混合试剂与之反应而实施。作为可用于本步骤的氟化剂，可例举例如氟化铵、TBAF、三乙胺三氢氟酸盐、氟化氢吡啶。氟化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(21)的摩尔量以0.1～20倍摩尔量为宜，优选0.2～10倍摩尔量。反应温度以0℃～120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

混合试剂中的氟化剂和酸的混合比以1∶2～1∶0.1(氟化剂：酸)为宜，优选1∶1.2～1∶1。

(7)步骤g：

在步骤f制得的核糖核酸衍生物(25)的5’位羟基导入酸性条件下脱去的保护基(R¹)的核糖核酸衍生物(13)的制造步骤。

式(13)及(25)中，B_Z、R¹、WG¹如前所述，X³表示卤素。

X³所表示的卤素可例举与上述B的修饰体中的卤素相同的卤素。

本步骤可按照公知的方法，通过使R¹X³(30)作用于核糖核酸衍生物(25)而实施。R¹X³的用量相对于核糖核酸衍生物(25)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。所用溶剂只要对反应没有影响即可，无特别限定，可例举例如乙腈、THF。作为碱，可例举吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二异丙基乙胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(25)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。反应温度以0℃～120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

(8)步骤h：

通过使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤b或步骤f制得的核糖核酸衍生物(13)，制备3’位羟基被亚磷酰胺化的亚磷酰胺化合物(B)的步骤。

式(13)及(B)中，B_Z、R¹、R^2a、R^2b、WG¹、WG²如前所述。

作为亚磷酰胺化试剂，可例举例如下述通式(26a)、(26b)表示的化合物。

式(26a)及(26b)中，R^2a、R^2b、WG²如前所述，X¹表示卤素。

X¹所表示的卤素可例举与上述B的修饰体中的卤素相同的卤素。

本步骤是使亚磷酰胺化试剂作用于核糖核酸衍生物(13)而将3’位羟基亚磷酰胺化的反应，可按照公知的方法实施。根据需要还可采用活化剂。所用溶剂只要对反应没有影响即可，无特别限定，可例举例如乙腈、THF。

亚磷酰胺化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(13)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。作为活化剂，可例举例如1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巯基-1H-四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并***盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶鎓盐、N，N-二异丙基乙胺、2，4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(13)的摩尔量以0.8～20倍摩尔量为宜，优选1～10倍摩尔量。反应温度以0℃～120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟～24小时为宜。

以上所制备的亚磷酰胺化合物(B)本身可通过例如浓缩、液相转换、转溶、溶剂萃取、结晶化、重结晶、分馏、层析等公知的方法进行分离精制。

III.低聚RNA(A)的制造方法

低聚RNA(A)的制造方法如下所述。

低聚RNA(A)的制法可按照公知方法进行，但也可以例如通过实施以下所示的步骤A～步骤H的操作，分步骤地由3’至5’的方向缩合核酸单体化合物，藉此制备低聚RNA(A)。

被用于下述步骤的化合物及试剂中，除亚磷酰胺化合物(B)以外，只要是常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及试剂即可，无特别限定。此外，与使用了现有的核酸合成试剂的情况同样，所有的步骤可采用人工方法或市售的DNA自动合成机来进行。用自动合成机进行反应时操作方法简便，且合成的准确性高，因此优选采用自动合成机的方法。此外，下述步骤A～步骤H中记载的化合物及试剂中，除核酸单体化合物以外，只要是常用于低聚DNA或低聚RNA的合成的化合物及试剂即可，无特别限定。

此外，在低聚RNA(A)的制造方法中，作为核酸单体化合物至少1次使用亚磷酰胺化合物(B)，藉此可制得各R中的至少1个为羟基的低聚RNA(A)。另外，例如在后述的步骤B中，作为核酸单体化合物全部使用亚磷酰胺化合物(B)，藉此可制得各R都为羟基的低聚RNA(A)。

(1)步骤A：

使酸作用于以下的通式(1)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脱去5’位羟基的保护基，制备以下的通式(2)表示的(低聚)核酸衍生物的步骤。

式(1)及(2)中，n、R¹如前所述，各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述，各B_X分别独立，表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体。

E表示酰基或以下的通式(5)表示的取代基。

式(5)中，E¹表示单键或以下的通式(6)表示的取代基。

式(6)中，Q、WG²的含义如前所述。

T表示H、酰氧基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基、上述通式(4)表示的取代基或上述通式(5)表示的取代基，但E或T的任一方为取代基(5)。

B_X中的核酸碱基只要是被用于核酸的合成的碱基即可，无特别限定，例如可例举胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。

B_X中的核酸碱基可被保护，其中具有氨基的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保护。

作为该氨基的保护基，只要是作为核酸的保护基使用的基团即可，无特别限定，具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基等。

B_X中的修饰体由核酸碱基被任意的取代基取代而得，作为B_X中的修饰体的取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它们在任意的位置取代有1～3个。

作为B_X的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基氨基、二烷基氨基，可例举与上述B的修饰体中对应的基团相同的基团。

作为E的酰基，可例举与上述B的修饰体中的酰基相同的基团。

作为T的酰氧基中的酰基部分，可例举与上述B的修饰体中的酰基相同的基团。

作为T中的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例举与上述B的修饰体中的对应的基团相同的基团。

作为T中的烷氧基烷氧基及烷硫基的烷基部分，可例举与上述B的修饰体中的烷基相同的基团。

作为T中的烷氧基烷氧基的烷氧基部分，可例举与上述B的修饰体中的烷氧基相同的基团。

作为T中的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分，可例举与上述R中的链烯基相同的基团。

作为T中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例举与上述R中的炔基相同的基团。

T中的烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护，作为该保护基，只要是用作氨基的保护基的基团即可，无特别限定，可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。

该步骤通过使酸作用于被负载于固相载体的以下的通式(27a)、(27b)表示的核酸衍生物(n＝1的核酸衍生物(1))或通过进行步骤A～步骤D的操作而制得的被负载于固相载体的低聚RNA或低聚DNA(n＝2～100的低聚核酸衍生物(1))(以下称为被负载于固相载体的低聚核酸衍生物)而实施。

式(27a)及(27b)中，B_X、R¹的含义如前所述。R^2L、R^4L表示取代基(5)。R²表示酰氧基。R^4a表示H、酰氧基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或取代基(4)。

作为R²、R^4a的酰氧基的酰基部分，可例举与上述B的修饰体中的酰基相同的基团。

作为R^4a的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例举与上述B的修饰体中的各对应基团相同的基团。

