CN101415837A - 结肠直肠癌的生物标志物组 - Google Patents

Abstract

一种已经被鉴定用于分析结肠直肠癌的生物标志物组。已经将起初使用小鼠结肠癌模型鉴定的组用于评价来自外科手术和活组织检查样品的人组织针对正常人的生物标志物的对照组的变化。可以将所述组用于提供经济有效、快速、非侵袭性的方法以用于危险率估计、早期诊断、确定预后，监测患者治疗，检测复发，和用于开发结肠直肠癌的治疗性干预。

Description

结肠直肠癌的生物标志物组

相关申请的参考

本申请要求美国临时专利申请60/488,660和美国专利申请10/690,880的优先权，所述申请60/488,660由Nancy M.Lee等于2003年7月18日提交，题为Molecular Marker Panel for Determination of Colorectal Cancer(律师记事表CPMC-01000US0)，所述申请10/690,880由Nancy M.Lee等于2003年10月22日提交，题为Biomarker Panel for ColorectaI Cancer(律师记事表CPMC-01000US1)，将这两个申请并入本文作为参考。

背景

该说明书的技术领域涉及结肠直肠癌症的生物标志物(CRC)。这些生物标志物用于危险率估计，早期检测，确定预后，干涉的评估，CRC的复发，和治疗性干预的开发，及其应用方法。

在药学领域，已经在长期寻求提供CRC的危险率估计和早期检测的临床方法。目前，CRC是西方世界中与癌症相关的死亡的第二大原因。通过对于CRC数十年的研究，已经清楚的是早期检测对于提高存活率是关键的。

目前，CRC筛选的被接受的方法包括大便潜印血(occult blood)试验(FOBT)，使用介于钡灌肠和空气之间的双重对比(DCBE)的X-射线，乙状结肠镜和结肠镜检查。乙状结肠镜是侵袭性的方法，其使用发光的，弹性的内诊镜视觉观察结肠下部的三分之一，而相关的方法，结肠镜检查是检查完整结肠的方法。在两种情形中，在所述方法过程中，可以取活组织检查样品。

关于被接受的用于筛选的方法，没有一个明显地具有在CRC的筛选检查中理想的内容。因为FOBT快速，其是非常通用的，并因此是CRC的非常不具特异性的筛选方法。尽管已经证实DCBE有效用在对结肠中的异常进行具体成像，DCBE方法的缺陷包括：1.)患者在准备检查和检查过程中感觉不适，产生对于作为筛选方法的DCBE依从性的不情愿。2.)使患者暴露于X-射线辐射，在作为筛选方法的使用频率上显示限制DCBE。3.)研究说明DCBE在检测更大的生长上更为有效，这限制了其对于早期检测的应用。4.)在所述方法过程中，不能取活组织检查样品。5.)由于涉及的费用，不是所有的保险商为DCBE筛选检查支付赔偿。尽管乙状结肠镜检查已经受到许多内科医师的青睐，该方法的缺陷包括：1.)患者在准备检查和检查过程中感觉不适，产生对于作为筛选方法的乙状结肠镜检查依从性的不情愿。2.)由于涉及的费用，不是所有的保险商为乙状结肠镜筛选检查支付赔偿.3.)由于仅检查了结肠的下部三分之一，而有研究指出许多明显的病变出现在结肠的近端，导致了乙状结肠镜检查是不足够的。尽管结肠镜检查解决了彻底检查结肠的问题，作为筛选方法的结肠镜检查的缺陷包括：1.)甚至比乙状结肠镜检查更让患者不舒服，因此通常需要镇静，并由此加剧了关于患者依从性的问题。2.)由于涉及的费用，不是所有的保险商为结肠镜筛选检查提供赔偿。3.)结肠镜检查具有危险，其包括出血，和刺破结肠内层。

正在出现的光谱学技术，诸如磁共振成像和X射线断层成像每个都有缺陷，所述缺陷来自目前已接受的筛选方法的缺陷的列表。

因此，本领域需要在早期检测和治疗CRC中具有价值的方法，其经济有效、快速并且侵袭性程度最小或没有侵袭性。从该方法中获得的另外的应用性还将充当确定预后，监测患者的治疗和检测复发，以及开发CRC的治疗性干预的基础。

附图简述

图1是序列表的简述。

图2A-2C显示举例说明对于取自腺性(adenomous)息肉的样品的生物标志物组(panel)，怀疑组织相对于正常对照的数据。图2A-2B是比较在小鼠(2A)中进行的选择在序列表中列出的22个生物标志物的组中的成员的模型研究的结果序列表与人受试者(2B)的生物标志物的可比较的选择的表格。图2C显示对于取自12个正常患者的78个活组织检查以及取自患有CRC的6个患者的63个活组织检查的9个标志物的多变量分析。

图3B-3C显示取自人受试者的一系列样品的代表性生物标志物，IL-8(3A)，CXCR-2(3B)，和COX-2(3C)的表达水平，对比正常对照比较了在组织学上鉴定的癌性病变，息肉，和邻近的非-癌性组织。

