CN101418290A - 一种高效的elp融合蛋白酶及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明利用弹性蛋白样多肽(ELP)与人鼻病毒3C蛋白酶进行融合表达，获得了一种高效的融合蛋白酶，即ELP－3C蛋白酶。由于采用了ELP作为纯化标签，可以不需要层析分离技术协助下纯化融合蛋白酶，降低纯化的成本。ELP－3C蛋白酶可应用于切割融合蛋白，酶切底物蛋白后通过简单地提高盐离子浓度触发其沉淀并通过离心将其除去，此过程不需要层析分离技术协助，而且ELP－3C蛋白酶可连续进行若干次酶切，多次酶切后仍保持酶切活性，因此能够降低大规模蛋白纯化的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组的融合蛋白酶，以及该蛋白酶在切割融合蛋白中的应用。
背景技术
随着大规模测序技术发展和广泛应用，人类基因组计划及其他物种包括海胆、斑马鱼、文昌鱼等基因组计划也相继完成。对这些物种的基因组测序的直接结果是产生成千上万个基因，对这些基因功能的阐明，有助于我们了解物种在进化过程的位置；对导致疾病的基因的研究有助于了解发病机理，寻找治疗的靶点，开发治疗相应治疗药物；同时，大量的药物蛋白基因也有待我们去研究其生理活性，及作用靶点，为开发新型的治疗药物提供基础。基因功能研究的方法很多，包括基因敲除技术，蛋白组学的研究，RNA干扰等。其中一个最直接的研究方法是把所研究的基因进行重组表达，获得相应的蛋白后进行生理和生化活性的研究和对其进行结构生物学的分析从而阐明其功能。由于物种基因的差异性，并不是所有的基因都能成功地表达。基因不表达，蛋白表达量低或表达的蛋白不稳定形成不可溶的包涵体，这些现象在异源表达***中经常出现，特别在原核表达***中表达真核生物基因。随着DNA重组技术的发展，可以将目的基因与表达亲和标签的基因进行融合，然后克隆在表达载体中进行融合表达，这些亲和标签不但可以帮助所融合的目的蛋白折叠，提高目的蛋白的可溶性和表达量，同时亲和标签能与相应的亲和层析的树脂结合，起到一步纯化融合蛋白的作用。常用的亲和纯化标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)，麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding Protein，MBP)，His标签等。最后利用蛋白酶对含有相应蛋白酶酶切位点的融合蛋白进行切割，使目的蛋白与亲和标签蛋白分离开，通过进一步的层析分离除去亲和标签和蛋白酶而获得目的蛋白。
亲和层析是一种非常有效的分离方法，在不需要了解所融合蛋白的物化性质的情况，就可以实现一步纯化融合蛋白，这种纯化技术被广泛应用。但是，应用亲和层析分离技术需要昂贵的亲和树脂，和相应的纯化设备，这样限制了同时表达多种蛋白用于高通量的结构生物学研究和高通量的药物蛋白筛选。1999年，报道了一个热敏感的纯化标签弹性蛋白样多肽(Elastin Like Polypeptides，ELP)，这个标签起源于弹性蛋白的重复的五肽“Val-Pro-Gly-Val-Gly”。ELP可以经历一个可逆相变过程，称为反温度相变(Inverse TemperatureTransition)。当温度低于相变温度(Transition temperature，Tt)时，ELP在液相表现出高度可溶，然而当温度高于Tt时，亲水的ELP则会脱水而发生凝集，而且ELP融合蛋白也具有这种特性，但是需要指出的是发生相变的时候只是ELP发生凝结而所融合的外源蛋白并没有发生变性或沉淀。利用ELP的这种特性，可以方便和快速地利用ELP标签来纯化ELP融合蛋白，而且纯化过程中不需要层析分离而避免了昂贵的亲和树脂和纯化设备，同时ELP融合蛋白的浓缩和更换缓冲液也变得非常简单。通过加热或提高盐离子浓度触发ELP融合蛋白的凝集，通过离心使ELP融合蛋白于表达宿主蛋白中分离出来，用低盐低温的溶液使沉淀的ELP融合蛋白重新溶解，再进行离心除去不可溶的蛋白而获得ELP融合蛋白，通过重复触发沉淀、离心和重溶步骤可以获得更纯的ELP融合蛋白，这种纯化过程称之为逆相循环(Inverse TransitionCycling，ITC)。
为了消除纯化标签对目的蛋白的生理活性、物理结构和免疫原性的影响，所纯化的融合蛋白需要除去纯化标签。切割融合标签方法包括化学方法和酶学的方法。化学方法切割的条件比较剧烈，容易造成蛋白变性和蛋白侧链的化学修饰而所切割；另外切割的位点也只限定于一个或两个特定的氨基酸，容易造成对目的蛋白内部进行切割。所以这种方法只限于分离小肽和分子量小的蛋白。相反，蛋白酶切割的条件相对于化学法来说就温和很多，而且蛋白酶的酶切特异高，有多种蛋白酶可供选择，所以在融合蛋白切割中使用蛋白酶是首选，尽管商业化的蛋白酶比较昂贵。人鼻病毒3C蛋白酶(Human Rhinovirus 14 3C Protease)是一种高效的蛋白酶。3C蛋白酶来源于人鼻病毒，是一种半胱氨酸蛋白酶，其识别的剪切蛋白序列为Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro，切割位点位于Gln-Gly之间。商业化的3C蛋白酶是与GST融合的(GST-3C)，称之为PreScission Protease，常用的pGEX系列融合表达载体中含有PreScission酶切位点。3C蛋白酶在低温和高盐条件下，仍然保持很高的酶切活性，即使溶液中离子浓度高达0.5M，亦保持酶切活性。相比其他的蛋白酶，3C酶具有识别特异性更强、切割效率更高、反应条件温和等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的融合蛋白酶ELP-3C蛋白酶。
本发明的另一目的在于提供该融合蛋白酶的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供该融合蛋白酶在切割融合蛋白中的应用。