作为R^4a的烷氧基烷氧基及烷硫基的烷基部分，可例举与上述B的修饰体中的烷基相同的基团。

作为R^4a的烷氧基烷氧基的烷氧基部分，可例举与上述B的修饰体中的烷氧基相同的基团。

作为R^4a的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分，可例举与上述R的链烯基相同的基团。

作为R^4a的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例举与上述R的炔基相同的基团。

R^4a的烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护，该保护基只要是作为氨基的保护基使用的基团即可，无特别限定，可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。

作为固相载体，可例举例如可控的多孔玻璃(controlled pore glass；CPG)、草酰化-可控的多孔玻璃(例如参照Alul等，Nucleic Acids Research，Vol.19，1527(1991))、TentaGel支承体-氨基聚乙二醇衍生物化支承体(例如参照Wright等，Tetrahedron Letters，Vol.34，3373(1993))、空孔-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。

作为连接基，可例举例如3-氨基丙基、琥珀酰基、2，2’-二乙醇磺酰基、长链烷基氨基(LCAA)。

核酸衍生物(27a)、核酸衍生物(27b)是按照公知方法制得的或可作为市售品获得的被负载于固相载体的核酸衍生物，作为其优选例子，可例举以下的通式(28)、(29)表示的核酸衍生物。

式(28)及(29)中，B_X、Q、R¹、R⁴、WG²如前所述。

R⁴为取代基(4)的核酸衍生物(28)、(29)可按照公知方法由亚磷酰胺化合物(B)制得。

作为可用于本步骤的酸，可例举例如三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。可用于本步骤的酸也可用适当的溶剂将其浓度稀释至1～5％后再使用。作为溶剂，只要不会对反应有影响即可，无特别限定，可例举二氯甲烷、乙腈、水或它们的任意的混合溶剂。上述反应的反应温度优选20℃～50℃。反应时间因低聚核酸衍生物(1)的种类、所用酸的种类和反应温度等而异，通常以1分钟～1小时为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的(低聚)核酸衍生物以0.8～100倍摩尔量为宜，更好为1～10倍摩尔量。

(2)步骤B：

采用活化剂使核酸单体化合物与步骤A制得的(低聚)核酸衍生物(2)缩合，制备以下的通式(7)表示的低聚核酸衍生物的步骤。

式(2)及(7)中，各Bx、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述。E、n、R¹、T的含义如前所述。

本步骤可通过使核酸单体化合物和活化剂作用于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物而实施。

作为核酸单体化合物，可例举亚磷酰胺化合物(B)或以下的通式(30)表示的核酸衍生物。

式(30)中，R¹、R^2a、R^2b、R^4a、WG²的含义如前所述，B_Y表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体。

作为B_Y中的核酸碱基，只要是被用于核酸的合成的碱基即可，无特别限定，可例举例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。

B_Y中的核酸碱基可被保护，其中具有氨基的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保护。

作为该氨基的保护基，只要是可作为核酸的保护基使用的基团即可，无特别限定，具体可例举苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。

B_Y的修饰体由核酸碱基被任意的取代基取代而得，作为B_Y的修饰体的取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有1～3个。

作为B_Y的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基，可例举与上述各B的修饰体中的对应的基团相同的基团。

作为活化剂，可例举与上述活化剂相同的试剂。

作为反应溶剂，只要不会对反应有影响即可，无特别限定，例如可例举乙腈、THF。上述反应的反应温度以20℃～50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(2)的种类、所用活化剂的种类和反应温度等而异，通常以1分钟～1小时为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩尔量为宜，更好为1～10倍摩尔量。

(3)步骤C：

在步骤B中未反应的(低聚)核酸衍生物(2)的5’位羟基的加帽(capping)步骤。

式(2)及(8)中，各B_X、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述，E、n、T的含义如前所述，R⁵表示甲基、苯氧基甲基、叔丁基苯氧基甲基。

本步骤是对步骤B中未反应的5’位羟基进行保护的反应，可通过使加帽化试剂作用于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物而实施。

加帽化试剂可例举例如乙酸酐、苯氧基乙酸酐或叔丁基苯氧基乙酸酐。加帽化试剂也可使用经合适的溶剂将浓度稀释为0.05～1M的试剂。作为溶剂，只要不会对反应有影响即可，无特别限定，可例举例如吡啶、二氯甲烷、乙腈、THF或它们的任意的混合溶剂。此外，该步骤中可根据需要使用反应促进剂，例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑。上述反应的反应温度以20℃～50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(2)的种类、所用加帽化试剂的种类、反应温度等而异，通常以1分钟～30分钟为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩尔量为宜，较好为1～10倍摩尔量。

(4)步骤D：

通过使氧化剂作用于步骤B中制备的低聚核酸衍生物(7)而将亚磷酸基转变为磷酸基或硫代磷酸基的步骤。

式(7)及(9)中，各B_X、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述。E、n、R¹、T的含义如前所述。

本步骤是利用氧化剂将3价磷转换为5价磷的反应，通过使氧化剂作用于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物而实施。

用氧来氧化磷时，作为氧化剂，例如可使用碘、过氧化氢叔丁基。该氧化剂也可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.05～2M后再使用。作为用于反应的溶剂，只要不会对反应有影响即可，可例举吡啶、THF、水或它们的任意的混合溶剂。例如可采用碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸和过氧化剂(过氧化氢叔丁基/二氯甲烷等)。

用硫来氧化磷时，作为氧化剂，例如可使用硫、Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二噻唑-3-酮-1，1-二氧化物)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)。该氧化剂可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.05～2M后再使用。作为用于反应的溶剂，只要不会对反应有影响即可，可例举二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意的混合溶剂。

反应温度以20℃～50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(7)的种类、所用氧化剂的种类、反应温度等而异，通常为1分钟～30分钟。所用试剂的量相对于被承载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩尔量为宜，更好为10～50倍摩尔量。

(5)步骤E：

将步骤D制备的低聚核酸衍生物(9)从固相载体切割(cleave)，脱去各核酸碱基部及各磷酸基的保护基的步骤。

式(9)及(10)中，各B、各B_X、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述。E、n、R、R¹、T、Z的含义如前所述。

切割步骤是利用切割剂将所需链长的低聚RNA从固相载体及连接基切割的反应，可通过向负载有所需链长的低聚核酸衍生物的固相载体添加切割剂而实施。本步骤中可脱去核酸碱基部的保护基。

作为切割剂，可例举例如浓氨水、甲胺。本步骤中可使用的切割剂也可用例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、THF或它们的任意的混合溶剂稀释后再使用。其中，优选使用乙醇。