图4A-4C显示跨越具有CRC的患者的结肠的53cm距离的多重分析的结果：4A显示IL-8表达的水平；4B显示C0X-2的表达水平；并且4C显示CXCR-2的表达水平。

发明详述

对除目前已经接受的筛选CRC的方法之外的方法的探索是对生物标志物的研究，所述生物标志物在检测和治疗CRC中具有价值。在超过40年的时间里，由于甲胎蛋白(AFP)和致癌性胚胎抗原(CEA)的开发，对于癌症检测和治疗的生物标志物的研究大体上在发展的状态中。在患者护理的管理中，癌症的生物标志物具有5个潜在的应用。理想地，它们将用于危险率估计，早期诊断，确定预后，监测治疗和检测复发。另外，这些标志物可以在发展治疗性干预中具有颇有价值的作用。

对于与生物标志物分析结合的取样方法而言，侵袭性程度最小或无侵袭性是更为有利的。这些取样方法的实例包括血清，大便，拭子(swab)，等。非侵袭性和侵袭性程度最小的方法增加患者的依从性，并通常减少费用。

在临床上，评价生物标志物的有效性的两个重要标准是选择性和敏感性。在临床上定义的生物标志物的选择性指被正确诊断的患者的百分比。将临床背景中的生物标志物的敏感性定义为疾病在可医治阶段被检测到的概率。理想地，生物标志物将具有100％的临床选择性和100％的临床敏感性。到目前为止，没有鉴定出具有在患者护理管理中广泛需求的有效性所要求的可接受地高度选择性和敏感性的单生物标志物。然而，从临床前景来看，单一血清生物标志物，诸如AFP和CEA已经证实在患者护理管理的某些方面中具有价值。

例如，CEA的升高的血清水平首先于1965年在患有结肠腺癌的患者中发现。升高的水平可以见于除结肠癌之外的许多良性和恶性的疾病。另外，结肠的早期局部化的肿瘤的CEA的产生在正常的范围内。因此，CEA缺乏评价危险或早期诊断所需的敏感性和选择性。另外，CEA的升高的水平与结肠肿瘤差异和阶段对应性较差，使CEA作为结肠癌预后的生物标志物的价值受到限制。在临床上，在管理患者护理中被证明有帮助的CEA的两个方面是评价治疗的有效性，和检测复发。作为这点的举例说明，许多研究已经发现结肠癌复发的临床检测前升高的CEA血清水平的高相关性。这已经证明了在管理用基于CEA的升高的水平的二次探查(second-look)外科手术方法处理的高危险患者的护理中的价值。

目前，通过许多领域，包括CRC、卵巢、乳腺和头部及颈部的肿瘤学研究发现在标志物组中的增加的敏感性和选择性。现在通常认为，许多突变必定在正常细胞突被改变之前发生，导致了疾病，诸如癌症。另外，考虑到生物***的复杂性，开发用于提供针对CRC的患者护理管理的评价的组正在开始阶段。

到目前为止，通过对腺性结肠息肉病(APC)，p53，和Ki-ras基因，以及相应的蛋白质和涉及其调节的相关途径的研究，已经得到了关于CRC生物学的更多了解。然而，在对具体基因、其表达、蛋白质产物和调节的研究以及理解什么基因对于包括在用于CRC分析的组中是关键的之间存在明显的差异，所述组有效用于针对该疾病对患者护理的管理。到目前为止，已经作为CRC的提示的组由APC，p53，和Ki-ras，以及BAT-26的具体点突变组成，所述BAT-26是作为微卫星不稳定性标志的基因。

本文公开的内容基于在小鼠多肠瘤形成(MIN)模型中进行的研究，其中在腺性息肉中筛选基因的表达水平。在小鼠MIN受试者中，进行了APC基因的化学诱导突变。由同窝出生的仔畜(littermates)来定义正常的对照，对于它们没有APC基因的畸变，并且因此它们被称为野生型。从基于小鼠MIN模型进行的研究，对候选基因进行选择以用于研究人受试者。根据这些人受试者的研究，本文公开了生物标志物组。另外，公开的是基于所述组测量基因和蛋白质表达水平的方法。另外，公开的另一个方面是试剂盒，其提供基于所述组测量基因和蛋白质表达水平的试剂和说明书。所述组，方法和试剂盒有效用于管理针对CRC的患者护理。另外，认为所述组，方法和试剂盒作为开发CRC的治疗性干预的基础是有用的。

图1是给出所公开的生物标志物的序列表的总结的表。所公开的生物标志物的组合形成了以增加的选择性和敏感性检测CRC的基础，并且因此提供了针对CRC的患者护理的提高的管理。要理解的是在序列表中所描述的生物标志物的片段和变体也是用于分析CRC的组中的有用生物标志物。片段所表示的是在序列表中的多核苷酸或多肽的任何不完整或分离的部分。要认识到的是针对基因变体，特别是被集中研究的那些基因，诸如涉及疾病如癌症的基因所发布的几乎每日的，新的发现。因此，给出的序列表是目前关于基因所报告的内容的示范，但是要认识到出于分析方法学的目的，将基因的变体和它们的片段也包括进来。

所公开的一个实施方案是具有选择性和敏感性的生物标志物组，所述选择性和敏感性是管理针对CRC的患者护理所需要的。在表1中，条目1-22是生物标志物组的多核苷酸编码序列，并包括基因的名称和缩写。表1中的个23-44是对应于条目1-22的编码序列的蛋白质，或多肽，氨基酸序列。如国家卫生研究所(National Institutes of Health)(NIH)所定义的生物标志物是具有具体生物性质，生化特点或方面的分子指示物，其可以用于测量疾病的进展或治疗效果。生物标志物组是生物标志物的选择。生物标志物可以来自许多种类的分子。如前所述，仍旧存在对具有选择性和敏感性的针对CRC的生物标志物的需要，所述选择性和敏感性是有效于患者护理管理的所有方面所必需的。因此，在提供有效确定CRC的基础方面来判定对于生物标志物的有效组的选择。

在本说明书的另一个实施方案中，将在SEQ ID NOs 1-22中指示的生物标志物的多核苷酸表达水平用在确定CRC中。这些多核苷酸表达水平的分析在本领域通常指基因表达图谱。在基因表达图谱中，将样品中mRNA的水平测量为生物状态的主要指示物，在该情形下，为CRC的指示物。分析基因表达图谱的最常用方法之一是使用称为逆转录的方法在生物样品中产生来自mRNA的多拷贝。在逆转录的方法中，将来自样品的mRNA用于产生相应的DNA序列的拷贝，所述mRNA最初即转录自所述DNA序列。在逆转录扩增方法中，产生DNA的拷贝，所述DNA不具有在基因中被称作内含子的调节区域。因此将来自mRNA的这些多拷贝称为拷贝DNA，或cDNA。条目45-88是用在逆转录方法中的引物的组，其针对条目1-22中所列出的每个基因。

由于逆转录方法扩增与样品中的mRNA的起始水平成比例的cDNA的拷贝，其成为容许分析在生物样品中出现的甚至低水平的mRNA的标准方法。基因可以在任何具体的生物状态下被上调或下调，并因此改变mRNA的水平。

在本说明书的另一个实施方案中，公开了在SEQ ID NOs 23-44中列出的蛋白质的表达水平，所述蛋白质对应于在SEQ ID NOs 1-22中指示的基因。在本文中，术语“多肽”或“多核苷酸”与术语“蛋白质”交替地使用。如前面讨论，已经长期对蛋白质作为生物标志物的潜力进行了研究，取得了有限的成功。存在对于蛋白质生物标志物的评价，所述蛋白质生物标志物作为多核苷酸生物标志物的补充。具有由两种类型的生物标志物提供的信息的理由包括目前关于mRNA表达水平不是蛋白质表达水平的良好预期物的观察，和mRNA表达水平没有说明蛋白质的翻译后修饰，所述蛋白质的翻译后修饰对于它们的生物学活性是关键的。因此，为了了解蛋白质的表达水平，和它们完整的结构，需要对于蛋白质的直接分析。

图2A-2B显示了来自22个生物标志物的列表的生物标志物的示范性组，针对这些生物标志物，在小鼠MIN模型，和人受试者中比较基因的表达水平。所述组的选择来自整个22个生物标志物的列表并出于数据的易于视觉同化的目的进行从而说明组的应用性。典型地，对于在生物标志物的22个成员组中出现的复杂数据组，应用多变量分析(MANOVA)，诸如在图2C中所说明的。

在图2A中，关于小鼠MIN研究所报道的数据表示了动物受试者的数目的统计学平均并报告了标准差。在右侧的p值说明了数值具有明显差异的信任度(degree of confidence)。作为实例，所列出的第一个基因SDF-1，与人IL-8基因相关，并且在相同的超家族中。对于SDF-1，0.003的p值说明这样的概率，即在野生型对照的值和单独偶然发生的MIN小鼠的腺性息肉的值之间的差异仅是1000中的3。在受试者小鼠中的腺性息肉中的表达水平的筛选被特异性地靶向，因为已经确定了腺性息肉在CRC的危险率估计中是有用的。在图2A中所证明的是6的组清晰地区分MIN小鼠与野生型对照的结果。

图2B-2C解决了生物标志物组的选择性问题。关于具有针对CRC的可接受选择性水平的生物标志物，具有CRC家族史的个体的CRC的发病率是一般人群的3-4倍。然而，目前估计，所有的美国人中的6％将发展CRC，并且其中70-80％将发生在一般危险的人群中。存在对于生物标志物的显而易见的需要，其具有必需的选择性，所述选择性是在确定CRC的信心中所需要的。