根据本发明的一个方面，由弹性蛋白样多肽(ELP)基因和人鼻病毒3C蛋白酶基因融合编码的ELP-3C蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的另一个方面，所述ELP-3C蛋白酶的制备方法包括以下步骤：
(1)将ELP-3C蛋白酶编码基因克隆到原核表达载体pET23a上，构建表达质粒；
(2)将所述表达质粒转化入大肠杆菌株BL21(DE3)，并进行培养表达；
(3)对所述大肠杆菌进行超声裂解，裂解菌液进行低温离心，取上清液；
(4)通过提高所述上清液的盐离子浓度触发ELP-3C蛋白酶凝集，室温离心，除去上清液，沉淀物用低温低盐溶液重新溶解；
(5)重复所述凝集、离心和重新溶解的步骤直至获得纯的ELP-3C蛋白酶。
本发明中，转化后的大肠杆菌BL21(DE3)的培养表达是将单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃ 225rpm培养12小时，作为种子菌；取种子菌接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600为1.0时，将温度调到18℃培养24小时。
本发明的基因克隆技术：参照Sambrook等分子克隆实施室手册(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)中所述的实验条件。
本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.coli.DH50或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养转化菌株。
根据本发明的第三个方面，提供ELP-3C蛋白酶在切割融合蛋白中的应用。
本发明所获得的ELP-3C蛋白酶在切割融合蛋白后，通过提高溶液盐离子浓度触发ELP-3C蛋白酶凝集并通过离心将其除去。
本发明所获得的ELP-3C蛋白酶可连续进行若干次酶切，且保持酶切活性。
本发明对ELP-3C融合蛋白酶的表达条件进行了摸索和优化，通过优化培养时间、诱导时间和温度等条件，使ELP-3C蛋白酶的表达量较高，且绝大部分处于可溶状态。所制备得到的ELP-3C蛋白酶的纯化无需使用层析分离的填料及相应的设备，因而能够降低ELP-3C蛋白酶的纯化成本。
切割融合蛋白实验证实：ELP-3C蛋白酶切割融合蛋白的最适浓度为ELP-3C蛋白酶∶融合蛋白＝1∶100(w/w)，在1∶100(w/w)浓度下ELP-3C蛋白酶能够高效切割GST-ELP、ELP-GST、ELP-MBP和ELP-TRX等融合蛋白；通过提高溶液盐离子浓度可触发ELP-3C和ELP凝集并通过离心将其除去，从而实现无需层析分离技术下去除ELP-3C蛋白酶。此外，连续酶切融合蛋白实验证实：ELP-3C蛋白酶切割ELP-GFP蛋白后进行回收，回收后的ELP-3C蛋白酶仍然具有酶切活性，而且可以连续进行6次酶切。因此，ELP-3C蛋白酶可作为纯化无标签目的蛋白的工具，并且能降低大规模蛋白纯化的成本。
附图说明
图1为ELP-3C蛋白酶的诱导表达与纯化及其应用于纯化GST蛋白的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：ELP-3C蛋白酶诱导表达的总菌蛋白；2：ELP-3C蛋白酶诱导表达的裂解上清；3：加盐沉淀ELP-3C蛋白酶后的离心上清；4：纯化后的ELP-3C蛋白酶；5：纯化后的GST-ELP；6：ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP；7：沉淀酶切产物；8：纯化的GST。
图2为ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP融合蛋白的最佳酶切浓度摸索的SDS-PAGE电泳图。1：GST-ELP；2：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶10(w/w)；3：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶50(w/w)；4：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶100(w/w)；5：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶500(w/w)；6：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶1000(w/w)；7：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶5000(w/w)；8：ELP-3C蛋白酶∶GST-ELP＝1∶10000(w/w)。
图3为利用ELP-3C蛋白酶纯化GFP蛋白的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：ELP-GFP诱导表达的总菌蛋白；2：ELP-GFP诱导表达的裂解上清；3：加盐沉淀ELP-GFP后的离心上清；4：纯化后的ELP-GFP；5：ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP；6：沉淀酶切产物；7：纯化的GFP。
图4为荧光显微镜下检测的GFP蛋白。
图5为利用ELP-3C蛋白酶纯化MBP蛋白的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：ELP-MBP诱导表达的总菌蛋白；2：ELP-MBP诱导表达的裂解上清；3：加盐沉淀ELP-MBP后的离心上清；4：纯化后的ELP-MBP；5：ELP-3C蛋白酶酶切ELP-MBP；6：沉淀酶切产物；7：纯化的MBP。
图6为利用ELP-3C蛋白酶纯化TRX蛋白的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白质分子量标准；1：ELP-TRX诱导表达的总菌蛋白；2：ELP-TRX诱导表达的裂解上清；3：加盐沉淀ELP-TRX后的离心上清；4：纯化后的ELP-TRX；5：ELP-3C蛋白酶酶切ELP-TRX；6：沉淀酶切产物；7：纯化的TRX。
