CN101418268A - 用Phyllobacterium sp.nov.921F菌株生产新型细菌胞外多糖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够产生细菌胞外多糖的细菌，并提供一种利用该菌株生产细菌胞外多糖的方法。本发明提供的菌种具有营养要求简单，易培养，胞外多糖产量高的特点。特别是利用本发明中半合成培养基发酵该菌株可得到较高的产糖量。在含有3％蔗糖的肉汁液体培养基中培养72h，其菌种胞外多糖产糖量达1.5g/100ml。该细菌胞外多糖为白色粉末，易溶于水，重均分子量为736kD，其中室温条件下1.0％糖溶液表观粘度为655mps。对该细菌胞外多糖的性质研究表明，该多糖由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸取代基形成的重复单元组成，摩尔组成比为1∶1∶1。该多糖不同于以往任何工业生产菌株所产生的多糖，同时用本发明的菌株作为一种细菌胞外多糖生产菌株，具有产品产量高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化应用生产。

Description

用Phyllobacterium sp.nov.921F菌株生产新型细菌胞外多糖
技术领域
生物技术
背景技术
目前已报告的能够产生胞外多糖的菌株有以下几类：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)产生的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸组成的酸性多糖，Chlamydomonas ulvaensis产生的葡萄糖、木糖构成的胞外多糖，以及结合杆菌(M.tuberculosis)的D-甘露糖、***糖组成的多糖。链球菌S.equi和S.zooepidernicus能够产生由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成的透明质酸。嗜热链球菌(S.Thermophilus)能够产生由D-半乳糖、D-葡萄糖和N-乙酰半乳糖构成重复单位的多糖。野生油菜黄单孢菌(Xanthomonas Campestris)能够产生黄原胶，结构由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸组成。也有少数的种能够产生同质聚糖，例如明串珠菌属(Leuconostoc sp.)和足球菌属(Pediococcus sp.)产生的胞外葡聚糖；醋酸杆菌(A.xylinum)产生的胞外细菌纤维素等。
Phyllobacterium sp.nov.921F能够产生胞外多糖，据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，目前并没有关于叶杆菌Phyllobacterium产生的胞外多糖进行研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种菌株Phyllobacterium sp.nov.921F，并利用该菌株生产细菌胞外多糖的方法。
本发明分离纯化出一株来源于真菌子实体表面的菌株Phyllobacterium sp.nov.921F，具有产生胞外多糖的特性，保藏单位简称CCTCC，保藏号为M205043。本发明的特点是：
首次分离出一株具有产生细菌胞外多糖的Phyllobacterium sp.nov.921F菌株。该菌株革兰氏阴性，直杆状，0.4-0.8μm×0.8-2.0μm。以1至几根极毛或长波状的侧生鞭毛运动。好氧，以分子氧为末端电子受体的严格好氧呼吸代谢类型。最适温度为28～34℃。接触酶阳性。化能异养菌，利用各种糖葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、***糖以及有机酸(丙二酸盐、葡萄糖酸盐)作为碳源。可利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸类作为氮源。不水解淀粉，果胶和纤维素。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版的结果，本发明涉及菌株的形态和生理生化特征大部分与叶杆菌属(Phyllobacterium sp.)相符。根据伯杰氏手册第九版，本发明的菌株的形态和生理生化特征与叶杆菌属一致，确定其为叶杆菌属，但其形态和生理生化特征与该属已知菌相比有所不同。(该菌株与叶杆菌属其他菌种的特征对比见表1)对该菌种进行16SRNA基因测序，其结果与Genebank中Phyllobacterium的序列进行比对相似度最高，其相似度为98.7％。该菌种具有营养要求简单，易培养，胞外多糖产量高的特点。该多糖由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸取代基形成的重复单元组成，摩尔组成比为1：1：1。该多糖不同于以往任何工业生产菌株所产生的多糖，是一种可以实现工业应用的新型细菌胞外多糖。
附图说明
图1：标准糖气相色谱分析结果。
图2：Phyllobacterium sp.nov.921F菌株生产胞外多糖酸解终产物气相色谱分析结果。
图3：分子量为805组分多糖的二级质谱分析结果。
图4：分子量为1200组分多糖的二级质谱分析结果。
具体实施方式
1.菌株的分离纯化：
本发明Phyllobacterium sp.nov.921F菌株的获得：从长白山余脉采集真菌子实体样品，加入到装有25ml富集培养基(蔗糖2g，NaNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NH4Cl0.5g，FeSO4 0.01g，H2O 1000ml，pH7.2)的三角瓶中，30℃，160r/mim摇瓶培养3d。然后将富集培养液用无菌生理盐水适当稀释后，取0.2ml涂布初筛分离培养基(蔗糖10g，NaNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NH4Cl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂15g，H2O 1000ml，pH7.5)平板。30℃倒置培养48h，获得选取平板上有粘稠乳白色的菌落，得到一株能产胞外多糖的细菌。
2.菌株的鉴定：
将分离得到是菌株按《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版本进行菌株的形态和生理生化鉴定，其特征与叶杆菌属一致，确定其为叶杆菌属，该属目前有报道7个种，对比属内的生理生化特征与该属已知菌相比有所不同(Phyllobacterium sp.nov.921F与叶杆菌属其他菌种的特征对比见表1)。又对该菌种进行16SrDNA基因测序，结果如下：
CATGCgAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAAT
AACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATACGCCCTTTTGGGGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTG
GATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG
GGACTGAGACACGGCCCAgACTccTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGC
CATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAG
AAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAA
GCGCACGTAGGCGGACTATTAAGTCAGAGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGCAGTC
TTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGGCG
AAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT
CCACGCCGTAAACTATGAGAG
其结果与Genebank中Phyllobacterium的序列进行比对相似度最高，其相似度为98.7％。根据以上结果将该种记为Phyllobacterium sp.nov.921F。
3.用Phyllobacterium sp.nov.921F菌株生产胞外多糖：
将菌种预培养物接种于装有100ml发酵培养基(蔗糖30g，蛋白胨7g，K2HPO4 2g，MgSO40.25g，FeSO4 0.01g，H2O 1000ml，pH 8)的250ml三角瓶中，30℃摇瓶培养48h后，将培养液过膜去除菌体。然后，加2倍体积的95％乙醇于发酵液中，玻璃棒搅动至出现絮状沉淀，4℃下保存12小时后，离心去除上清液，沉淀以蒸馏水复溶后，粗多糖经过Sevag法除蛋白，再用乙醇沉淀来进一步纯化产物多糖，冷冻干燥，得到多糖成品。
4.Phyllobacterium sp.nov.921F多糖的分析：
首先利用糖醇乙酸酯衍生物气相色谱法(GC)对单糖组成进行确定，即取25mg样品加入3mL 2mol/L三氟乙酸(TFA)，100℃水解6小时，减压除尽TFA，再加入50mg NaBH4和5mg内标物肌醇，对其进行衍生化后，将样品上气相色谱柱(DB225毛细管柱(30cm×25mm))。根据相对保留时间确定单糖组成以及相对保留峰面积确定各单糖的含量。图1为标准糖分析结果，图2为该多糖酸解终产物，经比对可知，该多糖由葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为1：1。
再将降解的产物经Bio-Gel P4进行分级得到3个组分，经一级质谱确定分子量分别为806、1200和1594。对其分别进行二级质谱(图3、图4)，结果显示该多糖由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸取代基形成的重复单元组成，摩尔组成比为1：1：1。
表1 叶杆菌属(Phyllobacterium)种间的鉴别

Claims (3)

1.一种叶杆菌(Phyllobacterium sp.nov.921F)，该菌种由中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏单位简称CCTCC，保藏号为M205043。
2.一种一种叶杆菌(Phyllobacterium sp.nov.921F)产糖细菌其16SrDNA核酸序列：SEQ ID NO.1。
3.一种叶杆菌(Phyllobacterium sp.nov.921F)菌株产生的细菌胞外多糖，其特征是由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸取代基形成的重复单元组成，摩尔组成比为1：1：1。
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PB01 Publication
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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