在图2B中，图2A中的在小鼠MIN模型中建立的相同的6个生物标志物的组是在人受试者中确定CRC的基础。在图2B中，对取自已知患有CRC的患者，通过组织学评价确定为正常的活组织检查组织的结果和取自被确认为正常对照的个体的活组织检查的组织的结果进行了比较。应该理解组织学方法是鉴定癌性结肠病变的被接受的标准。图2B中存在进一步讨论的两个方面。首先，患者对比正常对照的基因表达图谱分析的值可以变化到高达如IL8的情形，或低至如PPAR-δ的情形。当使用生物标志物组时，对于患者相对正常对照的集中转变(collective shift)的测定是显著的。第二，在浏览患者的数据中，可以注意样品-样品的变化，假设所有的患者-患者是可变化的，其是被预期的。在浏览时显而易见的是将所述组的表达水平作为将患者样品与正常对照组全部区别开的团体，即使任何一个具体生物标志物的值可能不完全地将患者样品从正常对照中区分开。例如，被称为H008的患者具有PPAR-δ的表达水平，其没有与正常对照区分。然而，在浏览中显而易见的是H008的组的结果将其从正常对照组中区分出来。这从原理上证明了考虑到生物学的复杂性和可变性，为什么被确定为有效的标志物组比单独的单一标志物增加了测定的选择性。

图2C进一步强调生物标志物组在增加患者的样品对比正常样品之间的测定的选择性中的价值。图2C中说明了证明MANOVA的应用的实例，所述MANOVA针对选自22个的组中的9个生物标志物的组。在该研究中，比较了来自12个正常患者的78个乙状结肠直肠活组织检查，和来自具有乙状结肠直肠癌的6个患者的非癌性切片的63个乙状直肠活组织检查。使用列出的9个生物标志物，将Wilks’Lambda标准用于评价介于患者样品和正常对照样品之间的不同。指出了接近1.0的入-值，其表示介于患者和正常样品之间的明显不同，其中或然率是1000中的约9个机会，即不同是偶而单独发生的。

图3A-3C和图4A-4C解决了生物标志物组的敏感性问题。如前面提及，由于随着CRC的初期指示，存活率大大增加，因此长期寻求关于CRC的危险率估计和早期检测的生物标志物。介于危险率估计和早期检测之间的不同是关于获得的CRC的确定性的程度。用于危险率估计的生物标志物在时间间隔内赋予少于100％的CRC确定性，而用于早期检测的生物标志物在一定时间间隔内赋予疾病发作的几乎100％的确定性。如果存在介于替代终点(surrogate end point)和确定的结果之间的确定关系，可以将危险因子用作没有被诊断为患有癌症的个体的替代终点。CRC的确定的替代终点的实例是腺性息肉的实例。已经确定的是腺性息肉的发生对于个体后来发展CRC是必需的，但不是充足条件。这点被这样的事实所证明，所述事实是所有的侵入前癌性病变的90％是腺性息肉或前体，但是不是所有具有腺性息肉的个体继续在后来形成CRC。

图3A-3C显示为多个活组织检查样品的基因表达水平所作的图表，所述活组织检查样品取自一个被诊断为具有CRC的示范性患者的结肠。通过常规的组织学方法来确定癌性病变，息肉，和邻近的组织。显示了对于以该方式分类的活组织检查样品三个生物标志物组表达水平。此外，如用图2A-2C所给出的实例证明，显而易见的是针对取样的癌性病变一起测量的三个标志物明显不同于正常对照，甚至即使独自一个(CXCR2)对于该患者将没有被区分。在该陈述中另外指出的是息肉对比正常对照的结果之间的区别。倘若息肉已经被接受为CRC的替代终点，那么使用侵袭性程度最小的方法，诸如拭子，或非侵袭性取样方法，诸如粪便样品的被确定为有效的分析方法来确定息肉的存在也将作为危险率估计的替代终点。

图4A-4C显示在活组织检查样品中的三个生物标志物的基因表达水平的结果，所述活组织检查样品取自患有CRC的患者的结肠的53cm区域中。不规则性状的目标代表被组织学方法证实为癌性的活组织检查的样品，而卵形代表被组织学方法确定为非-癌性的样品。还对每个活组织检查样品进行基因表达作图。将表达图谱的结果描述于图4A-4C中，在所述表达图谱中，图例说明与正常对照比较，在患者的活组织检查样品中的相对水平。

图4A-4C的图示说明生物标志物能够在患者的结肠组织中区分差异的距离，其中这些活组织检查样品通过常规的组织学分析被认为是正常的。这些结果说明通过侵袭性程度最小的擦拭收集方法从远离癌性病变的区域采集细胞，但是能够指示非正常的结肠疾病是可能的。而且，收集粪便样品已经是收集脱落细胞或细胞碎片的有效取样方法，从所述脱落细胞或细胞碎片中可以进行这些测定。在该方面，使用公开的生物标志物组，通过侵袭性程度最小或非侵袭性采集的样品将使样品可以进行分析。这些非侵袭性方法不仅减少了CRC确定的费用，还减少了不适和与目前的方法有关的危险。所有这些因素在一起增加了常规试验的吸引力并因此增加患者的依从性。增加的患者依从性，伴随CRC的有效确定提高早期检测的前景，并提高了存活率。

还将用于分子标志物组的多核苷酸和多肽表达作图的方法和试剂盒作为本说明书的部分。

在一个实施方案中，基因表达作图的方法包括测量cDNA水平，所述cDNA水平针对在被要求的组中选定的生物标志物。这些方法需要应用引物、酶、和其它用于制备，检测和量化cDNAs的试剂。将从样品的mRNA产生cDNA的方法称为逆转录酶聚合链式反应(RT-PCR)。在SEQ ID NOs45-88中列出的引物特别适合应用在基于被要求的组，使用RT-PCR的基因表达作图中。使用Primer Express Software(Applied Biosystems，FosterCity，CA)，设计一系列引物。选择具体的候选物，接着对其进行测试以证实仅有cDNA被扩增，并且没有被基因组DNA污染。因此，对在SEQ IDNOs 45-88中列出的引物进行特异性设计，选择和检验。除引物之外，进行RT-PCR方法需要试剂诸如包括具有所有的四种二核苷三磷酸(例如，dATP，dGTP，dCTP，和dTTP)的二核苷三磷酸混合物的试剂，具有逆转录酶的一种试剂，和具有热稳定性DNA聚合酶的一种试剂。另外，对于RT-PCR方法，还需要缓冲剂，抑制剂和激活剂。一旦cDNA已经被充分扩增到一定的终点，所述cDNA样品必须被准备以进行检测和量化。尽管如下面将详细讨论，考虑了许多检测方案，意欲检测多核苷酸的一种方法是荧光光谱学，因此，适合于荧光光谱学的发色团是标记多核苷酸所理想的。这种荧光标记的一个实例是SYBR Green，尽管存在许多相关的发色团，并是本领域已知的。

在另一个实施方案中，进行蛋白质表达作图的方法包括使用基于被要求的生物标志物组的抗体组来测量来自生物样品的被靶向的多肽的水平。在一个所述方法意欲的实施方案中，将所述组的抗体与固体支持物进行结合。蛋白质表达作图的方法可以使用特异于被结合的多肽的某些部分的第二抗体。可以用分子来对这种第二抗体进行标记，所述分子有效用于检测和量化被结合的多肽，并因此在与多肽结合中标记它以进行检测和量化。另外，还考虑了标记被结合的多肽以进行检测和量化的其它试剂。这些试剂可以直接标记被结合的多肽或，类似于第二抗体，可以是具有针对被结合的多肽的特异性的部分，所述多肽具有标记。这些部分的实例包括，但不限于小分子诸如辅因子，底物，复合试剂等，或大分子，诸如凝集素，肽，寡核苷酸等。这些部分可以是天然存在的或合成的。

公开的方法意欲的检测方式的实例包括，但不限于，光谱技术，诸如荧光和UV-Vis光谱，闪烁计数，和质谱分析。作为这些检测方式的补充，出于检测和量化的目的用在这些方法中的标记的实例包括，但不限于，生色标记，闪烁标记和质量标记。使用这些方法测量的多核苷酸和多肽的表达水平可以被标准化为为靶向测定的目的所确定的对照。认为这些方法在将测定规定为有效管理CRC的患者护理的基础中是有效的。还可以将这些方法用在开发CRC的治疗性干预中。另外，不仅来自乙状结肠镜检查，结肠镜检查或外科手术的活组织检查样品可以通过这些方法进行分析，而且来自非侵袭性或侵袭性程度最小的收集方法的生物样品也可以通过这些方法进行指示。

在本说明书中还提供试剂盒，所述试剂盒具有促进所述方法的迅速实现并因此提供一致性和质量控制的试剂和程序。

在一个实施方案中，用于基因表达作图的试剂盒包括被要求的组的基因表达作图必需的试剂和说明书。因此，例如，所述试剂可以包括引物，酶和其它用于制备、检测和量化对于被要求的生物标志物组的cDNAs的试剂。如上讨论，将从样品中的mRNA中产生cDNA的方法称为逆转录酶-聚合链式反应(RT-PCR)。在SEQ ID NOs45-88中列出的引物特别适合于用在基于被要求的组，使用RT-PCR的基因表达作图中。因此对在SEQIDNOs 45-88中列出的引物进行特异性设计，选择和检验。除了引物之外，RT-PCR需要试剂诸如包括具有所有的四中二核苷三磷酸(例如，dATP，dGTP，dCTP，和dTTP)的二核苷三磷酸混合物的试剂，具有逆转录酶的一种试剂，具有热稳定性DNA聚合酶的一种试剂。另外，用于RT-PCR方法的缓冲剂、抑制剂和激活剂是适合于包括在试剂盒实施方案中的合适的试剂。一旦所述cDNA已经被充分扩增到具体的终点，所述cDNA样品必须被准备以进行检测和量化。检测多核苷酸所希望的一种方法是荧光光谱法，并且因此适合于荧光光谱的发色团是标记多核苷酸所需要的，并且还可以被包括在试剂盒实施方案的试剂中。关于用于基因表达作图的试剂盒实施方案中被包括的说明书优选地教导使用者如下的步骤：获得生物样品；从所述样品中分离细胞RNA；针对组中的每个生物标志物从样品中扩增cDNA的拷贝，并且针对组提供试剂；和量化从样品中扩增的cDNA的水平。尽管可以使用来自许多程序的组织样品，获得生物样品的说明书是优选地，因此使用者以侵袭性程度最小的方法，诸如通过使用拭子或收集粪便样品来获得结肠直肠细胞的样品。所述说明书还可以优选地包括比较被量化的cDNA水平与对照的步骤。

在另一个实施方案中，用于蛋白质表达作图的试剂盒包括被要求的组的蛋白质表达作图所必需的试剂和说明书。因此，在该实施方案中，用于蛋白质表达作图的试剂盒包括提供基于被要求的生物标志物组的抗体组以从生物样品中测量被靶向的多肽水平。这样的组所预期的一个实施方案包括结合于固体支持物的抗体组。另外，关于用于蛋白质表达作图的试剂盒包括的试剂可以应用第二抗体，所述第二抗体特异于被结合的多肽的某些部分。可以用分子对这样的第二抗体进行标记，所述分子有效用于检测和量化被结合的多肽，并因此在与多肽结合中标记它以进行检测和量化。另外，还考虑了标记被结合的多肽以进行检测和量化的其它试剂。这些试剂可以直接标记被结合的多肽或，类似于第二抗体，可以具有针对被结合的多肽的特异性的部分，所述多肽具有标记。这些部分的实例包括，但不限于小分子诸如辅因子，底物，复合试剂等，或大分子，诸如凝集素，肽，寡核苷酸等。这些部分可以是天然存在或合成的。用于蛋白质表达作图的试剂盒的说明书优选地教导使用者：获得生物样品；使用抗体组，所述抗体组关于组中的每个生物标志物的试剂盒进行提供以结合来自所述样品的多肽；量化来自样品的与抗体组结合的多肽水平。优选地，试剂盒说明书还包括比较多肽水平和对照的步骤。优选地，通过侵袭性程度最小的方法诸如在整个粪便样品中应用拭子来获得生物样品。

另外，可以与试剂盒一起提供样品的收集、制备和分析所需要的可消费的实验室用品。

本文公开的内容出于举例说明和描述的目的进行提供。其不倾向于是排外的或将公开的内容限制到所述的拘泥形式。许多修改和变化将对于本领域技术人员是显而易见的。对所公开的内容进行选择和描述从而最好地解释所述的领域的公开的实施方案的原理和实际应用，由此使本领域的其它技术人员能够理解适合于考虑的具体应用的各种实施方案和各种修饰。倾向于通过后附的权利要求和它们的等价物来限定所公开内容的范围。

序列表

<110>李南希马时仪

     陈玲纯

<120>用于结直肠癌的生物标志物组

<130>NLEE 01000WO0

<140>

<141>

<150>60/488,660

<151>2003-07-18

<150>10/690,880

<151>2003-10-22

<160>88

<170>PatentIn Ver.3.2

<210>1

<211>1629

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(74)..(274)

<400>1

<210>2

<211>3356

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(98)..(1909)

<400>2

<210>3

<211>1750

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(53)..(1132)

<400>3

<210>4

<211>597

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(597)

<400>4

<210>5

<211>369

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(369)

<400>5

<210>6

<211>3939

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(106)..(1767)

<400>6

<210>7

<211>1024

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(321)

<400>7

<210>8

<211>1064

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(78)..(395)

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(27)

<223>a，c，t，g，其它或未知

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(766)

<223>a，c，t，g，其它或未知

<400>8

<210>9

<211>1469

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(102)..(1001)

<400>9

<210>10

<211>1256

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(145)..(1029)

<400>10

<210>11

<211>2121

<212>DNA

<213>人

<220>

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<212>DNA

<213>人

<220>

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<213>人

<220>

<221>CDS

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<212>DNA

<213>人

<220>

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<220>

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<220>

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<223>人工序列的描述：合成的引物

<400>88

Claims (95)

1.一种用于结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组，其包括选自SEQ ID NOs 1-5的至少两种多核苷酸。

2.权利要求1的组，其中对所述组进行选择以分析结肠直肠癌和结肠直肠息肉的多核苷酸表达水平。

3.权利要求2的组，其中所述多核苷酸表达水平是mRNAs。

4.权利要求2的组，其中所述多核苷酸表达水平是cDNAs。

5.权利要求1的组，其中所述多核苷酸的至少一种是片段。

6.权利要求1的组，其中所述多核苷酸的至少一种是变体。

7.权利要求1的组，其中所述组用于管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉中的患者护理。

8.权利要求7的组，其中患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗和检测复发的一个或多个。

9.权利要求1的组，其中将所述组用在结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预的开发中。

10.一种用于结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组，其包括：

选自SEQ ID NOs 1-5的至少两种多核苷酸；和

选自SEQ ID NOs 6-14的至少一种多核苷酸。

11.权利要求10的组，其中对所述组进行选择以分析结肠直肠癌和结肠直肠息肉的多核苷酸表达水平。

12.权利要求11的组，其中所述多核苷酸表达水平是mRNAs。

13.权利要求11的组，其中所述多核苷酸表达水平是cDNAs。

14.权利要求10的组，其中所述多核苷酸的至少一种是片段。

15.权利要求10的组，其中所述多核苷酸的至少一种是变体。

16.权利要求10的组，其中将所述组用在管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉的患者护理中。