图7为连续酶切纯化的GFP蛋白的SDS-PAGE电泳图。1：第一次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP；2：第二次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP；3：第三次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP；4：第四次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP；5：第五次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP；6：第六次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后纯化的GFP。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施室手册中所述的条件。
实施例1：ELP-3C蛋白酶表达载体的构建及转换宿主菌
根据1999年Meyer和Chilkoti等人报道的方法合成ELP基因(Meyer，D.E.，and Chilkoti，A.1999.Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.NatBiotechnol 17：1112-1115.)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过ELP基因N端的EcorI和C端的HindIII酶切后，克隆于商业化原核表达载体pET23a中的相应酶切位点而形成pET23a-ELP载体。将pET23a-ELP质粒转化入大肠杆菌DH5α菌株，经培养表达后提取pET23a-ELP质粒。同时，根据在NCBI中的genbank上公布的人鼻病毒3C蛋白酶的基因序列(登录号：M12168)合成3C蛋白酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并克隆于pbluscript载体中而形成pbluscript-3C载体。将pbluscript-3C质粒转化入大肠杆菌DH5α菌株，经培养表达后提取pbluscript-3C质粒。应用3C蛋白酶基因N端的HindIII和C端的NotI两种内切酶对pbluscript-3C进行酶切，将纯化获得3C基因片段克隆于pET23a-ELP载体相应酶切位点中，使3C蛋白酶基因位于ELP基因的C端，而获得ELP-3C蛋白酶表达载体pET23a-ELP-3C。
将构建的表达载体pET23a-ELP-3C，参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecularcloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化入E.coli.BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100 2g/mL)的LB培养基培养转化菌株。
实施例2：重组ELP-3C蛋白酶的表达与纯化
将含有重组质粒pET23a-ELP-3C的表达宿主菌BL21(DE3)单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃ 225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600约为1.0时，将温度调到18℃培养24小时。将100ml诱导后的菌液进行离心收菌，5000rpm5分钟。用8ml冰冷的PBS重悬菌体，然后进行超声裂解菌体，功率为200W，超声15分钟。将裂解菌液在4℃ 12000g离心10分钟，去除不溶的菌体蛋白。将固体NaCl加入离心上清液中，并使之溶解，溶液浓度为2M，裂解上清液在室温条件下由澄清变为浑浊。将变浑浊的裂解上清液室温高速离心5分钟后，去除上清液。加入预冷的PBS重悬沉淀，将沉淀吹打散，并置于冰上直至所有沉淀均溶解为止。将此蛋白溶液在4℃ 12000g离心5分钟，去除不溶的沉淀。将离心所得的上清液重复加盐使蛋白凝集，离心，溶解蛋白沉淀，离心去除不溶沉淀的步骤，直至去除所有的杂蛋白获得较纯的目的蛋白为止(见图1)。
实施例3：利用ELP-3C蛋白酶纯化GST蛋白
将含有重组质粒的pGEX-ELP表达宿主菌BL21(DE3)单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃ 225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+LB加富培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600约为1.0时，加入0.5mMIPTG，37℃诱导表达4小时。收菌后进行裂解，通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发GST-ELP凝集并离心使其沉淀，使用3C酶切缓冲液进行溶解。按1∶100加入ELP-3C蛋白酶，5℃酶切16小时。酶切后加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上清液为纯化的GST蛋白(见图1)。
实施例4：ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP融合蛋白的最适酶切浓度
酶切100μgGST-ELP蛋白底物，按ELP-3C∶GST-ELP质量比1∶10，1∶50，1∶100，1∶:500，1∶1000，1∶5000，1∶10000加入ELP-3C蛋白酶，混匀后于5℃酶切16小时。酶切反应结束后进行SDS-PAGE电泳检测(见图2)。
实施例5：利用ELP-3C蛋白酶纯化GFP蛋白