反应温度以15℃～75℃为宜，优选15℃～30℃，更好为18℃～25℃。脱保护反应时间因低聚核酸衍生物(9)的种类、反应温度等而异，以10分钟～30小时为宜，优选30分钟～24小时，更好为1～4小时。被用于脱保护的溶液中的氢氧化铵的浓度以20～30重量％为宜，优选25～30重量％，更好为28～30重量％。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以1～100倍摩尔量为宜，更好为10～50倍摩尔量。

(6)步骤F：

使TBAF作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物，将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的工序中，通过用可含THF的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂作为反应溶剂，制备以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步骤。

式(10)及(11)中，各B、各Q、各R、各R⁴分别独立，其含义如前所述。n、R¹、Z的含义如前所述。

本步骤可通过使TBAF作用于低聚核酸衍生物(10)而实施。所用的TBAF的量相对于被除去的保护基以1～500倍摩尔量为宜，较好为5～10倍摩尔量。作为反应溶剂，可使用可含THF的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂。此外，亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂作为与THF的混合溶剂使用时，THF的相对于亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂的用量以0～95％为宜，较好为0～50％。可含THF的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂(反应溶剂)的用量因低聚核酸衍生物(10)的种类或所用的反应溶剂等而异，相对于TBAF以0.8～100倍摩尔量为宜，较好为1～10倍摩尔量。反应温度因低聚核酸衍生物(10)的种类或所用的反应溶剂等而异，以20℃～80℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(10)的种类、所用反应溶剂或反应温度等而异，通常以1小时～100小时为宜。

此外，根据需要，还可添加捕集本步骤中作为副产物生成的丙烯腈的试剂，作为丙烯腈的捕集剂，例如可添加硝基烷、烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它们的任意的混合物。作为硝基烷，可例举直链状的碳数1～6的硝基烷。具体可例举硝基甲烷等。作为烷基胺，可例举直链状的碳数1～6的烷基胺。具体可例举例如甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作为脒，可例举例如苯甲脒、甲脒。作为硫醇，可例举例如直链状的碳数1～6的硫醇。具体可例举例如甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、1-己硫醇。作为硫醇衍生物，可例举例如具有相同或不同的直链状的碳数1～6的烷基硫羟基的醇或醚。具体可例举例如2-巯基乙醇、4-巯基-1-丁醇、6-巯基-1-己醇、巯基甲醚、2-巯基***、3-巯基丙醚、4-巯基丁醚、5-巯基戊醚、6-巯基己醚。

丙烯腈的捕集剂的用量因低聚核酸衍生物(10)的种类等而异，相对于保护低聚核酸衍生物(10)的各核糖的2’位羟基的2-氰基乙氧基甲基以0.1～500倍摩尔量为宜，较好为1～10倍摩尔量。

(7)步骤G：

将低聚核酸衍生物(11)的5’位羟基的保护基脱去的步骤。

式(11)及(A)中，各B、各Q、各R分别独立，其含义如前所述。n、R¹、Z的含义如前所述。

本步骤是最终脱去低聚RNA的5’位羟基的保护基的反应，可通过使酸作用于从固相载体切割得到的低聚RNA而实施。

作为可用于本步骤的酸，可例举例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸。本步骤中可使用的酸也可用适当的溶剂稀释后再使用。作为溶剂，只要是不会对反应有影响的溶剂即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、乙腈、水、pH为2～5的缓冲液或它们的任意的混合溶剂。作为缓冲液，可例举例如乙酸缓冲液。上述反应的反应温度以20℃～50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(11)的种类、所用酸的种类、反应温度等而异，通常以1分钟～1小时为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8～100倍摩尔量为宜，更好为1～10倍摩尔量。

(8)步骤H：

分离精制步骤G制备的低聚RNA(A)的步骤。

分离精制步骤是指通过单独或组合使用例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、C₈-C₁₈的反相柱色谱法、C₈-C₁₈的反相卡套柱(cartridgecolumn)色谱法、阳离子交换柱色谱法、阴离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、高效液相色谱法、透析、超滤等通常的分离精制方法，从上述反应混合物分离精制所需低聚RNA的步骤。

作为洗脱溶剂，可例举例如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、水的单独溶剂或任意比例的混合溶剂。这种情况下，也可以1mM～2M的浓度添加作为添加剂的例如磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸铵、乙酸三乙基铵、乙酸钠、乙酸钾、Tris-HCl、乙二胺四乙酸，将溶液的pH调整至1～9的范围。

通过重复实施步骤A～步骤D的操作，能够制得所需链长的低聚RNA(A)。本制法中，作为用于制造低聚RNA(A)的起始原料，可使用R^4a为取代基(4)的化合物(27a)、R^4a为H或酰氧基的核酸衍生物(27a)或R²为酰基的核酸衍生物(27b)等。作为起始原料，使用了R^4a为H或酰氧基的核酸衍生物(27a)或R²为酰氧基的核酸衍生物(27b)时，作为核酸单体化合物的至少1种必须使用本发明的亚磷酰胺化合物。

实施例

以下，例举参考例、实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限定于此。

参考例1 氯甲基2-氰基乙基醚

步骤1 甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制备

将32g(450mmol)3-羟基丙腈溶于450ml二甲亚砜，加入324mL乙酸酐和231mL乙酸，室温下搅拌24小时。将990g碳酸氢钠溶于4.5L水调制成溶液，用1小时的时间将反应液滴入该溶液中，随即搅拌1小时，用乙酸乙酯萃取反应液，用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得油状物进行精制，获得41g呈无色油状物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：2.18(s，3H)；2.66(t，2H，J＝6.3Hz)；3.77(t，2H，J＝6.3Hz)；4.69(s，2H)

步骤2 氯甲基2-氰基乙基醚的制备

使3.3g(25mmol)步骤1获得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲烷，冰冷下滴加2mL(25mmol)硫酰氯，再于室温反应1小时。反应后蒸除溶剂，在真空中进行蒸馏，获得2.5g呈无色油状物的目标化合物(收率85％)。

沸点：84～85℃(0.3托)

¹H-NMR(CDCl₃)：2.72(t，2H，J＝6.3Hz)；3.92(t，2H，J＝6.3Hz)；5.52(s，2H)

参考例2 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基) 尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)

步骤1 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备

将546mg(1mmol)5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷后加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺，再加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，然后于室温反应1小时。升温至80℃后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌30分钟。反应结束后在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg，收率34％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：2.47(d，1H，J＝7.8Hz)；2.69(t，2H，J＝6.3Hz)；3.55(dd，1H，11.3，2.2Hz)；3.62(dd，1H，11.3，2.2Hz)；3.83(s，6H)；3.87(t，2H，J＝6.3Hz)；4.07-4.08(m，1H)；4.32(dd，1H，J＝5.3，1.9Hz)；4.54(q，1H，J＝5.3Hz)；4.94，5.11(2d，2H，J＝6.9Hz)；5.32(d，1H，J＝8.2Hz)；6.00(d，1H，J＝1.9Hz)；6.85-6.88(m，4H)；7.29-7.41(m，9H)；8.02(d，1H，J＝8.2Hz)；8.53(br.s，1H)

ESI-质谱：652[M+Na]⁺

步骤2 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)的制备

将209mg(0.332mmol)步骤1获得的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmol)四唑溶于2mL乙腈，再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N，N，N’，N’-四异丙基亚磷酰胺，于45℃反应1.5小时。反应后加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(200mg，收率73％)。

ESI-质谱：852[M+Na]⁺

参考例3 2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷

步骤1 3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备

氩气氛下，将150mg(0.3mmol)3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)尿苷溶于7mL的THF，加入54mg(0.4mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子筛4A，搅拌10分钟。将温度调整为0℃，加入10mg(0.06mmol)三氟甲磺酸的2mlTHF溶液，搅拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亚胺，搅拌1小时。用硅藻土过滤反应液，用二氯甲烷洗涤后，有机相用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤，再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂。用薄层色谱法对所得残渣进行精制，获得3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg，收率85％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：0.97-1.12(m，28H)；2.68-2.73(m，2H)；3.78-3.86(m，1H)；3.96-4.05(m，2H)；4.12-4.30(m，4H)；5.0-5.04(m，2H)；5.70(d，1H，J＝8.2Hz)；5.75(s，1H)；7.90(d，1H，J＝8.2Hz)；9.62(br.s，1H)

ESI-质谱：570[M+H]⁺

步骤2 2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备

将200mg(0.35mmol)步骤1获得的3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇，再加入65mg(1.76mmol)氟化铵，于50℃加热搅拌5小时。放冷后加入乙腈搅拌，过滤浓缩。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(108mg，收率94％)。

¹H-NMR(CD₃OD)：2.72-2.76(t，2H，J＝6.2Hz)；3.68-3.92(m，4H)；4.00-4.03(m，1H)；4.26-4.32(m，2H)；4.81-4.95(m，2H)；5.71(d，1H，J＝8.1Hz)；6.00(d，1H，J＝3.3Hz)；8.10(d，1H，J＝8.1Hz)

ESI-质谱：350[M+Na]⁺

参考例4 5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基) 尿苷的制备

将14g(43mmol)2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分钟。然后，溶于300mL的THF，在氩气氛下加入68g(856mmol)吡啶和20g分子筛4A，搅拌10分钟。将19.6g(57.8mmol)4，4’^-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中，再搅拌1小时。接着，加入10mL甲醇搅拌2分钟，再用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯，再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(26.5g，收率98％)。

参考例5 N ⁴ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)

步骤1 N ⁴ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备

将588mg(1mmol)N⁴-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应1小时。然后，将温度升至80℃，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌60分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得N⁴-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg，收率35％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：2.19(s，3H)；2.56(d，1H，J＝8.8Hz)；2.65(t，2H，J＝6.2Hz)；3.55(dd，1H，10.5，2.5Hz)；3.63(dd，1H，10.5，2.5Hz)；3.82(s，6H)；3.86(t，2H，J＝6.2Hz)；4.09-4.14(m，1H)；4.28(d，1H，J＝5.1Hz)；4.44-4.49(m，1H)；4.97，5.24(2d，2H，J＝6.9Hz)；5.96(s，1H)；6.86-6.88(m，4H)；7.09(d，1H，J＝6.9Hz)；7.26-7.42(m，9H)；8.48(d，1H，J＝6.9Hz)；8.59(br.s，1H)

ESI-质谱：693[M+Na]⁺

步骤2 N ⁴ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)的制备

将205mg(0.306mmol)步骤1获得的N⁴-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲烷，加入105mg(0.812mmol)二异丙基乙胺，再滴加116mg(0.49mmol)2-氰基乙基N，N-异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应1小时。反应后蒸除溶剂，利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(242mg，收率91％)。

ESI-质谱：871[M+H]⁺

参考例6 N ⁴ -乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷

步骤1 N ⁴ -乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2- 氰基乙氧基甲基)胞苷的制备

混合1.00g(1.89mmol)N⁴-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)胞苷和500mg(3.79mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚，将混合物溶于10mL甲苯和10mL THF的混合溶剂。然后，加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸银，再加入分子筛4A，干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亚胺，将反应容器遮光，搅拌10分钟。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亚胺，搅拌25分钟。反应结束后加入二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得N⁴-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg，收率81％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：0.90-1.11(m，28H)；2.28(s，3H)；2.62-2.79(m，2H)；3.78-3.89(m，1H)；3.96-4.04(m，2H)；4.19-4.23(m，3H)；4.30(d，1H，J＝13.6Hz)；5.00(d，1H，J＝6.8Hz)；5.09(d，1H，J＝6.8Hz)；5.77(s，1H)；7.44(d，1H，J＝7.5Hz)；8.30(d，1H，J＝7.5Hz)；10.13(s，1H)

ESI-质谱：611[M+H]⁺

步骤2 N ⁴ -乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备

将500mg(0.819mmol)步骤1获得的N⁴-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mL THF和2.5mL甲醇的混合溶剂，加入150mg(4.10mmol)氟化铵，于50℃反应4小时。反应结束后，用乙腈稀释，过滤，蒸除溶剂，再用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得目标化合物(210mg，收率70％)。

¹H-NMR(D₂O)：2.13(s，3H)；2.66-2.71(m，2H)；3.72-3.78(m，3H)；3.90(dd，1H，J＝13.0，2.6Hz)；4.06-4.11(m，1H)；4.20(dd，1H，J＝7.1，5.2Hz)；4.29(dd，1H，J＝5.1，2.9Hz)；4.83(d，1H，J＝7.2Hz)；4.94(d，1H，J＝7.2Hz)；5.95(d，1H，J＝2.9Hz)；7.25(d，1H，J＝7.6Hz)；8.25(d，1H，J＝7.6Hz)

ESI-质谱：391[M+Na]⁺

参考例7 N ⁴ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备

将9.9g(26.8mmol)2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分钟。然后，溶于190mLTHF，在氩气氛下加入43g(538mmol)吡啶和20g分子筛4A，搅拌10分钟。将11.8g(34.9mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中，再搅拌1小时。接着，加入2mL甲醇搅拌2分钟，再用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。用蒸发器浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯，再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(15g，收率83％)。

参考例8 N ² -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)

步骤1 N ² -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备

将627mg(1mmol)N²-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应1小时。然后，将温度升至80℃，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌60分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得N²-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(450mg，收率63％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：1.92(s，3H)；2.47-2.51(m，2H)；2.68(br.s，1H)；3.30(dd，1H，10.7，3.8Hz)；3.47(dd，1H，10.7，3.8Hz)；3.55-3.60(m，.1H)；3.65-3.70(m，1H)；3.74，3.75(2s，6H)；4.22-4.23(m，1H)；4.55-4.58(m，1H)；4.78，4.83(2d，2H，J＝7.0Hz)；5.01(t，1H，J＝5.1Hz)；5.99(d，1H，J＝5.1Hz)；6.76-6.79(m，4H)；7.17-7.44(m，9H)；7.88(s，1H)；8.36(br.s，1H)；12.06(br.s，1H)

步骤2 N ² -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)的制备

将400mg(0.563mmol)步骤1获得的N²-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2mL二氯甲烷，加入181mg(1.4mmol)二异丙基乙胺，再滴加161mg(0.68mmol)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应1小时。反应后蒸除溶剂，利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(471mg，收率92％)。

参考例9 N ⁶ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)

步骤1 N ⁶ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备

将22.0g(36.0mmol)N⁶-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1，2-二氯乙烷，加入16.3g(126mmol)二异丙基乙胺后加入12.1g(39.7mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应1小时。然后，将温度升至80℃搅拌15分钟，再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌30分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得N⁶-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g，收率33％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：2.51(t，2H，J＝6.2Hz)；2.58(d，1H，J＝5.5Hz)；2.61(s，3H)；3.45(dd，1H，J＝10.7，4.0Hz)；3.54(dd，1H，J＝10.7，3.2Hz)；3.62-3.79(m，2H)；3.79(s，6H)；4.25(br.q，1H，J＝4.6Hz)；4.59(q，1H，J＝5.2Hz)；4.87-4.94(m，3H)；6.23(d，1H，J＝4.4Hz)；6.80-6.83(m，4H)；7.22-7.32(m，7H)；7.40-7.43(m，2H)；8.20(s，1H)；8.61(br.s，1H)；8.62(s，1H)

ESI-质谱：695[M+H]⁺

步骤2 N ⁶ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)的制备

将10.0g(14.4mmol)步骤1获得的N⁶-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲烷，加入4.7g(36mmol)二异丙基乙胺，再滴加4.82g(20.3mmol)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应1小时。反应后剩余30mL左右的溶剂，进行蒸除，再用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得目标化合物(12.0g，收率93％)。

ESI-质谱：895[M+H]⁺

参考例10 N ⁶ -乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷

步骤1 N ⁶ -乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2- 氰基乙氧基甲基)腺苷的制备

使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亚胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸银悬浮于8mL二氯甲烷，加入分子筛4A，干燥。冰冷下，在其中加入将400mg(0.73mmol)N⁶-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷和145mg(1.11mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲烷而形成的溶液，随即搅拌3小时。反应结束后加入二氯甲烷稀释，再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，所得混合物用硅胶柱色谱法精制，获得N⁶-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg，收率45％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：0.98-1.11(m，28H)；2.62(s，3H)；2.69(td，2H，6.5，J＝1.5Hz)；3.81-3.89(m，1H)；4.02-4.09(m，2H)；4.17(d，1H，J＝9.4Hz)；4.28(d，1H，J＝13.4Hz)；4.50(d，1H，J＝4.5Hz)；4.67(dd，1H，J＝8.8，4.5Hz)；5.02(d，1H，J＝7.0Hz)；5.08(d，1H，J＝7.0Hz)；6.10(s，1H)；8.34(s，1H)；8.66(s，1H)；8.67(s，1H)

ESI-质谱：636[M+H]⁺

步骤2 N ⁶ -乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备

将300mg(0.47mmol)步骤1获得的N⁶-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.1mL乙酸和2mL的0.5M TBAF的THF溶液的混合溶液，室温下搅拌2小时。反应结束后用硅胶柱色谱法对所得反应混合物进行精制，获得目标化合物(160mg，收率86％)。

¹H-NMR(DMSO-d₆)：2.25(s，3H)；2.53-2.68(m，2H)；3.41-3.46(m，1H)；3.56-3.64(m，2H)；3.69-3.73(m，1H)；4.00-4.01(m，1H)；4.36-4.37(m，1H)；4.72-4.78(m，3H)；5.20(bt，2H)；5.41(d，1H，J＝5.2Hz)；6.17(d，1H，J＝5.7Hz)；8.66(s，1H)；8.72(s，1H)；10.72(s，1H)

ESI-质谱：415[M+Na]⁺

参考例11 N ⁶ -乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备

将9.50g(24.2mmol)N⁶-乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脱水吡啶，浓缩干燥后，氩气氛下溶于100mL脱水吡啶。冰冷下，加入10.7g(31.2mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯，室温下反应1小时20分钟。反应结束后，用二氯甲烷稀释，再用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得目标化合物(13.8g，收率82％)。

参考例12 N ² -苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’- 0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)

步骤1 N ² -苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备

将720mg(1mmol)N²-苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)鸟苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应1小时。然后，将温度升至80℃，再滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌60分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得N²-苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(384mg，收率48％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：2.47-2.51(m，2H)；2.58(br.s，1H)；3.42(dd，1H，10.1，3.8Hz)；3.46(dd，1H，10.1，3.8Hz)；3.53-3.57(m，1H)；3.69-3.73(m，1H)；3.77(s，6H)；4.24-4.26(m，1H)；4.48-4.50(m，1H)；4.61-4.65(m，2H)；4.83，4.87(2d，2H，J＝7.0Hz)；4.88(t，1H，J＝5.7Hz)；6.05(d，1H，J＝5.7Hz)；6.80-6.82(m，4H)；6.92-6.96(m，3H)；7.07-7.11(m，2H)；7.20-7.42(m，9H)；7.84(s，1H)；8.99(s，1H)；11.81(br.s，1H)

ESI-质谱：825[M+Na]⁺

步骤2 N ² -苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)的制备

将320mg(0.399mmol)步骤1获得的N²-苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于4mL二氯甲烷，加入128.8mg(0.996mmol)二异丙基乙胺，再滴加141.5mg(0.598mmol)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应1小时。反应后蒸除溶剂，再利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(316mg，收率79％)。

ESI-质谱：1003[M+H]⁺

参考例13 N ² -苯氧基乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷

步骤1 N ² -苯氧基乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’- 0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备

将2.0g(3.0mmol)N²-苯氧基乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)鸟苷溶于16mLTHF，加入0.99g(7.6mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子筛4A，氩气氛下于—45℃搅拌10分钟。然后，加入0.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mLTHF溶液，搅拌后加入1.02g(4.5mmol)N-碘琥珀酰亚胺，搅拌15分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，过滤后用乙酸乙酯萃取，有机相用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤，再依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，接着用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂。所得残渣用硅胶柱色谱法精制，获得N²-苯氧基乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(2.0g，收率89％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：0.99-1.11(m，28H)；2.59-2.77(m，2H)；3.82-4.05(m，3H)；4.15(d，1H，J＝9.3Hz)；4.25-4.35(m，2H)；4.52-4.56(dd，1H，J＝9.3，4.3Hz)；5.00，5.07(2d，2H，J＝7.2Hz)；5.95(s，1H)；6.99-7.12(m，3H)；7.35-7.40(m，2H)；8.09(s，1H)；9.38(br.s，1H)；11.85(br.s，1H)

ESI-质谱：766[M+Na]⁺

步骤2 N ² -苯氧基乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备

在2.83mL(2.83mmol)的1M TBAF的THF溶液中加入0.14mL(0.14mmol)乙酸，调制出溶液。将1.0g(1.35mmol)步骤1获得的N²-苯氧基乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2.83mL THF，在其中加入先前调制的溶液，氩气氛下于室温搅拌1小时。减压下浓缩反应液后将其溶于二氯甲烷，用硅胶柱色谱法精制，获得目标化合物(0.67g，收率99％)。

¹H-NMR(DMSO-d₆)：2.59-2.66(m，2H)；3.41-3.63(m，4H)；3.98(m，1H)；4.32(m，1H)；4.58-4.62(t，1H，J＝5.3Hz)；4.71-4.78(dd，2H，J＝13.1，6.8Hz)；4.87(s，2H)；5.12(s，1H)；5.37(s，1H)；5.97(d，1H，J＝6.1Hz)；6.96-6.99(m，3H)；7.28-7.34(m，2H)；8.30(s，1H)；11.78(br.s，2H)

ESI-质谱：500[M-H]^-

参考例14 N ² -苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0- (2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备

将660mg(1.32mmol)N²-苯氧基乙酰基-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分钟。然后，溶于9mL THF，在氩气氛下加入2.1g(26.4mmol)吡啶和600mg分子筛4A，搅拌10分钟。将540mg(1.58mmol)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中，再搅拌1小时。接着，加入2mL甲醇搅拌2分钟，再用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。用蒸发器浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯，再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(800mg，收率75％)。

参考例15 N ⁶ -乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’- 0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷

步骤1 N ⁶ -乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-甲硫基甲基腺苷的制备

将2.00g(3.62mmol)N⁶-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)腺苷溶于25mL二甲亚砜，加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸，室温下搅拌14小时。反应结束后在200mL水中加入反应液，用乙酸乙酯萃取，用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得N⁶-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-甲硫基甲基腺苷(1.36g，收率61％)。

¹H-NMR(CDCl₃)：0.96-1.11(m，28H)；2.20(s，3H)；2.61(s，3H)；4.03(dd，1H，J＝13.4，2.4Hz)；4.18(d，1H，J＝9.1Hz)；4.27(d，1H，J＝13.4Hz)；4.63-4.71(m，2H)；5.00(d，1H，J＝11.5Hz)；5.07(d，1H，J＝11.5Hz)；6.09(s，1H)；8.31(s，1H)；8.65(s，1H)；8.69(s，1H)

ESI-质谱：635[M+Na]⁺

步骤2 N ⁶ -乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-(2- 氰基乙氧基甲基)腺苷的制备

将1.00g(1.63mmol)步骤1获得的N⁶-乙酰基-3’，5’-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2’-0-甲硫基甲基腺苷溶于25mL THF。加入5.88g(82.7mmol)3-羟基丙腈，再加入分子筛4A，干燥，冷却至—45℃。接着，加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亚胺，再加入490mg(3.26mmol)三氟甲磺酸，于—45℃搅拌15分钟。反应结束后，在冷却的状态下加入三乙胺进行中和，用二氯甲烷稀释，再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，所得混合物用硅胶柱色谱法精制，获得目标化合物(722mg，收率71％)。

参考例16 尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰 -[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰 -[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰 -[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰 -[3’→5’]-尿苷

将负载有市售的2’/3’-0-苯甲酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相载体(37mg，1μmol)装入带玻璃滤器的柱子中，使用核酸自动合成机(Expedite^TM：美国应用生物***公司(Applied Biosystems))进行作为标题化合物的低聚RNA的合成。

作为核酸单体化合物使用5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)，作为缩合催化剂使用四唑，作为氧化剂使用碘溶液，作为加帽剂溶液使用乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸单体化合物缩合20次后，作为切割剂使用10M甲胺的乙醇水溶液，室温下用1～2小时实施从CPG固相载体的切割及各磷酸部位的保护基的脱去反应。减压下浓缩反应混合物后，用反相柱(ODS)除去不需要的峰，再用洗脱溶剂(乙腈-50mM三乙胺-乙酸缓冲液)精制。减压下浓缩残渣后，用1M TBAF的THF溶液在室温下反应1小时，脱去2’位羟基的保护基。对溶液进行脱盐处理后，用80％乙酸除去5’末端的保护基(室温下10分钟)。减压下浓缩后水层用***洗涤，无需精制，获得高纯度的目标化合物。

MALDI-TOF-MS：计算值6367.52[M+H]⁺

实测值6366.50[M+H]⁺

参考例17具有硫代磷酸酯键(phosphorothioate bonds)的低聚RNA的制备

胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→ 5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→ 5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→ 5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→ 5’]-胞苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胸苷酰-[3’→ 5’]-胸苷

将负载有市售的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相载体(22mg，1μmol)装入带玻璃滤器的柱子中，使用核酸自动合成机(Expedite^TM：美国应用生物***公司)进行作为标题化合物的低聚RNA的合成。

作为核酸单体化合物使用5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、N⁴-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、N⁶-乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、N²-苯氧基乙酰基-5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胞苷3’-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)，作为缩合剂使用苯甲基巯基四唑，作为氧化剂使用Beaucage试剂(3H-1，2-苯并二噻唑-3-酮-1，1-二氧化物)，作为加帽剂溶液使用苯氧基乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸单体化合物缩合20次后，作为切割剂使用浓氨水-乙醇混合液(3∶1)，于40℃用4小时实施从CPG固相载体的切割和各磷酸部位的保护基的脱去反应及碱基的保护基的除去。减压下浓缩反应混合物后，用含2.5μL硝基甲烷的0.5M TBAF的DMSO溶液500μL于室温反应2小时，除去2’位羟基的保护基。加入250μL的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)后，将其滴入8mL乙醇中，使反应生成物沉淀。在冰箱中彻夜保存后除去上清，用ODS柱(LiChroprep RP-18)精制。在80％乙酸水溶液中将4，4’-二甲氧基三苯甲基脱保护，用乙酸乙酯和水进行分液操作，浓缩水层，获得目标化合物(80OD₂₆₀，收率40％)。

MALDI-TOF-MS：计算值6928.4[M+H]⁺

实测值6930.1[M+H]⁺

试验例1 酰胺类溶剂的脱保护效果

将负载有市售的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相载体(333mg，15μmol)装入带滤器的柱子中，使用核酸自动合成机(Expedite^TM：美国应用生物***公司)，在固相上进行腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胸苷的合成，在固相上脱去4，4’-二甲氧基三苯甲基。对于低聚RNA 2μmol部分的树脂，作为切割剂使用浓氨水-乙醇混合液(3∶1)6mL，于40℃用4小时实施从CPG固相载体的切割和各磷酸部位的保护基的脱去反应及碱基的保护基的除去。将反应混合物分为10等分，减压下浓缩后，在下述表1记载的脱保护条件下，进行将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的反应。各反应中，每100μmol的TBAF添加1μL硝基甲烷。加入了与反应溶液量等量的1M的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)后，用HPLC进行各低聚RNA的分析。

HPLC的测定条件如下所示。

测定条件：

HPLC装置

送液单元：LC-10AT(株式会社岛津制作所制)

检测器：SPD-10A(株式会社岛津制作所制)

反相HPLC柱

DNAPac PA100<4mmφ×250mm>(戴安(DIONEX)公司制)

柱温：50℃

流动相

梯度：线性梯度20分钟(B液：5—25％)

A液：含10％乙腈的25mM Tris-HCl缓冲液

B液：含10％乙腈、700mM高氯酸钠的25mM Tris-HCl缓冲液

流动相的流量：1.5ml/分钟

紫外可见分光光度计检测波长：260nm

[表1] 酰胺类溶剂的脱保护效果

	脱保护条件	TBAF的活性的程度
	脱保护条件	TBAF的活性的程度	1	200μL的1M TBAF/THF溶液	3小时左右反应完毕
2	200μL的1M TBAF/THF溶液中添加了200μL的DMF的溶液	1小时反应完毕	1	200μL的1M TBAF/THF溶液	3小时左右反应完毕
2	200μL的1M TBAF/THF溶液中添加了200μL的DMF的溶液	1小时反应完毕	3	100μL的1M TBAF/THF溶液中添加了100μL的DMF的溶液	3小时反应完毕

如表1所示，通过在TBAF的THF溶液中加入DMF，可缩短反应时间或减少TBAF试剂的量。

试验例2酰胺类溶剂及亚砜类溶剂的脱保护效果

将负载有市售的5’-0-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷的CPG固相载体(333mg，15μmol)装入带滤器的柱子中，使用核酸自动合成机(Expedite^TM：美国应用生物***公司)，在固相上进行腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-腺苷酰-[3’→5’]-胞苷酰-[3’→5’]-尿苷酰-[3’→5’]-鸟苷酰-[3’→5’]-胸苷的合成，在固相上脱去4，4’-二甲氧基三苯甲基。对于低聚RNA 1μmol部分的树脂，作为切割剂使用浓氨水-乙醇混合液(3∶1)3mL，于40℃用4小时实施从CPG固相载体的切割和各磷酸部位的保护基的脱去反应及碱基的保护基的除去。减压下浓缩上述反应混合物后，于室温下，在下述表2记载的脱保护条件下，进行将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的反应。各反应中，每100μmol的TBAF添加1μL硝基甲烷。此外，每100μmol的TBAF加入100μL的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)后，将其滴入2mL(对于Entry3为1.5ml)乙醇中，使反应生成物沉淀。在冰箱中彻夜保存后除去上清，用HPLC分析反应生成物，确认本反应的终点。HPLC的测定条件与试验例1相同。

[表2] 酰胺类溶剂及亚砜类溶剂的脱保护效果

	脱保护条件	TBAF的活性的程度
	脱保护条件	TBAF的活性的程度	1	500μL的1M TBAF/DMF溶液	1小时反应完毕
2	500μL的1M TBAF/DMSO溶液	1小时反应完毕	1	500μL的1M TBAF/DMF溶液	1小时反应完毕
2	500μL的1M TBAF/DMSO溶液	1小时反应完毕	3	400μL的0.5M TBAF/DMSO溶液	1小时反应完毕

如表2所示，作为反应溶剂用DMSO或DMF替代THF时，反应性明显提高。

此外，从上述结果可明确，作为反应溶剂使用了DMSO时，可减少TBAF的用量、反应溶剂的用量。TBAF的用量与作为反应溶剂使用THF时相比，仅为其1/5左右。藉此，可在减少高价的TBAF的用量的同时减少用于使最终生成物析出的乙醇的用量。

产业上利用的可能性

经由使TBAF作用、将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的工序中使用亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂作为反应溶剂除去了低聚核酸衍生物的各核糖的2’位羟基的保护基的低聚核酸衍生物的制造步骤，可大量制备高纯度的低聚RNA(A)。

Claims

1.以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，在使氟化四丁基铵(TBAF)作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的工序中，作为反应溶剂使用可含四氢呋喃的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂，

式(10)及(11)中，各B分别独立，表示核酸碱基或其修饰体，n表示1～200的范围内的整数，各Q分别独立，表示O或S，各R分别独立，表示H、羟基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1个表示羟基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，

R¹表示以下的通式(3)表示的取代基，

式(3)中，R¹¹、R¹²、R¹³相同或不同，表示氢或烷氧基，

各R⁴分别独立，表示H、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基，

式(4)中，WG¹表示吸电子基团。

2.如权利要求1所述的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，亚砜类溶剂为以下的通式(I)表示的化合物，

式(I)中，R^a、R^b相同或不同，表示烷基。

3.如权利要求2所述的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，通式(I)表示的化合物为二甲亚砜。

4.如权利要求1所述的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，酰胺类溶剂为以下的通式(II)表示的化合物，

式(II)中，R^c、R^d相同或不同，表示烷基，R^e表示氢或烷基，或者R^d表示烷基，R^c、R^e表示与邻接的氮原子及碳原子一起形成的5或6元的饱和环状酰胺基。

5.如权利要求4所述的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，通式(II)表示的化合物为N，N-二甲基甲酰胺。

6.如权利要求1～5中任一项所述的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，WG¹为氰基。

7.如权利要求1～6中任一项所述的低聚核酸衍生物的制备方法，其特征在于，使用还含有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇或硫醇衍生物或它们的任意的混合物的反应溶剂。

8.以下的通式(A)表示的低聚RNA的制备方法，

式(A)中，各B分别独立，表示核酸碱基或其修饰体，n表示1～200的范围内的整数，各Q分别独立，表示O或S，各R分别独立，表示H、羟基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷氧基，但至少1个表示羟基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，

其特征在于，包含制备以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步骤，该步骤中，在使氟化四丁基铵(TBAF)作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的工序中，作为反应溶剂使用可含四氢呋喃的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂，

式(10)及(11)中，各B、各Q、各R分别独立，其含义如前所述，n、Z如前所述，

R¹表示以下的通式(3)表示的取代基，

式(3)中，R¹¹、R¹²、R¹³相同或不同，表示氢或烷氧基，

式(4)中，WG¹表示吸电子基团。

9.如权利要求8所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，亚砜类溶剂为以下的通式(I)表示的化合物，

式(I)中，R^a、R^b相同或不同，表示烷基。

10.如权利要求9所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，通式(I)表示的化合物为二甲亚砜。

11.如权利要求8所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，酰胺类溶剂为以下的通式(II)表示的化合物，

12.如权利要求11所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，通式(II)表示的化合物为N，N-二甲基甲酰胺。

13.如权利要求8～12中任一项所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，WG¹为氰基。

14.如权利要求8～13中任一项所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，使用还含有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇或硫醇衍生物或它们的任意的混合物的反应溶剂。

15.以下的通式(A)表示的低聚RNA的制备方法，

其特征在于，包括以下的步骤A～H，

步骤A：

使酸作用于以下的通式(1)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脱去5’位羟基的保护基，制备以下的通式(2)表示的(低聚)核酸衍生物的步骤，

式(1)及(2)中，各Q分别独立，其含义如前所述，n如前所述，各B_X分别独立，表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，R¹表示以下的通式(3)表示的取代基，

式(3)中，R¹¹、R¹²、R¹³相同或不同，表示氢或烷氧基，

各WG²分别独立，表示吸电子基团，各R⁴分别独立，表示H、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基或以下的通式(4)表示的取代基，

式(4)中，WG¹表示吸电子基团，

E表示酰基或以下的通式(5)表示的取代基，

式(5)中，E¹表示单键或以下的通式(6)表示的取代基，

式(6)中，Q、WG²的含义如前所述，

T表示H、酰氧基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷氧基、上述通式(4)表示的取代基或上述通式(5)表示的取代基，但E或T的任一方为取代基(5)，

步骤B：

采用活化剂使核酸单体化合物与步骤A制得的(低聚)核酸衍生物(2)缩合，制备以下的通式(7)表示的低聚核酸衍生物的步骤，

式(2)及(7)中，各Bx、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述。E、n、R¹、T的含义如前所述，

步骤C：

在步骤B中未反应的(低聚)核酸衍生物(2)的5’位羟基的加帽步骤，

式(2)及(8)中，各B_x、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述，E、n、T的含义如前所述，R⁵表示甲基、苯氧基甲基、叔丁基苯氧基甲基，

步骤D：

通过使氧化剂作用于步骤B中制备的低聚核酸衍生物(7)而将亚磷酸基转变为磷酸基或硫代磷酸基的步骤，

式(7)及(9)中，各B_X、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述，E、n、R¹、T的含义如前所述，

步骤E：

将步骤D制备的低聚核酸衍生物(9)从固相载体切割，脱去各核酸碱基部及各磷酸基的保护基的步骤，

式(9)及(10)中，各B、各B_X、各Q、各R⁴、各WG²分别独立，其含义如前所述，E、n、R、R¹、T、Z的含义如前所述，

步骤F：

使氟化四丁基铵(TBAF)作用于以下的通式(10)表示的低聚核酸衍生物、将各核糖的2’位羟基的保护基脱去的工序中，通过用可含四氢呋喃的亚砜类溶剂或酰胺类溶剂或它们的混合溶剂作为反应溶剂，制备以下的通式(11)表示的低聚核酸衍生物的步骤，

式(10)及(11)中，各B、各Q、各R、各R⁴分别独立，其含义如前所述，n、R¹、Z的含义如前所述，

步骤G：

将步骤F制备的低聚核酸衍生物(11)的5’位羟基脱去的步骤。

式(11)及(A)中，各B、各Q、各R分别独立，其含义如前所述，n、R¹、Z的含义如前所述，

步骤H：

分离精制步骤G制备的低聚RNA(A)的步骤。

16.如权利要求15所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，通过重复进行步骤A～D制备所需链长的低聚RNA(A)。

17.如权利要求15所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，步骤B中，作为核酸单体化合物的至少1种使用以下的通式(B)表示的化合物，

式(B)中，B_Z表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，R¹表示以下的通式(3)表示的取代基，

式(3)中，R¹¹、R¹²、R¹³相同或不同，表示氢或烷氧基，

R^2a、R^2b相同或不同，表示烷基或表示R^2a、R^2b与邻接的氮原子一起形成的5～6元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子，WG¹、WG²相同或不同，表示吸电子基团。

18.如权利要求15～17中任一项所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，亚砜类溶剂为以下的通式(I)表示的化合物，

式(I)中，R^a、R^b相同或不同，表示烷基。

19.如权利要求18所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，通式(I)表示的化合物为二甲亚砜。

20.如权利要求15～17中任一项所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，酰胺类溶剂为以下的通式(II)表示的化合物，

21.如权利要求20所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，通式(II)表示的化合物为N，N-二甲基甲酰胺。

22.如权利要求15～21中任一项所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，WG¹为氰基。

23.如权利要求15～22中任一项所述的低聚RNA的制备方法，其特征在于，步骤F中，使用还含有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇或硫醇衍生物或它们的任意的混合物的反应溶剂。