17.权利要求16的组，其中患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗和检测复发的一个或多个。

18.权利要求10的组，其中将所述组用在结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预的开发中。

19.一种用于结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组，其包括：

选自SEQ ID NOs 1-5的至少两种多核苷酸；

选自SEQ ID NOs 6-14的至少一种多核苷酸；和

选自SEQ ID NOs 15-22的至少一种多核苷酸。

20.权利要求19的组，其中所述组被选择用于分析结肠直肠癌和结肠直肠息肉的多核苷酸表达水平。

21.权利要求20的组，其中所述多核苷酸表达水平是mRNAs。

22.权利要求20的组，其中所述多核苷酸表达水平是cDNAs。

23.权利要求19的组，其中所述多核苷酸的至少一种是片段。

24.权利要求19的组，其中所述多核苷酸的至少一种是变体。

25.权利要求25的组，其中所述组是管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉中的患者护理的基础。

26.权利要求19的组，其中患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗和检测复发的一个或多个。

27.权利要求25的组，其中将所述组用在结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预的开发中。

28.一种结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物的组，其包括选自SEQID NOs 23-27的至少两种多肽。

29.权利要求28的组，其中所述组被选择用于分析结肠直肠癌和结肠直肠息肉的多肽表达水平。

30.权利要求28的组，其中所述多核苷酸的至少一种是片段。

31.权利要求28的组，其中所述多肽的至少一种是变体。

32.权利要求28的组，其中将所述组用在管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉的患者护理中。

33.权利要求32的组，其中患者护理的管理包括危险率估计、早期诊断、确定预后、监测患者治疗，和检测复发的一个或多个。

34.权利要求28的组，其中所述组用在结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预的开发中。

35.一种用于结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组，其包括：

选自SEQ ID NOs 23-27的至少两种多肽；和

选自SEQ ID NOs 28-36的至少一种多肽。

36.权利要求35的组，其中所述组被选择以进行结肠直肠癌和结肠直肠息肉的多肽表达水平的分析。

37.权利要求35的组，其中所述多肽的至少一种是片段。

38.权利要求35的组，其中所述多肽的至少一种是变体。

39.权利要求35的组，其中将所述组用于管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉的患者护理中。

40.权利要求39的组，其中所述患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗和检测复发的一个或多个。

41.权利要求35的组，其中将所述组用在开发结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预中。

42.一种结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组，其包括：

选自SEQ ID NOs 23-27的至少两种多肽；

选自SEQ ID NOs 28-36的至少一种多肽；和

选自SEQ ID NOs 37-44的至少一种多肽。

43.权利要求42的组，其中所述组被选择以进行结肠直肠癌和结肠直肠息肉的多肽表达水平的分析。

44.权利要求42的组，其中所述多肽的至少一种是片段。

45.权利要求42的组，其中所述多肽的至少一种是变体。

46.权利要求42的组，其中将所述组用在管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉的患者护理中。

47.权利要求46的组，其中患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗和监测复发的一个或多个。

48.权利要求42的组，其中将所述组用在开发结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预中。

49.一种测量来自结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物的多核苷酸的表达水平的方法，其包括：

选择生物标志物的组，其包括来自SEQ ID NOs 1-5的至少两种多核苷酸；

获得生物样品；

从所述样品中分离细胞RNA；

针对所述组中的每种生物标志物，从所述样品中扩增cDNA的拷贝；

和

量化从所述样品中扩增的cDNA的水平。

50.权利要求49的方法，其中选择生物标志物组的步骤还包括来自SEQ IDNOs 6-14的至少一种多核苷酸。

51.权利要求49的方法，其中选择生物标志物组的步骤还包括：

来自SEQ ID NOs 6-14的至少一种多核苷酸；和

来自SEQ ID NOs 15-22的至少一种多核苷酸。

52.权利要求49的方法，其中扩增cDNA的拷贝的步骤还包括选自SEQ.IDNOs 45-50的至少两组引物。

53.权利要求52的方法，其中扩增cDNA的拷贝的步骤还包括使用制备cDNAs的酶和试剂。

54.权利要求49的方法，其中量化cDNA的水平的步骤还包括标记cDNA。

55.权利要求54的方法，其中标记cDNA包括至少一种发色团。

56.权利要求49的方法，其中将所述样品的cDNA水平与对照进行比较。

57.权利要求56的方法，其中将所述比较用在管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉的患者护理中。