将含有重组质粒pET23a-ELP-GFP的表达宿主菌BL21(DE3)单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600约为1.0时，将温度调到18℃培养24小时。收菌后进行裂解，通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP-GFP凝集并离心使其沉淀，使用3C酶切缓冲液进行溶解。按1∶100加入ELP-3C蛋白酶，5℃酶切16小时。酶切后加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上清液为纯化的GFP蛋白(见图3)。将纯化的GFP蛋白置荧光显微镜下观察，可以检测到明显的荧光(见图4)。
实施例6：利用ELP-3C蛋白酶纯化MBP蛋白
将含有重组质粒pET23a-ELP-MBP的表达宿主菌BL21(DE3)单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃ 225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600约为1.0时，将温度调到18℃培养24小时。收菌后进行裂解，通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP-MBP凝集并离心使其沉淀，使用3C酶切缓冲液进行溶解。按1∶100加入ELP-3C蛋白酶，5℃酶切16小时。酶切后加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上清液为纯化的MBP蛋白(见图5)。
实施例7：利用ELP-3C蛋白酶纯化TRX蛋白
将含有重组质粒pET23a-ELP-TRX的表达宿主菌BL21(DE3)单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃ 225rpm培养12小时，作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600约为1.0时，将温度调到18℃培养24小时。收菌后进行裂解，通过加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发使GST-GFP凝集并离心使其沉淀，使用3C酶切缓冲液进行溶解。按1∶100加入ELP-3C蛋白酶，5℃酶切16小时。酶切后加入固体NaCl使溶液浓度为2M，触发ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并离心除去。收集上清液为纯化的TRX蛋白(见图6)。
实施例8：ELP-3C蛋白酶重复利用活性的检测
酶切1mg ELP-GFP蛋白，按ELP-3C∶ELP-GFP质量比1∶100加入ELP-3C蛋白酶。20℃酶切4小时后，加入固体NaCl使酶切溶液浓度为2M，室温高速离心5分钟，保留上清样品。沉淀用含有1mg的ELP-GFP蛋白溶液重悬，并不断地吹吸使沉淀溶解为止，加入DTT(终浓度1mM)后继续进行20℃酶切4小时。如此重复上面的步骤6次。将每次纯化的GFP蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳检测(见图7)。
序列表
<110>中山大学
<120>一种高效的ELP融合蛋白酶及其制备和应用
<160>3
<210>1
<211>1374
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)..(1374)
<223>ELP基因
<400>1
<210>2
<211>549
<212>DNA
<213>人鼻病毒(Human Rhinovirus)
<400>2
<210>3
<211>648
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)..(648)
<223>ELP-3C蛋白酶
<400>3
Claims (6)
1、由弹性蛋白样多肽(ELP)基因和人鼻病毒3C蛋白酶基因融合编码的ELP-3C蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2、权利要求1所述的ELP-3C蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将ELP-3C蛋白酶编码基因克隆到原核表达载体pET23a上，构建表达质粒；
(2)将所述表达质粒转化入大肠杆菌株BL21(DE3)，并进行培养表达；
(3)对所述大肠杆菌进行超声裂解，裂解菌液进行低温离心，取上清液：
(4)通过提高所述上清液的盐离子浓度触发ELP-3C蛋白酶凝集，室温离心，除去上清液，沉淀物用低温低盐溶液重新溶解；
(5)重复所述凝集、离心和重新溶解的步骤直至获得纯的ELP-3C蛋白酶。
3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述培养表达是将单菌落接种于Amp+的LB液体加富培养基中，37℃ 225rpm培养12小时，作为种子菌；取种子菌接种于新鲜的Amp+TB培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至O.D.600为1.0时，将温度调到18℃培养24小时。
4、权利要求1所述的ELP-3C蛋白酶在切割融合蛋白中的应用。
5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：ELP-3C蛋白酶在切割融合蛋白后，通过提高溶液盐离子浓度触发ELP-3C蛋白酶凝集并通过离心将其除去。
6、根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：ELP-3C蛋白酶连续进行若干次酶切。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |