CN101413018A

CN101413018A - 一种基因组dna的提取方法

Info

Publication number: CN101413018A
Application number: CNA2008101438535A
Authority: CN
Inventors: 周钢; 胡维新; 朱敏
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2028-12-09
Also published as: CN101413018B

Abstract

本发明公开了一种基因组DNA的提取方法，在样本中加入细胞裂解液(5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS)，裂解样本细胞；RNase消化；(3)将样品冷却，加入蛋白沉淀液(1～10mol/L(NH4)₂SO₄或1～10mol/L NH₄Ac)，离心沉淀去除蛋白；将离心后的上清液转移到100％异丙醇中，离心沉淀DNA。与现有技术相比，本方法能够快速得到高纯度高质量的基因组DNA，整个过程可快至30分钟，得到的DNA片段约为50～500Kb。并且，本方法操作简单、无需复杂设备、花费低廉，清洁无毒，对使用者和环境均无害。

Description

一种基因组DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学和分子生物学，特别涉及DNA分离提取和纯化方法。

背景技术

分子生物学在近几十年的发展非常迅猛，对基因的研究已经遍及医学、农业、环境保护及生物各学科领域。基因组DNA的提取是分子生物学最常用的实验技术之一，在上述各领域中都有使用。20世纪后期，提取基因组DNA常用的方法是细胞破膜后利用有机溶剂(苯酚、氯仿、异戊醇等)使蛋白质变性达到与DNA分离的目的。这些有机溶剂对人体皮肤、呼吸道粘膜、眼睛等有较大的伤害，而且试剂残留对环境污染较大；后来又出现了利用DNA吸附材料来达到蛋白质与DNA分离的目的，这种方法解决了毒性和污染问题，但这种材料成本相对较高，操作比较繁琐，针对的生物样品局限性较大。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种提取并纯化基因组DNA的方法，该方法可以针对绝大多数生物样品，操作简单、经济、无毒无污染，高质高效。

本发明的提取基因组DNA的方法包括步骤：(1)裂解样本细胞：按300ul人全血样本或10～40mg动植物组织样本计算，在样本中加入300ul细胞裂解液(5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS)，裂解样本细胞，用移液器来回吹打混匀；(2)RNase消化：加入4～10mg/ml的RNase溶液并混匀，37℃消化15～60分钟；(3)蛋白沉淀：将样品放置冰上使其快速冷却，向冷却后的样品中加入100μl蛋白沉淀液(1～10mol/L(NH4)₂SO₄或1～10mol/LNH₄Ac)，震荡充分混匀，13,000rpm离心2分钟；(4)DNA沉淀：将离心后的上清液转移到100％异丙醇中，来回颠倒充分混合，13,000rpm离心2分钟，倒去上清，将离心管倒置于滤纸上除去残液，然后加入0.5～1ml 70％乙醇，并来回颠倒离心管十数次，洗涤DNA沉淀，13,000rpm离心1分钟，倒去上清液，将离心管倒置于滤纸上空气干燥10分钟或者真空抽干3～5分钟；(5)DNA的溶解：加入50～100μl TE或者灭菌双蒸水，敲打混匀，65℃水浴15分钟或37℃溶解过夜。产物置于4℃保存，如需要长时间保存，也可置于-20℃或-80℃下。

本发明的提取样本对象可以是全血、骨髓、培养细胞、动物组织、植物组织、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌。但针对不同的样本，裂解处理的步骤有所不同。

对于培养细胞，收集1～3×10⁶个细胞后加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀。

对于人类及动物组织标本，先用研磨，剪碎等方法处理样本，每10～20mg组织中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀。人类及动物组织标本中因蛋白含量非常高，需在细胞裂解液消化后加入1～5μl蛋白酶K溶液(5～40μg/μl)55℃消化过夜，直到无肉眼可见的组织团块。

对于血液和骨髓标本，每300μl样品中需先加入900μl红细胞裂解液(10～500mmol/L NH₄Cl，0.1～10mmol/L EDTA，1～100mmol/L KHCO₃)，室温放置5分钟，并不时来回颠倒混匀，直至溶液变得清亮。此步目的是裂解红细胞，外周血和骨髓中的红细胞是无细胞核结构，细胞中不含有基因组DNA，所以需要和白细胞分离去除。将裂解后的溶液13,000rpm离心1分钟，离心管底可见白色的白细胞沉淀，红细胞已裂解并分散到上清液中。小心去除上清，最后保留约20～30μl的上清液，并用其将白细胞沉淀重悬。往重悬的白细胞中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀。

对于植物组织样本，先在液氮中用研磨棒将样本磨碎。每20～40mg样品中加入300μl细胞裂解液，来回颠倒混匀后，置于65℃消化60分钟。

对于革兰氏阴性细菌，先用1.5ml离心管收集1ml左右细菌悬液(约0.5～2×10⁹个细胞)，13,000rpm离心15秒收集菌体。加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80℃消化5分钟。

对于***及酵母菌，用1.5ml离心管收集1ml左右细菌悬液(约1～3×10⁸个细胞)，13,000rpm离心15秒收集菌体。加入300μl细胞悬浮液(0.1～10mmol/L Nacl，0.2～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.1～20mmol/L EDTA(pH8.0))，用移液器来回吹打混匀。加入1μl溶菌酶(20mg/ml)置于37℃消化30钟。由于***和酵母菌细胞壁非常坚实，加入溶菌酶消化有利于细胞壁的裂解。消化产物于13,000rpm离心1分钟收集沉淀。向沉淀中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80℃消化5分钟。

本方法中，用阴离子去构剂SDS裂解细胞，同时SDS还可以抑制细胞中或环境里的DNase的活性，提供DNA稳定的环境。RNA可以用RNA酶消化除去。去除蛋白质时，使用高浓度的(NH₄)₂SO₄溶液代替了传统的有机溶液。最后，基因组DNA用乙醇沉淀回收并溶解在含有DNA稳定剂的缓冲液中。与现有技术相比，本方法能够快速得到高纯度高质量的基因组DNA，整个过程可快至30分钟，得到的DNA片段约为50～500Kb，可用于Southern，PCR，RFLP，DNA文库构建等各种分子生物学实验。并且，本方法操作简单、无需复杂设备、花费低廉，更重要的是清洁无毒，对使用者和环境均无害。

具体实施方式

以下用具体实施方式对本发明进行具体阐述，下列所有实施例中所述的操作步骤皆为以在1.5ml离心管中操作为例。如需大规模提取，按比例放大试剂与样品量即可。

所用的缓冲液和试剂：

细胞裂解液：5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS；

红细胞裂解液：10～500mmol/L NH₄Cl，0.1～10mmol/L EDTA，1～100mmol/L KHCO₃；

细胞悬浮液：0.1～10mmol/LNacl，0.2～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.1～20mmol/L EDTA(pH8.0)；

蛋白沉淀液：1～10mol/L(NH₄)₂SO₄或1～10mol/L NH₄Ac；

蛋白酶K溶液(5～40μg/μl)；

RNase(4～10mg/ml)；

溶菌酶(20mg/ml)；

异丙醇(100％)；

乙醇(70％)。

实施例1：培养细胞基因组DNA的提取

1)收集3×10⁶个培养细胞，加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；

2)加入1.0μl 8mg/ml的RNase溶液并混匀；

3)37℃消化30分钟；

4)将样品放置冰上1分钟，使其快速冷却；

5)向冷却的样品中加入100μl蛋白沉淀液，震荡充分混匀；

6)13,000rpm离心2分钟；

7)准备一个新的1.5ml离心管，加入400μl 100％异丙醇；

8)用移液器小心将离心后的上清液转移到异丙醇中并来回颠倒充分混合；

9)13,000rpm离心2分钟。此时管底可见白色团块；

10)倒去上清，将离心管倒置于滤纸上吸去残液，然后加入500μl 70％乙醇，并来回颠倒离心管十数次，洗涤DNA沉淀；

11)13,000rpm离心1分钟，小心倒去上清液，将离心管倒置于滤纸上，空气干燥10分钟；

12)加入100μl TE，用移液器吹打混匀；

13)65℃水浴15分钟溶解DNA；

14)将DNA样品保存于-20℃保存。

用该方法可从1～3×10⁶个培养细胞中提取10～30μg的基因组DNA。

实施例2：人外周血基因组DNA的提取

1)往300μl抗凝的人外周血样品中加入900μl红细胞裂解液，室温放置5分钟，并不时来回颠倒混匀，直至溶液变得清亮；

2)将清亮后的溶液13,000rpm离心1分钟，离心管底可见白色沉淀；用200μl移液器小心吸去上清并废弃，最后保留约20～30μl的上清液，并用其将沉淀重悬；

3)往重悬的白细胞中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；

4)其余步骤同实施例1中步骤2)～步骤14)。

用该方法可从300μl全血中提取5～15μg的基因组DNA。

实施例3：人类组织标本基因组DNA的提取

1)取人类组织标本，先用研磨，剪碎等方法处理样本；

2)每10～20mg组织中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；

3)在细胞裂解液消化后加入1～5μl蛋白酶K溶液，55℃消化过夜，直到无肉眼可见的组织团块；

4)其余步骤同实施例1中步骤2)～步骤14)。

用该方法可从10～20mg组织中提取10～30μg的基因组DNA。

实施例4：植物组织样本基因组DNA的提取

1)对于植物组织样本，先在液氮中用研磨将样本磨碎；

2)每20～40mg样品中加入300μl细胞裂解液，来回颠倒混匀后，置于65℃消化60分钟

3)其余步骤同实施例1中步骤2)～步骤14)。

用该方法可从20～40mg植物组织中提取5～20μg的基因组DNA。

实施例5：革兰氏阴性菌基因组DNA的提取

1)先用1.5ml离心管收集1ml左右革兰氏阴性菌悬液(约0.5～2×10⁹个细胞)，13,000rpm离心15秒收集菌体；

2)加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80℃消化5分钟；

3)其余步骤同实施例1中步骤2)～步骤14)。

用该办法可从1ml革兰氏阴性菌悬液中提取20μg的基因组DNA。

实施例6：革兰氏阳性菌基因组DNA的提取

1)用1.5ml离心管收集1ml左右细菌悬液(约1～3×10⁸个细胞)，13,000rpm离心15秒收集菌体；

2)加入300μl细胞悬浮液，用移液器来回吹打混匀；

3)加入1μl溶菌酶置于37℃消化30钟。由于***及酵母菌细胞壁非常坚实，加入溶菌酶消化有利于细胞壁的裂解；

4)消化产物于13,000rpm离心1分钟，收集沉淀；

5)向沉淀中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80℃消化5分钟；

6)其余步骤同实施例1中步骤2)～步骤14)。

用该办法可从1ml革兰氏阳性菌悬液中提取6～12μg的基因组DNA。

Claims

1.一种基因组DNA的提取方法，其特征在于包括步骤：

(1)裂解样本细胞：在样本中加入细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；所述细胞裂解液成分为5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS；

(2)RNase消化：加入4～10mg/mL的RNase溶液并混匀，37℃消化15～60分钟；

(3)蛋白沉淀：将样品快速冷却，加入蛋白沉淀液，充分混匀，13,000rpm离心2分钟；所述蛋白沉淀液成分为1～10mol/L(NH4)₂SO₄或1～10mol/LNH₄Ac；

(4)DNA沉淀：将离心后的上清液转移到100％异丙醇中，来回颠倒充分混合，13,000rpm离心2分钟，倒去上清，将离心管倒置于滤纸上除去残液，然后加入70％乙醇，并来回颠倒离心管十数次，洗涤DNA沉淀，13，000rpm离心1分钟，倒去上清液，将离心管倒置于滤纸上空气干燥10分钟或者真空抽干3～5分钟。

2.如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述样本为培养细胞；所述裂解液的加入量为：每1～3×10⁶个培养细胞中加入300μl细胞裂解液。

3.如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述样本为人类及动物组织；所述裂解步骤(1)为：先研磨、剪碎样本，每10～20mg组织中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀；细胞裂解液消化后再加入1～5μl蛋白酶K溶液，55℃消化过夜。

4.如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述样本为血液或骨髓；所述裂解步骤(1)为：按每300μl样品加入900μl红细胞裂解液室温放置5分钟，并不时来回颠倒混匀，直至溶液变得清亮，所述红细胞裂解液组成为10～500mmol/L NH₄Cl，0.1～10mmol/L EDTA，1～100mmol/L KHCO₃；将裂解后的溶液13,000rpm离心1分钟，去除上清，保留白细胞沉淀，向白细胞沉淀中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀。

5.如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述样本为植物组织；所述裂解步骤(1)为：先在液氮中用研磨棒将样本磨碎，按每20～40mg样品加入300μl细胞裂解液，来回颠倒混匀后，置于65℃消化60分钟。

6.如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述样本为革兰氏阴性细菌；所述裂解步骤(1)为：按0.5～2×10⁹个菌体细胞加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80℃消化5分钟。

7.如权利要求1所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述样本为***或酵母菌；所述裂解步骤(1)为：按每1～3×10⁸个菌体细胞加入300μl细胞悬浮液，所述细胞悬浮液成分为0.1～10mmol/L Nacl，0.2～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.1～20mmol/L EDTA(pH8.0)；用移液器来回吹打混匀后加入1μl浓度为20mg/ml的溶菌酶，置于37℃消化30钟；消化产物于13,000rpm离心1分钟，收集沉淀；向沉淀中加入300μl细胞裂解液，用移液器来回吹打混匀后，置于80℃消化5分钟。