58.权利要求57的方法，其中患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗，和监测复发的一个或多个。

59.权利要求56的方法，其中将所述比较用在开发结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预中。

60.权利要求49的方法，其中获得生物样品的步骤是获得结肠直肠细胞的样品。

61.权利要求60的方法，其中获得结肠直肠细胞的样品的步骤是侵袭性程度最小的。

62.权利要求61的方法，其中侵袭性程度最小的步骤是使用拭子。

63.权利要求60的方法，其中获得结肠直肠细胞的样品的步骤是非侵袭性的。

64.权利要求63的方法，其中非侵袭性的步骤是收集粪便样品。

65.一种测量来自结肠直肠癌和结肠直肠癌的生物标志物的多肽的表达水平的方法，其包括：

选择生物标志物组，其包括来自SEQ ID NOs 23-27的至少两种多肽；

获得生物样品；

在组中产生每个生物标志物的抗体组；

使用抗体组来结合来自样品的多肽；

和

量化与抗体组结合的来自样品的多肽水平。

66.权利要求65的方法，其中选择生物标志物组的步骤还包括来自SEQ IDNOs 28-36的至少一种多肽。

67.权利要求65的方法，其中选择生物标志物组的步骤还包括：

来自SEQ ID NOs 28-36的至少一种多肽；和

来自SEQ ID NOs 37-44的至少一种多肽。

68.权利要求65的方法，其中将所述样品的多肽水平与对照进行比较。

69.权利要求68的方法，其中将所述比较用在管理结肠直肠癌和结肠直肠息肉的患者护理中。

70.权利要求69的方法，其中患者护理的管理包括危险率估计，早期诊断，确定预后，监测患者治疗，和检测复发中的一种或多种。

71.权利要求68的方法，其中将所述比较用在结肠直肠癌和结肠直肠息肉的治疗性干预的开发中。

72.权利要求65的方法，其中获得生物样品的步骤是获得结肠直肠细胞的样品。

73.权利要求72的方法，其中获得结肠直肠细胞的样品的步骤是侵袭性程度最小的。

74.权利要求73的方法，其中侵袭性程度最小的步骤是使用拭子。

75.权利要求72的方法，其中获得结肠直肠细胞的样品的步骤是非侵袭性的。

76.权利要求75的方法，其中非侵袭性的步骤是收集粪便样品。

77.权利要求65的方法，其中量化结合的多肽的步骤还包括标记多肽。

78.权利要求77的方法，其中对多肽进行标记包括使用第二抗体。

79.一种用于确定结肠直肠癌和结肠直肠息肉的试剂盒，其包括：

用在分析结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组的多核苷酸表达水平的至少一种试剂，其中所述组包括在SEQ ID NOs 1-5中列出的至少两种多核苷酸；和

使用分析所述表达水平的试剂盒的说明书。

80.权利要求79的试剂盒，其中生物标志物组还包括在SEQ ID NOs 6-14中列出的至少一种多核苷酸。

81.权利要求79的试剂盒，其中生物标志物组还包括：

选自SEQ ID NOs 6-14的至少一种多核苷酸；和

选自SEQ ID NOs 15-22的至少一种多核苷酸。

82.权利要求79的试剂盒，其中所述多核苷酸表达水平是mRNAs。

83.权利要求79的试剂盒，其中所述多核苷酸表达水平是cDNAs。

84.权利要求83的试剂盒，其中所述试剂包括选自SEQ.ID NOs 45-50的至少两组引物。

85.权利要求84的试剂盒，其还包括制备cDNA的试剂。

86.权利要求79的试剂盒，其包括用于检测和量化多核苷酸的试剂。

87.权利要求86的试剂盒，其中所述试剂包括至少一种发色团。

88.权利要求79的试剂盒，其还包括用于样品收集、样品制备和样品分析的至少一种的可消费的实验室用品。

89.一种用于确定结肠直肠癌和结肠直肠息肉的试剂盒，其包括：

用在分析结肠直肠癌和结肠直肠息肉的生物标志物组的多肽表达水平中的至少一种试剂，其中所述组包括在SEQ.ID NOs 23-27中列出的至少两种多肽；和

使用用于分析所述表达水平的试剂盒的说明书。

90.权利要求89的试剂盒，其中生物标志物组还包括在SEQ ID NOs 28-36中列出的至少一种多核苷酸。

91.权利要求89的试剂盒，其中生物标志物组还包括：

选自SEQ ID NOs 28-36的至少一种多核苷酸；和

选自SEQ ID NOs 37-44的至少一种多核苷酸。

92.权利要求89的试剂盒，其中所述试剂是结合在组中选定的多肽的抗体试剂。

93.权利要求89的试剂盒，其还包括用于检测和量化被结合的多肽的试剂。

94.权利要求93的试剂盒，其中所述试剂包括第二抗体。

95.权利要求89的试剂盒，其还包括用于样品收集、样品制备和样品分析的至少一种的可消费的实验室用品。

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